JPH0720983B2 - 抗▲ｖｉｉｉ▼：ｃ抗体の分離法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、血漿のような液体中に存在する抗VIII:C抗体
の分離方法に関する。さらに詳しくは本発明は、凝固第
VIII:C因子の特異抗体（すなわちＡ型血友病患者の血漿
中に存在する抗VIII:C抗体）の選択的精製に使用可能
な、不溶性ポリマー又はコポリマー支持体に関する。す
なわち何度も輸血をうけたＡ型血友病患者では一般的
に、輸血された第VIII:C因子の凝固活性を中和する抗VI
II:C抗体が形成される。この抗体が存在すると重症にな
る。さらにＡ型血友病患者の出血を止めるためには、普
通血漿の交換が必要であり、この後直ちに通常のホメオ
スシスを得るために直ちに第VIII:C因子が注射される。
患者の病状の程度によりこの治療はしばしば長期間続け
る必要がある。この患者血漿の必須成分を所期のレベル
を維持することが困難な状態においては、重大な問題で
ある。さらに輸血回数が増加するにつれて、肝炎ウイル
スやLAV/HTLVウイルスによう感染の危険が増加する。
の分離方法に関する。さらに詳しくは本発明は、凝固第
VIII:C因子の特異抗体（すなわちＡ型血友病患者の血漿
中に存在する抗VIII:C抗体）の選択的精製に使用可能
な、不溶性ポリマー又はコポリマー支持体に関する。す
なわち何度も輸血をうけたＡ型血友病患者では一般的
に、輸血された第VIII:C因子の凝固活性を中和する抗VI
II:C抗体が形成される。この抗体が存在すると重症にな
る。さらにＡ型血友病患者の出血を止めるためには、普
通血漿の交換が必要であり、この後直ちに通常のホメオ
スシスを得るために直ちに第VIII:C因子が注射される。
患者の病状の程度によりこの治療はしばしば長期間続け
る必要がある。この患者血漿の必須成分を所期のレベル
を維持することが困難な状態においては、重大な問題で
ある。さらに輸血回数が増加するにつれて、肝炎ウイル
スやLAV/HTLVウイルスによう感染の危険が増加する。
さらにここ数年間、適当な支持体上に障害要素を吸着さ
せて血漿を直接精製することを目的とする研究が行われ
ている。Ｂ型血共病の場合は第IX因子特異抗体（すなわ
ち抗IX抗体）を、アガロースの共有結合したプロテイン
Ａ（ニルソン（Nilsson）ら、Blood、第58巻、No.1（19
81年７月）、p38−44に記載）に吸着させてこの精製を
行うことが可能である。プロテインＡは免疫グロブリン
のFc部分と反応し、セフアロースと結合している場合免
疫グロブリンＧを単離するための（従つて抗第IX因子を
単離するための）免疫吸着剤として使用可能である。し
かしこうして処理した血漿の総免疫グロブリン含量は本
来の値の1/5以下であり、これが若干の問題となる。さ
らに最近の研究の目的は所期の抗体、特に血友病患者の
血液中に存在する抗体を選択的に分離できる免疫吸着剤
を得ることである。
せて血漿を直接精製することを目的とする研究が行われ
ている。Ｂ型血共病の場合は第IX因子特異抗体（すなわ
ち抗IX抗体）を、アガロースの共有結合したプロテイン
Ａ（ニルソン（Nilsson）ら、Blood、第58巻、No.1（19
81年７月）、p38−44に記載）に吸着させてこの精製を
行うことが可能である。プロテインＡは免疫グロブリン
のFc部分と反応し、セフアロースと結合している場合免
疫グロブリンＧを単離するための（従つて抗第IX因子を
単離するための）免疫吸着剤として使用可能である。し
かしこうして処理した血漿の総免疫グロブリン含量は本
来の値の1/5以下であり、これが若干の問題となる。さ
らに最近の研究の目的は所期の抗体、特に血友病患者の
血液中に存在する抗体を選択的に分離できる免疫吸着剤
を得ることである。
抗VIII:C抗体についてはこれまでの研究では抗体を定量
的に分離できていない。従つて抗VIII:C抗体の固定され
たクロマトグラフイーゲルによる選択的吸着を利用して
この分離を行うことが考えられている。しかし抗VIII:C
抗体は急速にその抗原活性を失うため、この方法は実施
不可能である。
的に分離できていない。従つて抗VIII:C抗体の固定され
たクロマトグラフイーゲルによる選択的吸着を利用して
この分離を行うことが考えられている。しかし抗VIII:C
抗体は急速にその抗原活性を失うため、この方法は実施
不可能である。
ここ数年例えば血液のある成分に対し特別の親和性を与
えることを可能にするような、適当な固定化合物の結合
した不活性の支持体を使用することについて研究が続け
られている。例えばフランス国特許83/10773（1983年６
月29日、シーイーエー（C.E.A.）が申請）はトロンビン
の分離と精製にこの型のポリマーを使うことを例示して
いる。この場合支持体にトロンビンに対する親和性を与
えるために、アルギニン、ニトロアルギニン又はそれら
の誘導体（例えばメチルエステル）がポリマー又はコポ
リマーに固定されている。
えることを可能にするような、適当な固定化合物の結合
した不活性の支持体を使用することについて研究が続け
られている。例えばフランス国特許83/10773（1983年６
月29日、シーイーエー（C.E.A.）が申請）はトロンビン
の分離と精製にこの型のポリマーを使うことを例示して
いる。この場合支持体にトロンビンに対する親和性を与
えるために、アルギニン、ニトロアルギニン又はそれら
の誘導体（例えばメチルエステル）がポリマー又はコポ
リマーに固定されている。
発明の要約 本発明はＡ型血友病患者の血液の血漿精製に用い得るも
のと同じ型の支持体（この方法により抗VIII:C抗体を他
の免疫グロブリンから選択的に分離可能なため）を用い
る、液体中の抗VIII:C抗体の分離方法に関する。
