KR100893162B1 - 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에서 이용되는 유효성분인 카바크롤은 기존의 주름개선제로 사용되고 있는 레티놀에 비해 세포독성도 낮으면서, 콜라게네이즈 활성 억제 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효능, 항비만, 발모촉진 또는 탈모방지 효과를 가진다. 또한, 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

카바크롤, 주름개선, 발모촉진, 항비만, 콜라겐

Description

카바크롤을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선제{Agents for Improving Skin Wrinkles Comprising Carvacrol as an Active Ingredient}

도 1은 본 발명의 유효성분인 카바크롤이 RA에 비해 인체섬유아세포에 대한 세포독성이 낮은 정도를 보여주는 그래프이다. RA는 레티노산(retinoic acid)을 나타낸다. RA 와 카바크롤은 각각 1 μM, 10 μM 및 50 μM의 양으로 처리되었다.

도 2는 카바크롤에 의한 콜라겐(타입 I 콜라겐) 생합성 촉진 효과를 보여주는 그래프이다. RA는 1 μM의 양으로 처리되었다.

도 3은 본 발명의 유효성분인 카바크롤의 처리농도를 증가시킴에 따라 콜라게네이즈(MMP-1) 활성이 억제되는 효과를 보여주는 그래프이다. MMP-1 및 PMA는 각각 타입 I 콜라게네이즈 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate)를 나타낸다. PMA는 100 nM의 양으로 처리되었다

본 발명은 제품 안정성이 우수하고 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 주름개선효과, 발모 촉진 또는 탈모방지 효과 및 항비만 효과가 우수한 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

주름은 피부의 노화로 생기며, 노화된 피부라 함은 노화의 과정과 연관된 자연적 변화의 총체이다. 피부노화는 크게 두 가지로 구분되는데, 피부표면 전체에서 나이와 관련된 피부 기능, 구조 또는 모양의 변화를 나타내는 생리적 노화와 자외선에 의한 광노화로 구분된다.

피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(Fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생된다. 그 구체적인 변화는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin)수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분쇄 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인들 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현량과 활성이다. 카바크롤의 콜라겐과 콜라게네이즈 효소에 미치는 영향은 밝혀져 있지 않았으나, 본 실험을 통해 카바크롤이 콜라겐 합성을 증가시키고 콜라게네이즈 효소를 억제하는 결과를 보였다.

환경오염, 자동차 배기가스 등으로 인해 호르몬 불균형 현상이 심화되고 있다. 이로 인해 탈모 발생율이 높아지고, 발생연령도 낮아지고 있다. 또한 인스턴트 음식, 육류중심의 식생활변화로 어린나이에도 불구하고 비만으로 고통을 받고 있는 인구가 급격히 증가하고 있다.

따라서, 미적인 차원뿐만 아니라 심각한 사회문제가 되고 있는 여러 가지 현상 예를 들어, 내인성 노화와 자외선에 의한 주름발생, 비만 및 탈모 등과 같은 현상을 효과적으로 해결할 수 있고, 안전성과 안정성이 높으며 피부관련 효능이 우수한 소재 개발이 절실한 상황이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 주름개선, 항비만, 탈모 방지 또는 발모촉진 효과가 우수하고 안정성이 높아 피부 부작용이 없는 신규의 단일 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능 및 안전성이 우수한 피부주름 개선, 항비만, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 피 부상태 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 항비만용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물로서, 상기 피부상태 개선은 주름개선, 발모 촉진 또는 탈모 방지인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 주름개선 효과, 항비만 효과, 탈모 방지 또는 발모촉진 효과 가 우수하고 안정성이 높아 피부 부작용이 없는 신규의 단일 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 카바크롤을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제조하면 그 효능과 안전성이 우수한 피부 주름개선, 항비만, 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 카바크롤은 녹나무(Cinnamomum camphora Sieb), 오레가노(Origanum hirtum), 야생 베르가못(bergamot) 및 사향초 라 불리우는 타임(thyme) 등의 오일에서 추출되는 대표적인 방향성 정유성분이다. 카바크롤의 IUPAC 명은 2-메틸-5-프로판-2-일-페놀 또는 2-메틸-5-(1-메틸에틸)페놀이고, 하기 화학식 1로 표시되는 식물-유래의 화합물이다. 카바크롤은 일반적으로 방충효과와 함께 곰팡이나 세균 등 미생물에 대한 항균활성을 가지고 있으며 항암 효능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 카바크롤은 자연원(natural source)인 녹나무, 오레가노, 야생 베르가못 및 사향초로부터 추출해 낼 수 있다. 상세하게는, 상기의 카바크롤은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

