KR100887785B1 - 광역학적 치료를 위한 비극성 감광제 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비극성 포피린(porphyrin) 감광제와 하나 이상의 인지질을 포함하고, 동결건조할 필요없이 저장하여도 안정한 광역학적 치료를 위한 약제학적 리포솜 제형에 관한 것이다. 리포솜 제형은 정맥내 투여에 대한 치료적 유효량의 감광제를 제공한다. 인지질은 페길화, 즉 인지질의 통합 부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것에 의해 변형될 수 있다. 형성된 리포솜은 막내 비극성 감광제를 포함하며, 비극성 감광제 및 제 2 극성 물질이 함께 사용되는 표적화에 유용하다. 제형이 단당류나 폴리알코올의 존재를 포함할 때, 그것은 리포솜 비히클의 크기와 치료적 유효량의 감광제 함량을 유지하기 위해 효율적으로 동결건조될 수 있다. 본 발명은 또한 수성 비히클로 재구성되어 형성된 리포솜 조성물에 관한 것이다. 적합한 수성 비히클로 재구성되어 동결건조된 제형은, 또한 정맥내 투여에 유용한 리포솜을 형성할 수 있다.

리포솜, 광역학적 치료, 감광제, 감광제 제형, 리포솜 제형

Description

광역학적 치료를 위한 비극성 감광제 제형{NON-POLAR PHOTOSENSITIZER FORMULATIONS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY}

본 발명은 테모포핀(Temoporfin) 또는 다른 비극성 감광제를 포함하는 리포솜 제형의 제법, 및 치료에 있어서의, 특히 정맥내 주입을 사용함에 있어서의, 이러한 제형의 용도에 관한 것이다.

리포솜은 수분 구역에 의해 분리된 동심 지질 이중층으로 구성되며, 약물 전달 비히클로서 광범위하게 연구되고 있는 인위적 소포이다. 제조 방법에 의해 조절될 수 있는 이들의 구조, 화학적 조성 및 콜로이드 크기로 인해, 리포솜은 다양하게 적용 가능한 여러 가지 성질들을 나타낸다. 가장 중요한 성질은, 20 ㎚에서 10 ㎛에 이르는 범위에서 어느 정도 일정한 입도 분포를 나타내는 콜로이드 크기, 및 특수 막 및 표면 특징이다.

리포솜은 여러 가지 다른 목적을 수행할 수 있기 때문에 약물과 항원에 대한 운반체로 사용된다(Storm & Crommelin, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1, 19-31 1998). 약물로 피막화된 리포솜은 대사되는 효소에 접근할 수 없다. 대조적으로, 신체의 구성 성분(적혈구 또는 주입 지점의 조직과 같은)은 약물의 최대 용량에 직접적으로 노출되지 않는다. 약물 활성의 지속시간은 신체 내에서의 약물의 느린 방출로 인해 리포솜에 의해 연장될 수 있다. 리포솜이 방향 잠재력을 지닌다는 것은 표적화 옵션(targeting option)이 신체에 대한 약물의 분포를 변화시킨다는 것을 의미한다. 세포는 세포내 이입 또는 포식작용 메커니즘을 사용하여 세포질 내에서 리포솜을 흡수한다. 또한, 리포솜은 약물이 분해(예를 들어, 대사 분해)되는 것을 방지할 수 있다. 비록 가끔은 성공적이지만, 리포솜은 한계를 가지고 있다. 리포솜은 병든 조직에 약물을 전달할 뿐만 아니라 간, 지라, 신장 및 망상내피 시스템에 빠르게 침투하여 순환하는 동안에 약물을 누출시킨다(Harris & Chess, Nature, March 2003, 2, 214-221).

