KR100881137B1 - 신규 돼지 페로몬 성 화합물과 그 제조방법 및 발정 유도용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아마이드계 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 돼지의 발정 유도용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 m=1, X=CO, Y=CO 또는 CH₂, R₁=R₂=H이고, R₃=알릴 또는 피리딘카보닐기이다.

본 발명의 페로몬성 냄새물질은 합성이 용이하므로 이를 유효성분으로 함유하는 발정 유도용 조성물은 수급이 안정적이고 경제적으로 돼지의 발정을 동기화하여 번식효율을 향상시킬 뿐만 아니라, 노동력을 감소시킴으로써 양돈 경영의 효율성을 높일 수 있다.

아마이드계 화합물, 우레아계 화합물, 돼지, 번식조절, 페로몬성 물질, 발정 동기화.

Description

신규 돼지 페로몬 성 화합물과 그 제조방법 및 발정 유도용 조성물{New Pig pheromonal compounds, their preparation method and a composite for estrus induction}

본 발명은 신규한 돼지 페로몬성 물질 및 이를 유효성분으로 함유하는 돼지 의 발정 유도용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지의 발정 동기화를 조절하기 위한 아마이드계 화합물과 우레아계 화합물, 그 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하고 돼지의 발정 동기화를 조절하여 번식 효율을 향상시킬 수 있는 돼지의 발정 유도용 조성물에 관한 것이다.

오래 전부터 지금에 이르기까지 양돈 산업에서 번식 조절 방법으로 인공수정 방법이 보편적으로 이용되고 있다. 근래에는 더 나아가 후대의 성별을 조절하여 번식을 조절하고자 특정 항체를 이용하여 정액 중, X와 Y 정자 세포를 분리하는 방법 및 초음파를 이용하여 실질적인 임신 여부를 진단하는 방법도 이용하고 있다. 또한, 정액의 장기간 보관을 위한 수정란 동결방법의 개선 및 형질전환을 위한복제 기술 등이 돼지의 번식을 관리하고 조절하는데 활용되고 있다.

번식 효율을 개선하기 위하여 장기적인 목적으로 발정과는 별개로 일정량의 정액으로 정기적인 교배에 활용할 수 있는 프로토콜을 개발하는 연구가 진행되어 왔다. 이러한 맥락에서 돼지의 발정을 유도하기 위하여 성선자극호르몬(GnRH)이나 황체 호르몬을 사용하기도 하였으며, PMSG(Prenant Mares Serum Gonadotropin)와 황체형성호르몬(LH)이 조합된(eCG 및 hCG 혼합물) PG600 (Internert)을 사용하여 미경산돈의 첫 발정을 유도하고 모돈의 재귀 발정일을 단축시키는데 이용하고 있다. 황체 호로몬인 Matrix (Regumate)는 지금도 많이 사용되고 있다. 이외에도, Altrenogest(Regumate 또는 17α-allyl-17β-hydroxyestra-4, 19,11-trien-3-one)을 사료에 혼합하여 투여하거나 돼지 페로몬 스프래이(SOA: Sex odor aerosol; Intervert; Millsboro, DE 19966. Holland.)를 돼지의 비경 주위에 분사하여 발정을 유도하는 등, 발정 동기화를 위한 다양한 기술들이 사용되고 있다.

상품화된 SOA(PBS: The leader in animal health & nutrition, PBS Animal Health, PO Box 9101, Canton, Ohio 44711-9101. USA.)를 사용한 결과, 돼지의 재생산 효율이 개선되었다는 연구가 보고된 바(Shrestha 등, 2001) 있다. 그러나, 돼지 페로몬 스프래이(Intervert)의 유효물질이 천연물질인 5α-androst-16-en-3-one이며 Altrenogest 등은 모두 steroid계 화합물로서 합성이 난해하여 수급이 용이하지 못하다. 따라서, 효과적으로 돼지의 발정을 유도하면서도 합성이 용이하여 수급이 안정적이고 경제적인 돼지발정 유도제가 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 돼지의 발정 동기화에 효과적인 아마이드계 화합물과 우레아계 화합물 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아마이드계 화합물 또는 우레아계 화합물을 유효성분으로 함유함으로써 미경산돈의 발정 동기화를 조절하고 번식효율을 향상시킬 수 있는 페로몬 성 번식관리 및 조절용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 페로몬성 냄새물질은 하기 화학식 1 로 표시되는 아마이드계 화합물인 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

m=1, X=CO, Y=CO 또는 CH₂, R₁=R₂=H이고, R₃=알릴 또는 피리딘카보닐.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서 m, n은 각각 0~5이고, Z는 O 또는 S이다. R₄는 2-테트라하이드로퓨릴, 2-퓨라닐, 페닐, 메톡시페닐, 톨루일, 3,5-디메틸페닐, 3-플로로-6-메틸페닐 또는 피리딜이며, R₆는 메톡시페닐, 디메톡시페닐, 디메틸페닐, 에틸페닐, 3-클로로-6-메톡시페닐, 4-클로로-2-메틸페닐, 3-크롤로-6-메틸페닐, 플로로페닐, 클로로페닐, 2,5-디플로로페닐 또는 피리딜이고, R₅와 R₇은 각각 H 또는 메틸기이다.

