KR100930291B1 - 켑사이신을 분해하는 능력을 가지고 있는 신규한 바실러스균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추에 함유되어 있는 매운 맛과 다양한 생리활성 기능을 가진 켑사이신 (Capsaicin)을 분해하는 특성을 가진 신규 바실러스 균주와 그 균주를 이용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주 및/또는 그 효소는 고추의 매운 맛을 저감시킬 수 있으며, 켑사이신 분해 균주 및 효소를 이용하여 켑사이신 구조를 변경함으로서 다양한 생리활성을 조절함에 이용될 수 있다.

바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 고추, 켑사이신(Capsaicin)

Description

켑사이신을 분해하는 능력을 가지고 있는 신규한 바실러스 균주{Novel Bacillus sp. for degrading capsaicin}

본 발명은 고추에 함유되어 있는 매운 맛과 다양한 생리활성 기능을 가진 켑사이신 (Capsaicin)을 분해하는 특성을 가진 신규 바실러스 리체니포미스 (Bacillus licheniformis)와 그 균주를 이용한 켑사이신 분해 방법 등에 관한 것이다.

일반적으로 켑사이신 (Capsaicin)은 붉은 고추에 함유되어 있어 매운맛을 나타내는 물질로 다양한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다. 매운 맛과 약리작용을 나타내는 켑사이신(capsaicin)의 분자 구조는 알칼로이드 켑사이신 (alkaloid capsaicin)으로 8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide로 알려져 있다 (Rowland et al., 1983, J. Agric. Food Chem. 312:484-487).

켑사이신은 다양한 병원균의 성장을 억제하는 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 켑사이신은 위염을 일으키는 Helicobacter pylori를 직접적으로 성장을 억제하는 기능을 가지고 있고, 또한 H. pylori의 감염시에 나타나는 위점막상의 염증반응 중, Interlukin-8 (IL-8)의 생성을 억제하여 염증반응을 완화시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., 2007, Helicobacter 12:510-517). 켑사이신의 항염증 반응은 비만으로 인하여 발생하는 동맥경화나 당뇨병(Type II)의 예방에도 효과가 있다. 비만시에 지방세포로부터 분비되는 다양한 아디포카인들(adipokines)에는 tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interlukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), 그리고 adiponectin 등이 있으며 이들은 비만으로 야기되는 질병의 원인으로 밝혀져 있다. 비만이 유도된 마우스를 이용한 실험에서 켑사이신의 섭취는 지방세포와 지방조직에서 IL-6와 MCP-1의 mRNA 발현을 억제하였고, adiponectin의 발현량을 증가시켜 궁극적으로 비만으로 야기되는 당뇨와 동맥경화를 억제할 수 있는 가능성이 확인된 바 있다 (Kang et al., 2007, FEBS letters 581: 4389-4396).

켑사이신은 항산화의 기능을 가지고 있다. 켑사이신은 지질의 산화을 억제하며 조리시에 첨가되면 올레익산의 자동산화을 억제하여 지질과산화물의 생성을 억제한다 (Rosa, et al., 2002, J. Agric. Food Chem. 50:7396-7401).

그러나 켑사이신이 가지고 있는 독특한 매운맛으로 인하여 그 사용에 큰 제약을 받는다. 따라서 켑사이신과 유사한 생리학적 특성을 가지면서 맵지 않은 유도체를 발굴하기 위한 다양한 연구들이 수행되었다.

Rosa 등 (2002, J. Agric. Food Chem. 50:7396-7401)의 연구에서는 맵지않도록 재배된 고추 (Capsicum annuum L)에서 켑사이신 ester 유도체인 capsiate, dihydrocapsiate 그리고 Vanilly nonoate에서 우수한 항산화능력을 확인한 바 있다.

그러나 현재까지 켑사이신을 분해하는 미생물에 대한 정보는 매우 미비하다. 켑사이신을 단일 탄소원과 질소원으로 사용하는 최소배지에서 탄소원으로 켑사이신을 이용하는 세균으로 Variovorax와 Ralstonia, 그리고 질소원으로 vanillylamine을 이용하는 Pseudomonas와 Variovorax 가 분리된 바 있다 ( Flagan과 Leadbetter, 2006, Environmental microbiology 8:560-565).

