KR100863078B1

KR100863078B1 - 트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 안하이드로트롬빈 유도체및 그 제조방법, 혈소판 응집야기 조성물, 혈소판응집야기 방법, 임상검사약, 임상검사방법, 혈전형성억제제, 흡착체 및 그 제조방법, 정제된 혈액응고 제 ⅷ인자의 제조방법

Info

Publication number: KR100863078B1
Application number: KR1020037011791A
Authority: KR
Inventors: 카즈야 호소카와
Original assignee: 후지모리 고교 가부시키가이샤; 칫소가부시키가이샤
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2008-10-10
Also published as: CA2441201A1; DE60237757D1; CN1498226A; JPWO2002077031A1; EP1371663B1; AU2002238965A1; AU2002238965B2; WO2002077031A1; AU2002238965B8; EP1371663A1; ATE482231T1; CN1281624C; KR20030088451A; US20040096953A1; JP4137642B2; US6946279B2; EP1371663A4

Abstract

피브리노겐 활성을 저하시키는 트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 및 피브리노겐 활성을 저하시키는 안하이드로트롬빈 유도체 및 그 제조방법을 제공한다. 본 발명은, 트롬빈의 카르복실기가 수식된 트롬빈 유도체; 및 안하이드로트롬빈의 카르복실기가 수식된 안하이드로트롬빈 유도체를 제공하는 것이다. 상기 트롬빈 유도체는, 피브리노겐에 대한 친화성이 저하되어 있기 때문에, 혈소판 응집야기 조성물로서, 더더욱은 임상검사용 등에 특이적인 응고반응 시약으로서 이용할 수 있다. 또한, 안하이드로트롬빈을 리간드로 해서, 카르복실기와 결합시킨 어피니티 크로마토그래피에 의해, 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 대해 보다 선택성이 높은 정제가 가능하게 되고, 또, 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식한 안하이드로트롬빈 유도체는, 종래의 안하이드로트롬빈과 비교해서 소량으로도 충분한 항혈전 효과를 발생시키기 때문에, 혈전형성 억제제로서 이용할 수 있다.

트롬빈, 안하이드로트롬빈, 혈소판, 응집, 혈장형성억제제, 임상검사약, 혈액응고인자

Description

트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 안하이드로트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 혈소판 응집야기 조성물, 혈소판 응집야기 방법, 임상검사약, 임상검사방법, 혈전형성 억제제, 흡착체 및 그 제조방법, 정제된 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조방법{THROMBIN DERIVATIVE AND METHOD FOR PREPARATION THEREFORE, ANHYDROTHROMBIN DERIVATIVE AND METHOD FOR PREPARATION THEREFORE, COMPOSITION FOR CAUSING PLATELET AGGREGATION, METHOD FOR CAUSING PLATELET AGGREGATION, CLINICAL TEST DRUG, METHOD FOR CLINICAL TEST, INHIBITOR FOR THROMBUS FORMATION, ADSORBENT AND METHOD FOR PREPARATION THEREFORE, METHOD FOR PREPARATION OF PURIFIED BLOOD COAGULATION FACTOR Ⅷ}

본 발명은, 트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 안하이드로트롬빈 유도체 및 그 제조방법, 당해 트롬빈 유도체를 이용한 혈소판 응집야기 조성물, 혈소판 응집야기 방법, 임상검사약 및 임상검사방법, 당해 안하이드로트롬빈 유도체를 이용한 혈전형성 억제제, 흡착체 및 그 제조방법, 및 당해 흡착체를 이용해서 정제된 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조방법에 관한 것이다.

근년, 혈전형성 방지물질을 합성하는 방법으로서, 특개평 11-49800 호 공보에 기재되어 있는 세린 프로테아제(serine protease)인 활성화 혈액응고인자에 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)등의 저해제와 반응시켜서 활성부위에 존재하는 세린 잔기를 디하이드로알라닌으로 전환하여, 세린 프로테아제 활성을 상실시켜 기질과의 결합능만을 유지시키는 방법(안하이드로화라고 칭한다.), 또는 유전자 재조합 조작에 의해 세린 프로테아제 활성을 소실시키는 방법이 개발되어 있다. 이들 방법을 이용해서 트롬빈을 처리하여 얻어진 안하이드로트롬빈은, 활성화 혈액응고인자와 기질과의 반응을 경쟁적으로 저해하는 효과를 가져서, 트롬빈 기질(활성화 혈액응고인자, 피브리노겐 등)의 흡착체의 리간드로서의 이용이나, 혈전형성 억제제로서의 이용이 기대되고 있다.

그러나, 이 안하이드로트롬빈은 화학처리나 유전자조작에 의해 세린 프로테아제 활성을 잃어버렸을 뿐이어서 기질의 결합능에 관해서는 미처리의 트롬빈과 기본적으로 달라지지 않기 때문에, 안하이드로트롬빈을 리간드로 한 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)에서 트롬빈의 기질(혈액응고 제 Ⅴ, 제 Ⅷ, 제 ⅩⅠ, 제ⅩⅢ 인자, 피브리노겐, 프로틴 C 등)이 혼재하는 혈장 등의 액으로부터 혈액응고 제 Ⅷ 인자를 선택적으로 흡착, 회수하는 것은 곤란했다. 또한, 안하이드로트롬빈은 항혈전제로서의 기능을 가지긴 하지만, 전술한 항혈전제 동등의 항혈전 효과를 나타내기 위해서는 사용량이 많이 필요하고, 그 사용이 한정되어 있다.

또한, 혈소판 기능이상의 진단에 있어서, 혈소판 응집능의 측정은 필수인데, 트롬빈은 혈소판 응집야기 물질로서 측정에 사용되고 있지만, 트롬빈은 혈소판의 응집 이외에도 피브리노겐의 활성화도 유기(誘起)하기 때문에, 피브린의 응집괴가 혈소판 응집능의 측정에 악영향을 미치는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은, 활성화 혈액응고인자인 트롬빈 또는 트롬빈을 안하이드로화한 안하이드로트롬빈에 관해서, 화학적, 또는 유전자 조작에 의한 수식에 의해 트롬빈 기질(혈액응고 제 Ⅷ 인자)의 선택성을 향상시킨 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈 유도체, 및 트롬빈 유도체를 성분으로서 포함하는 혈소판 응집야기 물질 및 임상검사약, 및 이 안하이드로트롬빈을 리간드로 한 흡착체, 또한 안하이드로트롬빈 유도체를 주성분으로 하고, 항혈전 성능을 향상시킨 혈전형성 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명자는, 트롬빈에 관해서 예의 연구를 거듭한 결과, 트롬빈의 카르복실기를 수식한 트롬빈 유도체는, 트롬빈 기질 중 피브리노겐의 친화성을 선택적으로 저하시키고, 즉, 피브리노겐에서 피브린으로의 변환을 저해해서, 혈소판만을 특이적으로 활성화한다는 것을 발견했다.

