KR20060039451A - 광역학 치료를 위한 비극성 감광제 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비극성 포피린(porphyrin) 감광제와 하나 이상의 인지질을 포함하고, 동결건조할 필요없이 저장하여도 안전한 광역학 치료를 위한 약제학적 리포솜 제제에 관한 것이다. 리포솜 제제는 정맥내 투여에 대한 치료상 유효한 양의 감광제를 제공한다. 인지질은 페길화, 즉 인지질의 통합부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것에 의해 변경될 것이다. 형성된 리포솜은 막 안에 비극성 감광제를 포함하며 표적에 대한 비극성 감광제와 제 2 극성 물질을 결합하는데 유용하다. 제제가 단당류나 폴리알콜들의 존재를 포함할 때, 그것은 리포솜 운반체의 크기와 치료상 유효한 양의 감광제 함유량을 유지하기 위해 효율적으로 동결건조될 수 있다. 본 발명은 또한 수용성 운반체와 가공되어 형성되는 리포솜 조성물에 관한 것이다. 적합한 수용성 운반체와 가공되는 동결건조된 제제는, 또한 정맥내 투여에 유용한 리포솜을 형성할 수 있다.

리포솜, 광역학 치료, 감광제, 감광제 제제, 리포솜 제제

Description

광역학 치료를 위한 비극성 감광제 제제{NON-POLAR PHOTOSENSITIZER FORMULATIONS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY}

본 발명은 테모포핀(Temoporfin) 또는 다른 비극성 감광제들을 포함하는 리포솜 제제의 제법과, 치료에 있어서 특히 정맥내 주사로 사용하는 그들의 사용 방법에 관한 것이다.

리포솜은 수분 구역에 의해 분리되는 동심 지질 이중층으로 구성되고 약물 전달 운반체로서 광범위하게 연구되고 있는 인공적 소포이다. 그들의 구조, 화학적 조성 및 콜로이드 크기와 같은 모든 것을 제조 방법에 의해 조절할 수 있기 때문에, 리포솜은 다양하게 적용 가능한 여러 가지 성질들을 나타낸다. 가장 중요한 성질들은, 20 ㎚에서 10 ㎛ 에 이르는 범위 내에서 어느 정도 일정한 입자 크기 분배를 나타내는 콜로이드 크기, 그리고 고유막 및 표면 특징들이다.

리포솜은 여러 가지 다른 목적들을 수행할 수 있기 때문에 약물과 항원에 대한 운반자로 사용된다(Storm & Crommelin, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1, 19-31 1998). 약물로 피막화된 리포솜은 대사되는 효소에 접근할 수 없다. 역으로, 신체의 구성요소들은(적혈구 또는 주입 지점의 조직과 같은) 약물의 최대 용량에 직접적으로 노출되지 않는다. 약물 활성의 지속시간은 리포솜에 의해 연장될 수 있는데, 왜냐하면 신체 내에서 약물의 방출을 느리게 하기 때문이다. 리포솜은 방향 잠재력을 가지는데 그것은 표적의 선택이 온몸의 약물의 분포를 변화시킨다는 것을 의미한다. 세포는 세포내이입 또는 포식작용 메커니즘을 사용하여 세포질 내에서 리포솜을 흡수한다. 또한, 리포솜은 약물이 분해(예를 들어, 대사 분해)되는 것을 방지할 수 있다. 비록 가끔은 성공적이지만, 리포솜은 한계를 가지고 있다. 리포솜은 병든 조직에 약물을 전달할 뿐만 아니라 간, 지라, 신장 및 망상내피 시스템에 빠르게 침투하여 순환하는 동안에 약물을 누출한다(Harris & Chess, Nature, March 2003, 2, 214-221).