のと同じ型の支持体（この方法により抗VIII:C抗体を他
の免疫グロブリンから選択的に分離可能なため）を用い
る、液体中の抗VIII:C抗体の分離方法に関する。
従つて本発明は液体中に存在する抗VIII:C抗体の分離方
法において： ａ）鎖の中に置換可能な官能基を有し、少なくともその
一部は式−（SO3）xM（式中Ｍは液体と反応しない金属
であり、ｘは金属Ｍの結合価を表わす）、及び／又は式
−SO2Y及び／又は−COY（式中Ｙはアルギニン以外の−
アミン酸の、又はアルギニン以外のα−アミノ酸誘導体
のアミノ基から水素原子を除くことにより得られるラデ
イカルを表わす）（これらは抗VIII:C抗体に対する親和
性と、他の免疫グロブリンに比較して抗VIII:C抗体に対
して選択性を有する）により置換されたポリマー又はコ
ポリマーより成る固体支持体に、その液体を接触させ、
そして ｂ）抗VIII:C抗体の吸着された支持体から液体を分離す
ることより成る、上記分離方法に関する。
法において： ａ）鎖の中に置換可能な官能基を有し、少なくともその
一部は式−（SO3）xM（式中Ｍは液体と反応しない金属
であり、ｘは金属Ｍの結合価を表わす）、及び／又は式
−SO2Y及び／又は−COY（式中Ｙはアルギニン以外の−
アミン酸の、又はアルギニン以外のα−アミノ酸誘導体
のアミノ基から水素原子を除くことにより得られるラデ
イカルを表わす）（これらは抗VIII:C抗体に対する親和
性と、他の免疫グロブリンに比較して抗VIII:C抗体に対
して選択性を有する）により置換されたポリマー又はコ
ポリマーより成る固体支持体に、その液体を接触させ、
そして ｂ）抗VIII:C抗体の吸着された支持体から液体を分離す
ることより成る、上記分離方法に関する。
他の免疫グロブリンに比較して抗VIII:C抗体に対して親
和性及び選択性の良好な吸着剤を得るために、ラデイカ
ルＹは好ましくは式： （式中、R1は−アミノ酸の側鎖であり、R2は水素原子又
は例えば１−５個の炭素原子を有するアルキル基であ
り、基R1はCOOH、NH2、OHそしてSH基から選ばれる少な
くとも１つの官能基を表わす）に一致する。
和性及び選択性の良好な吸着剤を得るために、ラデイカ
ルＹは好ましくは式： （式中、R1は−アミノ酸の側鎖であり、R2は水素原子又
は例えば１−５個の炭素原子を有するアルキル基であ
り、基R1はCOOH、NH2、OHそしてSH基から選ばれる少な
くとも１つの官能基を表わす）に一致する。
使用可能な基Ｙの例としては、グルタミン酸、ヒドロキ
シプロリン、アラニン、フエニルアラニン、スレオニン
及びリジンより得られるものがある。好ましくは基Ｙは
グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、スレオニン又はリ
ジンからの基である。
シプロリン、アラニン、フエニルアラニン、スレオニン
及びリジンより得られるものがある。好ましくは基Ｙは
グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、スレオニン又はリ
ジンからの基である。
本発明によれば、基Ｙの前駆体である−アミノ酸が数個
のアミノ基を含有する場合、このα−アミノ酸又はその
誘導体（ここから水素原子を除いて基Ｙを生成する）の
アミン基はα位に存在するアミノ基である。
のアミノ基を含有する場合、このα−アミノ酸又はその
誘導体（ここから水素原子を除いて基Ｙを生成する）の
アミン基はα位に存在するアミノ基である。
本発明によれば、−SO2Y、−（SO3）XM及び／又は−COY
は炭化水素化鎖又は基（例えばCOY基の場合はペプチド
鎖）を介してポリマーに結合できる。
は炭化水素化鎖又は基（例えばCOY基の場合はペプチド
鎖）を介してポリマーに結合できる。
本発明によれば、使用可能なポリマー及びコポリマー
は、鎖にそつてクロロスルホン酸と反応できる置換可能
な基を有する個体物質である。このようなポリマーの例
としては架橋したポリスチレン、セルロースエステル、
セルロースエーテル、ポリビニルアセテート、ポリビニ
ルクロリド、ポリオイソプレン及びポリブタジエンがあ
る。又スチレンのコポリマー、ビニルアセテートのコポ
リマー、ビニルクロリドのコポリマー、イソプレンのコ
ポリマー及びブタジエンのコポリマーも使用可能であ
る。又コポリマーという単語は塩基性ポリマーにビニル
モノマーを結合させて得られるコポリマー（例えばクロ
ロスルホン化耐性ポリマーにスチレンを結合させて得ら
れるスチレンコポリマー）をも意味する。この場合クロ
ロスルホン化耐性塩基性ポリマーは、ポリオレフイン、
フツ素化ポリマー及びポリビニルクロリドから選ばれ
る。
は、鎖にそつてクロロスルホン酸と反応できる置換可能
な基を有する個体物質である。このようなポリマーの例
としては架橋したポリスチレン、セルロースエステル、
セルロースエーテル、ポリビニルアセテート、ポリビニ
ルクロリド、ポリオイソプレン及びポリブタジエンがあ
る。又スチレンのコポリマー、ビニルアセテートのコポ
リマー、ビニルクロリドのコポリマー、イソプレンのコ
ポリマー及びブタジエンのコポリマーも使用可能であ
る。又コポリマーという単語は塩基性ポリマーにビニル
モノマーを結合させて得られるコポリマー（例えばクロ
ロスルホン化耐性ポリマーにスチレンを結合させて得ら
れるスチレンコポリマー）をも意味する。この場合クロ
ロスルホン化耐性塩基性ポリマーは、ポリオレフイン、
フツ素化ポリマー及びポリビニルクロリドから選ばれ
る。
好ましくは、スチレン又はスチレンコポリマーを用い
る。この場合ポリマー又はコポリマーに結合した基は２
種類であり、１つは式−SO2（式中Ｙは前記した意味を
有する）であり、他の１つは式−（SO3）xM（式中Ｍは
液体と反応しない金属であり、ｘは金属Ｍ（これは普通