또한, 본 발명자는, 더욱 안하이드로트롬빈에 관해서 예의 연구를 거듭한 결과, 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식한 안하이드로트롬빈 유도체는, 상대적으로 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 대한 특이적 선택성이 향상된다는 것, 항혈전성이 향상된다는 것을 지득했다. 이들의 지견(知見)에 기초해서 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은, 하기의 (1)~(14)의 구성으로 이루어진다.

(1) 트롬빈의 카르복실기가 수식된 트롬빈 유도체.

(2) 안하이드로트롬빈의 카르복실기가 수식된 안하이드로트롬빈 유도체.

(3) 트롬빈의 카르복실기를 수식하는 것을 특징으로 하는 상기 트롬빈 유도 체의 제조방법.

(4) 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식하는 것을 특징으로 하는 상기 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.

(5) 상기 (1)에 기재된 트롬빈 유도체를 포함하는 혈소판 응집야기 조성물.

(6) 상기(1)에 기재된 트롬빈 유도체를 이용하는 것을 특징으로 하는 혈소판응집야기 방법.

(7) 상기 (1)에 기재된 트롬빈 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 임상검사약.

(8) 상기 (1)에 기재된 트롬빈 유도체를 이용하는 것을 특징으로 하는 임상검사방법.

(9) 상기 (2)에 기재된 안하이드로트롬빈 유도체를 함유하는 혈전형성 억제제.

(10) 안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합하여 이루어진 흡착체에 있어서, 상기 결합이, 안하이드로트롬빈의 카르복실기와 불용성 담체의 관능기의 반응에 의한 것인 흡착체.

(11) 아미노기를 2 이상 가지는 화합물의 아미노기와 안하이드로트롬빈의 카르복실기와의 결합에 의해 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈과, 수불용성 담체 가 결합하여 이루어진 흡착체에 있어서, 상기 결합이, 상기 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈이 함유하는 아미노기와 불용성 담체의 관능기와의 반응에 의한 것인 흡착체.

(12) 안하이드로트롬빈의 카르복실기와 불용성 담체의 관능기를 반응시키는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합하여 이루어지는 흡착체의 제조방법.

(13) 아미노기를 2 이상 함유하는 화합물의 아미노기와 안하이드로트롬빈의 카르복실기와의 결합에 의해 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈이 가지는 아미노기와, 불용성담체의 관능기와를 반응시키는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈과 수불용성담체가 결합되어 이루어진 흡착체의 제조방법.

(14) 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 흡착체를 이용하는 것을 특징으로 하는 정제된 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조방법.

제 1 도는, 전혈(全血)에서의 트롬보엘라스토그램(TEG)이다.

제 2 도는, 실시예 8에 있어서, 10㎕ 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응집의 변화(흡광도의 변화)를 나타내는 그래프이다.

제 3 도는, 실시예 8에 있어서, 100㎕ EDC 수식 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응집의 변화(흡광도의 변화)를 나타내는 그래프이다.

제 4 도는, 실시예 8에 있어서, 10㎕ EDC 수식 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응 집의 변화(흡광도의 변화)를 나타내는 그래프이다.

제 5 도는, 실시예 9에서 얻은 수식 트롬빈에 의한 피브리노겐에 대한 응고활성과 아미노기(아민) 양을 나타내는 그래프이다.

제 6 도는, 실시예 10에 있어서, 각 농도의 EDC 수식 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응집의 변화(흡광도의 변화)를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

제 1의 태양에 의하면, 본 발명은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식한 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명에서 수식의 대상이 되는 안하이드로트롬빈의 제조방법은 특히 한정되는 것은 아니며, 안하이드로트롬빈으로서는, 예를 들어, 특개평 11-49800호 공보에 나타나 있는 것처럼, 세린 프로테아제의 세린 활성잔기 부위와 PMSF 등의 저해제를 반응시킨 후, pH 11 이상에서 알칼리 처리를 해서, 안하이드로화하여 얻어진 것, 또 유전자재조합 등의 수법으로 트롬빈의 활성세린잔기를 알라닌으로 치환하여 효소 활성을 소실시키는 방법으로 얻어진 것을 들 수 있다.

안하이드로트롬빈의 정제방법은 특히 제한되는 것은 아니며, 종래 공지의 정제분리방법이 이용될 수 있다. 구체적으로는, pH 4~10의 범위에서 조정된 완충액(세린 프로테아제의 안하이드로화 반응 시에 이용된 완충액을 그대로 사용해도 좋다)을 사용해서 평형화시킨 어피니티 크로마토그래피 칼럼에 안하이드로트롬빈 용 액을 통액(通液)해서 크로마토그래피 담체에 안하이드로트롬빈을 선택적으로 흡착시킨 후 세정하여, 다른 불순물을 제거하는 방법이 있다.

그 후, 어피니티 크로마토그래피 담체에 결합한 안하이드로트롬빈을 탈리할 목적으로, 세린 프로테아제 저해제 용액, 또는 아미디노기, 구아니딜기, 페닐기, 장쇄 알킬기, 아르기닌 잔기 중 적어도 하나 이상을 가지는 물질 용액을 pH 4~10으로 조정하고, 어피니티 칼럼에 통액해서, 목적 물질을 용출시킨다. 그 후, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 수법에 의해 전술한 탈리액 성분을 제거하여, 고순도의 안하이드로트롬빈을 얻을 수 있다.