페길화(pegylation)는 이러한 결점들을 극복할 수 있는 대체 방법이다. 첫째, 페길화는 약물 레벨이 좀더 긴 시간 주기 동안 적정약물 농도 내에서 유지되고 더 작고, 더 활성을 가지며, 및/또는 깨끗하게 분해되기가 더 쉽게 점진적으로 분해하는 긴 순환 모이어티와 같은 약물을 제공한다. 둘째, 그것은 마이크로입자 또는 큰 거대분자를 포함하는 긴 순환 약물이 영향을 받는 혈관계 또는 수용체 발현과 병리부위에서 천천히 축적되도록 할 수 있고 그 영역에서의 약물 전달을 개선 또는 강화시킨다. 셋째, 그것은 최소한의 혈액 흐름 또는 표적 항원의 낮은 농도와 함께 병리 영역에 도달하기로 되어있는 그들이 표적으로 하는 약물과 약물 운반체에 대한 더 나은 목표 효과를 달성하는데 도움을 줄 수 있다. 페길화의 장점은 전형적으로 안정성의 증가(온도, pH, 용매, 등), 면역원성과 항원성의 급격한 감소, 프로테아제에 대한 저항, 효소활성의 유지 및 용해도의 증가, 그외 다른 특징들 중에서, 생성물 액체 안정성의 증가 및 초조-유발 응집의 감소라는 결과를 보여 준다는 것이다.

폴리(에틸렌 글리콜)-링크된 지질(PEG-지질) 또는 강글리오시드와 같은 이중층 친화성 종을 포함하는 리포솜 막은 스텔스 리포솜(stealth liposomes)을 제조하는데 사용된다(Papahadjopoulos et al., PNAS, 88, 11460-4 1991). 스텔스 리포솜은 혈액순환에서 상대적으로 긴 반감기를 가지며 생체 내에서 변경된 생분배(biodistribution)를 보여준다. Vaage 등은(Int. J. of Cancer 51, 942-8, 1992) 독소루비신의 스텔스 리포솜을 제조하고, 근착시키고 잘 확립된 자라는 일차(primary) 마우스 암종을 처리하고 내적 유방암 이식물로부터 동시적인 전이의 발생을 방해하기 위해 사용하였다. 그들은 독소루비신 제제의 스텔스 리포솜의 긴 순환 시간은 그것의 뛰어난 치료 효과를 설명한다는 결론을 내렸다. 효과적으로 입체적 안정화된 리포솜의 이중층 내에서 MPEG-유도된(페길화된) 지질의 존재는 플라즈마 단백질과의 상호작용에 대한 입체적 장벽과 빠른 혈관내 불안정화/파열과 전형적인 리포솜의 정맥내 주입 투여 후에 나타나는 RES 청소를 초래하는 셀 표면 수용체를 제공한다. 결과적으로, 페길화된 리포솜은 연장된 순환 반감기를 가지며, 그리고 어떠한 피막화된 약제의 약동학은 포획된 약물의 그것들보다는 피포소멀 운반체의 그것들을 따르도록 변경된다(Stewart et al., J. Clin. Oncol. 16, 683-691, 1998). 왜냐하면 페길화된 리포솜의 암 국소화의 메커니즘은 상기 암 내부의 새는 혈관을 통한 혈관밖 유출에 의한 것이고(Northfelt et al., J. Clin. Oncol. 16, 2445-2451, 1998; Muggia et al., J. Clin. Oncol. 15, 987-993, 1997), 연장된 순환은 상기 암 혈관을 통한 페길화된 리포솜에 의해 만들어진 경로 들의 전체 수가 증가하는 것에 의해 상기 암 내부로의 축적을 도와주기 때문이다.

광역학적 치료(PDT)는 다양한 의학적 적용에 사용하기 위해 연구되는 새로운 기술 중 가장 장래성이 있으며 암세포의 파괴를 위해 높이 인정된 치료법으로써 잘 알려져 있다("Pharmaceutical development and medical applications of porphrin-type macrocycles", T.D. Mody, J. Porphyrins Phthalocyanines, 4, 362-367 2000). PDT의 다른 중요한 적용은 피부, 치아, 화농, 위, 창자, 생식기 및 다른 감염을 포함하는 병원성 미생물에 기인하는 감염병의 치료이다.