본 발명자들은 컴퓨터를 이용하여 생물활성 분자를 설계하는 방법(CAMD: Computer-assisted molecular design) 중, Receptor based approach 방법인 Virtual docking Analysis에 관한 모델을 유도하여 돼지의 번식관리 및 조절 수단으로 양돈산업의 경영을 합리적으로 가능하게 할 수 있는 새로운 형태의 페로몬성 물질을 개발하고자 상기 화학식 1의 아마이드계 화합물 및 상기 화학식 2의 우레아계 화합물을 설계하고 그 효용성을 검증하였다.

본 발명에 따른 화학식 1의 아미드계 화합물 및 화학식 2의 우레아계 화합물들은 돼지의 발정동기화 효율이 우수할 뿐 아니라, 합성이 용이하므로 수급이 안정적이며 경제적으로 생산이 가능하다. 따라서 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 발정동기화 조절용 약학적 조성물은 미경산돈과 번식효율을 향상시킬 뿐만 아니라, 노동력을 감소시킴으로써 양돈 경영의 효율성을 높일 수 있다.

이하, 본 발명에 의한 화합물을 설계하는 과정에 대하여 보다 구체적으로 설명한다.

돼지 웅성 페로몬(androstenone)의 수용체로 알려진 Salivary lipocaline (PDB code, 1GM6)에 대한 다양한 화합물과의 분자 동역학적 모의실험으로 virtual screening을 실시하고 검토하였다. 즉, SYBYL 프로그램(Sybyl, Ver. 7.3, Tripos Associates, Inc., 1699 S. Hanley Rd., Suite 303, St. Louis, MO. 63144-2913, USA.) 중, 버츄얼 도킹 프로그램인 FlexX와 Molegro 2007 (Ver. 2.0.0)을 이용하여 androstenol 및 androsenone과 수용체 lipocaline (PDB code 1GM6)과의 Virtual Docking 실험을 수행하였다. 또한, FlexX로 automated docking ligand를 이 위치에서 Molecular mechanics (MM)을 이용한 최적화를 수행하여 잔기와의 restrain을 제거하였다. 이때 Ca 원자들은 constrain을 주었으며 곁사슬은 ligand 중심을 변경 10Å으로 최적화(minimization)를 수행하여 ligand와의 restriction을 제거하였다.

도 1과 같이 수용체 활성부위(Active Site)는 Val45, Ile48, Phe58, Phe60, Ala73, Cys75, Val85, Tyr87, Phe93, Leu106, Leu108, Glu121 및 Tyr123 등, 소수성 성질의 아미노산 잔기들로 이루어져 있다. 구조적인 특징 외에 수용체 활성부위 내부에 글리세롤이 결합되어 있으며 활성부위로 통하는 입구가 매우 작은 입체구조로 되어 있어 ligand가 결합하기 어려운 형태적 특징을 갖는다. 이러한 단백질에 ligand를 결합하기 위해서는 cavity의 형태 변화를 고려하여야만 한다. 즉, 이러한 구조는 ligand와 결합 전에는 입구가 열려있으며, ligand가 결합된 후, plapping effect에 의해서 입구가 닫히는 것으로 추측할 수 있다.

Ligand가 결합하는 활성부위 입구 주변에 존재하는 loop들의 움직임을 알아보기 위하여 loop들을 조사하였다. Cavity 주위에는 2개의 loop들이 존재하며 이는 도 1에 도시되어 있다. Loop 1은 활성부위의 위부분에 2개의 베타 sheet를 연결하고 있는 부분으로서 Tyr87, Try88 및 Gly89로 아미노산이 배열되어 있다. 또한 Loop 2는 Glu37, Asn38, Gly39, Ser40, Met41, Arg42 및 Val43을 포함하는 Asp30~Val43 구성 영역으로서 두 loop가 활성부위 입구의 역할을 하는 것으로 보여 진다. 두 loop의 유연성(flexibility)은 3개의 아미노산들로 구성되어진 loop 1보다 13개의 아미노산들로 구성되어진 loop 2의 유연성(flexibility)이 더 유리할 것으로 예상된다. 이러한 사실을 근거로 하여 이들 loop 1 및 loop 2의 형태변화를 Sybyl module 프로그램을 이용하여 예측하였다.

현재까지는 실험적으로 이 수용체의 활성부위에 ligand가 결합되어 있는 결정구조가 얻어지지 않았으므로 Sybyl의 FlexX 프로그램을 이용하여 돼지 웅성 페로몬으로 알려진 5-알파-안드로스트-16-엔-3-온(5α-androst-16-en-3-one)(도 2의 왼쪽)과 5-알파-안드로스트-16-엔-3-올(5α-androst-16-en-3-ol)(도 2의 오른쪽)을 도킹시켜 이들 페로몬 약물들의 binding key residues를 검토하였다.