페길화(pegylation)는 이러한 결점들을 극복하기 위한 대체 방법이다. 첫째, 페길화는 약물 레벨이 좀더 긴 시간 주기 동안 적정 약물 농도 내에서 유지되고, 더 작고, 더 활성을 가지고/거나 더 용이하게 깨끗한 단편으로 점진적으로 분해하는 긴 순환 부분(moiety)으로서 약물을 제공한다. 둘째, 페길화는 마이크로입자 또는 큰 거대분자를 포함하는 긴 순환 약물이 영향을 받는 혈관계 또는 수용체 발현을 병리부위에서 천천히 축적되도록 할 수 있고 그 영역에서의 약물 전달을 개선 또는 강화시킨다. 셋째, 페길화는 최소한의 혈액 흐름 또는 표적 항원의 낮은 농도로 병리 영역에 도달하기로 되어있는 그러한 표적화된 약물과 약물 운반체에 대해 더 나은 표적화 효과를 달성하도록 도움을 줄 수 있다. 페길화의 장점은 전형적으로는, 다른 무엇보다도 안정성의 증가(온도, pH, 용매, 등), 면역원성과 항원성의 상당한 감소, 프로테아제에 대한 내성, 촉매 활성의 유지 및 용해도의 증가, 및 생성물의 액체 안정성의 증가 및 교반으로 유발된 응집의 감소를 나타낸다는 것이다.

폴리(에틸렌 글리콜)-결합된 지질(PEG-지질) 또는 강글리오시드와 같은 이중층 친화성 종을 포함하는 리포솜 막은 스텔스 리포솜(stealth liposomes)을 제조하는데 사용되고 있다(Papahadjopoulos et al., PNAS, 88, 11460-4 1991). 스텔스 리포솜은 혈액순환에서 상대적으로 긴 반감기를 가지며 생체 내에서 변경된 생분포(biodistribution)를 보여준다. 바게(Vaage) 등(Int. J. of Cancer 51, 942-8, 1992)은 독소루비신의 스텔스 리포솜을 제조하고, 이를 최근 이식되어 잘 확립되어 있는 성장하는 일차(primary) 마우스 암종을 치료하고, 유방내 종양 이식물로부터 자발적 전이의 전개를 억제하기 위해 사용하였다. 상기 저자들은 독소루비신 제형의 스텔스 리포솜의 긴 순환 시간이 그것의 뛰어난 치료 효과를 설명하는 것이라고 결론지었다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 이중층 내에서 MPEG-유도된(페길화된) 지질의 존재는 전형적인 리포솜의 정맥내 주입 투여 후에 나타나는 빠른 혈관내 불안정화/파열 및 RES 소거의 원인이 되는 플라즈마 단백질 및 셀 표면 수용체와의 상호작용에 대해 입체적 장벽을 효과적으로 제공한다. 결과적으로, 페길화된 리포솜은 연장된 순환 반감기를 가지며, 임의의 피막화된 약제의 약동학은 포획된 약물의 것보다는 리포솜 운반체의 것을 따르도록 변경된다(Stewart et al., J. Clin. Oncol. 16, 683-691, 1998). 페길화된 리포솜의 종양 편재화 메커니즘은 종양내 누출 혈관을 통한 혈관밖 유출에 의한 것이기 때문에(Northfelt et al., J. Clin. Oncol. 16, 2445-2451, 1998; Muggia et al., J. Clin. Oncol. 15, 987-993, 1997), 연장된 순환은 종양 혈관을 통해 페길화된 리포솜에 의해 이루어지는 전체 통과 회수의 증가에 의해 종양에서의 축적을 도울 것이다.

광역학적 치료(PDT)는 다양한 의학적 적용에 사용하기 위해 연구되고 있는 새로운 기술 중 가장 유망한 것 중 하나이며, 종양 파괴를 위해 널리 인정된 치료법으로서 알려져 있다("Pharmaceutical development and medical applications of porphrin-type macrocycles", T.D. Mody, J. Porphyrins Phthalocyanines, 4, 362-367 2000). PDT의 다른 중요한 적용은 피부, 치아, 화농, 위장, 창자, 생식기 및 다른 감염을 포함하는 병원성 미생물에 기인하는 감염의 치료이다.

감염성 질병의 치료에 있어서 항상 문제가 되는 것은 질병의 치료에 사용되는 약제의 특이성이 없고, 결과적으로 환자는 치료로부터 새로운 일련의 병에 걸리게 된다는 것이다.

