KR100863267B1 - 허브 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼, 황기, 감초, 흑축(黑丑), 녹차 및 알로에 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물에 관한 것이다. 유효성분인 상기 허브 추출물 또는 허브 추출물-함유 제올라이트는 세포내 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 우수한 미백 효과, MMP-1의 발현을 억제하고 피부의 콜라겐 분해를 억제시키는 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효능, 및 자외선에 의한 피부손상을 개선에 매우 효과적으로 작용하는 우수한 피부상태 개선 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
인삼, 황기, 흑축, 허브, 제올라이트
Description
본 발명은 제품 안정성이 우수하고 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 피부상태 개선효과가 우수한 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되어진다. 인체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 자외선으로 발생하는 피부손상을 차단하는 중요한 역할을 하고 있다.
일반적으로 인체내의 멜라닌 합성은 색소형성세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 타이로시네이즈(tyrosinase), TRP(tyrosinase related protein)-1 및 TRP-2 등에 의하여 타이로신(L-tyrosine)을 기질로 하여 멜라닌 색소를 생성하도록 작용한다(Cohen, T., et al. Nucleic Acids Res., 18:2807-2808(1990)). 이러한 반응은 색소형성세포 내의 소기관인 멜라노솜(melanosome)에서 일어나며 새로이 생성된 멜라닌을 함유한 멜라노솜은 색소형성세포의 수지상 돌기(dendrite)를 통하여 인접한 각질형성세포(keratinocyte)로 분배되어 표피층의 피부색을 나타나게 되고 이것이 피부 밖으로 배출되지 못하고 피부 속에 남아 있게 되면 색소 침착이 일어나게 된다.
멜라닌이 형성되는 경로로서, 타이로신으로부터 타이로시네이즈에 의해 도파(DOPA) 및 도파퀘논(DOPA-quinone)을 거쳐 멜라닌이 생성되는 화학적인 경로 또는 멜라닌세포(melanocyte)로부터 케라틴세포(keratinocyte)로 이동하여 멜라닌을 생성하는 경로 등의 상당부분이 밝혀져 있다.
또한, 알파 멜라노사이트 자극 호르몬(alpha melanocyte-stimulating hormone; α-MSH)은 색소흑화 뿐만 아니라 멜라노사이트의 분열과 형태에 있어서 현저한 변화를 일으키는 것으로 연구되었다(1). α-MSH는 멜라노사이트의 멜라노코르틴-1 수용체에 결합하여 아데닐레이티드 사이클레이즈(adenylated cyclase)를 활성화 시켜 세포내에 사이클릭 AMP(cAMP)를 증가시킨다(10). 멜라노사이트와 멜라노마 세포에 α-MSH를 처리하면 폴스콜린 (forskolin), 콜레라 톡신 (cholera toxin) 및 이소부틸메틸잔틴 (isobutylmethylxanthine)과 같은 cAMP 증가 시약과 유사한 효과를 내는 피부흑화를 증가시킨다(3).
멜라노솜에 위치하는 막에 삽입되는 되어있는 티로시나아제는 구리이온을 자지고 있는 효소로써 멜라닌 합성에 있어서 주요한 속도 한계 효소(rate limiting enzyme)라고 알려져 있다. 지금까지 알려진 대부분의 멜라닌합성에 관한 연구는 멜라닌합성에 관여하는 타이로시네이즈를 직접적으로 억제하는 물질에 집중되어 있었다. 그래서 많은 기존의 멜라닌 생성 억제제 연구에 있어서 티로시나아제 활성 을 직접 저해하는 억제제들이 많이 개발되어 있다. 이러한 억제제로는 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 비타민 C 및 이의 유도체등이 있지만 피부 자극 및 제형내의 안정성에 문제가 있어 사용이 많이 제한되고 있는 실정이고, 최근 들어 타이로시네이즈의 직접억제 이외에도 타이로시네이즈 발현에 관여하는 신호전달기전(signal transduction)을 조절함으로써 미백효과를 기대할 수 있음이 개시되어 있다(2). 한편, cAMP가 증가하면 멜라닌 생성이 증가되고, AKT 또는 ERK 경로가 활성화되면 멜라닌 생성이 감소한다고 알려져 있다.
MITF는 외부의 자극 또는 호르몬 등의 영향을 받았을 때 증가되어 타이로시네이즈의 발현을 조절하는 것으로 보고 되어 있어 MITF의 발현이 증가할 경우 타이로시네이즈의 발현이 증가되어 결국은 멜라닌합성을 증가시키는 것으로 보고 되어 있다(9).