본 발명의 안하이드로트롬빈의 정제에 이용될 수 있는 세린 프로테아제 저해제로서는, 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 2-페닐에탄-1-설포닐 플루오라이드, 메탄설포닐 플루오라이드, 및 p-톨루엔설포닐(토실) 플루오라이드 등의 각종 설포닐 플루오라이드, 더더욱, 토실 클로라이드, 디이소프로필플루오로린산(DFP), 3,4-디클로로이소 쿠머린(3,4-DCI), L-1-클로로-3-[4-토실아미드]-7-아미노-2-헵타논-염산(TLCK), 및 L-1-클로로-3-[4-토실아미드]-4-페닐-2-부타논(TPCK) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 해서 얻어진 안하이드로트롬빈, 또는 트롬빈이 가지는 카르복실기를 수식하여, 트롬빈, 또는 안하이드로트롬빈 유도체를 얻는다. 여기서 말하는 수식이란, 트롬빈, 또는 안하이드로트롬빈이 가지는 카르복실기의 일부 또는 전부의 수식을 의미하고, 그 수식 방법으로서는, 이미드 결합 또는 아미드 결합인 것이 바람직하고, 예를 들어, 트롬빈, 또는 안하이드로트롬빈이 가지는 카르복실기의 일 부 또는 전부를 이미드와 결합시키는 방법; 트롬빈, 또는 안하이드로트롬빈이 가지는 카르복실기의 일부 또는 전부를 아미노기를 가지는 물질과 결합시키는 방법; 및 트롬빈, 또는 안하이드로트롬빈이 가지는 카르복실기의 일부 또는 전부를 이미드 및 아미노기를 가지는 물질과 결합시켜서, 당해 카르복실기를 수식하는 방법이 있다. 아미노기를 가지는 물질로서는, 화합물, 천연 유래의 물질 등 특히 한정되지는 않지만, 카르복실기 주변의 입체적 부피를 증가시키는 것이 보다 바람직하다. 또한, 이들의 반응 방법에 대해서는 종래 기지의 방법을 이용할 수 있다.

상기에서 사용된 이미드는, 특히 제한되지는 않지만, 카르보디이미드 유도체, 보다 바람직하게는 식 :R¹N=C=NR²로 표시되는 카르보디이미드 유도체가 바람직하게 사용된다. 상기 식에 있어서, R¹ 및 R²는 메틸기, 에틸기, 사이클로헥실기 등의 탄소 원자수 1~15의 쇄상 또는 환상 알킬기, (2-몰폴리노에틸)-p-톨루엔메토설폰산염, (3-디메틸아미노프로필) 염산염 등을 나타낸다. 이 때 R¹ 및 R²는, 동일한 것이어도 또는 다른 것이어도 좋다. 보다 구체적으로, 카르보디이미드 유도체로서는, 디사이클로헥실카르보디이미드 (이하 「DCC」로 기재 한다)

, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드{N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}

(이하「EDC」로 기재한다), 및 N-사이클로헥실-N'-2-(4'-메틸-몰폴리니엄)에틸카르보디이미드-p-톨루엔설포네이트) {N-cyclohexyl -N'- 2- (4'-methyl-morpolinium) ethyl carbodiimide -p- toluene sulphonate} (이하「CMC」로 기재한다)등을 들 수 있다. 이들의 카르보디이미드 유 도체는, 단독으로 사용되어도 또는 2종 이상의 혼합물의 형태로 사용되어도 좋다. 이들 중, 수용성 카르보디이미드인 EDC 및 CMC가 특히 바람직하게 사용된다.

본 발명에 있어서, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 이미드에의한 수식 조건은, 사용된 안하이드로트롬빈이나 수식 물질(이미드)의 종류나 양, 및 다른 조건 등에 의해 달라지고, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기가 소망하는 정도까지 수식될 수 있는 조건이라면 특히 제한되지 않는다. 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 수식의 바람직한 일실시 태양을 이하에 기재한다. 즉, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈을 우선 적당한 pH의 완충액으로 투석한 후, 수식 물질을 첨가하고, 0~50℃, 바람직하게는 4~25℃, 특히 바람직하게는 실온에서, 0.5~24시간, 바람직하게는 1~7시간, 교반한다. 이 때, 사용할 수 있는 완충액으로서는, pH 3~9, 바람직하게는 pH 4~7을 나타내는 완충액에서 임의로 선택된 것을 첨가한 것이면 좋다. 이렇게 한 완충액으로서는, 예를 들어, 피페스(PIPES) 완충액, 인산 완충액, 탄산염 완충액, 중탄산염 완충액, 트리스 완충액, 시트르산-인산나트륨 완충액, 숙신산-수산화나트륨 완충액, 프탈산칼륨-수산화나트륨 완충액, 이미다졸염산 완충액, 붕산 완충액, 생리적 염류용액 또는 굳즈 완충액(Good's buffer) 등을 들 수 있다. 또한, 수식 물질의 첨가량은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 소망하는 정도까지 수식할 수 있는 양이라면 특히 제한되지 않지만, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈에 대해서 과잉으로 존재하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 상기 완충액 중에 0.01M~5M, 보다 바람직하게는 0.1~2M 정도의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

더욱 본 발명에 있어서, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 이미드(카르보디이미드 유도체)에 의한 수식에 의해서, 카르복실기는, 하기 식에 나타난 것처럼 수식된다고 생각된다.

본 발명에 있어서, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 수식은, 아미노기를 가지는 물질을 이용해서 행해져도 좋다. 이와 같은 아미노기를 가지는 물질에 의한 수식에 의해, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기(-COOH)가 아미드(-CO-NHR)로 변환된다. 이 때, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 수식은, 아미노기를 가지는 물질을 단독으로 이용해서 행해져도 좋지만, 아미노기를 가지는 물질 및 이미드를 조합시켜 사용하여 행해지는 것도 바람직하다. 후자의 경우, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 이미드로 수식한 후에, 또는 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 이미드에 의한 수식 공정 중에 동시에 가해도 좋다.

본 발명에서 사용되는 아미노기를 가지는 물질은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기(-COOH)가 아미드(-CO-NHR)로 변환되는 것이라면, 화합물, 천연유래의 물질 등 특히 한정은 없지만, 카르복실기 주변의 입체적 부피를 증가시키는 것이 보다 바람직하다. 아미노기를 가지는 물질의 구체예로서는, 에틸렌디아민, 트리스히드록시아미노메틸, 히드록시아민, 에탄올아민, 염화암모늄 등을 들 수 있다. 이들 중, 에틸렌디아민, 트리스히드록시아미노메틸이 바람직하다. 또한, 이들의 반응 방법에 있어서는, 종래 기지의 방법을 이용할 수 있다. 아미노기를 가지는 물질은, 단독으로 사용되어도 또는 2종 이상의 혼합물의 형태로 사용되어도 좋다.