그러나 켑사이신을 분해하는 특성을 가진 바실러스는 본 발명에서 처음으로 분리되었다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 매운 맛과 다양한 생리활성을 나타내는 켑사이신을 분해하는 특성을 가진 신규한 균주를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 켑사이신을 분해하는 활성을 갖는 신규 바실러스 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스인 것이 바람직하고, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스 SK1230 (KFCC11398P) 균주인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 켑사이신은 매운 맛과 다양한 생리활성을 나타내는 (z)-켑사이신, (Z)-[N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-nonenamide],인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 신규 바실러스 균주를 이용하여 켑사이신을 분해하거나 구조를 변경하는 방법을 제공한다.

상기 방법과 관련한 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스인 것이 바람직하고, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스 SK1230 (KFCC11398P) 균주인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 방법과 관련한 일 실시예에 있어서, 상기 켑사이신은 매운 맛과 다양한 생리활성을 나타내는 (z)-켑사이신, (Z)-[N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-nonenamide],인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 신규 바실러스 균주를 이용한 켑사이신 유도체를 생성하는 방법을 제공한다.

상기 유도체 생성 방법과 관련된 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스인 것이 바람직하고, 상기 바실러스 균주는 바실러스 리케니포미스 SK1230 (KFCC11398P) 균주인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 유도체 생성 방법과 관련된 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 켑사이신은 매운 맛과 다양한 생리활성을 나타내는 (z)-켑사이신, (Z)-[N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-nonenamide]인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 켑사이신을 분해하는 능력을 가진 신규 바실러스 리케니포미스 SK1230 (Bacillus licheniformis SK1230)(기탁기관: 한국미생물보존센터 , 기탁일: 2007년 10월 10일 , 기탁번호: KFCC 11398P)를 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 리케니포미스 SK1230 (Bacillus licheniformis SK1230)는 전통발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 속의 신규한 균주임을 특징으로 한다.

상기 전통발효식품의 예로서는 김치, 채소발효물, 된장, 간장, 청국장 또는 젓갈 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

바실러스 리케니포미스 SK1230의 분리방법과, 균학적 성질는 하기와 같으며, 이하 상세하게 설명한다.

켑사이신, 정확하게 (z)-Capsaisin, (Z)-N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-nonenamide,(Tocris Bioscience, Cat No 0463)을 단독 탄소원으로 하는 MOPS agar 배지 (pH 7.4, MOPS powder 8.37%, Tricine 0.07%, NaCl 0.3%, NH₄Cl 0.05%, KOH 0.16%, K₂SO₄ 0.276mM, MgCl₂ 0.528mM, K₂HPO₄ 2.0mM, Bacto agar 1.6%)에 전통발효식품인 고추절임액을 희석하여 도말하고 37℃ 항온기에서 48시간동안 배양 켑사이신을 탄소원으로 하여 성장한 콜로니들을 분리하였다. 분리된 콜로니들은 다시 켑사이신과 포도당이 함유된 최소배지 (pH 7.4, Na₂HPO₄7H₂O 33.51mM KH₂PO₄ 22.04mM, NaCl 8.56mM, NH₄Cl 18.69mM, MgSO₄ 1.00mM, CaCl₂ 0.10mM, Glucose 10mM, (z)-capsaicin, 0.05mM)를 이용하여 37℃ 항온기에서 48시간 동안 배양하며 4시간과 8시간 그리고 25시간째의 배양액에 분해되고 남은 켑사이신을 HPLC를 이용하여 검출하였다. 최종적으로 배양액에 잔류하는 켑사이신의 함량이 검출되지 않는, 즉 켑사이신을 분해하는 능력이 있는 균주를 선발하였다.