한편, 진피를 이루는 세포들은 세포외 기질(extracellular matrix)이라고 불리는 거대 그물조직으로 구성되어 있고 세포외 기질은 콜라겐, 엘라스틴 또는 프로테오글리칸과 같은 단백질과 다당류로 구성되어 있는데 이 중에서도 콜라겐은 결합조직의 탄력을 나타내며 진피를 구성하는 단백질의 70%를 차지한다. 이러한 콜라겐은 섬유상의 콜라겐(fibrillar collagens)으로 로프와 같은 구조를 가지고 있으며 세포외로 분비된 후에 다수의 콜라겐이 모여 콜라겐 섬유(collagen fibrils)로서 폴리머를 형성하게 된다. 피부에 영향을 미치는 인자로는 피부의 노화로 인한 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부노화와 색소침착에 의해 끊임없이 변한다. 피부노화는 크게 자연 노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선이며 가장 두드러진 외적인 노화현상이 바로 주름 형성이다(5 내지 7). 생체내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 메탈로프로테이즈(Matrixmetalloprotease, MMP)의 발현은 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 본 발명은 제품 안정성이 우수하고 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 주름개선, 피부 미백 또는 자외선에 의한 피부 손상의 개선 효과가 우수한 유효물질을 천연식물을 대상으로 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인삼 및 황기 등의 허브 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능과 안전성이 우수한 피부상태 개선용 조성물을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 주름, 미백 또는 자외선에 의한 피부 손상인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인삼, 황기, 감초, 흑축(黑丑), 녹차 및 알로에 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 주름, 미백 또는 자외선에 의한 피부 손상인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 본 발명은 제품 안정성이 우수하고 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 주름개선, 피부 미백 또는 자외선에 의한 피부 손상의 개선 효과가 우수한 유효물질을 천연식물을 대상으로 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인삼 및 황기 등의 허브 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능과 안전성이 우수한 피부상태 개선용 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 인삼은 다양한 형태로 가공된 모든 인삼, 예컨대, 수삼, 미삼, 백삼 및 홍삼에 적용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 인삼, 황기, 감초, 흑축, 녹차 및 알로에 추출물을 포함하는 허브 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, 추출온도 50℃ 내지 100℃에서 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.
필요한 경우, 본 발명의 유효성분을 얻기 위하여, 상기의 추출용매 처리 이후에 추가적인 정제 과정을 거쳐 얻을 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 본 발명의 유효성분인 허브 추출물을 얻을 수 있다.
본 명세서에서 용어 “허브(Herbs)”는 지구상에서 자생하는 식물 중에 식용, 미용, 약용 또는 방향제 등으로 우리에게 이로움을 주는 녹색식물을 총칭하는 말로 이해된다.
본 발명의 조성물은 주름개선 용도를 갖는다. 본 발명의 조성물은 MMP-1의 활성의 억제하고 피부의 콜라겐 분해를 억제시키는 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효능을 발휘하며, 이와 같은 사실은 하기의 실시예에 명확하게 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 용도인 주름 개선은 통상적인 피부 보호 용도(주름의 예방, 주름의 제거, 피부 노화 억제 등)를 포함하는 것으로 해석된다.
또한, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 피부 미백 용도를 갖는다. 본 명세서에서 용어 “미백”은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하는 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다.
본 발명의 피부 미백 조성물에서, 본 발명의 유효성분은 세포내 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로서 멜라닌 생성을 억제하는 미백 효과를 나타내며, 안정성이 높고, 시간 경과에 따른 성분 함량의 변화가 거의 없으며 피부 자극 유발 등 의 부작용이 거의 없다. 이와 같은 사실은 하기의 실시예에서 명확하게 입증된다.
또한, 본 발명의 피부상태 개선용 조성물은 자외선에 의한 피부손상을 완화, 개선, 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유효성분은 인삼 10-20 중량%, 황기 10-20 중량%, 감초 15-25 중량%, 흑축 10-20 중량%, 녹차 10-20 중량% 및 알로에 추출물 20-45 중량%를 포함된다. 보다 바람직하게는 인삼 10-15 중량%, 황기 10-15 중량%, 감초 15-20 중량%, 흑축 10-15 중량%, 녹차 10-15 중량% 및 알로에 추출물 20-45 중량%이다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유효성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%이다. 유효성분인 허브 추출물의 중량이 0.00001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 15.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유효성분은 제올라이트를 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 유효성분을 제올라이트의 세공 내에 함유되어 있다.