감염병의 치료에 있어서 항상 문제가 되는 것은 병의 치료에 대하여 사용하는 약제의 특이성이 없고, 결과적으로 환자는 치료로부터 새로운 일련의 병들을 얻는다.

다양한 형태의 병들의 치료에 대한 PDT의 사용은 감광제의 내재적 특성 때문에 제한된다. 이러한 것들은 그들의 높은 가격, 숙주생물 내에서 연장되는 잔류, 실질적인 피부 광 독성, 배경 독성, 생리 용액 내에서의 낮은 용해도(혈전 색전성 사고를 일으킬 수 있듯이 혈관 내 투여에 대한 그것의 유용성을 감소시킨다), 및 낮은 표적 효율을 포함한다. 이러한 단점들은 극단적인 고용량의 감광제의 투여를 유도하여, 손상 받지 않은 조직들 내의 감광제의 축적과 손상 받지 않은 부위에 동반하는 위험의 영향을 끼칠 가능성을 크게 증가시킨다.

감광제의 특이성과 PDT의 효율을 증가시키기 위한 가능성 있는 접근방법 중의 하나는 리간드-벡터와 감광제를 짝짓는 것이며, 그리고 그것은 표적세포의 표면상의 수용체에 특이성을 가지고 결합한다. 표적세포에 의해 확인된 수많은 자연적 및 합성 분자들은 벡터와 같이 사용될 수 있다. 이러한 접근은 지금 암의 치료를 위한 새로운 세대의 감광제를 디자인하는데 쓰이고 있다("Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy" E.D. Sternberg, D, Dolphin, C. Brueckner, Tetrahedron, 54, 4151-4202 1998).

암세포에 대한 표적 감광제에 의한 암 선택성을 증가시키기 위한 다른 접근방법은 리포솜, 예를 들어, 트랜스퍼린-짝지어진 리포솜(transferrin-conjugated liposomes)을 사용하는 것이다(Derycke & DeWitte, Int. J. Oncology 20, 181-187, 2002). 짝지어지지 않은 리포솜은 때때로 쉽게 세망내피계에 의해 인지되고 제거되기 때문에 페길화된 리포솜이 사용된다(Woodle & Lasic, Sterically stabilized liposomes, Biochim Biophys Acta 1113, 171-199, 1992; Dass et al., Enhanced anticancer therapy mediated by specialized liposomes. J Pharm Pharmacol 49, 972-975, 1997).

암과 다른 병들의 치료에 있어서 광역적 치료의 적용은 신속히 증가하는 추세이기 때문에, 새로운 감광제 제제에 대한 요구도 점점 커지고 있다. 이러한 새로운 감광제 제제는 좀더 안정되고, 제조하거나 취급하기 쉬울 것을 필요로 한다. 또한, 특별히 더욱 소수성인 비극성 감광제는 효율적이고 선택적인 방법으로 조직을 표적으로 할 수 있어야 한다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 광역학 치료(PDT)에 사용하기 위한 개선된 감광제 제제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 같은 운반체를 사용하여 비극성과 극성 물질들이 모두 전달될 수 있는 리포솜 막 안에 비극성 감광제를 혼합하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동결건조 단계 동안 동해방지제와 같은 단당류 또는 폴리알코올을 가하여 혼합된 비극성 감광제로 구성된 리포솜의 구조와 크기를 보전하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 개선된 약동학적 성질을 가지는 감광제 제제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 PDT의 효능을 증가시킬 수 있도록 세포막을 통한 비극성 감광제의 운반을 개선하기 위한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 비극성 포피린(porphyrin) 감광제와 하나 이상의 인지질을 포함하고, 동결건조할 필요없이 저장하여도 안전한 광역학 치료를 위한 약제학적 리포솜 제제에 관한 것이다. 리포솜 제제는 정맥내 투여에 대한 감광제의 치료상 유효한 양을 제공한다. 인지질은 페길화, 즉 인지질의 통합부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것에 의해 변경될 것이다. 형성된 리포솜은 막 안에 비극성 감광제를 포함하며 비극성 감광제와 제 2 극성 물질의 결합된 약물 표적화에 유용하다. 제제는 단당류나 폴리알콜들의 존재를 포함하고, 그것은 리포솜 운반체의 크기와 치료상 유효한 양의 감광제 함유량을 유지하기 위해 효율적으로 동결건조될 수 있다. 본 발명은 또한 수용성 운반체와 가공되어 형성되는 리포솜 조성물에 관한 것이다. 적합한 수용성 운반체와 가공되는 동결건조된 제제는, 또한 정맥내 투여에 유용한 리포솜을 형성할 수 있다.