분리된 균주는 그람양성 간균이며, LB 배지(Trypticase peptone 1.0%, Yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, Bacto agar 1.5%)에서 균의 형태로서 나타난 집락의 형태는 산모양의 봉우리와 태양과 같은 갈기모양의 테두리를 나타내는 집락을 형성한다. 생리학적 성질로는 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 55℃ 이하의 생육 온도, pH 3.0 내지 11.0, 바람직하게는 4.5 내지 10의 생육 pH 조건에서 성장하며, 산소의 영향은 통성 혐기성이다.

본 발명의 바실러스 리케니포미스 SK1230는 전통발효식품으로부터 분리하였으며 16S rDNA 분석으로 동정한 결과, 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)의 16S 리보솜(ribosomal) DNA의 염기 서열(NCBI/GenBank/Accession No AB354236)과 가장 좋은 상동성(99%)을 보여, 상기 미생물을 바실러스 리케니포미스 SK1230 (Bacillus licheniformis SK1230)로 명명하고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2007년 10월 10일자로 기탁하였다.

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 본 발명은 켑사이신을 분해하는 능력을 가진 신규 바실러스 리케니포미스를 제공하여, 본 발명의 균주 및/또는 그 효소는 고추의 매운 맛을 저감시킬 수 있으며, 켑사이신 분해 균주 및 효소를 이용하여 켑사이신 구조를 변경함으로서 다양한 생리활성을 조절함에 이용될 수 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1. 전통 발효 식품으로부터 켑사이신을 유일한 탄소원으로 사용하는 미생물의 분리

켑사이신, 정확하게 (z)-Capsaisin, (Z)-N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-nonenamide,(Tocris Bioscience, Cat No 0463)을 단독 탄소원으로 하는 MOPS agar 배지 (pH 7.4, MOPS powder 8.37%, Tricine 0.07%, NaCl 0.3%, NH₄Cl 0.05%, KOH 0.16%, K₂SO₄ 0.276mM, MgCl₂ 0.528mM, K₂HPO₄ 2.0mM, Bacto agar 1.6%, (z)-capsaicin 50㎛mol)에 전통발효식품인 고추절임액을 희석하여 도말하고 37℃ 항온기에서 48시간동안 배양 켑사이신을 탄소원으로 하여 성장한 콜로니들을 분리하였다.

실시예 2. 켑사이신 분해 능력의 확인

분리된 콜로니들 LB 배지에서 single colony로 분리하였고 다시 최소배지(pH 7.4, Na₂HPO₄7H₂O 33.51mM KH₂PO4 22.04mM, NaCl 8.56mM, NH₄Cl 18.69mM, MgSO₄ 1.00mM, CaCl₂ 0.10mM, Glucose 10mM)에서 배양한 후에 포도당과 켑사이신이 함유된 상기 최소배지를 이용하여 37℃ 항온기에서 48시간동안 배양한 결과, 배지내에 포함된 glucose는 배양 8시간째에 거의 대부분이 소진되었으나, 미생물의 성장은 8시간 이후에도 지속적으로 증가하였다. 즉 배지 내에 탄소원으로 첨가된 포도당이 먼저 이용되고, 이후에는 켑사이신이 탄소원으로 작용하여 바실러스 리케니포미스의 성장을 유도하였다(그림 1). 또한 4시간과 8시간 그리고 25시간째의 배양액에 분해되고 남은 켑사이신을 HPLC를 이용하여 검출한 결과, 최종적으로 배양액에 잔류하는 켑사이신의 함량이 검출되지 않는, 즉 켑사이신을 분해하는 능력이 있는 균주를 선발하였다 (그림 2).