ナトリウムである）の結合価である）である。
る。この場合ポリマー又はコポリマーに結合した基は２
種類であり、１つは式−SO2（式中Ｙは前記した意味を
有する）であり、他の１つは式−（SO3）xM（式中Ｍは
液体と反応しない金属であり、ｘは金属Ｍ（これは普通
ナトリウムである）の結合価である）である。
本発明は又カルボキシメチル化可能なポリマー及びコポ
リマー（例えばポリデキストランのような多糖）にも適
用される。
リマー（例えばポリデキストランのような多糖）にも適
用される。
塩基性ポリマーがスチレン又はスチレンコポリマーであ
る本発明の支持体は、クロロスルホン酸との反応により
ポリマーまたはコポリマーをクロロスルホン化する第一
段階と、ポリマー又はコポリマーに結合した−SO2Cl基
の少なくとも一部−SO2Y基に変える第２段階より成る工
程により得られる。
る本発明の支持体は、クロロスルホン酸との反応により
ポリマーまたはコポリマーをクロロスルホン化する第一
段階と、ポリマー又はコポリマーに結合した−SO2Cl基
の少なくとも一部−SO2Y基に変える第２段階より成る工
程により得られる。
ポリスチレンを使用する場合はクロロスルホン化反応は
以下の反応に従う： この反応はニトロメタンの結合した塩素化溶媒 （例えばニトロメタンの結合したジクロロメタン）より
成る有機溶媒中で実施することが有効である。
以下の反応に従う： この反応はニトロメタンの結合した塩素化溶媒 （例えばニトロメタンの結合したジクロロメタン）より
成る有機溶媒中で実施することが有効である。
第２段階ではクロロスルホニル基−SO2Clは、 式： （式中R1はα−アミノ酸の側鎖を、R2は水素原子又はア
ルキルラデイカルを表わす）に一致する対応するα−ア
ミノ酸と反応させることよりＹ基に変換される。この反
応は下記の反応式に対応する： この反応は、R2が水素原子である場合は周囲温度で水−
ジオキサン混合液中で実施され、R2がアルキルラデイカ
ルである場合は周囲温度より少し高い温度でジクロロメ
タン中で実施される。
ルキルラデイカルを表わす）に一致する対応するα−ア
ミノ酸と反応させることよりＹ基に変換される。この反
応は下記の反応式に対応する： この反応は、R2が水素原子である場合は周囲温度で水−
ジオキサン混合液中で実施され、R2がアルキルラデイカ
ルである場合は周囲温度より少し高い温度でジクロロメ
タン中で実施される。
ポリスチレンの場合は反応の最後の下記の式の基が得ら
れる： SO3Na及び に置換される基の数は特に反応条件に依存する。良好な
結果を得るためには、−SO2Y又は−COY基に置換される
スチレン基の数は10−30％であることが好ましい。
れる： SO3Na及び に置換される基の数は特に反応条件に依存する。良好な
結果を得るためには、−SO2Y又は−COY基に置換される
スチレン基の数は10−30％であることが好ましい。
式−COYの基を有するポリマー又はコポリマーより成る
本発明の個体支持体は、カルボキシメチル化の第１段
階、適当なアミン又はベンジルクロリドを固定する第２
段階、ラデイカルＹの得られるアミノ酸を固定する第３
段階そして第４のスルホ化段階より成る工程により得ら
れる。
本発明の個体支持体は、カルボキシメチル化の第１段
階、適当なアミン又はベンジルクロリドを固定する第２
段階、ラデイカルＹの得られるアミノ酸を固定する第３
段階そして第４のスルホ化段階より成る工程により得ら
れる。
この場合ポリマーは多糖（例えばポリデキストラン）で
もよく、塩基性ポリマーに結合する基は式−COYのみで
なく、式CH2CONHR4−SO3R5（式中R4は置換されている又
は置換されていないアルキル、アリール、又はアルキル
アリールラデイカルを表わし、R5は水素原子、又は液体
と反応しないナトリウムのような金属を表わす）でもよ
い。
もよく、塩基性ポリマーに結合する基は式−COYのみで
なく、式CH2CONHR4−SO3R5（式中R4は置換されている又
は置換されていないアルキル、アリール、又はアルキル
アリールラデイカルを表わし、R5は水素原子、又は液体
と反応しないナトリウムのような金属を表わす）でもよ
い。
クロロスルホン酸耐性ポリマーにスチレンを結合させて
得られるスチレンコポリマー支持体を使用する場合は、
イオン化光線を照射して結合させることが好ましい。こ
の場合クロロスルホン化耐性ポリマーをスチレン溶液に
入れて酸素を含まない空気中で、例えばコバルト60を照
射することも可能である。
得られるスチレンコポリマー支持体を使用する場合は、
イオン化光線を照射して結合させることが好ましい。こ
の場合クロロスルホン化耐性ポリマーをスチレン溶液に
入れて酸素を含まない空気中で、例えばコバルト60を照
射することも可能である。
この粉末の結合量は、溶液のスチレン濃度、溶媒の種
類、拡散時間、総照射量そして照射速度を変えることに
より、調節できる。照射後普通結合生成物を、例えばス
チレンで次にアルコールで洗滌し、次に乾燥させる。
類、拡散時間、総照射量そして照射速度を変えることに
より、調節できる。照射後普通結合生成物を、例えばス
チレンで次にアルコールで洗滌し、次に乾燥させる。
この結合粉末の調製方法は、粉末の表面にスチレンを結
合させ、適当な基を固定してから、抗VIII:C抗体に対す
る良好な親和性及び選択性を付与できるため、特に有効
である。
合させ、適当な基を固定してから、抗VIII:C抗体に対す
る良好な親和性及び選択性を付与できるため、特に有効
である。
本発明の方法は、血漿（特にＡ型血友病患者の血漿）よ
り成る液体の処理に特に使用できる。この場合、この種
の患者の血液の生体外精製に本発明の方法を使用するこ
とが可能である。
り成る液体の処理に特に使用できる。この場合、この種
の患者の血液の生体外精製に本発明の方法を使用するこ