필요한 경우, 본 발명의 카바크롤을 얻기 위하여, 상기의 추출용매 처리 이후에 추가적인 정제 과정을 거쳐 얻을 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 카바크롤을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 카바크롤은 녹나무(Origanum hirtum)의 정유를 증기증류법(steam distillation)으로 채집하고 채집된 정유를 감압분류 과정을 거쳐 분리해 낼 수 있다.

또한, 본 발명의 카바크롤은 사이몰 술폰산(cymol sulfonic acid)을 코스틱 포타쉬(caustic potash)(KOH)와 반응시켜 인공적으로 제조할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 주름개선 용도를 갖는다. 본 발명의 조성물은 기존의 주름개선제로 사용되고 있는 레티놀에 비해 세포독성도 낮으면서, 콜라게네이즈 활성 억제 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효능을 발휘하며, 이와 같은 사실은 하기의 실시예에 명확하게 기재되어 있다. 본 발명의 조성물의 용도인 주름 개선은 통상적인 피부 보호 용도(주름의 예방, 주름의 제거, 피부 노화 억제 등)를 포함하는 것으로 해석된다.

또한, 본 발명의 피부개선용 조성물은 발모 촉진 또는 탈모 방지에 매우 효과적으로 작용한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “탈모 방지” 또는 “발모 촉진”은 동일한 의미로 사용되며, 이는 당업계에서 이용되는 또 다른 용어 양모 또는 육모 촉진과 동일한 의미를 가진다.

또한, 하기 실시예에서 명확하게 나타나 있듯이, 본 발명의 조성물은 우수한 항비만 효과를 갖는다.

본 발명의 상기 화학식 1의 카바크롤은 당업계에서 통상적으로 실시되는 치환기의 부가 또는 치환 반응에 의하여 얻어지는 유도체 중 콜라겐합성 증진 및/또는 콜라게네이즈(MMP-1) 활성 억제에 의한 주름개선 효과를 나타내거나, 발모촉진 또는 탈모방지 효과, 항비만 효과를 나타내는 유도체를 포함한다는 것은 당업계의 기술 수준을 고려하여 당업자에게 명확하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 카바크롤의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%이다. 카바크롤의 유효성분의 중량이 0.00001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 15.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물이다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 카바크롤 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡 수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 카바크롤뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 카바크롤 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 카바크롤에 대한 피부누적 자극시험 결과 카바크롤은 천연물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 카바크롤은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하 게 적용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 카바크롤을 유효성분으로 포함한다.

(ⅱ) 유효성분인 카바크롤은 기존의 주름개선제로 사용되고 있는 레티놀에 비해 세포독성도 낮으면서, 콜라게네이즈 활성 억제 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효능, 항비만, 발모촉진 또는 탈모방지 효과를 가진다.

(ⅲ) 또한, 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 카바크롤의 주름개선 효과 측정

주름개선효과는 통상 콜라겐 생합성능과 콜라게네이즈 분해 억제능 및 사람에 대한 임상시험으로서 효과를 측정할 수 있다. 사람의 정상 섬유 아세포 (Human normal fibroblast, (주)태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2 x 10⁵ 세포/웰), 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별로 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 도 1은 시료의 처리 농도(1 μM, 5 μM 및 10 μM) 에서는 세포독성이 없음을 나타내고 있다.

콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), 다카라, 교토, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 자세한 시험방법은 (주)다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다.

콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게네이즈에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게네이즈 활성을 유도하는 물질로 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate)(PMA)(Sigma)를 처리하였다. 전체적인 시험은 판매회사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트 (Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Tek ELx808™ Series Ultra Microplate Reader, 영국)로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균± 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였고 그 결과를 하기 표 1 및 도 2-3에 나타내었다.