본 명세서에서 용어 “제올라이트”는 (ⅰ) 알칼리 또는 알칼리토금속의 규산 알루미늄 수화물인 광물의 총칭뿐만 아니라, (ⅱ) 제올라이트의 규소 (Si)와 알루미늄 (Al)의 그 일부 또는 전체를 여러 다른 원소로 대체시킨 제올라이트 유사 분자체(zeotype molecular sieve)도 포함하며, 최광의로는 표면에 히드록실기를 가지는 모든 다공성 산화물 또는 황화물을 포함한다. 분자체의 골격을 이루는 원자들은 규소, 알루미늄, 갈륨, 붕소, 인, 산소, 황 등의 주족 원소뿐만 아니라, 티탄, 바나듐, 지르코늄, 망간, 크롬, 철, 코발트, 니켈, 구리, 아연 등의 여러 전이금속들도 가능하다. 한 세공에 치환되는 양이온 또는 병속의 배(ship-in-a-bottle) 기법에 의해 합성되는 양이온의 종류에 상관없이 본 발명의 제올라이트에 포함된다. 제올라이트의 바람직한 예들을 예시하면 다음과 같다:
1. 천연 및 합성 제올라이트
2. MFI 구조를 갖는 제올라이트 및 유사물질(ZSM-5, 실리카라이트-1, TS-1 또는 전이금속이 부분적으로 치환된 메탈로-실리카라이트-1 등)
3. MEL 구조를 갖는 제올라이트 및 유사물질(ZSM-11, 실리카라이트-2, TS-2 또는 전이금속이 부분적으로 치환된 메탈로-실리카라이트-2 등)
4. 제올라이트 A, X, Y, L, 베타, 모오데나이트, 페리어라이트, ETS-4 또는 ETS-10 등)
5. 메조다공성 실리카(MCM 계열, SBA 계열, MSU 계열, KIT 계열)
6. 기타 수열합성을 통해 생성되는 제올라이트 및 메조다공성 실리카를 포함하는 유사분자체
7. 유기-무기 복합 메조세공 구조체 및 층상물질
8. 금속이온과 리간드가 3 차원적으로 결합하여 규칙적인 나노세공을 형성하는 유기 제올라이트, 유기금속 제올라이트 또는 배위화합물 제올라이트라 불리는 나노다공성 물질들.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유효성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%이다. 유효성분인 허브 추출물 함유 제올라이트의 중량이 0.00001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 15.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.0.0001-10 중량%로 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물이다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 허브 추출물 또는 허브 추추물 함유 제올라이트 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으 로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸 렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트에 대한 세포내 독성 실험(세포 생존율 분석) 결과 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트는 천연물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 조성물은 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트를 유효성분으로 포함한다.
(ⅱ) 유효성분인 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트는 세포내 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로서 멜라닌 생성을 억제하는 우수한 미백 효과, MMP-1의 활성의 억제하고 피부의 콜라겐 분해를 억제시키는 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효능, 및 자외선에 의한 피부손상을 개선에 매우 효과적으로 작용하는 우수한 피부상태 개선 효과를 가진다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 유효성분인 허브 추출물 또는 허브 추출물 함유 제올라이트는 세포내 타이로시네이즈의 활성을 억제함으로서 멜라닌 생성을 억제하는 우수한 미백 효과, MMP-1의 활성의 억제하고 피부의 콜라겐 분해를 억제시키는 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효능, 및 자외선에 의한 피부손상을 개선에 매우 효과적으로 작용하는 우수한 피부상태 개선 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실험재료 및 실험방법
허브(
Herbs
) 추출물 제조
인삼 900 g, 황기 900 g, 감초 1200 g, 흑축(黑丑) 900 g, 녹차 900 g 및 알로에 2000 g을 깨끗한 물로 세척하여 불순물을 제거한 다음 작게 으깬 후 일정한 용기에 물 30,000 ml을 담고 85-95°C 이하에서 5일간 중탕으로 증류하여 허브 추출물을 수득하였다. 허브 추출물의 성분비는 다음 표 1과 같다:
| Herbs 추출물 성분비 | |
| 성분 | 함량 |
| 인삼 | 13% |
| 황기 | 13% |
| 감초 | 18% |
| 흑축 | 13% |
| 녹차 | 13% |
| 알로에 | 30% |
허브 추출물 함유 제올라이트 4A(
실리코알루민산나트륨
;
Sodium
Silicoaluminate
;
Na
2
O
·
Al
2
O
3
· SiO
2
)의 제조
1차 용기에 상기 허브 추출물 500 ml과 황산알루미늄 8-13 g을 투입하여 혼합한 후 26℃에서 30 분 동안 60 회/분 속도로 교반하였다. 2차 용기에 허브 추출물 30 ml 및 규산소다 30 ml을 투입한 후 25-26℃ 에서 30-35 분 동안 60 회/분 속도로 교반하였다. 1차 용기 반응물과 2차 용기 반응물을 상호 반응시키되, 20-30℃를 유지하면서 회전속도 1200 회/분으로 2시간 교반하여 반응을 완료하였다.
