JPS58212785A - 血餅のトロンビン及び抗トロンビンならびにこれらの錯体の分離及び精製方法 - Google Patents

血餅のトロンビン及び抗トロンビンならびにこれらの錯体の分離及び精製方法

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JPS58212785A
JPS58212785A JP58089039A JP8903983A JPS58212785A JP S58212785 A JPS58212785 A JP S58212785A JP 58089039 A JP58089039 A JP 58089039A JP 8903983 A JP8903983 A JP 8903983A JP S58212785 A JPS58212785 A JP S58212785A
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マルセル・ジヨゼブオウイチ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は血餅の蛋白分解酵素及び抗蛋白分解酵素〔特に
トロンじン（Ｔ）及び抗トｏシじシ（Ａ　Ｔ）ならびに
トロンじンー抗トロンピン錯体（Ａ−ＡＴ））　の新規
な分離及び精．極力法に関する。
血液凝固の機構の研究及び知識によれば純粋な状態の多
量のトロンじン及び抗ト０ンピシを利用し得ることが必
要である。
発明者らは抗″凝．血性を付与した重合体の製造に多大
の経験を有゛シ（特にフランス国特許第２　４　６ｌ　
７　２　４　号又ハＡＮＮ，　ＢＩＯＭＥＤ，　ＥＮＧ
。
１９７９参照）、これらの重合体と血液凝固の蛋白分解
酵素及び抗蛋白分解酵素の如きある種の蛋白質との間の
親和性の法則を確立した。蛋白分解酵素及び抗蛋白分解
酵素（Ｔ及びＡＴの如き）の簡単で経済的な信頼性大な
る分離及び精製の方法を提供することが目的であった。
発明の一般的記載 本発明に依って蛋白分解酵素（Ｔ）及び抗蛋白分解酵素
（Ａ　Ｔ）ならびにこれらの錯体（Ａ　＋　Ａ　Ｔ）の
分離及び精製方法が提供され、該方法は蛋白分解酵素又
は抗蛋白分解酵素又はこれらの錯体を含有する溶液を置
換基−ＳＯ３Ｒ□一及び／又は−５０２Ｒ２−（但しＲ
１は水素原子又は金属、Ｒ２　はそのア三ノ官能基一Ｎ
Ｈ一　を介して一ＳＯ２一架橋に結合するアミノ酸残基
を示す）をその連鎖中に有する不溶性架橋重合体と接触
せしめ、所望の蛋白質を吸収した重合体を分離し、緩衝
液によシ注意深く洗浄し、吸収された蛋白質をＴの場合
には多価カチオｙ化合物の溶液によシあ、るいはＡＴ又
は錯体Ｔ，ＡＴの場合にはアルプ三シ溶液によって脱着
．シ、所望ならば公知の手段、特に凍結乾燥、によって
単離することを特徴とする。
本発明の有利な実施態様において架橋重合体としてポリ
スチレンを使用する。
本発明の他の有利な実施態様において、蛋白質を含有す
る溶液との接触に先立って重合体を適当な緩衝液を用い
て連続的に洗浄することによって７、３ないし７．５の
ｆｉＨに平衡させる。
本発明において、不溶性架橋重合体は存在する蛋白質η
当υ５０ないし２５００１Ｉｖ，好ましくは７’ｌｑ当
り５０ないし８０Ｗｌｆ，ＡＴ１１１ｆ当シ２００ない
し２０００岬及びＴ−ＡＴ　　１Ｍ９当シ２２０ないし
２０００ｌＩｙの割合で使用する。
本発明に依る有利な実施態様に於て、多価カチオン化合
物はへ士すジメスリンプロマイド及びポリリシンからな
る群より選択され、本化合物の使用量は蛋白質ダ当シ１
０ないし１５ｑである。
本発明に依る他の有利な実施態様に於て、脱着のだめの
アルづミンの使用量は吸収された所望の蛋白質ダ当シフ
５０ないし２５００ｑ、好ましくは、ＡＴ１ｑ当り８０
０ないし１２００１１ｇ、錯体Ａ−ＡＴ　　１η当υ１
０００ないし２０００岬である０ 本発明において、吸収前の重合体の平衡化及び吸収後の
洗浄のため使用する緩衝液は三カニリス緩衝液及びトリ
ス緩衝液からなる群よシ選択する。
上記の特徴の他に、本発明は以下の説明及び本発明に依
る方法を使用する実施例に示されるその他の特徴を有す
る。
然しなから、これらの実施例は単に本発明の説明のだめ
にのみ記載するもので、本発明を何ら限定するものでは
ない。
分離の実施例 実施例　１ トロンじンの分離 本発明に係る重合体１ｇを予めトリス緩衝液を用いて数
回洗浄することによってｐＨ７，４に平衡させた。次い
て重合体を１８．７５　　ｑのトロンじンを含有する溶
液を用い４°Ｃで半時間洗浄した。この時間の経過後、
重合体を分離しく遠心分離又は焼結ガラスフィルターに
よシ）、その容積の５倍量の同一緩衝液によって洗浄し
た。次いで重合体をへ＋サジメスリンづ０マイトの１０
η／ｌ溶液１０ｔｔと混合（４°Ｃで半時間）した。へ
士サジメスリンブロマイドと複合した重合体を脱着させ
たトロンピンを含有する溶液から分離した。トロンじン
を凍結乾燥によって単離した。１５〜のトロンじンが得
られ、従って収率は８０％であった。
実施例　２ 抗ト０ンじンの分離 重合体１０ｆを予め三カニリス緩衝液を用いて数回洗浄
することによってｌ’Ｈ７，４に平衡させた。
次いで重合体を３０ｍ１の血漿と４°Ｃで半時間混合し
た。生成したゲルを血漿から遠心分１１！（又は焼結１
３ラスによる濾過）によって分離した。重合体を次いで
その容積の５倍量の三カニリス緩衝液を用いて洗浄した
後、１００η／１のアルジミン（牛又は人間）を含有す
る同じ緩衝液と４°Ｃで半時間混合した。脱着された抗