시험항목	카바크롤 (1 μM)	카바크롤 (10 μM)	카바크롤 (50 μM)
콜라겐 합성증가율	20	26	25
콜라게네이즈 억제율	13	20	29

상기 표 1 및 도 2-3에서 확인할 수 있듯이, 카바크롤은 콜라겐 합성을 증가시키면서도 콜라게네이즈 활성을 억제한다는 것을 알 수 있다. 결국, 카바크롤은 주름개선 효능을 가지고 있음을 알 수 있다. 또한, 이러한 콜라겐 합성 증가 및 콜라게네이즈 활성 억제는 카바크롤의 대체적으로 농도에 의존적으로 나타났다.

또한, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 카바크롤은 양성 대조군인 RA(레티노산)와 유사한 콜라겐 합성 증가율을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 카바크롤을 함유한 화장료의 주름개선 효과 측정

카바크롤을 함유한 화장료의 주름 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 제조예 A(카바크롤을 각각 1%, 2% 및 5% 함유한 영양 크림) 및 비교 제조예 (정제수를 함유한 영양 크림)에서 제조한 영양 크림을 사용하였다.

주름개선 효과는 피부탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부탄력의 측정은 온도 24 내지 26℃, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 30명(25 내지 35세)을 대상으로 제조예 A 크림의 3종류와 비교 제조예의 영양 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 측정함으로써 이루어졌으며, 판정기준은 피부탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 2에 나타내었다.

시험항목	제조예 A (카바크롤 1% 함유크림)	제조예 A (카바크롤 2% 함유크림)	제조예 A (카바크롤 5% 함유크림)	비교 제조예 (카바크롤 0% 함유크림)
피부탄력도	2.5	3.1	3.82	2.03

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 제조예 A가 비교 제조예에 비해 주름개선 효과가 훨씬 우수하였으며, 카바크롤의 함유 농도가 증가함에 따라 피부탄력도 향상되었다.

제조예 A: 카바크롤을 함유한 크림의 제조

카바크롤을 함유한 영양 크림의 조성은 하기 표 3과 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 카바크롤 및 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

카바크롤을 함유한 영양크림의 성분 및 함량

성분	함량 (중량%)
카바크롤	1.00 or 2.00 or 3.00
알프로겐 (alprogen)	1.00
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 3: 카바크롤에 의한 멜라닌 생성 억제효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)(한국세포주은행)를 이용하여 카바크롤에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.

본 실험은 뮤라인 멜라노마(murine melanoma)(B-16 F10) 세포(한국세포주은행)를 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum)(FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 웰 당 1 x 10⁵ 개로 접종하고 5% CO₂ 및 37℃ 하에서 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 이어 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체하고, 5% CO₂ 및 37℃ 하에서 3일 동안 배양하였다. 카바크롤의 농도범위는 세포독성이 없는 1 μM, 10 μM 및 50 μM 으로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 이를 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)(Tiefe Depth Profondeur 0.100mm,Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, 독일)를 이용하여 세포수를 측정하고, 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 펠릿을 얻었다. 이 세포 펠릿을 60℃에서 건조시키고 10% DMSO가 함유된 1 M 수산화나트륨액 100 ml를 넣어 60℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 이를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Bio-Tek ELx8081U, 미국)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시료	처리농도(μM)	멜라닌 생성 억제율 (%)
알부틴	100	23
카바크롤	1	14
	10	42
	50	55

상기 표 4에 기재된 바와 같이, 처리 농도에서 카바크롤은 알부틴보다 멜라닌 생성 억제율이 높음을 알 수 있다. 또한, 카바크롤의 멜라닌 생성 억제 활성은 농도-의존적이라는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 카바크롤에 의한 세포내 타이로시네이즈 활성억제 효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)(한국세포주은행)를 이용하여 카바크롤에 의한 타이로시네이즈의 활성 억제효과를 측정하고, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴에 의한 세포내 타이로시네이즈 활성 억제효과와 비교하였다.