미백 효과
검증 시험
(1) 실험재료
B16F10(흑색종 세포)은 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 허브 추출물은 DMSO에 용해하여 -20℃에서 보관하였다. 본 실험에 사용된 L-DOPA(Cat No. D9628) 및 멜라닌(Cat No. M8631)은 Sigma-Aldrich사 로부터, 머쉬룸 타이로시네이즈(mushroom tyrosinase)(Cat No. 93898)는 Fluka사 로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 PD98059(Cat No. 513000)와 알파-MSH(Cat No. 05-23-0751)은 Calbiochem사 로부터, 1차 항체인 타이로시네이즈(Cat No. SC-7833)와 pERK(Cat No. SC-16982)는 Santa Cruz Biotechnology사 로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 1차 항체인 MITF(Cat No. MS-77-P0)와 튜불린(Cat No. MS-581-P0)은 NeoMarkers사 로부터, HRP가 컨쥬게이트 된 2차 항체들 모두 Invitrogen(ZYMED Laboratories)사 로부터 구입하였다. 세포배양에 필요한 DMEM(Cat No. 11995), FBS(Cat No. 16000-044) 및 항생제-항진균제 시약(Cat No. 15240-062)은 Invitrogen(GIBCO)사 로부터 구입하였다.
(2) 타이로시네이즈 활성억제 시험
멜라닌 생합성과정 중 가장 첫 번째 단계에 관여하는 효소로써 전체 멜라닌합성 과정에 율속 단계이므로 이 효소의 활성을 억제함으로써 멜라닌합성을 억제 할 수 있다. 타이로시네이즈 활성 측정은 다음과 같다:
| 무세포계: 효소반응액 조성 | |
| 인산완충액에 다양한 농도로 희석되어 있는 허브 추출물 함유 제올라이트 4A | 70 ㎕ |
| L-DOPA 수용액(10 mM) | 10 ㎕ |
| 머쉬룸 타이로시네이즈(10 ㎍/ml) | 20 ㎕ |
| 합계 | 100 ㎕ |
인산완충액에 다양한 농도로 희석되어있는 허브 추출물 함유 제올라이트 4A 70 ㎕, 10 mM L-DOPA 수용액 10 ㎕ 및 10 ㎍/ml의 머쉬룸 타이로시네이즈 20 ㎕를 96 웰 플레이트에 잘 혼합한 후 37 ℃에서 약 1시간 정도 반응시켰다. 반응 후 반응생성물인 도파크롬(DOPAchrome)의 흡수파장인 475 nm에서 흡광도를 모니터링 하여, 효소반응의 활성도를 측정하였다.
(3) 배양 흑색종 세포를 이용한 시험
타이로시네이즈를 직접 이용하는 방법에 비해 배양 흑색종 세포를 이용하면 색소세포 전체의 다양한 멜라닌 생성계에서의 영향을 해석할 수 있다. 상기 방법을 통하여 멜라닌 생성에 대한 효과를 세포 펠릿과 분비된 멜라닌을 색으로 판단할 수도 있고 알칼리로 가용화하여 흡광도로 측정할 수도 있으며, 세포내 타이로시네이즈 활성을 흡광도로 측정할 수 있어 멜라닌 생성 억제 효과의 기작 연구에도 편리하다.
① 세포내 타이로시네이즈 활성 측정
| 세포계: 효소반응액 조성 | |
| 인산완충액에 다양한 농도로 희석되어 있는 허브 추출물 함유 제올라이트 4A | 90 ㎕ |
| L-DOPA 수용액(10 mM) | 10 ㎕ |
| 합계 | 100 ㎕ |
흑색종 세포(B16F10)를 이용하여 실험하였다. 10% 태아혈청, 0.5% 글루코오스, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 50 U/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 및 95% 공기와 습도가 유지되는 배양기에서 반응시켰다. 세포내 타이로시네이즈 활성를 측정하기 위하여 실험방법은 Busca R의 방법에 따라 수행하였다(3 및 4).