トロンビン及び過剰のアルづ三ンを含有する残留溶液を
濾過（又は遠心分離）によって回収した。これをヘパリ
ン−ｔファｏ−ｆｉカラムに注入して二種の蛋白質を分
離した。３ｑの抗トロンじンが得られ、従って収率は６
０％であった。
実施例　３ 抗トロンじンのカラム上での分離 トリス緩衝液中で予め膨潤させ平衡させた重合を通過さ
せた。吸収されなかった血漿を緩衝液で洗浄することに
よシ溶離した。次いでカラム上を１００ｑ／Ａ’のアル
プ三ン溶液を通して抗ト０ンヒン入び過剰のアルジミン
を含有する溶液を回収した。この溶液を実施例２に記載
のヘパリン−ｔフッ０−メカラムを通過せしめた。
抗トＤンじン３ｆが得られ収率は６０％であった０ 実施例　４ Ｔ−ＡＴの分離 重合体１０Ｆを予めトリス緩衝液で数回洗浄することに
よって戸Ｈ７，４に平衡させた。次いで重合体をト０：
Ｊピンー抗ト０ンじン錯体を３００ｍｍ　ｏ　ｌ　／　
ｌの割合で含有する３０ｍ１の血漿と混合した。４°Ｃ
に於て半時間混合後、重合体を血漿から遠心分離によっ
て分離した。次に重合体をその５倍容量の緩衝液で洗浄
した後、１００〜／ｌのアルジミンを含有する５倍容量
の同じ緩衝液を用い４°Ｃで半時間洗浄した。重合体を
カラム中に導入し２５０ダ／　ｍｅのアルジミンを含有
する緩衝液によって完全に溶ｗｉ＜放射免疫検査によっ
て測定）した。溶離液をコンカナバリンＡ−セファロー
ズ（又はヘバリシーｔファｏ−，ｔ）のカラム上を通過
させることによってアルジミンから錯体を分離した０錯
体１５〜を回収し、従って収率は約５０％であった。
上記の説明に於て、より一層明確に記載した適用の様式
、実施態様及び使用法に本発明は決して限定されず、本
発明はその枠又は範囲よシ逸脱することなく、当該技術
の熟練者の想到するすべての変更態様を包含する。
（以　上） ご／、竪 衰１１．，１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ■　蛋白分解酵素又は抗蛋白分解酵素もしくはそれらの
    錯体を含有する溶液を置換基−５Ｏ３Ｒ−及び／又は−
    ５ｏ２Ｒ２＋　　（Ｒ□は水素原子又は金属、Ｒ２はそ
    のアミン官能基−ＮＨ−を介して−ＳＯ。 架橋に結合するアミノ酸残基を示す）をその連鎖中に含
    有する不溶性架橋重合体と接触せしめ、所望の蛋白質を
    吸収した重合体を分離し、これを緩衝液により洗浄し、
    該吸収された蛋白質を蛋白分解酵素の場合は多価カチオ
    ン化合物の溶液によりあるいは抗蛋白分解酵素又は蛋白
    分解酵素及び抗蛋白分解酵素の錯体の場合にはアルブミ
    ン溶液によって脱着し、所望によシ、公知の手段特に凍
    結乾燥によって蛋白質を単離することを特徴とする血餅
    の蛋白分解酵素及び抗蛋白分解酵素ならびにこれらの錯
    体の分離及び精製方法。 ■　該架橋重合体がポリスチレシであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ■　該重合体を該蛋白質を含有する溶液と接触するに先
    立ち適当な緩衝液による連続的洗浄により７．３ないし
    ７．５のｐＨに調整することを特徴とする特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 ■　該重合体を該蛋白質を含有する溶液と接触するに先
    立ち適当な緩衝液による連続的洗浄によシフ、ジないし
    ７．５のｐＨに平衡せしめることを特徴とする特許請求
    の範囲第２項記載の方法。 ■　該不溶性架橋重合体を存在する蛋白質〜に対し５０
    ないし２５００Ｉｑの割合で使用することを特徴とする
    特許 の方法。 ■　該蛋白質が蛋白分解酵素！η当９５０ないし８０ｑ
    １抗蛋自分解酵素１ＩＩ５／当シ２００ないし２００（
    ｌｙ、蛋白分解酵素及び抗蛋白分解酵素の錯体ｔ＃ｖ当
    り２２０力いし２０００Ｍｖ”ｔｌ’あることを特徴と
    する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ■　該多価カチオン化合物がへ士サジメスリンブロマイ
    ド及びポリリシンからなる群よシ選択され且つこの化合
    物を蛋白分解酵素１１ｑ当シ１０ないし１５ｑ使用する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ■　脱着のため使用するアルプ″：、：、Ｉの量が吸収
    された所望の蛋白質のη当り７５０ないし２５００ダで
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
    。 ■　該アルづ三ンの量が抗蛋白分解酵素１η当シ８００
    ないし１２００ダであシ蛋自分解酵素及び抗蛋白分解酵
    素の錯体１ＩＩｑ１当υ１００ないし２０００■である
    ことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。 ［相］　吸収前の重合体の平衡及び吸収後の洗浄に使用
    する緩衝液が三カニリス緩衝液及びトリス緩衝液からな
    る群より選択されることを特徴とする特許
JP58089039A 1982-05-19 1983-05-19 血餅のトロンビン及び抗トロンビンならびにこれらの錯体の分離及び精製方法 Granted JPS58212785A (ja)