다양한 유형의 병을 치료하기 위한 PDT의 사용은 감광제의 내재적 특성 때문에 제한된다. 이러한 특성으로는 높은 가격, 숙주 유기체에서의 오랜 잔류, 상당한 피부 광 독성, 배경 독성, 생리 용액 내에서의 낮은 용해도(이는 혈전 색전성 사고를 일으킬 수 있기 때문에 혈관내 투여에 대한 유용성을 감소시킨다), 및 낮은 표적화 효율이 포함된다. 이러한 단점들은 극단적인 고용량의 감광제의 투여를 유도하여, 손상되지 않은 조직내 감광제의 축적 가능성과 이에 동반하여 손상되지 않은 부위에 영향을 미칠 위험성을 크게 증가시킨다.

감광제의 특이성과 PDT의 효율을 증가시키기 위한 유망한 접근방법 중 하나는 표적 세포의 표면상의 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드-벡터와 감광제를 컨쥬게이트시키는 것이다. 표적 세포에 의해 확인된 수많은 천연 및 합성 분자가 이러한 벡터로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종양의 치료를 위한 신세대의 감광제를 설계하는 데 사용된다("Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy" E.D. Sternberg, D, Dolphin, C. Brueckner, Tetrahedron, 54, 4151-4202 1998).

종양에 표적 감광제를 표적화시킴으로써 종양 선택성을 증가시키기 위한 또 다른 접근방법은 리포솜, 예를 들어, 트랜스페린-컨쥬게이트된 리포솜(transferrin-conjugated liposomes)을 사용하는 것이다(Derycke & DeWitte, Int. J. Oncology 20, 181-187, 2002). 비-컨쥬게이트된 리포솜은 세망내피계에 의해 용이하게 인지되고 제거되는 것이 흔하기 때문에 페길화된 리포솜이 사용된다(Woodle & Lasic, Sterically stabilized liposomes, Biochim Biophys Acta 1113, 171-199, 1992; Dass et al., Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes. J Pharm Pharmacol 49, 972-975, 1997).

암 및 다른 질병의 치료에 있어서 광역학적 치료의 적용은 빠르게 증가하는 추세이기 때문에, 새로운 감광제 제형에 대한 요구도 점점 커지고 있다. 이러한 새로운 감광제 제형은 좀더 안정되고, 제조 및 취급이 용이할 필요가 있다. 또한, 특히, 보다 소수성인 비극성 감광제가 효율적이고 선택적인 방법으로 조직을 표적화시킬 수 있어야 한다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 광역학적 치료(PDT)에 사용하기 위한 개선된 감광제 제형을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비극성 감광제를 리포솜 막내 도입시켜 비극성과 극성 물질이 같은 비히클을 사용하여 모두 전달되도록 하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동결건조 단계 동안에 동해방지제로서 단당류 또는 폴리알코올을 첨가함으로써 도입된 비극성 감광제를 갖는 리포솜 작제물의 구조와 크기를 보전하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 개선된 약동학적 성질을 갖는 감광제 제형을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 세포막을 통한 비극성 감광제의 전달을 개선시켜 PDT의 효능을 증가시키기 위한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 비극성 포피린(porphyrin) 감광제 및 하나 이상의 인지질을 포함하고, 동결건조할 필요없이 저장하여도 안정한, 광역학적 치료를 위한 약제학적 리포솜 제형에 관한 것이다. 리포솜 제형은 정맥내 투여를 위한 치료적 유효량의 감광제를 제공한다. 인지질은 페길화에 의해, 즉 인지질의 통합 부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함함으로써 변형될 수 있다. 형성된 리포솜은 막내 비극성 감광제를 포함하며 비극성 감광제 및 제 2 극성 물질이 함께 사용되는 표적화에 유용하다. 제형은 단당류나 폴리알코올의 존재를 포함하는 경우, 효과적으로 동결건조되어 리포솜 비히클의 크기와 치료적 유효량의 감광제 함량을 유지할 수 있다. 또한, 본 발명은 수성 비히클로 재구성되어 형성된 리포솜 조성물에 관한 것이다. 또한, 적합한 수성 비히클로의 재구성시 동결건조된 제형은 정맥내 투여에 유용한 리포솜을 형성한다.