상술한 본 발명의 목적들, 특성들과 장점들은 다음의 상세한 설명과 이와 관련된 동반된 도면에 의해 명백해질 것이다.

발명의 구체예에 대한 상세한 설명

광역학 치료를 위한 약제학적 리포솜 제제는 비극성 포피린(porphyrin) 감광제와 하나 이상의 인지질을 포함하고, 하기에 서술되는 바와 같이 동결건조할 필요없이 저장하여도 안전하다. 리포솜 제제는 정맥내 투여에 대한 치료상 유효한 양의 비극성 감광제를 제공한다. 인지질은 페길화, 즉 인지질의 통합부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것에 의해 변경될 것이다. 형성된 리포솜은 막 안에 비극성 감광제를 포함하며 표적에 대한 비극성 감광제와 제 2 극성 물질을 결합하는데 유용하다.

제제는 단당류나 폴리알콜을 사용하는 동결건조 공정에 의해 유지될 수 있지만, 상당히 안정된 저장 기간을 요구하는 것은 아니다. 공정 싸이클은 감광 화합물의 막의 함량과 마찬가지로 리포솜 운반체의 크기를 유지한다.

본 발명에서의 비극성 감광제에는 잘 알려진 포피린을 기반으로 하는 화합물들이 포함된다. 본 발명의 실행에서 바람직하게 사용되는 구체적인 감광제들은 포피린 거대고리 감광제에 기반을 둔 것으로서, 듀테로포피린(deuteroporphyrin), 에티오포피린(etioporphyrin), 프로토포피린(protoporphyrin), 헤마토포피린(hematoporphyrin), 페오포바이드(pheophorbide)와 그들의 유도체, 바람직하게는 디- 및 테트라-하이드로포피린을 포함하고 640~780 나노미터의 영역에서 빛의 흡수가 최대로 나타난다.

인지질은 페길화(통합부분으로서 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는)에 의해 변경되거나 되지 않을 수 있다. 형성된 리포솜은 막 안에 비극성 감광제를 포함하며 표적에 대한 비극성 감광제와 제 2 극성 물질을 결합하는데 유용하다.

감광제 제제는 비극성 감광제 분자를 원하지 않는 세포 또는 다른 원치않는 물질을 표적으로 하게 하는데 유용하며, 적합한 광원으로 조사 후에 표적을 손상시키게 된다. 감광제 제제는 또한 감광제의 제한된 광화학 활성화의 존재 여부에 관계없이 형광 영상 방법을 사용하여 원하지 않는 세포 또는 다른 원치않는 물질에 대한 모니터를 하는데 유용하다.

본 발명의 바람직한 리포솜 제제는 비극성 감광제를 운반하는데 유용하다. 비극성 물질들은 운반체의 막 내부에서 통합되고, 그것에 의하여 쉽게 개방되는 구조가 생성되며 세포막에 직접적으로 작용하는 감광제가 유리된다. 이러한 메커니즘은 감광제를 바람직한 반응장소 중 하나인 세포막 시스템으로 직접 운반한다. 따라서 적합한 외부 광원과의 조명에 의해 효과적으로 활성화되는 감광제는 원하지 않는 세포, 조직 또는 다른 구조들을 비가역적으로 손상시킬 수 있다.