실시예 3. 선발균주의 동정

상기 실시예 1-2에서 선발된 SK1230 균주의 동정은 생화학적 방법 및 분자계통학적 방법을 이용하였다. 생화학적 특성은 API kit (CH 50, Biomerieux)를 이용하여 조사하였고, 그 결과는 apiweb (http://www.apiweb.biomerieux.com)에서 평가하였다. 분자계통학적 방법은 16S rDNA 시퀀스를 조사한 후, NCBI 데이타베이스를 통하여 조사하였다. 생화학적 특성은 표 1과 같은 결과를 나타내었고, 분자계통학적 방법인 apiweb 분석결과, 서열번호 1로 기재되는 SK1230 균주의 16S rDNA 염기서열은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 16S rDNA 염기서열 과 99%의 상동성을 나타내어, 바실러스 리케니포미스 SK1230 (Bacillus licheniformis SK1230)으로 명명하고 대한민국 서울시 서대문구 홍제동 361-221 유림빌딩 2층 소재 한국미생물센터(KCCM)에 2007년 10월 10일자로 기탁하였다(기탁번호: KFCC 11398P).

기질	반응성	기질	반응성
대조군(control)	-	갈락토스(galactose)	-
글리세롤(glycerol)	+	글루코스(glucose)	+
에리트리톨(erythritol)	-	프럭토스(fructose)	+
D-아라비노스(D-arabinose)	-	만노스(mannose)	+
L-아라비노스(L-arabinose)	+	소르보스(SorBosE)	-
리보스(ribose)	+	람노스(rhamnose)	-
D-자일로스(D-xylose)	+	둘시톨(dulcitol)	-
L-자일로스(L-xylose)	-	이노시톨(inositol)	-
아도니톨(adonitol)	-	만니톨(mannitol)	+
β-메틸-D-자일로시드(β-methyl-D-xyloside)	-	소비톨(Sorbitol)	-
α-메틸-D-만노시드(α-methyl-D-mannoside)	-	멜리비오스(melibiose)	-
α-메틸-D-글루코시드(α-methyl-D-glucoside)	+	수크로스(sucrose)	+
N-아세틸-글루코사인(N-acetyl-glucosaine)	+	트레할로스(Trehalose)	+
아미그달린(amygdalin)	+	이눌린(inulin)	+
알부틴(arbutin)	+	멜레치토오스(melezitose)	-
에스쿨린(esculin)	+	라피노스(raffinose)	+
살리신(salicin)	+	스타치(starch)	+
셀로비오스(cellobiose)	+	글리코겐(glycogen)	+
말토스(maltose)	+	자일리톨(xylitol)	-
락토스(lactose)	-	겐티오비오스(gentiobiose)	+
D-튜라노스(D-turanose)	+	D-아라비톨(D-arabitol)	+
D-라일조스(D-lyxose)	+	L-아라비톨(L-arabitol)	-
D-타가토스(D-tagatose)	+	글루코네이트(gluconate)	-
D-푸코스(D-fucose)	-	2-케토-글루코네이트(2-keto-gluconate)	-
L-푸코스(L-fucose)	-	5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate)	-

도 1은 켑사이신과 포도당이 함유된 최소배지에서 Bacillus licheniformis SK1230 균주의 성장곡선 및 포도당 이용곡선을 나타내는 그림.

도 2는 켑사이신과 포도당이 함유된 최소배지에서 배양한 Bacillus licheniformis SK1230균주의 배양 시간별 배양액에 잔류하는 켑사이신의 검출 크래마토그램을 나타내는 그림

<110> KonKuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Novel Bacillus sp. for degrading capsaicin <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA <400> 1 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 60 atgcttgatt gaaccgcatg gttcaattat aaaaggtggc ttttagctac cacttacaga 120 tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta 180 gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 240 aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 300 tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta ccgttcgaat 360 agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 420 cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 480 gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg 540 gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 600 gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa 660 agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 720 720

Claims (13)

1. 켑사이신을 분해하는 활성을 갖는 바실러스 리케니포미스 SK1230 (KFCC11398P) 균주.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 켑사이신은 Z-켑사이신인 것을 특징으로 하는 균주.
5. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 발효식품으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 균주.
6. 제 1항의 바실러스 리케니포미스 균주를 이용하여 켑사이신을 분해하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 6항에 있어서, 상기 켑사이신은 Z-켑사이신인 것을 특징으로 켑사이신을 분해하는 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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