도 2의 화학 구조식과 Silvia Spinelli 등(Eur . J. Biochem . 269, 2449~ 2456 (2002))에 의해 알려진 lipocaline 활성부위에 대한 정보에서 확인할 수 있듯이 활성부위를 구성하고 있는 소수성의 아미노산 잔기 Phe50, Phe60, Phe93, Val43 및 Leu103으로 구성되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 활성부위의 하단부에는 아미노산 Glu121이 위치하고 있어 리간드 화합물과 protonation을 통하여 구조적으로 강력한 수소결합을 형성할 수 있을 것으로 예상된다.

5알파-안드로스트-16-엔-3-올(이하 "-ol"이라 한다)의 경우에는 3-위치의 OH기와 Glu121의 카르복실기와 수소결합을 형성하고 있음을 알 수 있었다. 한편, 5알파-안드로스트-16-엔-3-온(이하 "-one"이라 한다)의 경우에는 Glu121의 카르복실기와 구조상 카르보닐기간의 정전기적인 반발로 인하여 3-위치의 카르보닐기가 "- ol"의 경우와는 반대로 활성부위의 위쪽으로 배향하고 리간드의 탄소고리가 반응점 안쪽으로 배향되어 있었다. 또한 "-ol"과 "-one"의 FlexX binding score가 각각 -6.78 kcal/mol 및 -4.5 kcal/mol로서 "-ol"이 훨씬 더 유리한 결합양상을 가짐을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 활성자리의 결합 유발효과는 반응점 하단부의 Glu121와 수소결합 혹은 정전기적 상호작용과 반응점을 구성하고 있는 잔기들과의 소수성 상호작용임을 알 수 있었으며 이러한 유발효과들은 새로운 ligand를 찾는데 기준점이 될 것이라 생각된다.

활성부위의 반응점에 결합하는 "-ol"과 "-one"의 결합양상를 기준으로 Sybyl의 unity program을 사용하여 Tyr87을 수소결합 받게와 주게, Arg62, Cys75 및 Val74은 RD(수용체주게), Glu121은 LA(골격받게)로 query를 정하였다.

기질 분자의 설계는 Sung 등(Reprod. Dev. Biol. 30(1): 13~19 (2006)) 그리고 Florence Vincent 등(Eur. J. biochem. 271, 3822~3842 (2004))이 제시한 화합물 중, 도 3에 나타낸 화합물에서 하이드로퓨란 및 NCC(O)N을 기본 골격으로 하는 화합물들을 "Chembridge product library" 와 "Tripos LeadQuest"를 대상으로 선택항목들을 선정하여 만족하는 화합물를 선별하였다.

상기의 선별과정을 통하여 선별항목들을 만족하는 화합물을 선택하였고 이들 화합물들을 대상으로 virtual docking analysis를 실시하였다. 또한 ligand based 2D-QSAR 및 3D-QSAR analysis을 통하여 얻어진 결과들로부터 우수한 활성을 나타 낼 것으로 예측되는 후보 화합물들(Sung 등, Reprod. Dev. Biol. 30(1): 13~19 (2006))도 molegro 2007(Ver. 2.0.0) 프로그램으로 virtual docking analysis를 동 시에 실시하였다.

Lipocaline(1GM6) 활성부위 분자표면 cavity 부피는 211.9ų, 표면은 285Ų 이고 확장 Van der Waals cavity 부피는 64ų, 표면은 154.88Ų이었다. 선별되어진 620개의 리간드 화합물들을 확장 Van der Waals cavity에 Virtual docking 실험을 실시하였다. 그 결과, RS (Rerank Score)가 -60이하의 값을 갖는 리간드 화합물 244개가 선별되었으며 또한 분자표면 cavity에 대해 Virtual docking 실험을 통해 AF (Affinity KJ/mol)값이 -18.0 이하의 안정한 값을 갖는 총 30개의 화합물이 선별되었다. 이렇게 선별된 화합물들은 선택적인 결합 친화력을 갖을 것으로 예상할 수 있고 이를 통하여 높은 발정유도 효과를 나타낼 것으로 예측할 수 있다.

상기 방법에 의해 선별된 화합물들의 구조와 도킹시험을 통해 얻어진 결과를 표 1과 표 2에 나타내었으며, 표 1은 화학식 1의 화합물에 대하여 표 2는 화학식 2의 화합물들에 대하여 정리한 것이다. 도 4는 그 중 가장 생리활성이 높을 것으로 예측되는 화합물 22에 대한 도킹결과를 보여주는 모형도이다. 표 1과 표 2의 데이터로부터 화학식 1 및 화학식 2의 골격 구조 중 m, n, X, Y, Z 및 R₁~R₇에 대한 범위를 결정하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이 상기 화합물은 salivary lipocaline(PDB code 1GM6)의 활성 부위 내에서 유연성이 확보되어 flexible하고 강력한 protonation 아미노산 잔기 Glu121 카르복실기와 2.406Å내에서 수소결합을 형성하고, 화합물의 구형 중심(sphere center)으로부터 7Å 범위에서 아미노산 잔기 Phe58, Phe93, Leu108 및 Val143과 소수성 상호작용으로 결합함을 알 수 있다.