본 실험은 뮤라인 멜라노마(murine melanoma)(B-16 F1) 세포(한국세포주은행)를 10%의 우태아혈청 (fetal bovine serum)(FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 웰 당 1 x 10⁵ 개로 접종하고 5% CO₂ 및 37℃ 하에서 세포가 웰 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 이어 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석된 배지에 교체한 다음 5% CO₂ 및 37℃ 하에서 3일 동안 배양하였다. 카바크롤의 농도범위는 세포독성이 없는 1 μM, 10 μM 및 50 μM 으로 결정하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 이를 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 헤마토사이토미터(hematocytometer)(Tiefe Depth Profondeur 0.100mm,Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, 독일)를 이용하여 세포수를 측정하고 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 펠릿을 얻었다. 이 세포 펠릿을 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 분쇄시키고 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수집하였다. 이를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(microplate reader)(Bio-Tek ELx8081U, 미국)로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정수당 타이로시네이즈 활성을 구하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료	처리 농도 (μM)	세포내 tyrosinase활성 억제율 (%)
알부틴	100	30
카바크롤	10	11
	100	43
	500	57

상기 표 5에 기재된 바와 같이, 카바크롤이 알부틴보다 세포내 타이로시네이즈 억제율이 높음을 알 수 있었다. 또한, 카바크롤의 세포내 타이로시네이즈 활성 억제 정도는 농도-의존적이라는 것을 알 수 있었다.

실시예 5 : 동물수준에서의 미백 효과 평가

사람과 유사하게 자외선에 의해 색소침착이 생긴다고 알려진 갈색 기니아 피그(Tortoiseshell guinea pigs; Brown guinea pigs)를 사용하여 카바크롤에 의한 미백효과를 측정하였다.

상기 갈색 기니아 피그에서 자외선(UV)에 의한 색소침착을 유발하기 위하여, 갈색 기니아 피그 배위의 털을 제거한 피부에 3 X 3 cm²의 정방형 창문이 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착시킨 후, SE lamp(파장 290-320 nm, 도시바)로 자외선을 조사하였다(총 조사 에너지량 = 1350 mJ/cm²). 자외선 조사 후 알루미늄 호일을 벗겨내고 아래와 같은 방법으로 시료(카바크롤, 옥시카바크롤 및 알부틴)를 도포하였다. 자외선 조사 후 2-3일 후에 색소침착이 나타났으며, 약 2주 후에 최고에 도달하였고, 이 때부터 각 시료를 도포하였다.

도포회수는 1일 1회 또는 2회로, 50일간 계속하였다. 시료는 특정한 용매(Propylene Glycol: Ethanol: Water = 5: 3: 2의 혼합용매)를 사용하여 용해 및 희석하였으며, 면봉으로 도포하고 다른 부위에 반드시 용매를 도포하는 대조부위를 마련하였다. 이 경우 효과 판정과 함께 누적자극성 여부도 관찰하였다.

색차계(CR2002 chromameter, 미놀타, 일본)를 사용하여 피부의 흑백정도를 측정하여 효과를 판정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 색을 표시하는데는 L^*A^*B^* 표색계를 사용하며, 본 발명에서는 L^*값을 지표로 하였다. L^*값은 표준 백판으로 교정하며, L^*값은 1개 부위에 5회 이상 반복하여 측정하였고, 색소침착을 균등하게 하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L^*)를 구하고 이 값으로 효과를 판정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

△L^* = 도포 00일 후의 L^*값 - 도포 개시일의 L^*값

△L^* 값을 시료도포 부위와 대조군 부위에 대해서 구한 후 비교하면 미백물질의 효과를 알 수 있다.

시료	처리 농도 (%)	미백효과 (△L)
카바크롤	0.2	0.41
	1.0	0.55
알부틴	1.0	0.46
대조군	-	0.35

상기 표 6에 기재된 바와 같이, 카바크롤은 알부틴보다 우수한 미백효과를 보였으며, 시험물질 도포시험 중 누적 자극을 보인 것은 관찰되지 않아 안전성 또한 우수한 것으로 나타났다.

실시예 6 : 카바크롤의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

카바크롤이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 이를 위해 피부누적자극시험을 실시하였다.