상술한 본 발명의 목적, 그 밖의 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명과 이와 관련된 동반된 도면에 의해 명백해질 것이다.

발명의 구체예에 대한 상세한 설명

광역학적 치료를 위한 약제학적 리포솜 제형은 하기에 서술되는 바와 같이 동결건조할 필요없이 저장하여도 안정한, 비극성 포피린(porphyrin) 감광제 및 하나 이상의 인지질을 포함한다. 리포솜 제형은 정맥내 투여를 위한 치료적 유효량의 비극성 감광제를 제공한다. 인지질은 페길화에 의해, 즉 인지질의 통합 부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함함으로써 변형될 수 있다. 형성된 리포솜은 막내 비극성 감광제를 포함하며, 비극성 감광제 및 제 2 극성 물질이 함께 사용되는 표적화에 유용하다.

제형은 단당류나 폴리알코올을 사용하는 동결건조 공정에 의해 보존될 수 있지만, 상당히 안정된 저장 기간을 가져야 할 필요는 없다. 공정 싸이클은 감광 화합물의 막 함량 뿐만 아니라 리포솜 비히클의 크기를 보존한다.

본 발명에서의 비극성 감광제에는 공지되어 있는 포피린 기재 화합물이 포함된다. 본 발명의 실시에 바람직하게 사용되는 구체적인 감광제는 포피린 거대고리 감광제를 기재로 하며, 듀테로포피린(deuteroporphyrin), 에티오포피린(etioporphyrin), 프로토포피린(protoporphyrin), 헤마토포피린(hematoporphyrin), 페오포바이드(pheophorbide) 및 이들의 유도체, 바람직하게는 디- 및 테트라-하이드로포피린을 포함하고, 640 내지 780 나노미터의 범위에서 광 흡수가 최대이다.

인지질은 페길화(통합부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는)에 의해 변형되나 변형되지 않을 수 있다. 형성된 리포솜은 막내 비극성 감광제를 포함하며, 비극성 감광제 및 제 2 극성 물질이 함께 사용되는 표적화에 유용하다.

감광화 제형은 비극성 감광제 분자를 원하지 않는 세포 또는 조직 또는 다른 원하지 않는 물질에 표적화시키는 데 유용하며, 적합한 광원으로 조사 후에 표적물을 손상시키는 데 유용하다. 감광화 제형은 또한 감광제의 제한된 광화학 활성화의 존재 여부에 관계없이 형광 영상법을 사용하여 원하지 않는 세포 또는 조직 또는 다른 원하지 않는 물질을 모니터하는 데 유용하다.

특히 본 발명의 리포솜 제형은 비극성 감광제를 전달하는 데 유용하다. 비극성 물질은 비히클의 막 내부에서 통합되고, 이로써 보다 용이하게 개방되는 구조가 생성되며 세포막에 직접적으로 작용하는 감광제가 유리된다. 이러한 메커니즘은 감광제를 바람직한 작용 장소 중 하나인 세포막 시스템으로 직접 운반한다. 따라서 적합한 외부 광원에 의한 조명으로 효과적으로 활성화되는 감광제는 원하지 않는 세포, 조직 또는 다른 구조들을 비가역적으로 손상시킬 수 있다.

통상적으로 작제된 리포솜 제형은 비히클의 내강 부분에 가두어진 여러 가지 화합물을 전달하는 데 사용된다. 본 발명은 비극성 및 극성 물질이 함께 전달되도록 하는, 하나의 리포솜 안에 두 개의 다른 전달 구획으로 된 조합에 중점을 둔다. 이와 같이, 막 내부에 감광제가 존재함으로써, 감광화제는 치료에 있어서 유익한 효과를 가질 수 있는 약물을 포함하여, 다른 물질들의 내포를 위해 유리된 상태인 리포솜 입자 내부의 내강 부분을 제외하고, 그 작용 장소에 대해 효과적으로 표적화시킨다.

또한, 글루코오스로서 단당류와 인지질에 결합된 감광제의 조합은 이당류 대신에 생리적으로 일반적인 탄수화물을 사용하는 동결건조 및 재수화작용 동안에 리포솜의 크기를 보존하는 데 매우 뛰어난 수단이다.