본 발명에 있어서, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 이미드 및 아미노기를 가지는 물질에 의한 수식 조건은, 사용되는 안하이드로트롬빈이나 수식 물질(이미드 및 아미노기를 가지는 물질)의 종류나 양, 및 다른 조건등에 의해서 달라지고, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 소망하는 정도까지 수식할 수 있는 조건이라면 특히 제한되지 않는다. 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기 수식의 바람직한 일실시 태양을 이하에 기재한다.

즉, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈을 우선 적당한 pH의 완충액으로 투석해서 협잡물을 제거한 후, 수식 물질을 첨가하고, 0~50℃, 바람직하게는 4~25℃, 특히 바람직하게는 실온에서, 0.5~24시간, 바람직하게는 1~7시간, 교반한다. 이 때, 사용할 수 있는 완충액으로서는, pH 3~9, 바람직하게는 pH 4~7을 나타내는 완충액으로부터 임의로 선택된 것을 가한 것이면 좋다. 이렇게 한 완충액으로서는, 예를 들어, 피페스 완충액, 인산 완충액, 탄산염 완충액, 중탄산염 완충액, 트리스 완충액, 시트르산-인산나트륨 완충액, 숙신산-수산화나트륨 완충액, 프탈산칼륨-수산화나트륨 완충액, 이미다졸염산 완충액, 붕산 완충액, 생리적 염류용액 또는 굳즈 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 이미드 및 아미노기를 가지는 물질의 첨가량은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 소망하는 정도까지 수식할 수 있는 양이라면 특히 제한되지 않지만, 이미드의 첨가량은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈 에 대해서 과잉으로 존재하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 상기 완충액 중에 0.01~5M, 보다 바람직하게는 0.1~2M인 것이 바람직하다. 또한, 아미노기를 가지는 물질의 첨가량은, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈에 대해서 과잉으로 존재하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 상기 완충액 중에 0.1M~5M, 더욱 바람직하게는 0.5~2M인 것이 바람직하다.

더욱, 본 발명에 있어서, 트롬빈 또는 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 이미드(카르보디이미드 유도체) 및 아미노기를 가지는 물질에 의한 수식에 의해서, 카르복실기는, 하기 식에 나타난 것처럼 수식된다고 생각된다.

본 발명에 있어서, 상기의 트롬빈 유도체는, 트롬빈의 카르복실기의 일부 또는 전부를 이미드와 결합시키는 것에 의해, 또는 트롬빈을 이미드 및 아미노기를 가지는 화합물과 결합시키는 것에 의해, 피브리노겐의 친화성을 선택적으로 저하시키며, 피브리노겐으로부터 피브린에의 변환을 저해해서, 혈소판만을 특이적으로 활성화하는 것을 특징으로 한다. 이 때문에, 본 발명의 트롬빈 유도체는, 혈소판 응집야기 물질로서, 더우기, 임상검사약, 특히 혈소판의 정상성을 모니터 하기위한 검사약으로서 유용하다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기의 안하이드로트롬빈 유도체는, 안하이드로트롬빈의 카르복실기의 일부 또는 전부를 이미드와 결합시키는 것에 의해, 또는 안하 이드로트롬빈을 이미드 및 아미노기를 가지는 화합물과 결합시키는 것에 의해, 혈액응고 제 Ⅷ 인자를 포함하는 혈액응고인자나 혈소판등에의 얼마간의 작용 또는 영향에 의해 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 대해 향상된 선택적 친화성을 가진다; 및 항혈전성이 개선된 것을 특징으로 한다. 이 때문에, 본 발명의 안하이드로트롬빈 유도체는, 흡착체, 특히 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 정제용의 흡착체에; 및 혈전형성 억제제, 특히 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 특이적인 혈전형성 억제제로서 유용하다.

제 2의 태양에 의하면, 본 발명은, 트롬빈의 카르복실기를 수식한 트롬빈 유도체를 성분으로 하는 혈소판 응집야기 물질 및 임상검사약이다. 본 발명의 트롬빈 유도체는 피브리노겐의 친화성을 수식에 의해 저하시켜서, 트롬빈에 의한 피브린 형성을 억제할 수 있기 때문에, 피브린 석출에 의한 영향을 받지 않고, 혈소판 응집 작용만을 특이적으로 일으킬 수 있다. 또한, 이 특질을 살려서, 혈전증 등에 있어서 임상검사용의 시약으로서 사용할 수 있다.

제 3의 태양에 의하면, 본 발명은, 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식한 안하이드로트롬빈 유도체를 함유하는 혈전형성 억제제를 제공하는 것이다. 임상에서, 혈액응고를 억제해야할 병체는 많고, 그 때의 상태에 대응해서 혈전형성 억제제를 투여할 필요가 있지만, 본 발명의 혈전형성 억제제는 생리적인 물질 유래이고, 종래의 안하이드로트롬빈을 함유하는 혈전형성 억제제와 비교해서 보다 소량으로 혈액응고 억제효과를 나타내기 때문에, 안전성, 코스트 면에서도 바람직하다.

제 4의 태양에 의하면, 본 발명은 안하이드로트롬빈의 카르복실기와 수불용성 담체상의 관능기가 결합해서 이루어진 흡착체를 제공하는 것이다.