우선 흑색종 세포를 6-웰 세포배양 접시에 각각 다양한 농도의 허브 추출물함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 3일 동안 배양하였다. 배양 후 저온 PBS로 2-3번 세척한 다음 트리톤 X-100(구입처: Amresco, USA)이 1% 포함된 인산완충액으로 세포를 파쇄하였다. 파쇄 방법은 동결-융해를 반복한 다음 10,000 x g로 5분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 브래드포드 어세이로 정량하고 동일한 파쇄 완충액으로 모든 시료의 부피를 90 ㎕로 맞추었다. 96 웰-플레이트에 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 처리한 단백질 90 ㎕ 및 10 mM L-DOPA 10 ㎕를 첨가하고 대조군 실험은 허브 추출물을 처리한 단백질 대신 파쇄 완충액 90 ㎕를 10 mM L-DOPA 10 ㎕와 첨가하였다. 이어, 96 웰 플레이트에 잘 혼합 한 다음 37℃에서 약 1시간 정도 반응시켰다. 반응 후 반응생성물인 도파크롬의 흡수파장인 475 nm에서 흡광도를 모니터링 하여 효소반응의 활성도를 측정하였다.
② 총 멜라닌 량 측정
세포외 멜라닌의 측정은 Smally K 방법을 참고하였다(11). 우선 멜라닌 측정실험을 하기 12 시간 전에 흑색종 세포 1 x 105 개를 6-웰 세포배양 접시에 분주하고 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 3일 동안 배양하였다. 배양 후 배지 200 ㎕를 96 웰-플레이트에 첨가한 다음 흡수파장 400 nm에서 흡광도를 모니터링 하여 멜라닌을 측정하였다. 스탠다드는 합성 멜라닌(0 내지 200 mg/ml)을 이용하여 측정하였다.
③ 세포 생존율 분석(MTT 세포 증식 분석)
우선 흑색종 세포를 96-웰 세포배양 접시에 분주하고 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 2일 동안 배양하였다. 각 웰에 10 ㎕의 MTT(5㎎/㎖)(구입처: Sigma, USA)를 분주하고, 4시간 후 용해액(1% SDS, 0.1N HCl) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 방치하였다. 분석을 위하여 600 nm에서 ELISA 리더(Molecular Devices,미국)를 이용하여 흡광도를 조사한 후 대조군과 비교 분석하였다.
④ 웨스턴 블롯 분석
흑색종 세포를 100 mm 세포배양 접시에 분주하고 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 2 또는 3일 동안 배양하였다. 세포를 트립신으로 처리 하고, PBS로 세척한 다음 파쇄 완충액(Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, PMSF 100 mM 및 트리톤 X-100 0.1%)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 수득한 단백질은 브래드포드 분석법을 이용하여 정량하고, 각 시료를 SDS-PAGE한 다음 PVDF 멤브레인에 전기-이동하였다. 블롯은 5% 탈지분유가 포함된 TBST(TBS 및 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 블록킹하였다. 동일한 완충액에 1 : 1000의 비율로 일차 항체를 희석하여 혼합한 후 블롯과 함께 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 일차 항체 반응이 끝난 후, TBST에서 15분 씩 4회 멤브레인을 세척한 다음 5% 탈지분유가 포함된 TBST에 HRP가 컨쥬게이트된 이차 항체를 1 : 3000의 비율로 희석하여 블롯과 함께 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 블롯을 다시 TBST에서 20분씩 6회 세척하고, ECL 웨스턴 블롯 검출 키트(Amersham. UK)를 이용하여 반응시킨 다음 X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다.
주름개선 효과
검증 시험
(1) 실험재료
인간 케라티노사이트 HacaT 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하고, 허브 추출물은 DMSO에 용해한 다음 -20℃에 보관하였다. 본 실험에 사용된 1차 항체인 MMP-1(Cat No. SC-21731)은 Santa Cruz Biotechnology사 로부터, 1차 항체인 튜불린(Cat No. MS-581-P0)은 NeoMarkers사 로부터 구입하였다. 본 실험에 사용된 HRP가 컨쥬게이트된 2차 항체들 모두 Invitrogen(ZYMED Laboratories)사 로부터, 세포배양에 필요한 DMEM(Cat No. 11995), FBS(Cat No. 16000-044) 및 항생제-항진균제 시약(Cat No. 15240-062)은 Invitrogen(GIBCO)사 로부터 구입하였다.