본 발명에 의한 화합물들은 하기 반응식 1 내지 반응식 3의 방법을 적용하여 제조할 수 있다. 실시예에는 각 반응식에 대하여 1개의 물질만의 제조만을 예시하였으나, 반응식 1, 반응식 2 및 반응식 3의 일반적인 제조방법을 응용하여 반응물로서 적절한 유도체를 사용할 경우, 다양한 아미드계 화합물 및 우레아계 화합물을 합성할 수 있다.

즉, 반응식 1의 방법에 의해 제조예 1의 알릴아민 대신 N-메틸 알릴아민을, 및/또는 테트라하이드로퓨릴아민 대신 N-메틸 테트라하이드로퓨릴아민을 사용하여 반응시키는 것에 의하여 표 1의 화합물 2~화합물 4를 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 (1) C1~C4의 저급알킬옥살릴크로라이드와 아민의 반응에 의해 C1~C4의 저급알킬옥살릴아마이드(B)를 제조하는 단계; (2) 상기 저급알킬옥살릴아마이드(B)와 테트라하이드로퓨릴아민의 반응에 의해 옥살릴 아마이드(I)을 제조하는 단계;에 의해 하기 (I)의 아미드계 화합물을 제조할 수 있다.

이때, m=0~5; R=C1~C4의 저급 알킬, 페닐, 클로로페닐 또는 톨루일 R₁ 및 R₂는 각각 H 또는 메틸기이다.

마찬가지로, 반응식 2의 제조방법에 의하여 제조예 2의 반응물 대신 적절한 치환기가 도입된 반응물을 반응시키는 것에 의하여 X 및 Y의 치환기가 각각 카보닐기(C=O), 메틸렌기(CH₂) 또는 CHCH₃기로 각각 치환된 화합물들(예: 화합물 5~화합물 17 등) 등을 제조할 수 있다. 즉, (1) N-(t-부톡시카보닐)글라이신과 테트라하이드로퍼퓨릴아민의 축합반응에 의해 화합물 (C)를 제조하는 단계; (2) 화합물 산 존재하에서의 (C)의 가수분해에 의해 암모늄 염(D)를 제조하는 단계; (3) 상기 암모늄 염(D)과 R₃-Y의 반응에 의해 아마이드 (II)를 제조하는 단계; 에 의해 하기 (I)의 아미드계 화합물을 제조할 수 있다.

이때, m=0~5인 정수; R₁ 및 R₂은 각각 H 또는 메틸; X는 클로라이드, 브로마이드, 아세테이트, 또는 트리플로로아세테이트; Y는 플로라이드, 클로라이드, 브로마이드 또는 요오드; R₃는 알릴, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 페닐, 톨루일, 메톡시페닐, 하이드록시페닐, 클로로페닐, 브로모페닐, 나프틸, 벤질, 피리딜, 피리딘카보닐 또는 피리딘메틸기이다.

화학식 2의 화합물(예: 화합물 18~화합물 30 등)들은 제조예 3의 테트라하이드로퍼퓨릴아민 및/또는 4-에틸아닐린 대신 반응식 3의 방법에 의해 원하는 치환체 가 도입된 화합물을 얻을 수 있도록 반응물질을 선정하여 반응시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, (1) 1,1-카보닐디이미다졸과 아민 (F)의 반응에 의해 카보아미드 (E)를 제조하는 단계; (2) 카보 아미드 (E)와 아민 (G)의 반응에 의해 우레아계 화합물(III)을 제조하는 단계; 로 이루어진 하기 반응식 3에 의해 하기 (III)의 우레아계 화합물을 제조할 수 있다.

이때, m과 n은 각각 0~5인 정수; R₄는 2-테트라하이드로퓨릴, 2-퓨라닐, 페닐, 메톡시페닐, 톨루일, 3,5-디메틸페닐, 3-플로로-6-메틸페닐 또는 피리딜; R₅와 R₇은 각각 H 또는 메틸기; R₆는 메톡시페닐, 디메톡시페닐, 디메틸페닐, 에틸페닐, 3-클로로-6-메톡시페닐, 4-클로로-2-메틸페닐, 3-크롤로-6-메틸페닐, 플로로페닐, 클로로페닐, 2,5-디플로로페닐 또는 피리딜이다.

일반적인 독성발현 예측 기준을 기초로 하여 본 발명에서 제시된 후보 화합물들의 독성 예측 결과는 대부분 매우 경미할 것으로 예측되었으며 diketone 또는 amide 결합을 갖고 있는 화학식 1 화합물 보다는 urea 골격을 갖는 화학식 2의 화합물들의 설치류에 대한 독성 결과가 유리하게 나타났다.

본 발명에 의한 돼지 페로몬 성 물질인 화학식, 1 및 화학식, 2의 화합물을 사용하여 돼지의 코 끝에 분사하고 초산돈의 발정에 미치는 효과를 확인한 결과, 돼지의 품종과 무관하게 초산돈의 발정일을 유의적으로 단축시켜 발정 동기화를 유발할수 있으므로 번식돈의 번식효율 향상 및 관리비용을 절감할수 있음을 입증하였다.