스쿠알렌을 베이스로 카바크롤을 각각 1%, 5% 및 10%를 첨가한 제형을 제조하고, 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 카바크롤이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 2를 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

평균반응도 = [[(반응지수 x 반응도)/ 총 피검자수 x 최고점수(4점)] x 100] ÷ 검사회수(9회)

반응도에서 ± 는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질	반응이 나타난 피검자 수									평균반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋	± ＋ ＋＋
대조군(스쿠알렌)	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
카바크롤(1%) [시험군 1]	1 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.09
카바크롤 (5%) [시험군 2]	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
카바크롤(10%) [시험군 3]	2 - -	0 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18

상기 표 7에서 시험군 1, 2 및 3 모두 ± , + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 각각 1명, 2명 및 2명이고, 평균 반응도는 각각 0.09, 0.18, 0.18이었다. 그러므로 평균반응도가 3이하의 반응도를 나타내므로, 카바크롤은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.

실시예 7: 항산화 효과

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)(Sigma)은 색을 띄는 라디칼로 시료의 라디칼 제거능력을 색깔의 변화로 직접 확인할 수 있다. 먼저 용매에 녹인 시료 20 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 200 μM DPPH 용액을 180 ㎕씩 다시 넣어준 다음 상온에서 30분 동안 배양하였다. 남아있는 DPPH의 양을 540 nm에서의 흡광도 측정을 통해 결정하였다. 카바크롤의 항산화력 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 간략하게, 효과는 시료에 의한 자유라디칼 제거율을 관찰함으로써 항산화기능의 유무를 판단하였다.

시료	처리 농도 (μM)	슈퍼옥사이드 음이온 제거율 (%)
카바크롤	10	5
	100	15
	1000	35

상기 표 8에 기재된 바와 같이, 카바크롤은 농도-의존적으로 항산화 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 항염증효능 평가

항염증 효과가 있는지 살펴보기 위하여 인간단핵구 세포인 THP-1 세포(한국세포주은행)에서의 통상의 방법에 따라 COX(cyclooxygenase) 활성억제능 실험을 시행하였다. COX 활성 측정은 F. J. Van de Ouderaaa and Muytenhek 가 발표한 Method in Enzymology 43:9(1994)에 따라 실시하였다. COX assay는 THP-1세포주를 배양한 다음 24-웰 플레이트에 세포들을 분주하였다. 웰 당 반응 부피를 500㎕로 맞추고 리포폴리사카리드(lipopolysaccharide)(LPS)(1㎍/㎖)(Sigma)와 하기 표 8에 표기된 용매에 각각 녹인 시료 화합물 2 ㎕를 첨가한 다음 24-48시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 24-48시간 후 각 웰에 칼슘 이오노포어(calcium ionophore, Sigma)와〔1-14C〕아라키돈산 1 ㎕(in EtOH, 0.1 μCi/ml, Sigma)를 첨가한 다음 동일 조건으로 10분 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 시트르산을 첨가하여 pH를 3.5로 맞추어 흔들어 주고, 각 배양액을 500 ㎕를 취하여 마이크로 원심분리기 튜브에 분주한 다음 에틸아세테이트 700 ㎕를 첨가하여 10분 동안 진탕 추출하였다. 에틸아세테이트 층을 500 ㎕ 취하여 스피드 진공 건조기를 이용하여 20분 동안 농축하고 농축된 잔여부분 20 ㎕를 에틸아세테이트로 녹인 다음 TLC 플레이트에 어센틱 스탠다드(authentic standard)와 함께 적용하였다. 방사능 밴드는 어센틱 이오코사노이드 스탠다드(authentic eicosanoid standards)로 확인하였고, 확인된 밴드의 방사능은 BAS 2000 바이오-이메이징 어넬라이저(bio-imaging analyzer)(Fuji, 일본)를 이용하여 측정하였다.

시료	COX 활성(%)
LPS (1 ㎍/ml)	100
LPS(1 ㎍/ml)+ 카바크롤(1 μM)	88
LPS(1 ㎍/ml)+ 카바크롤(10 μM)	79
LPS(1 ㎍/ml)+ 카바크롤(50 μM)	55

상기 표 9에 기재된 바와 같이, 카바크롤은 COX의 활성을 효과적으로 억제하고 있음을 알 수 있다. 이를 통해 염증억제 효능을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