とが可能である。
図面の簡単な説明 以下本発明を非限定的態様と図面に関して詳細に記載す
る。図中： 第１図は、部分トロンボプラスチン時間（PTT）に基づ
き、試料の抗VIII:C抗体濃度を定量を可能にする標準曲
線を示す。
る。図中： 第１図は、部分トロンボプラスチン時間（PTT）に基づ
き、試料の抗VIII:C抗体濃度を定量を可能にする標準曲
線を示す。
第２図及び第３図は、異なる支持体上の免疫グロブリン
と抗VIII:C抗体の吸着等温式を示す。
と抗VIII:C抗体の吸着等温式を示す。
第４図は、本発明の方法を実施するためのカラム血漿精
製器の図である。
製器の図である。
第５図は、又別の血漿精製器の図である。
発明の詳細な説明 実施例1:−SO2Gluと−SO3NA基を有するポリスチレン支
持体の調製 ａ）クロロスルホン化ポリスチレンの調製 粒径10−70μｍの架橋したポリスチレンボールの18g
を、1440mlのジクロロメタン中で周囲温度で３時間膨潤
させ、次に270mlのジクロロメタンと227mlのクロロスル
ホン酸の混合液を加える。この懸濁液を周囲温度で25分
攪拌し、原料樹脂を濾過した後、これをジクロロメタン
−ジキサン混合液中で注意深く洗滌し、次に50℃で真空
乾燥する。
持体の調製 ａ）クロロスルホン化ポリスチレンの調製 粒径10−70μｍの架橋したポリスチレンボールの18g
を、1440mlのジクロロメタン中で周囲温度で３時間膨潤
させ、次に270mlのジクロロメタンと227mlのクロロスル
ホン酸の混合液を加える。この懸濁液を周囲温度で25分
攪拌し、原料樹脂を濾過した後、これをジクロロメタン
−ジキサン混合液中で注意深く洗滌し、次に50℃で真空
乾燥する。
次に以下の方法でクロロスルホン基（−SO2Cl）の濃度
を定量する。200mgのクロロスルホン化ポリスチレンを4
0mlの1MNaOH中で還流しながら24時間加水分解する。酸
性化した後、放出されたCl−イオンを、銀指示電極を用
いて0.1MのAgNO3溶液中で滴定する。
を定量する。200mgのクロロスルホン化ポリスチレンを4
0mlの1MNaOH中で還流しながら24時間加水分解する。酸
性化した後、放出されたCl−イオンを、銀指示電極を用
いて0.1MのAgNO3溶液中で滴定する。
ｂ）クロロスルホン基へのグルタミン酸の固定 水とジオキサン（3:2）の混合液より成る溶媒中でグル
タミン酸を溶解させるため4Mのソーダを添加してpHを9/
10に調整してグルタミン酸溶液を調製する。次にあらか
じめ得たクロロスルホン化ポリスチレン10gを添加し、2
Mのソーダを加えてpHを最初の９−10に維持する。pHが
一定の場合反応が完了する。次にポリマーを濾過し、ま
ず十分量の水で、次に10-2のソーダ、そして水で洗滌し
た後、真空中で乾燥する。
タミン酸を溶解させるため4Mのソーダを添加してpHを9/
10に調整してグルタミン酸溶液を調製する。次にあらか
じめ得たクロロスルホン化ポリスチレン10gを添加し、2
Mのソーダを加えてpHを最初の９−10に維持する。pHが
一定の場合反応が完了する。次にポリマーを濾過し、ま
ず十分量の水で、次に10-2のソーダ、そして水で洗滌し
た後、真空中で乾燥する。
次に窒素の元素分析からポリマー中の−SO2Gluの含量を
定量する。又あらかじめ求めたクロロスルホン基の含量
と−SO2Glu基の含量からSO3Naの含量を求める。こうし
て得られた結果を表に示す。実施例２から8:−SO2Ala，
−SO2PheAla，−SO2OHPro，−SO2Threo，−SO2Y（Ｙは
グルタミン酸メチルから得られるラデイカルを表わ
す）、−SO2Pro又は−SO2Lye基を有するポリスチレン支
持体の調製 実施例1a）で得られた様なクロロスルホン化ポリスチレ
ンを使用し、ここに実施例1b）と同様の方法を用いてア
ミノ酸又は対応するアミノ酸誘導体、すなわちアラニン
（実施例２）、フエニルアラニン（実施例３）、ヒドロ
キシプロリン（実施例４）、スレオニン（実施例５）、
グルタミン酸メチル（実施例６）、プロリン（実施例
７）又はリジン（実施例８）を固定させる。前記した様
にこうして得られる支持体の−SO2Y及び−SO3Na基の含
量を側定する。結果を表に示す。
定量する。又あらかじめ求めたクロロスルホン基の含量
と−SO2Glu基の含量からSO3Naの含量を求める。こうし
て得られた結果を表に示す。実施例２から8:−SO2Ala，
−SO2PheAla，−SO2OHPro，−SO2Threo，−SO2Y（Ｙは
グルタミン酸メチルから得られるラデイカルを表わ
す）、−SO2Pro又は−SO2Lye基を有するポリスチレン支
持体の調製 実施例1a）で得られた様なクロロスルホン化ポリスチレ
ンを使用し、ここに実施例1b）と同様の方法を用いてア
ミノ酸又は対応するアミノ酸誘導体、すなわちアラニン
（実施例２）、フエニルアラニン（実施例３）、ヒドロ
キシプロリン（実施例４）、スレオニン（実施例５）、
グルタミン酸メチル（実施例６）、プロリン（実施例
７）又はリジン（実施例８）を固定させる。前記した様
にこうして得られる支持体の−SO2Y及び−SO3Na基の含
量を側定する。結果を表に示す。
実施例9:本例では血友病患者の血漿中の存在する抗VII
I:C抗体を吸着するための、実施例１−８の支持体の使
用法を示す。
I:C抗体を吸着するための、実施例１−８の支持体の使
用法を示す。
ａ）支持体の馴化と洗滌 血液中の蛋白に反応する可能性のある不純物を完全に除
去するために、実施例１−８の支持体をまず馴化させ
る。次に支持体を1.5Mの塩化ナトリウム、そして1.0Mの
クエン酸ナトリウム溶液で順番に洗滌する。次にこの支
持体をミカエリス緩衝液（pH7.3）中で平衡化させ、濾
過し、水で数回洗滌し真空中で乾燥させる。この粒子を