전형적으로 생성된 리포솜 제제는 운반체의 내강부분에 여러 가지 화합물들을 가두어 운반하는 것이 일반적이다. 본 발명은 비극성 및 극성 물질들이 결합된 운반이 가능한 하나의 리포솜 안에 두 개의 다른 운반 구획의 조합에 중점을 둔다. 이렇게, 막 내부에 감광제의 존재로 인해, 감광제는 치료에 있어서 유익한 효과를 가질 수 있는 약물을 포함하는 다른 물질들의 함유를 위해 유리된 상태인 리포솜 입자 내부의 내강부분을 제외한, 그들의 반응장소를 효과적으로 표적으로 한다.

또한, 글루코오스와 같은 단당류의 조합과 인지질에 붙은 감광제는 동결건조와 이당류 대신에 생리학적으로 일반적인 탄수화물을 사용한 재수화작용 동안에 리포솜의 크기를 보존하는데에 있어 매우 뛰어난 수단이다.

이러한 다양한 개념은 치료에 있어서 유익한 효과를 가지는 물질들의 추가를 가능하게 한다. 하나의 운반체 안의 막에 결합된 감광제와 둘 이상의 물질들의 조합은 표적이 되는 세포의 산소 함량에 직간접적으로 영향을 줄 수 있고, 그리고 그것은 광역학 치료의 효능에 영향을 준다. 예를 들어, 어떤 효과는 포유류의 티오레독신 환원제(thioredoxin reductase, TrxR)의 저해제와 같은 효소 활성 저해제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 따라서 단지 표적이 되는 세포의 세포질에 도달한 후에 효과가 있는 저해제는 일반적으로 항산화제와 같은 역할을 하는 Trx/TrxR을 차단할 것이다.

도 1은 리포솜 제제 mTHPC의 겔 투과 곡선을 도시한 것이다. 지질 조성물과 mTHPC 둘 모두 선택된 모든 부분에 걸쳐 같은 분포를 보여준다.

도 2는 스위스 nu/nu 마우스에 0.5 mg/kg의 mTHPC의 정맥내 주사 후, 무손상 피부와 콜로(Colo) 26 암세포를 빛 유도 형광(light-induced fluorescence, LIF)으로 측정한 주입 후 시간 함수와 생성물 A및 B가 암세포내에 축적되는 양을 도시한 것이다.

도 3은 생성물 A, B 및 mTHPC의 정맥내 주입 후 6시간의 PDT-효과를 보여준다. 마우스는 PDT 처리 후에 즉시 에반스 블루(1%)와 함께 복막내에 주사되고 24시간 후에 희생된다.

실시예 1

m-THPC를 함유한 리포솜의 제조

m-THPC(테모포핀)은 Pat. No. 4,992,257와 5,162,519에 서술된 대로 합성되었고, 여기서 참조예에 의해 구체화된다.

리포솜은 다음의 일반적인 공정에 따라 합성되었다:

비극성 감광제, 아스코빅 팔미테이트 및 인지질을 클로로포름/메탄올에 녹였다. 상기 용액을 클로로포름/메탄올 혼합물이 가스 크로마토그래피에서 더이상 검출되지 않을 때까지 회전 증발기를 사용하여 진공하에서 건조시켰다. 주입을 위한 물을 50℃의 온도에서 적어도 2시간동안 재수화된 지질 필름에 가하였다. 다음에 상기 혼합물을 100 나노미터의 최종 구멍크기를 이용한 균질화 필터 시스템을 통하여 통과시켰다. 선택적으로, 재수화된 물은 단당류 또는 폴리알코올과 함께 공급되었다. 여과액을 골라내고, 바이알에 채운 후, 선택적으로 동결건조하였다. 동결건조된 조성물은 투여전에 주입을 위해 물과 가공된다.