본 발명에 사용된 담체로서는, 공지의 담체가 사용될 수 있지만, 수불용성 담체가 바람직하게 사용된다. 본 명세서에 있어서, 「수불용성 담체」라는 것은, 담체를 구성하는 성분이 비수용성, 또는 수용성의 물질을 가교 반응 등의 처리를 행하는 것에 의해 수불용성으로 한 물질로부터 이루어진 담체를 의미한다. 구체적으로는 가교 아가로오스, 셀룰로오스, 키토산, 및 폴리아크릴아미드 등을 들 수 있고, 이 들 중, 셀룰로오스 및 가교 아가로오스가 담체로서 바람직하게 사용된다. 또한, 상기 수불용성 담체의 형상은, 특히 제한되지 않고, 공지의 형상이 사용되지만, 예를 들어, 구상입자상(球狀粒子狀), 중공사상(中空絲狀) 및 막상(膜狀) 등의 형상을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 수불용성 담체가 구상입자인 경우에는, 그 형상은 정확히 진구일 필요는 없지만, 진구도(眞球度)의 높이인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 구상입자의 진구도가 0.9 이상, 보다 바람직하게는 0.95 이상인 것이 바람직하다. 더욱, 본 명세서에 있어서, 「진구도」라는 것은, 입자의 최소경(단경)에 대한 최대경(장경)의 비(=단경/장경)이고, 고로 이 값이 1.0에 가까울수록 진구도가 높은, 즉, 진구에 가까워지는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서, 수불용성 담체의 형상이 구상인 경우, 이 수불용성담체는 구상 셀룰로오스인 것이 바람직하다. 이와 같이 수불용성 담체로서 구상 셀룰로오스를 사용하는 것에 의해, 리간드인 안하이드로트롬빈의 고정화가 용이하고, 안하이드로트롬빈을 리간드로서 포함하는 활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자 흡착체는, 생체 적합성 및 강도도 함께 높아진다. 이 때문에, 본 발명의 흡착체는, 활성화 및/ 또는 비활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 흡착체로서 유효하다. 더욱, 여기서 나타난 「생체 적합성」이라는 것은, 담체를 흡착체 담체로 이용해서 정제 조작을 행할 때에, 담체로부터 생체에 유해한 물질의 용출이 발생하지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 수불용성 담체의 형상이 중공사상인 경우에 있어서 중공사상의 담체는, 내부에 연속 또는 불연속의 공동(空洞)을 가지는 섬유상의 담체를 의미하고, 예를 들어 방사액에 발포제를 첨가하는 것에 의해, 또는 특수한 구금(口金) 등을 이용해서 내부에 공동을 형성하는 것에 의해 얻을 수 있다.

더더욱, 본 발명에 있어서, 수불용성 담체의 형상이 막상인 경우에 있어서 막상의 담체로는, 시판되는 멤브란 필터와 같이 평판상으로 다공(多孔)을 가지고, 일정한 범위의 배제한계(排除限界)분자량을 가지는 것이다.

본 발명에 있어서, 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수불용성 담체에 고정시키는 방법으로는, 종래 기지의 방법이 사용될 수 있지만, 예시하면 수용성 카르보디이미드인 EDC나, CMC를 이용해서, 수불용성 담체상의 아미노기와 결합시키는 방법, 또는, 안하이드로트롬빈의 카르복실기와 EDC, 또는 CMC를 결합시킨 후, 에틸렌디아민 등의 복수의 아미노기를 가지는 화합물과 축합시킨 후, 도입된 아미노기와 수불용성 담체상의 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)(이하, 「NHS」로 칭한다.)와를 결합시키는 방법 등이 있다. 결합의 방법으로서는 NHS 결합 담체를 이용한 결합이 과잉 활성기의 블로킹 때에 리간드인 안하이드로트롬빈이 가지는 아미노기에 영향을 부여하지 않기 때문에, 보다 바람직하다.

수불용성 담체와 리간드 사이에 삽입되는 스페이스에 관해서는 특히 한정은 없고, 에폭시기, 포르밀기 등을 가지는 공지의 화합물에서 적절한 정도의 길이를 가지는 것을 적당 선택할 수 있다.

제 5의 태양에 의하면, 본 발명은, 제 4의 태양의 활성화응고 제 Ⅷ 인자 흡착체를 사용하는 활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조 방법을 제공하는 것이다. 이 방법을 사용하는 것에 의해, 다른 트롬빈 기질인 피브리노겐이나, 활성화 혈액응고 제 Ⅴ인자를 거의 흡착하지 않고, 활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자를 선택적으로 흡착하는 것이 가능하고, 또한 면역원이 되는 물질이나 이종 단백이나 바이러스 등의 혼입 가능성도 유의미하게 낮게 억제할 수 있다.

본 발명의 활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조방법으로서는, 본 발명의 제 4의 태양인 활성화응고 제 Ⅷ 인자 흡착체를 칼럼에 충진해서, 다른 혈액 응고인자 등을 포함한 혈장 성분, 또는 협잡물로서 이종 단백이나 바이러스 등이 혼입되어 있는 혈장 등의 용액 중으로부터 활성화 혈액응고 제 Ⅷ 인자를 선택적으로 흡착하고, 고도로 회수, 또는 제거하는 방법이다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 구체적으로 설명한다.

실시예 1 : 안하이드로트롬빈의 합성

인간 혈장 유래 트롬빈 60mg을 0.15 M의 NaCl, 0.1% PEG를 포함하는 50mM 인 산 완충액(pH 6.5) 100ml에 용해했다. 이 용액에 7% PMSF 메탄올 용액 100㎕를, 30분 간격으로 3회 첨가했다. 반응 동안 용액의 온도를 25℃로 유지했다. 반응 후의 트롬빈 활성은 1% 이하였다. PMS-트롬빈 용액을 0.1M NaCl, 0.1% PEG를 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 6.5)으로 평형화한 세파덱스(Sephadex) G-25 칼럼(펄머시아사제)에 주입하여 완충액의 교환을 행했다.

상기 용액을 4℃, 120ml로 조정하여 최종 농도 0.05M이 되도록 1N NaOH를 첨가하여 12분간 반응을 행했다. 얻어진 용액에 대해 3N NaCl 60ml를 첨가하고, 이어서 150ml 글리세린을 첨가 교반했다. 상기 용액을 10배량의 1M NaCl, 0.1% PEG를 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 6.5)에 투석 후, 다시 0.1M NaCl, 0.1% PEG를 포함하는 10mM 인산 완충액( pH 6.5)에 투석했다.

실시예 2 : 안하이드로트롬빈의 정제

실시예 1에서 얻어진 안하이드로트롬빈 용액을 바이오맥스 10(밀리포어사)에 의해 50ml로 농축하고, 30mg p-아미디노페닐 메탄설포닐 플루오라이드(APMSF)를 첨가하여 잔존 활성을 불활성화했다.

그 위에, 얻어진 용액을 0.1% PEG를 포함하는 5mM 인산 완충액으로 pH 6.5로 평형화한 벤즈아미딘세팔로스 칼럼에 첨가했다. 피크가 끝날 때까지 동 완충액으로 세정하고, 0.1M NaCl을 포함하는 0.2M 벤즈아미딘(pH 6.5)에 의해 용출하고, 20ml씩 60ml를 분취했다. 각각의 단백량을 측정하고, 안하이드로트롬빈이 포함되는 프랙션을 확인하고, 이 프랙션을 0.1M NaCl을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 6.5)으 로 투석하고, 용액 중의 벤즈아미딘을 제거했다. 이 용액 중의 단백량은 30mg (수율 50%)이었다.