すりつぶすと、水中で膨潤させた粒子の平均径（TAS型
定量顕微鏡で測定）は５−10μｍの範囲にある。
去するために、実施例１−８の支持体をまず馴化させ
る。次に支持体を1.5Mの塩化ナトリウム、そして1.0Mの
クエン酸ナトリウム溶液で順番に洗滌する。次にこの支
持体をミカエリス緩衝液（pH7.3）中で平衡化させ、濾
過し、水で数回洗滌し真空中で乾燥させる。この粒子を
すりつぶすと、水中で膨潤させた粒子の平均径（TAS型
定量顕微鏡で測定）は５−10μｍの範囲にある。
ｂ）試料の調製 まず血清試料を調製する:1つは抗VIII:C抗体を有する血
友病患者の血液から、そして他の１つは15人の普通の対
照患者から調製する。血液は3.8％のクエン酸三ナトリ
ウム溶液（クエン酸溶液１部に対して血液９部）中に採
取し、−70℃で保存する。
友病患者の血液から、そして他の１つは15人の普通の対
照患者から調製する。血液は3.8％のクエン酸三ナトリ
ウム溶液（クエン酸溶液１部に対して血液９部）中に採
取し、−70℃で保存する。
次に血漿中の抗VIII:C抗体の抗体価格が640ベセスダ（B
ethesda）単に/mlである血友病患者の血漿の免疫グロブ
リンを単離する。このために血友病患者の血漿の繊維素
を除いた後リン酸緩衝液（0.005M、pH＝6.5）中で４℃
で一晩透析する。
ethesda）単に/mlである血友病患者の血漿の免疫グロブ
リンを単離する。このために血友病患者の血漿の繊維素
を除いた後リン酸緩衝液（0.005M、pH＝6.5）中で４℃
で一晩透析する。
得られた血清をDEAE52セルロースカラムにかけ、免疫ブ
ロブリンＧを含有する画分を厚め濃縮する。次にこれを
0.15MのNaClで十分に透析する。血友病患者の免疫グロ
ブリンの最終調製液（IgGHは、ベセスダ（Bethesda）単
位/mgIgGの抗VIII:C抗体活性を有している。
ロブリンＧを含有する画分を厚め濃縮する。次にこれを
0.15MのNaClで十分に透析する。血友病患者の免疫グロ
ブリンの最終調製液（IgGHは、ベセスダ（Bethesda）単
位/mgIgGの抗VIII:C抗体活性を有している。
カスパー（C.K,KASPER）らがベセスダ（Bethesda）会議
で記載した方法（″A more uniform measurement of fa
ctor VIII inhibitores″、スロンボ・ヂアス・ヘモル
（Thromb.Diath.Haemorrh.）第34巻、869頁、1975年）
に従い抗VIII:C抗体濃度を測定する。この方法では抗VI
II:C抗体を含有する血漿濃縮液又はIgGの調製物0.1ml
を、正常血漿1mlと37℃で２時間インキュベートする。
次にこの混合液の第VIII因子の凝血促進活性を測定し、
ミカエリス緩衝液と正常血漿をインキュベートさせた対
照試験管の活性と比較する。第VIII因子の凝血促進作用
は、第VIII因子欠損ヒト血漿を基質とし、前記した方法
で調製した正常血漿をスタンダード（1U/ml）として用
いて、トロンボプラスチン時間（PTT）に基づき測定す
る。２時間のインキユベーシヨンで凝血促進活性の50％
を不活性化する量を１抗VIII:C抗体単位とする。従つて
ベセスダ（Bethesda）単位で表示した抗VIII:C抗体濃度
は、２時間のインキュバーシシヨンの間にVIII:Cの0.5u
を不活性化する対照血漿又はIgG調製物の希釈物の逆数
を測定することにより求められる。
で記載した方法（″A more uniform measurement of fa
ctor VIII inhibitores″、スロンボ・ヂアス・ヘモル
（Thromb.Diath.Haemorrh.）第34巻、869頁、1975年）
に従い抗VIII:C抗体濃度を測定する。この方法では抗VI
II:C抗体を含有する血漿濃縮液又はIgGの調製物0.1ml
を、正常血漿1mlと37℃で２時間インキュベートする。
次にこの混合液の第VIII因子の凝血促進活性を測定し、
ミカエリス緩衝液と正常血漿をインキュベートさせた対
照試験管の活性と比較する。第VIII因子の凝血促進作用
は、第VIII因子欠損ヒト血漿を基質とし、前記した方法
で調製した正常血漿をスタンダード（1U/ml）として用
いて、トロンボプラスチン時間（PTT）に基づき測定す
る。２時間のインキユベーシヨンで凝血促進活性の50％
を不活性化する量を１抗VIII:C抗体単位とする。従つて
ベセスダ（Bethesda）単位で表示した抗VIII:C抗体濃度
は、２時間のインキュバーシシヨンの間にVIII:Cの0.5u
を不活性化する対照血漿又はIgG調製物の希釈物の逆数
を測定することにより求められる。
ｃ）吸着試験 これらの試験は種々の濃度の50μｌのIgGHを実施例１か
ら７の支持体のうち１つの懸濁液（支持体1ml当たり２
−10mg）と、又はミカエリス緩衝液とインキュベートす
ることにより実施する。30分経過後IgGHを含む混合液を
遠心分離し、以下の方法に従い上澄液のIgG及び／又は
抗VIII:C抗体濃度を測定する： １）ICLプレート（ICLサイエンチフイツク（Fountain V
alley,カリフオルニア州）が販売している）を用いて放
射免疫抗散法によりIgG濃度を測定する。測定すべきIgG
濃度により低濃度又は極低濃度キツトを使用する。測定
に際して１枚のプレートの上にIgG濃度が既知の２種類
のスタンダード（それぞれ0.15と3mg/ml）とIgGHを含有
する４個の上澄液を処理した。又再現性をよくするため
5.0μｌの上澄液が各位置に正確に添加できるマイクロ
ピペツトを使用する。さらに結果の偏りをなくすため、
吸着前後のIgG濃度に対応する試料を隣り合う２つの位
置に置く。
ら７の支持体のうち１つの懸濁液（支持体1ml当たり２