이러한 다양한 개념은 치료에 있어서 유익한 효과를 갖게 하는 물질의 첨가를 허용한다. 하나의 비히클내 막 결합된 감광제와 둘 이상의 물질의 조합은 표적이 되는 세포의 산소 함량에 직간접적으로 영향을 줄 수 있고, 이에 따라 광역학적 치료의 효능에 영향을 끼친다. 예를 들어, 이러한 효과는 포유류의 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase, TrxR)의 저해제와 같은 효소 활성 저해제의 첨가함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 표적화된 세포의 세포질에 도달한 후에만 효과가 있는 저해제는 일반적으로 항산화제로서 역할을 하는 Trx/TrxR 경로를 차단할 것이다.

도 1은 리포솜 제형된 mTHPC의 겔 여과 곡선을 도시한 것이다. 지질 성분과 mTHPC 둘 모두 채택된 모든 분획에 대해 동일한 분포를 보여준다.

도 2는 0.5 mg/kg의 mTHPC, 생성물 A 및 B가 정맥내 주입된 무손상 피부의 스위스 nu/nu 마우스를 사용하여 콜로(Colo)26 종양을 광유도 형광법(light-induced fluorescence, LIF)으로 측정한 것을 나타내며, 시간에 따른 종양내 축적을 제시하고 있다.

도 3은 생성물 A, B 및 mTHPC의 정맥내 주입 후 6시간의 PDT-효과를 보여준다. 마우스는 PDT 처리 후에 즉시 에반스 블루(1%)와 함께 복막내에 주입되고 24시간 후에 희생되었다.

실시예 1

m-THPC를 함유한 리포솜의 제조

m-THPC(테모포핀)를 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제 4,992,257호 및 제 5,162,519호 기재되어 있는 바와 같이 합성하였다.

리포솜을 하기 일반적인 공정에 따라 합성하였다:

비극성 감광제, 아스코르빅 팔미테이트 및 인지질을 클로로포름/메탄올에 녹였다. 이후, 상기 용액을 클로로포름/메탄올 혼합물이 가스 크로마토그래피에서 더 이상 검출되지 않을 때까지 회전 증발기를 사용하여 진공하에서 건조시켰다. 주입용 물을, 50℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 지질 막을 재수화시키기 위해 첨가하였다. 이후, 상기 혼합물을 100 나노미터의 최종 공극 크기를 사용하는 균질화 여과 시스템을 통하여 통과시켰다. 선택적으로, 재수화 물을 단당류 또는 폴리알코올과 함께 보충하였다. 여액을 수거하고, 바이알에 채운 후, 선택적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 조성물을 투여전에 주입용 물로 재구성시켰다.

상기 공정을 사용하여, 리포솜 제형의 여러 가지 서로 다른 제제를 다음과 같이 제조하였다:

실시예 1a

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

페길화된 디스테로일 포스파티딜 에탄올아민 0.05~0.2

아스코르빅 팔미테이트 0.002~0.004

주입용 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

실시예 1b

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

아스코르빅 팔미테이트 0.002~0.004

주입용 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

실시예 1c

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

글루코오스 2.0~12.0

아스코르빅 팔미테이트 0.002~0.004

주입용 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

상기 모두는 본 발명에 따른 그 용도에 잘 기능하는 것으로 나타났다.

실시예 2

리포솜 mTHPC의 물리적 및 화학적 안정성

리포솜 제형의 물리적 안정성을 광자상관분광법에 의해 입도 분포를 모니터하여 측정하였다.

리포솜 mTHPC의 안정성

저장 조건 입도 분포(nm)

초기 166

23℃-1개월 177

23℃-4개월 167

실시예 3

제형의 리포솜 이중층내 mTHPC의 편재화

리포솜 제형을 세파덱스 G50 컬럼(Sephadex G50 column) 상에서 겔 여과시켰다. 도 1에 도시된 바와 같이, 지질 및 mTHPC는 모든 분획에 걸쳐 동일한 분포를 나타냈으며, 이는 두 성분의 물리적 상호작용, 즉 mTHPC의 막 이중층으로의 통합을 시사한다. 표 1과 표 2에 보여지는 바와 같이, 초음파 처리에 의해 리포솜 구조가 파괴된 후에도 분포가 두드러지게 변화하지는 않았다.