상기 공정을 사용하여, 준비된 리포솜 제제의 여러 가지 서로 다른 제제가 다음과 같이 준비되었다:

실시예 1a

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

페길화된 디에스테로일 포스파티딜 에타올아민 0.05~0.2

아스코빅 팔메이트 0.002~0.004

주입을 위한 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

실시예 1b

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

아스코빅 팔메이트 0.002~0.004

주입을 위한 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

실시예 1c

성분 양% w/v

mTHPC 0.05~0.15

디팔미토일 포스파티딜 콜린 0.5~2.0

디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 0.05~0.2

글루코오스 2.0~12.0

아스코빅 팔메이트 0.002~0.004

주입을 위한 물 상기 농도를 달성하기 위해 필요한 양

모든 것은 본 발명에 따르는 그들의 사용에 있어서 기능 웰(function well)을 근거로 한다.

실시예 2

리포솜 mTHPC의 물리적 및 화학적 안정성

리포솜 제제의 물리적 안정성은 광자 상호작용 분광계에 의해 입자 크기의 분포를 모니터링하여 측정된다.

리포솜 mTHPC의 안정성

저장조건 입자 크기 분포(nm)

최초 166

23℃-1달 177

23℃-4달 167

실시예 3

제제의 리포솜 이중층 사이의 mTHPC의 국소화

리포솜 제제의 겔 필터는 세파덱스 G50 컬럼(Sephadex G50 column)상에서 수행되었다. 도 1에서 도시한 바와 같이, 지질과 mTHPC는 두 조성물 사이에서의 물리적 연관성 즉, 막 이중층 내부로 mTHPC의 통합과 같은 모든 영역에 걸친같은 분포를 나타낸다. 분포는 표 1과 표 2에서 나타내는 바와 같이, 초음파 처리에 의해 리포솜 구조가 파괴된 후에도 급격하게 변화하지는 않았다.

표 1. G50 겔 필터 후의 mTHPC 회수율 표 2. G50 겔 필터 후의 지질 회수율

실시예 4

마우스에서의 약동학 성질

비전이 마우스 직장결장 암세포 라인, Balb/c 마우스와 유전적 동계인 콜로(Colo)26이 사용되었다.

세포는 95% 공기 및 5% CO₂, 37℃하에서 10%의 열활성 태아 장딴지 혈청, 1% 스트렙토마이신-페니실린 및 200 mM L-글루타민으로 구성된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)-1640 미디움 내의 단일층 컬쳐(culture)와 같이 유지되었다.

6주된 무흉선 암컷 마우스(Swiss, nu/nu)는 오른쪽 후부 발의 피하조직에 2 x 10⁶ Colo26 세포가 접종되었다. 2주 후, 암세포가 직경 10~13 mm에 이르면 m-THPC의 제제(0.5 mg/Kg)이 정맥내로 주사되었다.

비침해 LIF 측정은 세 개의 부분 조직에서 수행되었다: 피부 겉에 씌어진 암, 왼쪽 후부 발의 피부에 씌어진 일반 조직 및 약물 투여 후에 다른 시간에서 증가하는 피부. 선택된 시간 포인트에서 마우스는 희생되고 그리고 암과 일반 조직으로부터의 형광 신호는 직접 접촉하여 측정된다.

도 2는 네 마리의 마우스에서 측정된 주입 후 시간의 함수에서 암세포 내에서의 m-THPC, 생성물 A 및 B의 축적을 도시한 것이다. 비침투 측정은 24시간에서 최고의 비율(1.3)과 함께 암세포 내의 mTHPC의 축적이 일반 조직과 비교하여 더 잘된다는 경향을 나타낸다. 주입 후 24시간과 48시간에서 암과 근육에 직접적으로 접촉하여 수행되는 침투 측정은 각각 2.7 및 3.0의 비율을 나타낸다.