(2) 세포 생존율 분석(MTT 세포 증식 분석)
우선 96-웰 세포배양 접시에 HacaT 세포를 분주하고 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 2일 동안 배양하였다. 각 웰에 10 ㎕의 MTT(5㎎/㎖)를 분주하고, 4시간 후 용해액(1% SDS, 0.1N HCl) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 방치하였다. 분석을 위하여 600 nm에서 ELISA 리더를 이용하여 흡광도를 조사한 후 대조군과 비교 분석하였다.
(3) UVB 조사(radiation)
우선 HacaT 세포를 100 mm 세포배양 접시에서 1일 정도 배양하였다. UV 조사 1시간 전에 다양한 농도의 허브 추출물을 첨가하였다. 이어, 자외선 챔버(FR/BLX-254, VILBER LOURMAT)를 이용하여 HacaT에 UVB를 0-50 mJ/cm2의 에너지로 조사한 다음 시료가 첨가된 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다.
(4) 웨스턴 블롯 분석
HacaT 세포를 100 mm 세포배양 접시에 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 2 또는 3일 동안 배양하였다. 이어, 세포를 트립신으로 처리하고, PBS로 세척한 다음 파쇄 완충액(100 mM Tris-Hcl, 10 mM EDTA, 100 mM PMSF 및 0.1% 트리톤 X-100)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 수득한 단백질을 브래드포드 분석법을 이용하여 정량하고, 각 시료를 SDS-PAGE한 다음 PVDF 멤브레인에 전기-이동 하였다. 블롯을 5% 탈지분유가 포함된 TBST(TBS, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 블록킹하였다. 동일한 완충액에 1 : 1000의 비율로 일차 항체(MMP1 및 튜불린)를 희석하여 혼합 한 다음, 블롯과 함께 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 일차 항체 반응이 끝난 다음, TBST에서 15분씩 4회 멤브레인을 세척하고, 5% 탈지분유가 포함된 TBST에 HRP가 컨쥬게이트된 이차 항체를 1 : 3000의 비율로 희석하여 블롯과 함께 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 블롯은 다시 PBST에서 20분씩 6회 세척하고, ECL 웨스턴 블롯 검출 키트(Amersham. UK)를 이용하여 반응시킨 다음, X-ray 필름에 감광시켜 현상하였다.
실험 결과
허브 추출물 함유 제올라이트 4A의
세포내의
독성 정도(세포 생존율 분석)
허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 세포독성을 검토하기 위해 MTT 세포 증식 분석을 흑색종 세포에서 실험하였다. 우선 실험방법은 흑색종 세포를 96-웰 세포배양 접시에 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 하루 동안 배양하였다. 각 웰에 10 ㎕의 MTT(5㎎/㎖)를 분주하고, 4시간 후 용해액(1% SDS 및 0.1N HCl) 100 ㎕를 첨가한 다음 37℃에서 12시간 동안 방치하였다. 분석을 위하여 600 nm에서 ELISA 리더를 이용하여 흡광도를 조사한 후 대조군과 비교 분석하였다.
도 1에서 확인 할 수 있듯이, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 심각한 세포독성을 보이지 않았고, 특별히 외견상으로 보이는 세포사의 형태를 띄지 않았다. 따라서 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 세포실험에 적합한 것으로 판단된다.
허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 멜라닌(
melanin
) 생성억제에 대한 영향
세포외 멜라닌 측정은 Smally K 방법을 참고 하였다(11). 우선, 멜라닌 측정실험을 하기 12 시간 전에 흑색종 세포 1 x 105 개를 6-웰 세포배양 접시에 분주하고, 각각 다양한 농도의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 첨가한 다음 3일 동안 배양하였다. 배양 후 배지 200 ㎕를 96 웰-플레이트에 넣은 후 흡수파장 400 nm에서 흡광도를 모니터링 하여, 세포외 멜라닌을 측정하였다. 스탠다드는 합성 멜라닌(0 내지 200 mg/ml)을 이용하여 측정하였다. 대조군 실험으로는 기존에 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 알려진 코지산(1mg/ml)(Sigma-Aldrich)을 이용하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 비교하여 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A 투여군의 멜라닌 양이 현저히 감소하는 경향을 보였으며, 세로외 멜라닌 양 또한 세포 배양액에서 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 농도-의존적으로 감소하는 경향을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 총 멜라닌합성을 저해하는 효과를 가지고 있다고 판단된다.