실험 예는 초산돈의 발정 동기화에 대한 효과만을 예시하였으나, 동일한 작용 메카니즘에 의해 모돈의 재귀 발정일 역시 단축될 것으로 기대된다.

또한 본 발명에서는 미경산돈만을 대상으로 페로몬성 물질의 발정 동기화에 대한 효과를 검증하였으나, 소에서 분리 정제한 OBP(odorant binding protein) 단백질과 돼지에서 분리 정제한 OBP 단백질에 대하여 odorant 화합물에 대한 binding activity 결과를 분석한 결과, 특이적으로 두 종간의 활성관계가 10배 이하로 유사하였으므로(Chemical Senses (1993) 18(6) 713~721) 돼지의 발정 조절 활성을 갖는 본 발명의 페로몬성 물질이 소와 같은 다른 경제성 동물의 발정 동기화에 적용할 수 있을 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 의한 합성 페로몬 물질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 돼지의 발정동기화를 유발하여 번식효율 향상 및 관리 비용 절감에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 아마이드계 화합물 및 우레아계 화합물을 유효 성분으로 하는 조성물은 돼지의 발정 유도제로 이용될 수 있도록 약제학적 및 식품학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 즉, 그 자체 또는 약학적 또는 식품학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 주사제 및 분사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들을 경구 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 돼지의 발정 유도제로 사용하여 발정을 촉진시킬 수 있다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시 예

제조 예 1: N-알릴-N'-(테트라하이드로퓨란-2-일메틸)옥살아미드, {( N -Allyl- N' -(tetrahydrofuran-2-yl-methyl)oxalamide)} (X=Y=C=O, R ₁ =R ₂ =H, m=1) (I)의 제조.

1) 에틸 2-(알릴아미노)-2-옥소아세테이트, {ethyl 2-(allylamino)-2-oxo- acetate} (X=Y=C=O, R=CH ₂ CH ₃ , R ₂ =H) (B)의 제조.

무수 테트라하이드로퓨란 100 ml에 에틸옥살릴크로라이드 (R=CH₂CH₃,) (A) 5.0 ml(44.9 mM)을 녹인 용액에 무수 테트라하이드로퓨란 60 ml에 알릴아민 3.4 ml(45.4 mM)을 녹인 용액을 적가하고 0 ℃에서 6시간 동안 강하게 저어주었다. 혼합물을 실온에서 1시간 이상 더 저어준 다음에 여과하여 그 여액을 감압 농축하고 1N-염산 용액을 혼합한 후에 에틸아세테이트로 두 번 이상 추출하였다. 유기층을 합하여 마그네슘썰페이트로 건조하고 감압 농축하여 기름상 액체 (X=Y=C=O, R=CH₂CH₃, R₂=H) (B) 7.2 g을 얻었다.

2) N -알릴- N' -((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸)옥살아미드, { N -allyl- N' -((tetra- hydrofuran-2-yl)methyl)oxalamide} (X=Y=C=O, R ₁ =R ₂ =H, m=1) (1)의 제조.

에탄올 10 ml에 에틸 에스터 (B) (X=Y=C=O, R=CH₂CH₃, R₂=H) 1.0 g(6.36 mM)과 테트라하이드로퓨릴아민 675 mg(6.67 mM)을 녹인 용액을 8시간 동안 가열하고 환류하였다. 반응이 완결되도록 0.3 ml(2.89 mM)의 테트라하이드로퓨릴아민을 추가로 가하고 30분간 더 환류하였다. 30분 후에 반응 혼합물을 감압 농축하고 잔사를 에틸아세테이트 20 ml로 희석하였다. 에틸아세테이트 용액를 과량의 1N-염산 용액과 포화된 중탄산나트륨(NaHCO₃) 용액으로 차례로 세척하였다. 세척 후 유기층은 마그네슘썰페이트(MgSO₄)로 건조하고 감압 농축한 후, 얻은 고체를 헥산으로 세척하여 X=Y=C=O, R₁=R₂=H, m=1인 백색 고체 (I) 1.19 g(5.59 mM, 수율: 88%)을 얻었다.

¹H-NMR(δ) 1.45~2.1(m, 4H), 3.2~3.6(m, 2H), 3.65~ 3.86(q, 2H, ), 3.86~3.92(m, 2H), 3.92~4.1(m, 1H), 5.13~ 5.31(m, 2H), 5.7~5.95(m, 1H, ); LC/MS(EI), m/z(relative intensity): [M+H]⁺ (213).

제조 예 2 : N -(2-옥소-2((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸아미노)에틸)니코틴아미드, { N -(2-oxo-2-((tetrahydrofuran-2-yl)methylamino)ethyl)nicotinamide} (X=C=O, Y=CH ₂ , R ₁ =R ₂ =H, m=1) (II) (16)의 제조.

1) 삼차- 뷰틸 2-옥소-2-(( 테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸아미노 ) 에틸카바메이트 ,{ tert - butyl -2- oxo -2-(( tetrahydrofuran -2- yl)methylamino)ethylcarbamate}(X=C=O, Y= CH ₂ , R ₁ =H, m=1) (C)의 제조.