−10mg）と、又はミカエリス緩衝液とインキュベートす
ることにより実施する。30分経過後IgGHを含む混合液を
遠心分離し、以下の方法に従い上澄液のIgG及び／又は
抗VIII:C抗体濃度を測定する： １）ICLプレート（ICLサイエンチフイツク（Fountain V
alley,カリフオルニア州）が販売している）を用いて放
射免疫抗散法によりIgG濃度を測定する。測定すべきIgG
濃度により低濃度又は極低濃度キツトを使用する。測定
に際して１枚のプレートの上にIgG濃度が既知の２種類
のスタンダード（それぞれ0.15と3mg/ml）とIgGHを含有
する４個の上澄液を処理した。又再現性をよくするため
5.0μｌの上澄液が各位置に正確に添加できるマイクロ
ピペツトを使用する。さらに結果の偏りをなくすため、
吸着前後のIgG濃度に対応する試料を隣り合う２つの位
置に置く。
２）部分トロンボプラスチン時間（PTT）と抗VIII:C抗
体濃度を関係づける標準曲線を用いて抗VIII:C抗体定量
測定を行う。この標準曲線は抗VIII:C抗体濃度が０−２
ベセスダ（Bethesda）単位/ml（IgGH調製物を希釈して
得られる）のIgGH調製物から得られる。標準曲線を得る
ために、抗VIII:C抗体を含有する希釈率の異なるIgG希
釈液を、まず正常血漿と37℃で２時間インキュベート
し、次に1/10希釈して、この混合液の0.1mlを0.1mlの血
友病患者の血漿及び10分間活性化したケフアリン0.1ml
とインキュベートする。次に0.1mlのCaCl2を添加した後
部分トロンボプラスチン時間（PTT）を測定する。
体濃度を関係づける標準曲線を用いて抗VIII:C抗体定量
測定を行う。この標準曲線は抗VIII:C抗体濃度が０−２
ベセスダ（Bethesda）単位/ml（IgGH調製物を希釈して
得られる）のIgGH調製物から得られる。標準曲線を得る
ために、抗VIII:C抗体を含有する希釈率の異なるIgG希
釈液を、まず正常血漿と37℃で２時間インキュベート
し、次に1/10希釈して、この混合液の0.1mlを0.1mlの血
友病患者の血漿及び10分間活性化したケフアリン0.1ml
とインキュベートする。次に0.1mlのCaCl2を添加した後
部分トロンボプラスチン時間（PTT）を測定する。
抗VIII:C抗体濃度が上昇するとすぐれたPTTが上昇す
る。得られた結果は第１図に示す。この図は、抗VIII:C
抗体濃度（U/ml）の関数としてのPTT（秒）の標準曲線
を示す。
る。得られた結果は第１図に示す。この図は、抗VIII:C
抗体濃度（U/ml）の関数としてのPTT（秒）の標準曲線
を示す。
標準曲線を作成した後、上澄液について部分トロンボプ
ラスチン時間を測定し、標準曲線と希釈率から抗VIII:C
抗体濃度をもとめる。
ラスチン時間を測定し、標準曲線と希釈率から抗VIII:C
抗体濃度をもとめる。
これらの方法により、吸着前の最初のIgGと抗VIII:C抗
体の濃度、及び吸着支持体に接触した後の試料のIgGと
抗VIII:C抗体の残存濃度を求めることができる。
体の濃度、及び吸着支持体に接触した後の試料のIgGと
抗VIII:C抗体の残存濃度を求めることができる。
すなわちミカエリス緩衝液と接触させた試料のIgGと抗V
III:C抗体濃度は、試料の最初のIgG及び抗VIII:C抗体濃
度を２で割つたものを対応する。吸着支持体に接触させ
た試料のIgGと抗VIII:C抗体濃度は残存するIgG及び抗VI
II:C抗体濃度に対応する。従つてここから異なる支持体
に吸着されたIgGと抗VIII:C抗体濃度を求めることがで
きる。
III:C抗体濃度は、試料の最初のIgG及び抗VIII:C抗体濃
度を２で割つたものを対応する。吸着支持体に接触させ
た試料のIgGと抗VIII:C抗体濃度は残存するIgG及び抗VI
II:C抗体濃度に対応する。従つてここから異なる支持体
に吸着されたIgGと抗VIII:C抗体濃度を求めることがで
きる。
第２図と第３図は、実施例１、２及び７の支持体に対応
するIgGと抗VIII:C抗体の吸着等温線である。曲線１はI
gGの吸着に対応し、横軸には吸着前のIgG濃度（mg/m
l）、そして縦軸には支持体に吸着されたIgG濃度（mg/m
l）がプロツトしてある。曲線２は抗VIII:C抗体の等温
吸着に対応し、横軸には吸着前の抗VIII:C抗体濃度（U/
ml）、そして縦軸には支持体に吸着された抗VIII:C抗体
濃度（U/ml）がプロツトしてある。IgGHの具体的な活性
を考慮した目盛りにより２つの吸着線を直接比較するこ
とができる。
するIgGと抗VIII:C抗体の吸着等温線である。曲線１はI
gGの吸着に対応し、横軸には吸着前のIgG濃度（mg/m
l）、そして縦軸には支持体に吸着されたIgG濃度（mg/m
l）がプロツトしてある。曲線２は抗VIII:C抗体の等温
吸着に対応し、横軸には吸着前の抗VIII:C抗体濃度（U/
ml）、そして縦軸には支持体に吸着された抗VIII:C抗体
濃度（U/ml）がプロツトしてある。IgGHの具体的な活性
を考慮した目盛りにより２つの吸着線を直接比較するこ
とができる。
これらの曲線に基づき、抗VIII:C抗体に対する吸着等温
線（２）の傾きとIgGに対する吸着等温線（１）の関係
を示すS1の値、及びこの２つの等温線間のプラトー状態
での吸着値の関係を示すS2の値が求められる。支持体の
抗VIII:C抗体に対する選択性がゼロの場合、この２つの
吸着等温線はかなり、S1とS2は１に近くなる。しかし選
択性が高い場合は、S1とS2は高い値となる。
線（２）の傾きとIgGに対する吸着等温線（１）の関係
を示すS1の値、及びこの２つの等温線間のプラトー状態
での吸着値の関係を示すS2の値が求められる。支持体の
抗VIII:C抗体に対する選択性がゼロの場合、この２つの