알파
멜라노사이트
자극 호르몬(α-
MSH
) 자극에 의한 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 멜라닌(
melanin
) 생성억제에 대한 영향
α-MSH 자극에 대한 멜라닌 합성 억제는 피부흑화의 조절에 중요한 역할을 할 것으로 판단되어 α-MSH에 유도된 멜라닌 합성 억제를 조사하였다
실험방법을 간단히 설명하면, 대조군 실험은 흑색종 세포 1 x 105 개를 6-웰 세포배양 접시에 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 mg/ml의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 처리한 다음 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 0.1 mM의 α-MSH를 각각 처리한 하고 2일 동안 배양하여 실험하였다. 배양 후 배지 200 ㎕를 96 웰-플레이트에 첨가한 다음 흡수파장 400 nm에서 흡광도를 모니터링 하여 멜라닌을 측정하였다.
도 3(패널 A)에서 볼 수 있듯이, 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 mg/ml의 α-MSH를 처리하여 한 대조군 실험을 통하여, 본 실험에 사용된 B16F10세포가 α-MSH 자극에 대하여 멜라닌합성이 증가되는 것을 알 수 있었고 코지산에 의하여 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3(패널 B)에서 확인 할 수 있듯이, α-MSH 자극에 의한 멜라닌합성이 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 농도-의존적으로 억제되는 경향을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 허브 추출물은 α-MSH 자극에 의한 멜라닌합성을 저해하는 효과를 가지고 있다고 판단된다.
타이로시네이즈
(
tyrosinase
) 활성 억제효과
본 실험은 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 타이로시레이즈 저해 활성을 알아보기 위하여 머쉬룸 타이로시네이즈를 이용하였다(8).
기질로서는 멜라닌 생합성의 전구체인 타이로신을 이용하여, 타이로시레이즈에 의한 기질의 산화과정에서 생성되는 도파와 도파퀴논의 생성량의 흡광도를 이용하여 타이로시레이즈 활성을 분석하였다(8).
실험 방법은 인산완충액에 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ㎍/ml)로 희석되어있는 허브 추출물 함유 제올라이트 4A 70 ㎕, 10 mM L-DOPA 수용액 10 ㎕ 및 10 ㎍/ml의 머쉬룸 타이로시네이즈 20 ㎕를 96 웰 플레이트에 잘 혼합한 다음 37℃에서 약 1시간 정도 반응시켰다. 반응 후 반응생성물인 도파크롬의 흡수파장인 475 nm에서 흡광도를 모니터링 하여 효소반응의 활성도를 측정하였다.
도 4에서 확인 할 수 있듯이, 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 직접적으로 타이로시레이즈 활성을 억제하지는 않는 것을 확인 할 수 있다. 그러나 다른 실험결과들을 검토해보면 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 다른 경로로 멜라닌합성을 저해하는 것으로 판단된다.
MITF
발현억제 및
ERK
경로의 활성화 효과
본 실험에서도 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 타이로시네이즈를 직접적으로 억제하지는 않는 것으로 판단된다. 한편, cAMP가 증가하면 멜라닌 생성이 증가되고, AKT 또는 ERK 경로가 활성화되면 멜라닌 생성이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 멜라닌 합성 억제가 ERK경로의 활성하는지 여부와 타이로시네이즈 발현을 조절하는 전사인자 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 증가시키는지 여부를 조사하였다.
도 5에서 확인 할 수 있듯이, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 처리시간이 경과함에 따라 ERK를 직접 활성화시키고, 타이로시네이즈의 발현을 조절하는 MITF의 발현을 억제함으로써 결과적으로 멜라닌합성을 억제하고 있음을 알 수 있다.
HacaT
에서
MMP
-1(
Matrix
Metalloproteinase
-1)의 활성 억제 효과
본 실험에서는 자외선 조사에 의한 MMP 발현을 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A가 억제하는지 여부를 조사하였다.
도 6(패널 A 및 B)에서 확인할 수 있듯이, UV에 의하여 MMP-1 발현이 시간 및 조사량-의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었고, 도 6(패널 C)에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A가 MMP-1 발현을 농도-의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 이러한 실험결과를 통하여, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4는 MMP-1의 활성을 억제하고, 피부의 콜라겐 분해를 억제시킴으로써 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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11. Smalley K, Eisen T. The involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in the alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha-MSH)-induced melanogenic and anti-proliferative effects in B16 murine melanoma cells. FEBS Lett. 476(3):198-202(2000).