무수 N,N-dimethylformamide(DMF) 10 ml에 N-(tert-Butoxycarbonyl)glycine 1.8 g(10 mM)을 녹인 용액에 무수 DMF 20 ml에 2-(1H-benzoriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium hexafluorophosphate(HBTU) 3.8 g(10 mM), 1-hydroxybenzo- triazole(HOBt) 1.4 g(10 mM) 및 N,N-diisopropylethylamine(DIEA) 1.8 ml(12 mM)을 녹인 용액을 실온에서 천천히 적가하고 30분 동안 교반시켜 카르복실산 부분을 활성화 시켰다. 이 반응 혼합물에 무수 DMF 10 ml에 테트라하이드로퍼퓨릴아민 1.1 ml(11 mM)을 녹인 용액을 실온에서 천천히 적가하였다. 이 반응 혼합물 용액을 실온에서 12시간 이상 교반시켜 반응시키고 감압 농축하고 1N-염산 용액을 혼합한 후에 에틸아세테이트로 세 번 이상 추출하였다. 세척 후 유기층은 마그네슘썰페이트(MgSO₄)로 건조하고 감압 농축한 후 얻은 혼합물을 실리카겔 크로마토그라피를 이용하여 정제하여 고체 (C) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1) 2.4 g을 93% 수율로 얻었다. (분자량 258)

LC/MS(EI), m/z(relative intensity): [M+H]⁺ (259).

2) N -((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸)아세트아미도-2-암모니움 트리풀로로아세테이드 염, { N -((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)acetamido-2-ammonium trifluoroacetate} (D) (X=C=O, Y=CH ₂ , R ₁ =H, m=1)의 제조.

무수 메틸렌클로라이드 용액 10 ml에 중간체 (C) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1) 2.0 g (7.7 mmol)을 녹인 후, 과량의 trifluoroacetic acid(TFA) 5 ml과 소량의 물 0.1 ml를 실온에서 교반하면서 천천히 적가하였다. 반응 혼합물 용액을 실온에서 6 시간 이상 교반시켜 반응시켰다. 반응의 완결을 박층크로마토그래피(TLC)를 통하여 확인한 후, 과량의 TFA와 물은 감압 농축하여 제거하였다. 감압 농축하여 얻어진 고체를 최소량의 메틸알콜에 녹인 후 냉각된 과량의 디에틸에테르를 과량 첨가하여 흰백색의 트리플로로아세테이트 암모니움 염상태로 중간체 (D) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1)를 얻었다. 얻어진 중간체 (D) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1)는 정제과정 없이 곧바로 다음 반응에 이용하였다.

LC/MS(EI), m/z(relative intensity): [M+H]⁺ (159).

3) N -(2-옥소-2((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸아미노)에틸)니코틴아미드, { N - (2-oxo-2-((tetrahydrofuran-2-yl)methylamino)ethyl)nicotinamide} (X=C=O, Y=CH ₂ , R ₁ =R ₂ =H, m=1) (16)의 제조.

무수 메틸렌클로라이드 10 ml에 단계 2에서 얻은 중간체 (D) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1)를 넣고 디아이소프로필에틸아민 (diisopropylethylamine, DIEA) 4.2 ml(24 mM)를 천천히 아이스베스 상태에서 적가하였다. 중간체 (D) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=H, m=1)가 완전히 녹은 것을 확인 한 후, 아이스베스 상태에서 nicotinoyl chloride hydrochloride 1.4 g(8.0 mM)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물 용액을 실온에서 12시간 이상 교반시켜 반응시키고 감압 농축하고 1N-염산 용액을 혼합한 후에 에틸아세테이트로 세 번 이상 추출하였다. 세척 후 유기층은 마그네슘썰페이트(MgSO₄)로 건조하고 감압 농축한 후, 얻은 혼합물을 실리카겔 크로마토그라피를 이용하여 정제하여 고체 (16) (X=C=O, Y=CH₂, R₁=R₂=H, m=1) 2.0 g을 2 단계 80% 수율로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 400 MHz): δ 1.60~1.93(m, 4H), 3.20(dd, 1H), 3.45(dd, 1H), 3.70~3.80(m, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.37(m, 1H), 7.55(t, 1H), 8.00(bs, 1H), 8.14~8.93(m, 4H); LC/MS(EI), m/z(relative intensity): [M+H]⁺ (264).

제조 예 3: 1-(4-에틸페닐)-3-((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸)우레아, {1-(4- ethylphenyl)-3-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)urea} (Z=O, m=1, n=0, R ₅ =R ₇ =H) (III) (22)의 제조.