吸着等温線はかなり、S1とS2は１に近くなる。しかし選
択性が高い場合は、S1とS2は高い値となる。
添付した表には、吸着試験中に得られたS1及び／又はS2
の値を、実施例１−８の支持体に変換してある。実施例
４、１、５及び８の支持体でそれぞれクロロスルホン化
ポリスチレンへのヒドロキシプロリン、グルタミン酸、
スレオニン及びリジンの固定に対応して最も良い選択性
が得られている。実施例１の支持体の場合、抗VIII:C抗
体の60％が吸着され、IgGの吸着はわずか16％であると
いう、良好な選択性が得られている。実施例２及び３に
ついても良好な結果が得られている。
の値を、実施例１−８の支持体に変換してある。実施例
４、１、５及び８の支持体でそれぞれクロロスルホン化
ポリスチレンへのヒドロキシプロリン、グルタミン酸、
スレオニン及びリジンの固定に対応して最も良い選択性
が得られている。実施例１の支持体の場合、抗VIII:C抗
体の60％が吸着され、IgGの吸着はわずか16％であると
いう、良好な選択性が得られている。実施例２及び３に
ついても良好な結果が得られている。
しかし実施例６の場合S1の値は１より小さく、抗VIII:C
抗体が選択的に吸着されないため良好な選択性は得られ
ない。
抗体が選択的に吸着されないため良好な選択性は得られ
ない。
すなわちグルタミン酸メチルは選択性は悪いが、グルタ
ミン酸は非常に良い選択性を有している。これらはＹの
ラデイカルR1が酸性官能基の場合に良好な結果が得られ
ることを示している。同様にプロリンで得られた結果は
ヒドロキシプロリンで得られた結果よりも悪く、これは
プロリンのラデイカルR1がOH基であるためである。
ミン酸は非常に良い選択性を有している。これらはＹの
ラデイカルR1が酸性官能基の場合に良好な結果が得られ
ることを示している。同様にプロリンで得られた結果は
ヒドロキシプロリンで得られた結果よりも悪く、これは
プロリンのラデイカルR1がOH基であるためである。
すなわち固定されたアミノ酸の性質は結果を大きく左右
する。
する。
実施例10:−SO3Na基のみを固定したポリスチレン支持体 実施例１のように4m当量/gの−SO2Cl基を含むクロロス
ルホン化ポリスチレンを調製した後、2M NaOHソーダ溶
液を用いて60℃でクロロスルホン基を加水分解した。ク
ロロスルホン化したこの粉末をソーダ溶液に24時間浸
し、全ての−SO2Cl基を−SO3Na基に変換させた。
ルホン化ポリスチレンを調製した後、2M NaOHソーダ溶
液を用いて60℃でクロロスルホン基を加水分解した。ク
ロロスルホン化したこの粉末をソーダ溶液に24時間浸
し、全ての−SO2Cl基を−SO3Na基に変換させた。
こうして調製した支持体を馴化させ実施例9a）のように
洗滌し、実施例９と同じ条件で血友病患者の血漿中に残
存する抗VIII:C抗体の吸着試験を行つた。
洗滌し、実施例９と同じ条件で血友病患者の血漿中に残
存する抗VIII:C抗体の吸着試験を行つた。
実施例９と同じ条件で得られた吸着等温式に基づき、S1
とS2の値を求めると、S1＝3.2でS2＝2.7である。従つて
この支持体も抗VIII:C抗体の選択的吸着を実施するのに
興味深い性質を有している。
とS2の値を求めると、S1＝3.2でS2＝2.7である。従つて
この支持体も抗VIII:C抗体の選択的吸着を実施するのに
興味深い性質を有している。
本発明の支持体は第４図と第５図に示す精製器中で血漿
の精製用に使用できる。
の精製用に使用できる。
血漿の連続的精製を示す第４図から明らかなように、精
製器は、本発明の吸着支持体を含むカラム１、精製すべ
き血液から血漿を分離するための細胞分離機３、そして
一方で（３で）処理されるべき血液の分離された細胞が
導入され、他方では精製された血漿が導入される捕集器
５より構成される。
製器は、本発明の吸着支持体を含むカラム１、精製すべ
き血液から血漿を分離するための細胞分離機３、そして
一方で（３で）処理されるべき血液の分離された細胞が
導入され、他方では精製された血漿が導入される捕集器
５より構成される。
この装置ではポンプ９と圧力測定手段11を備えた最初の
パイプ７を用いて患者の血液を細胞分離機３に導入し、
ここで細胞はパイプ13により捕集器５に排出され、一方
血漿はポンプ17を備えたパイプ15に導かれて、本発明の
吸着支持体を含有するカラム１に入る。カラム１を出る
と精製血漿は、圧力測定手段21を備えたパイプ19により
捕集器５に排出され、この捕集器は又はこのように復元
した血液の泡を防ぐための安全装置となる。圧力測定手
段25を有するパイプ23により、復元血液は患者の循環系
に排出される。従つて装置に血液を導入するためのパイ
プ７と循環系に血液を戻すためのパイプ23は患者の静脈
に接続されている。
パイプ７を用いて患者の血液を細胞分離機３に導入し、
ここで細胞はパイプ13により捕集器５に排出され、一方
血漿はポンプ17を備えたパイプ15に導かれて、本発明の
吸着支持体を含有するカラム１に入る。カラム１を出る
と精製血漿は、圧力測定手段21を備えたパイプ19により
捕集器５に排出され、この捕集器は又はこのように復元
した血液の泡を防ぐための安全装置となる。圧力測定手
段25を有するパイプ23により、復元血液は患者の循環系
に排出される。従つて装置に血液を導入するためのパイ
プ７と循環系に血液を戻すためのパイプ23は患者の静脈
に接続されている。
第５図に示す血漿を精製するための精製器では、患者血
液が装置に連続的に移動してくる間、精製は断続的に実
施される。第４図の精製器のほとんどの成分が出ており
これらは同様の意味を有している。この場合、細胞分離
機３からの血漿は、本発明の吸着支持を含有する容器31
と32中で断続的に精製される。この場合ポンプ17で循環