실시예 3 : 안하이드로트롬빈의 수식

실시예 2에서 얻어진 안하이드로트롬빈 30mg을 pH 6으로 조정한 20mM 피페스버퍼, 0.5M NaCl로 투석했다. 투석 후 30ml로 조정하여 20mg/ml가 되도록 EDC를 가하여 교반했다. 실온에서 3시간 반응시켜, 안하이드로트롬빈 유도체로서 EDC 수식 안하이드로트롬빈 30mg을 얻었다.

실시예 4 : 안하이드로트롬빈 결합 어피니티 크로마토그래피의 제조

실시예 2에서 얻어진 안하이드로트롬빈 30mg을 pH 6으로 조정한 20mM 피페스버퍼 0.5M NaCl 10ml 중에 투석하고, 아미노셀룰로파인(칙소사) 20ml에 첨가했다. 다시 pH를 6으로 조정하고 20mg/ml가 되도록 EDC를 첨가해 6시간 실온에서 반응시켰다.

실시예 5

실시예 4에서 얻어진 셀룰로오스 겔을 칼럼에 충진해서 50mM 피페스 버퍼 0.1M NaCl pH 6.5로 평형화했다. 동 버퍼에 용해된 콘팩트 F(화혈연)를 첨가해서 동 버퍼에서 비흡착 피크를 세정했다. 그 위에 혼입된 피브리노겐을 50mM 피페스 버퍼 0.3M NaCl pH 6.5에서 세정 후 50mM 피페스 버퍼 0.1M NaCl 1M 아르기닌 염산 염 pH 6.5에서 혈액응고 제 Ⅷ 인자를 용출했다. 혼입된 피브리노겐을 제거해서 약 비활성 1000 u/mg 혈액응고 제 Ⅷ 인자가 회수되었다.

실시예 6

실시예 3에서 얻어진 유도체를 첨가해서 전혈의 트롬보에라스토그램(TEG)을 측정하고, 그 결과를 제 1 도에 나타냈다. 그 결과, 제 1 도에 나타난 것처럼, 본 발명의 EDC 수식 안하이드로트롬빈은, 농도 의존적으로 응고를 연장시켰다.

실시예 7

인간 혈장에 대하여 실시예 3의 안하이드로트롬빈 유도체 (EDC 수식 안하이드로트롬빈)를 첨가하고, APTT(활성화부분 트롬보플라스틴 시간) (표 1), PT(프로트롬빈 시간) (표 2)을 측정했다.

	각 첨가 농도에 있어서 혈장 응고 시간
	무첨가	0.1mg/ml	0.2mg/ml
EDC 수식 안하이드로트롬빈	42.5초	115초	>180초
안하이드로트롬빈	42.5초	45초	50초

	각 첨가 농도에 있어서 혈장 응고 시간
	무첨가	0.1mg/ml	0.2mg/ml
EDC 수식 안하이드로트롬빈	24초	26초	31초
안하이드로트롬빈	24초	25초	28초

상기 표 1 및 2 에 나타난 결과로부터, 본 발명의 안하이드로트롬빈 유도체인 EDC 수식 안하이드로트롬빈은, APTT에 특이적인 농도 의존적인 혈장응고 시간의 연장이 확인되었다. 이 때, APTT는 내인계 응고에 관련되고, PT는 외인계 응고에 관련된다는 것을 함께 생각하면, 본 발명의 안하이드로트롬빈 유도체인 EDC 수식 안하이드로트롬빈은, 외인계가 아닌 내인계 응고에 관여해서 응고 시간을 연장시키고, 이로 부터 혈전형성 억제제로서 유용하다는 것이 시사된다. 또한, 상기 실시예 5 및 하기 실시예 11 로부터, 본 발명의 안하이드로트롬빈 유도체는, 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 특이적으로 결합하는 것이기 때문에, 특히 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 특이적인 혈전형성 억제제로서 유용하다는 것이 시사된다.

실시예 8

인간 트롬빈 4mg을 50mM 피페스 버퍼 0.1M NaCl pH 6.5 4ml에 용해시켜 100mg EDC를 첨가해서 3시간 반응시키고, 트롬빈 유도체로서 EDC 수식 트롬빈을 얻었다. 혈소판 수 40만/㎕로 조정된 인간 다혈소판 혈장(PRP)을 이용한 상기 물질을 야기물질로서 혈소판 응집을 측정했다. 응집은 흡광도의 저하를 모니터 했다(응집메타아그리텍 TE-500 사용). PRP 240㎕에 대해서, 야기물질로서의 EDC 수식 트롬빈 10㎕ 및 100㎕를, 각각, 첨가했다. 비교로서 10

의 트롬빈을 이용했다.

제 2 도, 제 3 도 및 제 4 도는, 각각, 10㎕ 트롬빈, 100㎕ EDC 수식 트롬빈, 10㎕ EDC 수식 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응집의 변화(흡광도의 변화)를 나타내 는 그래프이다. 제 2 도, 제 3 도 및 제 4 도에서, EDC 수식 트롬빈을 이용하는 것에 의해, 비교 대조로서 트롬빈을 이용한 경우와 비교해서, 노이즈가 적은 모니터가 가능하다는 것을 알았다.

보다 상세하게 설명하면, 트롬빈은, 혈전 형성의 야기 물질이고, 종래, 혈소판의 정상성을 모니터 하기 위한 혈소판 활성화 물질중 하나이다. 그러나, 제 2 도에 나타난 것처럼, 트롬빈을 이용한 경우에는, 모니터 중에 노이즈가 꽤 발생한다는 것을 알았다. 이와 같은 노이즈는, 트롬빈은, 혈소판의 활성화만이 아니고, 피브리노겐으로부터 피브린으로의 변환도 일으키기 때문에 발생한다고 생각되고, 고로, 혈소판의 정상성만을 선택적으로 모니터하기 위해서는, 트롬빈으로부터 피브리노겐을 제거할 필요가 있다. 이 것에 대해, 본 발명의 트롬빈 유도체인 EDC 수식 트롬빈은, 제 3 도 및 제 4 도에서 나타난 것처럼, 모니터 중의 노이즈를 거의 발생시키지 않고, 즉, 피브리노겐으로부터 피브린으로의 변환도 일으키지 않고, 혈소판만을 특이적으로 활성화시킬 수 있다는 것이 나타난다. 따라서, 혈소판의 정상성의 모니터에 있어서, 피브리노겐을 제거할 필요가 없다고 생각된다. 더욱, 이하의 고찰에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 트롬빈 유도체에 의한 피브리노겐으로부터 피브린에의 변환의 억제(또는 저해)는, 트롬빈 유도체가, 트롬빈의 카르복실기의 수식에 의해, 트롬빈에 의한 피브리노겐의 활성화 부위를 수식하는 것에 의한다고 생각된다.