1)N-( 테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 )-1H- 이미다졸 -1-카보아미드{N-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)-1H-imidazole-1-carboxamide} (Z=O, R ₅ =H, m=1) (E)의 제조

무수 메틸렌클로라이드 50 ml에 1,1-카보닐디이미다졸 8.1 g(50 mM)을 녹인 용액에 무수 메틸렌클로라이드 20 ml에 테트라하이드로퍼퓨릴아민 5.2 ml(52 mM)을 녹인 용액을 0 ℃에서 천천히 적가하고 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물의 반응 정도를 박층크로마토그라피(TLC)로 확인한 후, 감압 농축하여 기름상의 액체 중간체 (E) (Z=O, R₅=H, m=1) 10.1 g을 얻었다. 매우 불안정한 중간체 화합물이므로 정제없이 다음 단계의 합성에 이용하였다.

2)1-(4-에틸페닐)-3-((테트라하이드로퓨란-2-일)메틸)우레아, {1-(4-ethylphenyl)-3-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)urea} (Z=O, R ₅ =R ₇ =H, m=1, n=0) (III) (22)의 제조

무수 메틸렌클로라이드 50 ml에 중간체 (E) (Z=O, R₅=H, m=1) 10.1 g을 녹인 용액에 무수 메틸렌클로라이드 20 ml에 4-에틸아닐린 6.2 ml(50 mM)을 녹인 용액을 0 ℃에서 천천히 적가하고 실온에서 12시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물의 반응 정도를 박층크로마토그라피(TLC)로 확인한 후, 에틸아세테이트 200 ml로 희석하였다. 에틸아세테이트 용액를 소량의 1 N 염산 수용액과 과량의 포화된 중탄산나트륨(NaHCO₃) 용액으로 차례로 세척하였다. 세척 후 유기층은 마그네슘썰페이트(MgSO₄)로 건조하고 감압 농축한 후 얻은 혼합물을 실리카겔 크로마토그라피를 이용하여 정제하여 백색의 고체 (22) (Z=O, m=1, n=0, R₅=R₇=H) 8.7 g(2단계 총수율: 70%)을 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz): δ 1.18(t, 3H), 1.60~1.98(m, 4H), 2.54(q, 2H), 3.20(dd, 1H), 3.32(dd, 1H), 3.62~3.81(m, 2H), 4.33(m, 1H), 6.05(bs, 1H), 7.22(d, 2H), 7.49(d, 2H), 8.20(bs, 1H); LC/MS(EI), m/z(relative intensity): [M+H]⁺ (249).

실험 예 1 : 미경산돈의 발정동기화 조절효율 평가

1) 시료 저장 용액의 제조

상기 제조예에서 제조한 화합물들을 상품화 된 (PBS) 제품 (SOA: Intervet, Boxmeer, Netherlands)의 경우(0.28 mg/75ml)와 동일한 농도(1.29ㅧ10^-5 M)의 수용액을 제조하여 미경산돈의 발정동기화 조절효율을 평가하였다. 즉, 제조예 1의 화합물 (1)(분자량: 214.25 amu.)의 시료 저장용액은 화합물 (I) 2.76 mg을 증류수 99 ml와 THF 1 ml를 혼합하여 제조한 용매 100 ml에 녹여 제조하였다. 마찬가지로 제조예 2 및 제조예 3의 화합물 (16) (분자량 263.29 amu)의 경우는 화합물 (16) (3.40 mg)을 그리고 화합물 (22) (분자량 248.32 amu)의 경우는 화합물 (22) (3.20 mg)을 증류수 99 ml와 THF 1 ml를 혼합하여 제조한 용매 100 ml에 녹여 제조하였다.

2) 독성 예측

상기 표 1 및 표 2에 기재된 화합물들을 대상으로 미국 연방 식품 의약국(FDA)이 규정한 설치류 발암성, Ames 돌연변이성(AM), 쥐 경구독성(LD₅₀) 등의 독성을 TOPKAT (Accelrys Inc., Web. http:/www.accelrys.com) 프로그램을 이용하여 예측하였다. 그중 RS(reraking score)값이 -75.0 이상의 값을 갖는 후보 화합물에 대한 독성 예측 결과를 표 3에 정리하였다. 표 3에서 No.는 표 1 및 표 2에 기재된 화합물의 번호를 의미한다.

일반적인 항목별 독성발현 기준으로서 설치류에 대한 발암성(RC)은 0.3 이하일 경우에는 발암 확률이 낮으나 0.7이상은 발암 확률이 높은 것으로 간주하며, Ames 돌연변이성은 0.3-0.0 사이의 값일 때 돌연변이성 발현 확률이 없는 것으로 평가한다. 또한, 잠재적 독성 발현수치는 0.3 이하일 경우에는 발현 확률이 매우 낮으나 0.7이상인 경우에는 발현확률이 매우 높은 것으로 그리고 피부 감작성은 잠재적 독성 발현수치의 기준과 동일하게 0.7이상이면 피부 감작성 발현확률이 매우 높은 것으로 평가한다.

이상의 일반적인 독성발현 예측 기준을 기초로 하여 본 발명에서 제시된 후보 화합물들의 독성 예측 결과는 대부분 매우 경미할 것으로 예측되었으며 diketone 또는 amide 결합을 갖고 있는 화학식 1 화합물 보다는 urea 골격을 갖는 화학식 2의 화합물들의 설치류에 대한 독성 결과가 유리하게 나타났다.