표 1. G50 겔 여과 후의 mTHPC 회수율 표 2. G50 겔 여과 후의 지질 회수율

실시예 4

마우스에서의 약동학적 성질

Balb/c 마우스와 유전적 동계인 콜로(Colo)26, 즉 비-전이 마우스 직장결장 종양 세포주를 사용하였다.

세포를, 95% 공기 및 5% CO₂, 37℃에서, 10%의 열불활성 우태아 혈청, 1% 스트렙토마이신-페니실린 및 200 mM L-글루타민으로 완결된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (Roswell Park Memorial Institute: RPMI)-1640 배지에서 단층 배양물로서 유지시켰다.

6주된 무흉선 암컷 마우스(Swiss, nu/nu)를 오른쪽 뒷발의 피하조직에 2 x 10⁶ 콜로26 세포를 접종시켰다. 2주 후, 종양이 직경 5 내지 7 mm에 이르면, m-THPC의 제형(0.5 mg/Kg)을 정맥내 주입하였다.

세 개의 별개의 부위에서 비침입성 LIF 측정을 수행하였다: 약물 투여 후 상이한 시간에서 피부가 덮고 있는 종양, 왼쪽 뒷발의 피부가 덮고 있는 대칭적 정상 조직 및 융기된 피부. 선택된 시점에서 마우스를 희생시키고, 종양 및 정상 조직으로부터의 형광 신호를 직접 접촉으로 측정하였다.

도 2는 네 마리의 마우스에서 측정된 주입 후 시간에 따른 종양내 m-THPC, 생성물 A 및 B의 축적을 도시한 것이다. 비침입성 측정은 24시간째에 최고 비(1.3)를 갖는 정상 조직과 비교하여, 종양내 THPC의 축적이 보다 더 우수한 경향을 나타냄을 입증하였다. 주입 후, 24시간 및 48시간에서 종양 및 근육에 직접적으로 접촉하여 수행되는 침입성 측정은 각각 2.7 및 3.0의 비를 나타내었다.

생성물 A에 대한 측정은 마우스 한마리에 약물을 투여한 후, 0.5시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간에 수행하였다. 생성물 A는 mTHPC와 비슷한 약동학적 성질을 나타내었다. mTHPC와 비교하여, 종양 조직내 최고 형광 세기가 주입 후 4시간 후에 이미 도달하였다.

생성물 B에 대한 측정은 마우스 한마리에 약물을 투여한 후, 0.5시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간에 수행하였다. 종양내 최고 형광 세기가 정맥내 주입 후 8시간에 측정되었다. mTHPC와 비교하면, 생성물 B는 완전히 다른 약동학적 성질을 보여주었다. 생성물 B의 농도는 종양내에서 mTHPC보다 훨씬 빠르게(16 시간) 증가하였다.

실시예 5

리포솜 m-THPC의 항종양 활성

Balb/c 마우스와 유전적 동계인 콜로26, 즉 비-전이 마우스 직장결장 종양 세포주를 사용하였다.

세포를, 95% 공기 및 5% CO₂, 37℃에서 10%의 열불활성 우태아 혈청, 1% 스트렙토마이신-페니실린 및 200 mM L-글루타민으로 완결된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)-1640 배지에서 단층 배양물로서 유지시켰다.

6주된 무흉선 암컷 마우스(Swiss, nu/nu)를 오른쪽 뒷발의 피하조직에 2 x 10⁶ 콜로26 세포를 접종시켰다. 2-3주 후, 종양이 직경 10 내지 13 mm에 이르면 m-THPC의 제형(0.5 mg/kg)을 정맥내 주입하였다.