생성물 A에 대한 측정은 한 마리의 마우스에서 약물 투여 후 0.5시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간에서 수행되었다. 생성물 A는 mTHPC와 비슷한 약동학 성질을 나타낸다. mTHPC와 비교하여 암세포 내에서 최고의 형광 세기는 주입 후 4시간 후에 이미 도달되었다.

생성물 B에 대한 측정은 한 마리의 마우스에서 약물 투여 후 0.5시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간에서 수행되었다. 암세포 내에서 최고의 형광 세기는 정맥내 주입 후 8시간에서 측정되었다. mTHPC와 생성물 B를 비교하면 완벽히 다른 약동학 성질을 나타낸다. 생성물 B의 농도는 mTHPC보다 암세포 내에서 훨씬 빠르게(16 시간) 증가한다.

실시예 5

리포솜 m-THPC의 항암효과

비전이 마우스 직장결장 암세포 라인, Balb/c 마우스와 유전적 동계인 콜로(Colo)26이 사용되었다.

세포는 95% 공기 및 5% CO₂, 37℃하에서 10%의 열활성 태아 장딴지 혈청, 1% 스트렙토마이신-페니실린 및 200 mM L-글루타민으로 구성된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)-1640 미디움 내의 단일층 컬쳐(culture)와 같이 유지되었다.

6주된 무흉선 암컷 마우스(Swiss, nu/nu)는 오른쪽 후부 발의 피하조직에 2 x 10⁶ Colo26 세포가 접종되었다. 2-3주 후, 암세포는 직경 5~7 mm에 이르면 m-THPC의 제제(0.5 mg/Kg)이 정맥내로 주사되었다.

나타내어지지는 않았지만, 생성물당 그룹당 3 마리의 마우스가 각 PDT 뒤에 사용되었다.

a. 광역학 치료

0.5시간, 4시간, 6시간, 72시간의 약물-빛 간격(DLI)이 mTHPC, 생성물 A(리포솜 및 m-THPC) 및 생성물 B(페길화된 리포솜 및 m-THPC)와 같은 생성물에 대하여 사용되었다. 각각의 동물은 케타민(12.5 mg/ml)의 근육내 주입에 의해 마취되고, 다음에 빛 다이오드 레이저를 사용하여 100 mW/cm²에서 10J/cm²과 652 nm에서 방사선 조사된다.

b. PDT 효과의 측정

형태학적 방법

PDT 치료 후에 암세포의 괴사를 측정하기 위해, 에반스 블루 염료 방법을 사용하였다.

마우스는 PDT 치료 후에 즉시 정맥내에 에반스 블루(1%)가 주입(0.25 ml)된다.

24시간 후에 마우스는 할로탄(halothan)의 과량 복용에 의해 희생되었고, 암은 제거되어 세로로 잘라진다. 도 3에서 예시한 바와 같이, 전체 암의 사진들과 암 슬라이스가 얻어졌다.

흠이 없는 괴저성 영역은 암이 손상된 것으로 여겨진다:

i. 약물-빛 간격(DLI) = 0.5시간, 괴사는 사용한 생성물에 관계없이 관찰되지 않았다.

ii. 약물-빛 간격(DLI) = 4시간. mTHPC-PDT로 치료된 세 마리의 마우스가 부분적 암 괴사를 나타내었다. 생성물 A로 치료된 두 마리의 마우스는 세 번째 마우스의 암이 여전히 유지되는 동안에 부분적인 암 괴사를 일으킨다. 생성물 B-PDT로 치료된 세 마리의 마우스는 암 괴사를 나타낸다: 한 마리의 마우스에서 암 괴사가 부분적으로 일어나는 동안 두 마리에서는 명확한 암 괴사가 관찰된다.

iii. 약물-빛 간격(DLI) = 6시간; 6 마리의 마우스가 생성물 A에 대해 사용되었다. 명확한 괴사가 생성물 A로 치료된 두 마리의 마우스의 암에서 인지되었고 다른 네 마리에서는 그대로였다. 생성물 B에 대하여, 모든 마우스에서 명확한 암 괴사가 관찰되었다. mTHPC-PDT로 치료된 두 개의 암은 명확한 괴사를 나타내었고, 하나의 암은 괴사가 일어나지 않았다. 괴사를 나타내는 mTHPC-PDT 암들은 육안 관찰에 의해 확인되었다.