3) 미경산돈의 발정동기화 조절효율 평가.

전술한 페로몬성 화합물에 대한 활성 예측 결과(표 1 및 표 2)와 독성 예측 결과(표 3)를 기초로 화합물 1, 화합물 16 및 화합물 22를 선정하여 미경산돈의 발정동기화 조절 효율을 직접 평가하였다.

충남대학교 동물사육장과 충청남도 축산기술연구소에서 각각 초산돈의 발정개시에 미치는 본 발명에 의한 합성 페로몬 성 물질들의 발정효과를 검정하고 그 결과를 표 4에 기재하였다.

페로몬은 1) 시료 저장용액의 제조 방법으로 제조한 시료 저장용액을 각 처리군 당 16두의 초산돈, 총 64두에 14일간 하루에 1회씩 2초간 분무기로 암컷 돼지의 코 끝에 분사하였다. 발정조사는 시험개시 후, 60일 동안 실시하였다. 각 처리구 당 발정 발현율은 75.0~81.2%이었으며, 시험개시 시 초산돈의 체중은 108.6~ 110.5 kg 사이에 있었다.

제조예 1~ 제조예 3의 화합물 1, 화합물 16 및 화합물 22 처리구의 발정 개시일은 11.5일, 10.5일 및 12.5일로 무처리구에 비하여 27.7일 이상 발정 개시일을 단축시키는 효과를 나타내었다.

실험 예 2 : 돼지 품종별 발정동기화 조절효율 평가

제조예 1~ 제조예 3의 화합물들을 이용하여 품종 간 발정동기화에 대한 조절 효율을 조사하고, 표 5에 그 결과를 기재하였다. 본 실험의 결과는 SAS 9.1 통계 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 Student's t-test 및 분산분석(ANOVA)을 실행하였으며 분산 분석 후, 유의성이 나타나는 효과에 대하여 Duncan 다중검정을 실시하였다 (p<0.05).

모두 96두의 초산돈에 대하여, 실험예 1과 동일한 방법으로 돼지 품종에 따른 발정 개시일을 조사한 결과, 제조예 1~ 제조예 3의 합성 페르몬 화합물 처리구와 무처리구 간에는 현저한 차이가 인정되었으나 품종간에는 차이가 인정되지 않았다.

도 1은 Salivary lipocaline (PDB code, 1GM6)의 표면과 2차구조를 보여주는 모식도.

도 2는 5알파-안드로스트-16-엔-3-온(왼쪽) 및 5알파-안드로스-16-엔-3-올(오른쪽)의 구조를 나타내는 화학식.

도 3은 기질분자 설계의 모체 화합물의 구조를 나타내는 화학식.

도 4는 본 발명의 일예에 의한 돼지 페로몬성 물질 (1-(4-ethyl-2-methyl- phenyl)-3-((tetrahydrofuran-2-yl)methyl)urea)의 Salivary lipocaline (PDB code 1GM6)대한 도킹결과를 보여주는 모식도.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미드계 화합물.

   [화학식 1]

   

   상기 화학식 1에서

   m=1, X=CO, Y=CO 또는 CH₂, R₁=R₂=H이고, R₃=알릴 또는 피리딘카보닐.
2. 삭제
3. (1) C1~C4의 저급알킬옥살릴크로라이드와 아민의 반응에 의해 C1~C4의 저급알킬옥살릴아마이드(B)를 제조하는 단계;

   (2) 상기 저급알킬옥살릴아마이드(B)와 테트라하이드로퓨릴아민의 반응에 의해 옥살릴 아마이드(I)을 제조하는 단계;

   로 이루어진 하기 반응식 1에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 하기 (I)의 아미드계 화합물의 제조 방법.

   [반응식 1]

   

   m=1; R=C1~C4의 저급 알킬, 페닐, 클로로페닐 또는 톨루일; R₁=R₂=H.
4. (1) N-(t-부톡시카보닐)글라이신과 테트라하이드로퍼퓨릴아민의 축합반응에 의해 화합물 (C)를 제조하는 단계;

   (2) 화합물 산 존재하에서의 (C)의 가수분해에 의해 암모늄 염(D)를 제조하는 단계;

   (3) 상기 암모늄 염(D)과 알릴 할라이드 또는 피리딘카보닐 할라이드(Y)의 반응에 의해 아마이드 (II)를 제조하는 단계;

   로 이루어진 하기 반응식 2에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 하기 (II)의 아미드계 화합물의 제조 방법.

   [반응식 2]

   

   m=1; R₁=R₂=H; X는 클로라이드, 브로마이드, 아세테이트, 또는 트리플로로아세테이트; Y는 플로라이드, 클로라이드, 브로마이드 또는 요오드; R₃는 알릴 또는 피리딘카보닐.
5. 제 1 항의 아마이드계 화합물 중 m=1, X=CO, Y=CO, R₁=R₂=H, R₃=allyl 또는 m=1, X=CO, Y=CH₂, R₁=R₂=H, R₃=3-피리딘카보닐인 화합물을 유효성분으로 함유하는 돼지의 발정 유도용 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

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