이로 부터, 본 발명의 트롬빈 유도체는, 혈소판 응집야기 물질로서, 또한, 임상검사약, 특히 혈소판의 정상성을 모니터 하기위한 검사약으로서 유용하다고 생 각된다.

실시예 9

(i): 에틸렌디아민 수식 트롬빈의 조제

트롬빈을 헤파린 칼럼에 첨가해서 흡착시켜, 1mM 피페스 버퍼, 0.5M NaCl, pH 6.5에서 용출시켰다. 얻어진 트롬빈 함유 용액(0.6 mg/ml)에 동량의 에틸렌디아민을 포함하는 용액(1M 에틸렌디아민 - 1mM PIPES - 0.5M NaCl pH 6.5)을 혼합했다. 이어서, 이것에 최종 농도 20mg/ml가 되도록 EDC를 첨가하고, EDC의 첨가로부터, 2시간에 걸쳐, 실온에서 교반하고, 축합반응을 행해서, 카르보디이미드 첨가시(반응 0분 때)로부터 1, 15, 30, 60, 90, 120분 후에 시료의 일부를 채취했다.

(ii): 에틸렌디아민 수식 트롬빈의 피브리노겐에 대한 응고 활성

상기 반응 0분 때, 1분 때, 15분 때, 30분 때, 60분 때, 90분 때, 120분 때의 시료에, 동량의 버퍼(50mM NaHCO₃, 0.1M NaCl, pH 8.0)를 가하여 축합반응을 정지시켰다.

얻어진 각 샘플 300㎕에 피브리노겐 용액(약 0.1 %) 1ml를 가하여, 피브리노겐 응고시간을 실온에서 측정했다.

반응 0분 때의 샘플의 응고시간을 100%로 해서, 각 샘플의 응고 활성을 나타 내면, 그 활성은 감소되고, 반응 60분 때 이후, 그 활성은 거의 상실되었다. 결과를 제 5A 도에 나타낸다.

(iii): 에틸렌디아민 수식 트롬빈의 아미노기의 정량

상기(i)의 반응 0분 때, 1분 때, 15분 때, 30분 때, 60분 때, 90분 때, 120분 때의 시료에, 소량의 강알칼리 용액을 가하여 반응을 정지시키고, 0.5M NaCl-50mM NaOH 용액에서 충분히 투석을 행하여, 비결합 에틸렌디아민을 제거했다.

얻어진 각 샘플 용액에 0.1M Na₂SO₃를 가하고, 다음에 TNBS(트리니트로벤젠설폰산)액을 첨가하고, 빠르게 교반하여, 5분 후에 아류산 이온을 포함하는 용액을 가하여 반응을 정지시켰다.

420nm에서의 흡광도(도 5B에 있어서 A420)를 측정하고, 각 샘플의 아미노기 정량을 행했다.

결과를 제 5B 도에 나타낸다. 축합 반응의 경과 시간과 함께 흡광도가 증가하고, 트롬빈의 표면에의 에틸렌디아민의 축합 반응량의 증가가 나타난다. 더욱, 트롬빈의 표면에는 디카르본산인 아스파라긴산이나 글루타민산이 존재하기 때문에, 상기 처리 (i)에 의한 상기 카르복실기에 에틸렌디아민의 아미노기가 축합된다. 또한, 에틸렌디아민은 아미노기를 2개 갖기 때문에, 축합 반응에 사용되지 않은 아미노기가 TNBS와 반응해서 420nm의 흡수에 의해 정량된다.

실시예 9의 결과로부터, 카르보디이미드를 이용한 트롬빈의 카르복실기에의 수식 반응은 경과 시간과 함께 진행되었다. 이 것은, 트롬빈에 포함된 복수의 카르 복실기에 대한 카르보디이미드에 의한 수식이 시간의 경과와 함께 진행되고, 반응 시간이 길수록 트롬빈에 있어서 카르보디이미드의 수식율을 증가시킬 수 있다는 것이 판명되었다. 그리고, 상기 에틸렌디아민 수식 트롬빈에 의한 피브리노겐에 대한 응고 활성은, 반응 60분 때의 에틸렌디아민 수식 트롬빈에 의해 완전히 소실되었다.

한편, 피브리노겐에 대한 응고 활성은, 반응 1분 때로부터 급격히 저하되고, 대응되는 아미노산의 정량치와 대비하면, 트롬빈의 일부에 카르보디이미드에 의한 수식이 행해진 경우에도 유효하게 피브리노겐에 대한 응고 활성의 저하 효과를 얻을 수 있다는 것이 판명되었다.

실시예 10

인간 트롬빈 4mg을 50mM 피페스 버퍼, 0.1M NaCl, pH 6.5 4ml에 용해시켜 100mg EDC를 첨가해서 3시간 반응시키고, 트롬빈 유도체로서 EDC 수식 트롬빈을 얻었다. 혈소판 수 40만/㎕로 조정한 인간 다혈소판 혈장(PRP)을 이용한 상기 물질을 야기 물질로 해서 혈소판 응집을 측정했다. 응집은 흡광도의 저하를 모니터 했다(응집 메타아그리텍 TE-500 사용). PRP에 대한 야기 물질로서의 EDC 수식 트롬빈을, 각각, 91.3 nM, 36.5 nM, 30.1 nM, 24.2 nM, 20.1 nM, 10.1 nM의 농도가 되도록, 첨가했다. 비교로서 EDC 수식 트롬빈을 가하지 않은 것(첨가 농도: 0 nM)을 이용했다.

제 6 도는, 각 농도의 EDC 수식 트롬빈 첨가 후의 혈소판 응집의 변화(흡광 도의 변화)를 나타낸 그래프이다. 제 6 도로부터, EDC 수식 트롬빈의 첨가 농도가 많을수록, 흡광도는 급격히 상승하고, 즉, 신속히 혈소판을 응집시킨다는 것을 알았고, 고로, EDC 수식 트롬빈은, 농도에 의존해서 혈소판을 야기한다는 것을 알았다.