실시예 9: 면역억제능 평가

본 발명에 사용된 시료들이 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제하는지의 여부를 인터루킨-2 루시퍼라아제 리포터(interleukin-2 luciferase reporter) 활성실험을 통해 다시 조사하였다. 인터루킨-2 프로모터는 염증과 관련된 면역관련 사이토카인의 생산에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다. 인터루킨-2 루시퍼라아제 활성을 측정하기 위해서 다음과 같은 방법을 사용하였다. 인간 T림프구 세포주인 Jurkat 세포(한국세포주은행)를 6 웰에 각각 1x10⁶개의 세포를 분주하고 수퍼펙트 트란스펙션 리에전트(superfect transfection reagent)(In vitrogen)를 이용하여 인터루킨-2 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 DNA (interleukin-2 luciferase reporter plasmid DNA)를 형질감염 시켰다. 24시간이 경과한 후, PHA(Phytohemaglutinin)(100 ng/ml)(Sigma)를 처리하여 Jurkat 세포를 활성화시킴과 동시에 각각의 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 후 세포를 수집하여 루미노미터(luminometer)(Berthold Technologies GmbH&Co.KG, 독일)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 그 결과를 정리하면 다음과 같다.

시료	인터루킨-2 루시퍼라아제 활성(%)
PHA (100 ng/ml)	100
PHA(100 ng/ml)+ 카바크롤(1 μM)	94
PHA(100 ng/ml)+ 카바크롤(10 μM)	85
PHA(100 ng/ml)+ 카바크롤(50 μM)	76

상기 표 10에 기재된 바와 같이, 카바크롤은 인터루킨-2의 발현을 억제함으로써 면역반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 10: 항비만 효과

비만억제시험은 일반적으로 잘 알려진 동물을 이용한 하기 방법으로 실시하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

비만억제활성의 측정방법은 다음과 같다:

Crj : 생후 7주된 ICR 계 수컷 마우스(챨스리버, 일본)를 1주일 동안 예비사육하고 1군 7마리로 실험에 사용하였다. 동물은 온도 23± 1℃, 습도 55± 5%, 조명시간 12시간/일(day)로 설정된 항온항실에서 사육하고, 사료에 라보MR(일본농산공업 제조)을 사용하며 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 카바크롤은 0.1% 와 1%가 되도록 리포좀제형(레시틴 5%에 녹인 것)으로 제조하였다. 각 시료 용액은 마우스 10 g당 0.1 ml 투여되도록 농도를 조정하여 투여량을 1.5 g/kg 과 1 g/kg으로 하였다. 또한, 대조군은 5% 레시틴 에멀젼으로 하였다. 마우스는 투여하기 전날부터 절식(絶食) 상태로 하여 다음 날 강제로 단회(單回) 투여하였다. 시험기간은 2주일로 하고 체중 및 일반증상을 측정 및 관찰하였다.

시료	일수	체중(g)
		무처리군	카바크롤(0.1%)	카바크롤(1%)
카바크롤 리포좀제형	5	34	32	34
	10	38	35	37
	15	46	43	42

상기 표 11에 기재된 바와 같이, 카바크롤은 비만억제 효과를 나타내었고 투여 농도가 높아질수록 그 효능이 증가됨을 관찰할 수 있었다.

실시 예 11: 탈모방지 및 육모효과

탈모방지와 육모효과에 대한 효과를 측정하기 위하여 시료를 방부제와 점증제만 함유한 하이드로 젤 베이스로 만들어 시험을 실시하였다. 제조한 발모촉진용 외용액제를 이용하여 약화 또는 방사능노출에 따른 탈모 환자 10명의 탈모부위에 1일 2회 각각 3㏄씩 6개월간 적용하였다. 그 결과, 탈모 환자 8명에게서 새로운 모근이 발생하는 등의 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다. 시험결과는 다음과 같다. 대조구로서 한미약품에서 판매 중인 목시딜을 사용하였다.

무처리군	목시딜	카바크롤
-	++	++

상기 표 12에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 카바크롤은 발모제로 판매되고 있는 목시딜과 유사한 발모 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서 이용되는 유효성분인 카바크롤은 기존의 주름개선제로 사용되고 있는 레티놀에 비해 세포독성도 낮으면서, 콜라게네이즈 활성 억제 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효능, 항비만, 발모촉진 또는 탈모방지 효과를 가진다. 또한, 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 카바크롤(carvacrol)을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 카바크롤은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001-10.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 삭제
7. 삭제

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