다르게 명시하지 않는 한, 생성물당 그룹당 3 마리의 마우스를 각 PDT 후에 사용하였다.

a. 광역학적 치료

0.5시간, 4시간, 6시간, 72시간의 약물-광 간격(DLI)을 mTHPC, 생성물 A(리포솜 및 m-THPC) 및 생성물 B(페길화된 리포솜 및 m-THPC)로서 생성물에 대하여 사용하였다. 각각의 동물에 케타민(12.5 mg/ml)을 근육내 주입하여 마취시킨 후, 광 다이오드 레이저를 사용하여 100 mW/cm²에서 10J/cm²로 652 nm에서 광조사하였다.

b. PDT 효과의 측정

형태학적 방법

PDT 치료 후에 종양 조직의 괴사를 평가하기 위해, 에반스 블루 염료법(Evans Blue dye method)을 사용하였다.

마우스를 PDT 치료 직후, 에반스 블루(1%)를 정맥내 주입하였다(0.25 ml).

24시간 후에 마우스가 할로탄(halothan)의 과량 복용에 의해 희생되고, 종양을 제거하여 세로로 잘랐다. 도 3에 예시된 바와 같이, 전체 종양 및 종양 조각의 사진을 찍었다.

염색되지 않은 괴사 영역은 종양 손상인 것으로 간주하였다:

i. 약물-광 간격(DLI) = 0.5시간. 사용된 생성물에 관계없이 괴사가 관찰되지 않았다.

ii. 약물-광 간격(DLI) = 4시간. mTHPC-PDT로 치료된 세 마리의 마우스가 부분적인 종양 괴사를 나타내었다. 생성물 A로 치료된 두 마리의 마우스는 세 번째 마우스의 종양이 여전히 유지되는 동안에 부분적인 종양 괴사를 일으켰다. 생성물 B-PDT로 치료된 세 마리의 마우스는 종양 괴사를 입증하였다: 한 마리의 마우스에서 종양 괴사가 부분적으로 일어난 반면, 두 마리에서는 명백한 종양 괴사가 관찰되었다.

iii. 약물-광 간격(DLI) = 6시간. 6 마리의 마우스는 생성물 A에 대해 사용하였다. 생성물 A로 처리된 두 마리의 마우스의 종양에서 명백한 괴사가 인지되었고, 다른 네 마리에서는 그대로였다. 생성물 B에 대하여, 모든 마우스에서 명백한 종양 괴사가 관찰되었다. mTHPC-PDT로 치료된 두 개의 종양은 명백한 괴사를 나타내었고, 종양 중 하나는 괴사가 일어나지 않았다. 괴사를 나타내는 mTHPC-PDT 종양은 육안 관찰로 확인되었다.

비록 본 발명이 첨부된 특정 구체예와 관련하여 설명되었으나, 하기의 특허청구의 범위에서 청구된 발명의 사상 및 그 범주로부터 출발하지 않고 본 발명 분야의 통상의 지식을 가진 자들에 의해 다양하게 변화되거나 변형될 수 있음을 인식하여야 할 것이다.

Claims (37)

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31. 동결건조되고 재구성되는 경우에 안정한, 광역학적 치료를 위한 약제학적 리포솜 제형으로서,

    디팔미토일 포스파티딜 콜린, 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤, 및 이들 물질의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 인지질로 이루어진 리포솜 이중층;

    프룩토오스, 글루코오스, 및 이들 물질의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단당류; 및

    디히드로- 및 테트라히드로 포피린으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료적 유효량의 소수성 비극성 감광제를 포함하는 리포솜 제형.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 디팔미토일 포스파티딜 콜린과 상기 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤의 중량비가 10 : 1인 리포솜 제형.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 소수성 감광제가 테모포핀(temoporfin)인 리포솜 제형.
34. 제 31 항에 있어서, 인지질과 단당류의 중량비가 1 : 2 내지 1 : 12인 리포솜 제형.
35. 제 31 항에 있어서, 인지질과 단당류의 중량비가 2 : 5인 리포솜 제형.
36. 제 31 항에 있어서, 상기 감광제의 치료적 유효 농도가 0.0001 내지 0.15 퍼센트 w/v인 리포솜 제형.
37. 제 31 항에 있어서, 약제학적 투여를 위해 수성 유체로 재구성되는 리포솜 제형.

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