이로 부터, 본 발명의 트롬빈 유도체는, 혈소판 응집야기 물질로서, 더더욱은, 임상검사약, 특히 혈소판의 정상성을 모니터하기 위한 검사약으로서 유용하다고 생각된다.

실시예 11

본 실시예에서는, 에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈의 기질 친화성을 이하와 같이 해서 평가했다.

실시예 2에서 얻어진 안하이드로트롬빈을, 1mM 피페스 버퍼, 0.5M NaCl, pH 6.5에서 투석하고, 얻어진 안하이드로트롬빈 함유 용액(0.6 mg/ml)에 동량의 에틸렌디아민을 포함하는 용액(1M 에틸렌디아민, 1mM PIPES, 0.5M NaCl, pH 6.5)을 혼합했다. 이어서, 이것에 최종 농도 20 mg/ml가 되도록 EDC를 첨가하고, EDC의 첨가후, 2시간에 걸쳐, 실온에서 교반하고, 축합 반응을 진행시켰다. 반응 후, 수식 안하이드로트롬빈을 0.5M 탄산수소나트륨, 0.5M NaCl 용액(4℃)에 대해서 2회 투석해서, 에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈을 얻었다.

이와 같이 해서 얻어진 에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈 및 비교로서의 안하이드로트롬빈에 있어서, 피브리노겐(Fbgn), 혈액응고 제 Ⅷ 인자(FVIII) 및 혈 액응고 제 Ⅴ 인자(FV) 간의 해리정수(Kd 값)를 IAsys(일제산업)를 이용해서 측정했다. 결과를 표 3에 나타낸다.

	FVIII	Fbgn	FV
에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈
안하이드로트롬빈

상기 표 3 에 나타난 것처럼, 에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈은, 혈액응고 제 Ⅷ 인자(FVIII)에 대해서는 높은 친화성을 유지하고 있지만, 피브리노겐(Fbgn) 및 혈액응고 제 V 인자(FV)에 대해서는 친화성이 FVIII에 대한 친화성에 비해서 수백분의 1 정도로 유의미하게 저하되었다. 이로 부터, 본 발명의 안하이드로트롬빈 유도체인 에틸렌디아민 수식 안하이드로트롬빈은, 혈액응고 제Ⅷ인자에 대해서 특이적으로 결합한다는 것이 시사된다.

본 발명의 트롬빈 유도체는 피브리노겐에 대한 친화성이 저하되어 있기 때문에, 혈소판 응집야기 조성물로서, 더더욱은 임상검사용 등에 특이적인 응고 반응 시약으로서 이용될 수 있다. 또한, 안하이드로트롬빈을 리간드로 하여, 카르복실기와 결합시키는 어피니티 크로마토그래피에 의해, 혈액응고 제 Ⅷ 인자에 대해 보다 선택성이 높은 정제가 가능하게 되고, 또, 안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식 한 안하이드로트롬빈 유도체는, 종래의 안하이드로트롬빈에 비해 소량으로도 충분한 항혈전 효과를 발생시키기 때문에, 혈전형성 억제제로서 이용될 수 있다.

Claims

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안하이드로트롬빈의 카르복실기가 수식된 안하이드로트롬빈 유도체.
제 6 항에 있어서,

상기 카르복실기의 수식은 이미드를 이용해서 행해지는 안하이드로트롬빈 유도체.
제 7 항에 있어서,

상기 이미드는 카르보디이미드 유도체인 안하이드로트롬빈 유도체.
제 8 항에 있어서,

상기 카르보디이미드 유도체는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이 미드 하이드로클로라이드}{N - ethyl - N'- (3-dimethylamionpropyl) carbodiimide hydrochloride} 및 N-시클로헥실-N'-2-(4'-메틸-몰폴리니엄)에틸카르보디이미드-p-톨루엔 설포네이트 {N - cyclohexyl - N' - 2 - (4'- methyl-morpolinium) ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 안하이드로트롬빈 유도체.
제 6 항에 있어서,

상기 카르복실기의 수식은 아미노기를 가지는 물질을 이용해서 행해지는 안하이드로트롬빈 유도체.
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안하이드로트롬빈의 카르복실기를 수식하는 것을 특징으로 하는 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.
제 16 항에 있어서,

카르복실기의 수식이 이미드를 이용해서 행해지는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.
제 17 항에 있어서,

상기 이미드는 카르보디이미드 유도체인 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.
제 18 항에 있어서,

상기 카르보디이미드 유도체는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드하이드로클로라이드{N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride} 및 N - 사이클로헥실-N'-2-(4'-메틸-몰폴리니엄)에틸 카르보디이미드-p-톨루엔 설포네이트) {N - cyclohexyl - N' - 2-(4'-methyl-morpolinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate} 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.
제 16 항에 있어서,

카르복실기의 수식이 아미노기를 가지는 물질을 이용해서 행하는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈 유도체의 제조방법.
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제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 안하이드로트롬빈 유도체를 함유하는 혈전형성 억제제.
안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합해서 이루어진 흡착체에 있어서, 상기 결합이 안하이드로트롬빈의 카르복실기와 수불용성 담체의 관능기와의 반응에 의한 것인 흡착체.
아미노기를 2 이상 가지는 화합물의 아미노기와 안하이드로트롬빈의 카르복실기와의 결합에 의해 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈과, 수불용성 담체가 결합하여 이루어진 흡착체에 있어서, 상기 결합이, 상기 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈이 함유하는 아미노기와 수불용성 담체의 관능기와의 반응에 의한 것인 흡착체.
제 27 항에 있어서,

상기 아미노기를 2 이상 가지는 화합물은 에틸렌디아민인 흡착체.
안하이드로트롬빈의 카르복실기와 수불용성 담체의 관능기와를 반응시키는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합되어 이루어진 흡착체의 제조방법.
아미노기를 2 이상 함유하는 화합물의 아미노기와 안하이드로트롬빈의 카르복실기와의 결합에 의해 아미노기가 도입된 안하이드로트롬빈이 가지는 이미노기와, 수불용성 담체의 관능기와를 반응시키는 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합되어 이루어진 흡착체의 제조방법.
제 29 항에 있어서,

아미노기를 2 이상 함유하는 화합물이 에틸렌디아민인 것을 특징으로 하는 안하이드로트롬빈과 수불용성 담체가 결합되어 이루어진 흡착체의 제조방법.
제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 흡착체를 이용하는 것을 특징으로 하는 정제된 혈액응고 제 Ⅷ 인자의 제조방법.