される血漿は回路から抽出され抽出弁18により容器31に
導入される。容器31で精製された後、血漿は再びパイプ
16によりポンプ17の上流に導入されるが、この間弁14は
閉じたままである。
液が装置に連続的に移動してくる間、精製は断続的に実
施される。第４図の精製器のほとんどの成分が出ており
これらは同様の意味を有している。この場合、細胞分離
機３からの血漿は、本発明の吸着支持を含有する容器31
と32中で断続的に精製される。この場合ポンプ17で循環
される血漿は回路から抽出され抽出弁18により容器31に
導入される。容器31で精製された後、血漿は再びパイプ
16によりポンプ17の上流に導入されるが、この間弁14は
閉じたままである。
本発明の支持体は又第VIII:C因子の精製に用いることも
できる。この場合、支持体にまず抗VIII:C抗体を含有す
る血漿を接触さえて抗体を吸着させる。次にこの抗体が
結合した支持体に、第VIII:C因子を含有する液体を接触
させることにより、第VIII:C因子の精製に使用できる。
できる。この場合、支持体にまず抗VIII:C抗体を含有す
る血漿を接触さえて抗体を吸着させる。次にこの抗体が
結合した支持体に、第VIII:C因子を含有する液体を接触
させることにより、第VIII:C因子の精製に使用できる。
第１図は、部分トロンボプラスチン時間（PTT）に基づ
き、試料の抗VIII:C抗体濃度を定量するための標準曲線
を示す。 第２図及び第３図は、異なる支持体上の免疫グロブリン
と抗VIII:C抗体の吸着等温式を示す。 第４図は、本発明の方法を実施するためのカラム血漿精
製器の図である。 第５図は、又別の血漿精製器の図である。
き、試料の抗VIII:C抗体濃度を定量するための標準曲線
を示す。 第２図及び第３図は、異なる支持体上の免疫グロブリン
と抗VIII:C抗体の吸着等温式を示す。 第４図は、本発明の方法を実施するためのカラム血漿精
製器の図である。 第５図は、又別の血漿精製器の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ａ 8310−2Ｊ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ 33/545 Ｚ 9015−2Ｊ (72)発明者 ジヤツクリーヌ ジヨズフオンビクヅ フランス国ラモライエ，デユクシセーム アブニユ 65 (56)参考文献 特開 昭60−36505（ＪＰ，Ａ)
Claims (11)
- 【請求項１】液体中に存在する抗VIII:C抗体の分離方法
であって： ａ）鎖の中に置換可能な官能基を有し、少なくともその
一部は、式−(SO3)xMの基及び式−SO2Yの基、あるいは
式−(SO3)xMの基のみ、あるいは式−COYの基（式中、Ｍ
は前記液体と反応しない金属であり、Ｘは、金属Ｍの結
合価であり、Ｙは、他の免疫グロブリンに比較して抗VI
II:C抗体に対して親和性を有する化合物であってグルタ
ミン酸、アラニン、フェニルアラニン、ヒドロキシプロ
リン、スレオニン、リジン及びこれらの誘導体から選ば
れる化合物のアミノ基から水素原子を除くことにより得
られる基を表わす）により置換されたポリマー又はコポ
リマーより成る固体支持体に、前記液体を接触させ、そ
して ｂ）抗VIII:C抗体を吸着させた支持体から前記液体を分
離する ことより成る、上記分離方法。 - 【請求項２】基Ｙはグルタミン酸のアミノ基から水素原
子を除くことにより得られるものである、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】基Ｙはヒドロキシプロリンのアミノ基から
水素原子を除くことにより得られるものである、特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】基Ｙはスレオニンのアミノ基から水素原子
を除くことにより得られるものである、特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 - 【請求項５】基Ｙはアラニン、フェニルアラニン及びリ
ジンから選ばれるアミノ酸のアミノ基から水素原子を除
くことにより得られるものである、特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 - 【請求項６】支持体は、式−SO2Yの基と式−(SO3)xMの
基が結合したポリスチレン又はスチレンコポリマーより
構成される、特許請求の範囲第１項から第５項のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項７】スチレンコポリマーは、スチレンの結合し
たクロロスルホン化耐性ポリマーにより構成される、特
許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】クロロスルホン化耐性ポリマーは、ポリオ
レフイン、フッ素化ポリマー及びポリビニルクロリドよ
り選ばれる、特許請求の範囲第７項に記載の方法。 - 【請求項９】支持体は、式−COYの基及び式CH2CONHR4−
SO3R5の基（R4は置換されている又は置換されていない
アルキル、アリール、又はアルキルアリールを表わし、
R5は水素原子又は液体と反応しない金属を表わす）が結
合した多糖により構成される、特許請求の範囲第１項か
ら第５項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】多糖はポリデキストランである、特許請
求の範囲第９項に記載の方法。 - 【請求項１１】液体は、血漿である、特許請求の範囲第
１項から第10項のいずれか１項に記載の方法。
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