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FR8208779A FR2527222A1 (fr) 1982-05-19 1982-05-19 Procede de separation et de purification des proteases et des antiproteases de la coagulation sanguine, ainsi que du complexe protease/antiprotease
FR8208779 1982-05-19

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Publication Number Publication Date
JPS58212785A true JPS58212785A (ja) 1983-12-10
JPH0446960B2 JPH0446960B2 (ja) 1992-07-31

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EP (1) EP0094892B1 (ja)
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DE (1) DE3361689D1 (ja)
FR (1) FR2527222A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3519011A1 (de) * 1985-05-25 1986-11-27 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur herstellung eines materials zur affinitaetschromatographie
DE3843126C3 (de) * 1988-12-22 1994-10-06 Octapharma Ag Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates
US20050214457A1 (en) * 2004-03-29 2005-09-29 Applied Materials, Inc. Deposition of low dielectric constant films by N2O addition
CN101307093B (zh) * 2007-05-14 2012-01-11 上海水产大学 从鲨鱼皮分离纯化生物医药用胶原蛋白的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1463729A (fr) * 1965-02-24 1966-12-23 Rohm & Haas Enrichissement et éventuellement séparation d'un composé organique par des techniques d'adsorption
SE392038B (sv) * 1971-09-08 1977-03-14 Kabi Ab Forfarande for isolering av antitrombin ur blod eller blodprodukter
US3902964A (en) * 1971-12-13 1975-09-02 U S Medical Research And Dev I Method of and apparatus for chemically separating plasma or serum from formed elements of blood
DE2406971B2 (de) * 1974-02-14 1979-08-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur Gewinnung eines polyvalenten Proteinasen-Inhibitors
US3928587A (en) * 1974-08-16 1975-12-23 Philip Nicholas Sawyer Method of conditioning vascular systems by administering 3,5 dichloroaspirin and method of evaluating pharmaceutical compounds
FR2461724A1 (fr) * 1979-07-20 1981-02-06 Christine Fougnot Polymeres substitues par des groupes leur conferant des proprietes anti-coagulantes et leur procede de preparation, objets constitues par et/ou comprenant lesdits polymeres et leurs procedes de fabrication, application desdits objets en chirurgie et en medecine, et compositions pharmaceutiques contenant lesdits polymeres substitues
JP2528471B2 (ja) * 1987-06-22 1996-08-28 出光興産株式会社 ジクロロシラン類の製造方法
DE20022020U1 (de) * 2000-12-28 2001-11-08 Trw Automotive Safety Sys Gmbh Gassackmodul

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FR2527222A1 (fr) 1983-11-25
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US4945054A (en) 1990-07-31
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