JPH0113837B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人血漿由来のプラスミンを含まないプ
ラスミノゲンの製造方法に関する。プラスミノゲ
ンはウロキナーゼ等によつて活性化されてプラス
ミンとなり、これがフイブリンを分解して線溶現
象を生起するものである。プラスミンを含まない
プラスミノゲンは線溶現象の研究には必須のもの
であり、特にウロキナーゼ等の活性剤の研究にあ
つては欠かせないものである。

プラスミノゲンのリジン・セフアロースを用い
ての精製法はすでに確立された方法（Science、
第170巻、第1095頁、1970年参照）であるが、コ
ーンの分画を原料として用いた場合に得られる
プラスミノゲン中には約５〜10％のプラスミンが
混在しており、線溶現象の研究用としては使用出
来ないものである。

そこで本発明者らは、プラスミノゲンを含有す
る水溶液からプラスミンを完全に除去する方法を
種々検討し、吸着・除去剤として固定化天然性プ
ラスミン阻害剤を選択することにより本発明を完
成した。

本発明は、固定化天然性プラスミン阻害剤を用
いて粗製プラスミノゲン中に混在するプラスミン
を選択的に吸着除去し、線溶現象の研究用に使用
し得るプラスミノゲンを製造する方法からなる。

本発明で使用する天然性プラスミン阻害剤とし
ては、 大豆トリプシン阻害剤：Kunitz（J.Gen.
Physiol.29巻、149頁（1946年））によつて大豆よ
り発見された阻害剤、 臓器由来のKunitzの阻害剤（M.Kunitzおよび
J.H.Northrop；J.Gen.Physiol.、９巻、991頁、
1936年）、 Kazalの阻害剤（L.A.Kazal、D.S.Spicerおよ
びR.A.Brahinsky；J.Am.Chem.Soc.、70巻、
3034頁、1948年）、 血液由来のα₁―グロブリンの阻害剤（H.
Fritz：Z.Phys.Chem.、350、933、1969年）、 人尿性阻害剤（特開昭51−123810）、 α₂―グロブリンの阻害剤（M.Laskousk；J.
Biol.Chem.、204、153、1953年）、 卵白中のオボムコイドの阻害剤（R.E.
Feeney；J.Biol.Chem.、244、1957、1969年）、
その他植物起源、ジヤガイモ（特公昭46−27833）
およびトウモロコシ（K.Hochstasser.K.
Illchmann ＆ E.Werlc；Hoppe―Seylers.Z.
Physiol.Chem.、351、721、1970年）起源； あるいは、微生物起源（例えばストレプトマイ
セス・ローシヤス産生のもの、H.Umezawa；J.
Antibiotics.、22、283）の阻害剤等従来公知の天
然性蛋白分解酵素阻害剤のうちプラスミン阻害剤
が広く用いられる。次にこれら阻害剤を固定化担
体と吸着または結合せしめて不溶性とする方法
は、一般に酵素の不溶化方法として知られている
方法において酵素の代りに前記阻害剤を用いるこ
とにより同様に行なわれる。

即ち従来実施又は提案されている酵素の不溶化
方法としては、高分子多糖体を臭化シアンで活性
化させたものに酵素を結合させるとか、ケイ素材
料に酵素を共有結合させるなど不溶性担体に化学
的に結合させる方法（特開昭46−1838号）、活性
炭吸着などの物理的（米国特許第2717852号）若
しくは塩基性陰イオン交換体に吸着させるなどの
静電的（特公昭45−6870号）な方法、適当なマト
リツクス、例えばフイブリン重合体中に酵素を埋
没させる方法（特開昭49−41584などが挙げられ、
本発明における固定化天然性プラスミン阻害剤の
製造は酵素の代りに前記の阻害剤を用いること以
外は同じ方法によつて達せられる。