비록 본 발명이 첨부된 특정 구체예와 관련하여 설명되었으나, 하기의 특허청구범위에서 청구된 발명의 사상 및 그 영역을 이탈하지 않으면서 본 발명 분야의 통상의 지식을 가진 자들에 의해 다양하게 변화되거나 변경될 수 있음을 인식하여야할 것이다.

Claims (16)

1. 인지질로 실질적으로 이루어진 리포솜 이중층 및 치료상 유효한 양의 비극성 감광제를 포함하는 광역학 치료(photodynamic therapy)를 위한 약제학적 리포솜 제제.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 인지질은 디팔미토일 포스파티딜 콜린, 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤, 폴리(에틸렌 글리콜)이 링크된 인지질 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택된 리포솜 제제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 감광제는 포피린 거대고리 감광제(porphyrin macrocycle photosensitizer)인 리포솜 제제.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 포피린 거대고리 감광제는 듀테로포피린(deuteroporphyrin), 에티오포피린(etioporphyrin), 프로토포피린(protoporphyrin), 헤마토포피린(hematoporphyrin), 페오포바이드(pheophorbide) 및 그들의 디- 및 테트라-하이드로포피린 유도체들로 이루어지는 군으로부터 선택된 리포솜 제제.
5. 제 1 항에 있어서, 동결건조되고, 하나 이상의 단당류 또는 폴리알코올을 더 포함하고, 그리고 동결건조된 제제는 적합한 수용성 운반체가 부가되고 상기 리포솜 이중층 안에 상기 치료상 유효한 양의 비극성 감광제를 포함하는 복수의 리포솜을 형성하는 리포솜 제제.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 단당류는 글루코오스 및 프락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 리포솜 제제.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 폴리알코올은 이노시톨 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택된 리포솜 제제.
8. 제 5 항에 있어서, 단당류와 인지질의 농도비는 1 : 2 ~ 1 : 12인 리포솜 제제.
9. 제 5 항에 있어서, 폴리알코올과 인지질의 농도비는 1 : 2 ~ 1 : 12인 리포솜 제제.
10. 제 5 항에 있어서, 약제학적 투여를 위해 수용성 액체와 재구성되는 리포솜 제제.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 감광제의 치료상 유효한 농도는 0.0001 ~ 0.15 퍼센 트 w/v인 리포솜 제제.
12. 제 5 항에 있어서, 상기 감광제의 치료상 유효한 농도는 0.0001 ~ 0.15 퍼센트 w/v인 리포솜 제제.
13. 제 1 항에 있어서, 부틸화된 히드록시톨루엔, 아스코빅 팔미테이트 및 상기 두 물질의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구성요소를 더 포함하는 리포솜 제제.
14. 제 5 항에 있어서, 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 아스코빅 팔미테이트(ascorbic palmitate) 및 이러한 두 물질들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구성요소를 더 포함하는 리포솜 제제.
15. 제 1 항에 있어서, 상기 제제는, 특히 극성이고, 미리 선택된 치료에 있어서 유익한 효과를 가지는데 적합한, 적어도 하나의 부가적인 약제학적 활성 물질을 더 포함하는 리포솜 제제.
16. 제 5 항에 있어서, 상기 제제는, 특히 극성이고, 미리 선택된 치료에 있어서 유익한 효과를 가지는데 적합한, 적어도 하나의 부가적인 약제학적 활성 물질을 더 포함하는 리포솜 제제.

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