도 1은 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 세포독성을 검토하기 위해 MTT 세포 증식 분석을 흑색종세포에서 실험한 결과를 보여주는 그래프이다. Herb extract는 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A를 나타낸다. 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml의 양으로 처리되었다.
도 2는 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 멜라닌 생성 억제 효과를 보여준다. 패널 A는 음성 대조군, 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A 및 양성대조군으로 코지산 투여군의 흑색종 세포에서의 멜라닌 합성 저해 효과를 보여주는 사진이다. 허브 추출물 함유 제올라이트 및 코지산은 각각 1 mg/ml 및 1mM의 양으로 처리되었다. 패널 B는 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A 및 코지산 투여군의 흑색종 세포에서의 멜라닌 합성 저해 효과 보여주는 세포 배양 접시 사진이다. 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 0 및 1 mg/ml의 양으로, 코지산은 1 mg/ml의 양으로 처리되었다. 패널 C는 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 농도-의존적으로 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다. 허브 추출물 함유 제올라이트 4A는 0, 0.01, 0.1 및 1 mg/ml의 양으로 처리되었다.
도 3은 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 B16F10세포에 대한 α-MSH 자극에 대한 멜라닌 생성 억제 효과를 보여준다. 패널 A는 B16F10세포에서 α-MSH의 처리에 대하여 농도-의존적으로 멜라닌의 생성이 증가되는 것을 보여주고, 코지산의 처리로 멜라닌의 생성이 억제되는 것을 보여 주는 그래프이다. α- MSH는 알파 멜라노사이트 자극 호르몬(alpha melanocyte-stimulating hormone)을 나타낸다. α-MSH는 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μM의 양으로, 코지산은 α-MSH는 0.1 μM의 양으로 처리된 세포에 대하여 1 mM의 양으로 처리되었다. 패널 B는 α-MSH가 처리된 B16F10세포에 대하여 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A의 처리로 멜라닌 합성이 농도-의존적으로 억제되는 것을 보여주는 그래프이다. α-MSH는 0.1 μM의 양으로 처리된 세포에 대하여 본 발명의 추출물은 0, 0.01, 0.1 및 1 mg/ml의 양으로 처리되었다.
도 4는 무세포계에서 본 발명의 허브 추출물 함유 제올라이트 4A가 직접적으로 타이로시네이즈의 활성을 억제하는지 여부를 보여주는 그래프이다. 본 발명의 추출물은 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 및 1,000 mg/ml의 양으로 처리되었다.
도 5는 본 발명의 추출물이 ERK를 활성화하고 MITF의 발현을 억제함으로써, 멜라닌 합성을 억제하고 있음을 보여주는 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 패널 A는 본 발명 추출물의 처리 시간이 경과함에 따라 ERK의 발현이 증가하고 있음을 보여주는 겔 사진이다. 패널 B는 본 발명 추출물의 농도-의존적으로 MITF의 발현이 억제되고 있음을 보여주는 겔 사진이다. MITF는 마이크로프탈미아-관련 전사인자(microphthalmia-associated transcription factor)를 나타낸다. α-MSH는 0.1 μM의 양으로, 그리고 본 발명의 추출물은 0, 0.1 및 1 mg/ml의 양으로 처리되었다.
도 6은 본 발명의 추출물이 자외선 조사에 의한 MMP-1의 발현을 억제하고 있음을 보여주는 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 패널 A 및 B는 자외선 조사 시간 및 조사량이 증가함에 따라 MMP-1의 발현이 증가함을 보여주는 겔 사진이다. 패널 C는 본 발명의 추출물이 자외선 조사에 의한 MMP-1의 발현을 억제하고 있음을 보여주는 겔 사진이다. MMP-1은 콜라겐을 분해하는 효소인 메탈로프로테이즈 (Matrixmetalloprotease)을 나타낸다.
Claims (9)
- 인삼 추출물, 황기 추출물, 감초 추출물, 흑축(黑丑) 추출물, 녹차 추출물, 알로에 추출물 및 제올라이트를 유효성분으로 포함하는 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물로서, 상기 피부 상태는 주름, 미백 또는 자외선에 의한 피부 손상인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001-10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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