阻害剤を化学的に結合させて不溶化するために
用いられる固定化担体は、天然性プラスミン阻害
剤と結合可能な基、例えばカルボキシル基又はア
ミノ基などを有する水不溶性有機又は無機高分子
材料である。ポリアクリルアミドゲル〔バイオ―
ゲル（Bio―gel）ｐ―300など：米国、バイオゲ
ル社発売〕、アガロース〔セフアロース
（Sepharose）4Bなど：スウエーデン国、フアル
マシア社発売〕、デキストラン〔セフアデツクス
（Sephadex）G200、〕のような天然性プラスミン
阻害剤と直接結合しない多糖体では、これらを臭
化シアンで処理することにより結合能を与えた材
料が有利に用いられる。多糖類を臭化シアンで処
理する方法はP.クアトレカサス及びC.B.アンフイ
ンセン（Cuatrecasas、P.and Anfinsen、C.B.）
〔メソーズ イン エンザイモロジイＸXII、ジヤ
コビ編（Methods in Engymology.XXII、ed.by
Jakoby、W.B.）pp345、（1971）〕によつて提案
されているアフイニテイ―クロマトグラフイーの
手法でタンパクを分離する方法として既に確立さ
れている。

同様にして結合基を有しないポリアミド、例え
ばナイロン、ポリアセタール、ポリスチレンなど
の高分子重合体も適当な処理剤、例えば臭化シア
ンで処理することによつて、天然性プラスミン阻
害剤との結合能のある基を与えるこてができる。
更にガラスのような無機材料も、これをアミノア
ルキルシランで処理することによつて結合可能な
アミノ基を与えることができ、天然性プラスミン
阻害剤の不溶化に用いることが可能である。

酵素を閉じ込めて不溶化させるのに用いられる
マトリツクスは、高分子量の有機重合体のゲル又
は繊維が用いられるが、天然性プラスミン阻害剤
についても適当な手段を選ぶことによつて、これ
らが用いられ得る。

担体にタンパク結合可能基を与える処理剤で処
理する条件は次のとおりである。

多糖類担体の場合、通常臭化シアンを用いPH
10〜12で冷却しながら行う。

高分子重合体である巨大網状構造を有するメ
タアクリレート重合体も又同様にして、PH10〜
12で臭化シアンで活性化するとよい結果が得ら
れる。

無機質担体であるガラスの活性化は、オルガ
ノシランによつて行われる。その条件として
は、不活性溶媒にオルガノシランを溶かし、室
温で十分な時間反応させることによつて得られ
る。

重合体―トラツプ法としては、天然性リプシ
ン阻害剤を吸着する担体はすべて可能である
が、より簡単な担体が好ましい。

以上のようにして得られた結合能を有する担体
と天然性プラスミン阻害剤との反応は、中性付近
（PH６〜８）で約３〜25℃で行うことができる。

以上の不溶化方法においてより好ましい方法は
天然性プラスミン阻害剤と担体との結合が共有結
合によるものである。

かくして提供された固定化天然性プラスミン阻
害剤は、次にプラスミンを夾雑するプラスミノゲ
ンを含有する水溶液と接触され、選択的にプラス
ミンを該担体に吸着せしめ除去する。

本発明で使用する原料のプラスミンを夾雑する
プラスミノゲンを含有する水溶液は特に限定され
るものではなく、血清、血漿及び腹水以外にも人
の血漿のフイブリノーゲン、γ―グロブリンおよ
びアルブミンなど重要な生物学的薬剤の製造に一
般に用いられる血漿タンパク分画法におけるコー
ンの低温アルコール分画法の分画のようにプラ
スミノゲンを含有するものであればよい。

この水溶液の精製度は特に限定されないが、よ
り好ましくは、例えば固定化リジンによるアフイ
ニテイクロマトグラフイー処理によつて高度精製
したものであれば、そのまま本発明に利用できる
が、分画のように粗精製のものの場合は、本発
明からなる処理後さらにプラスミノゲンの特異的
精製が必要である。

このプラスミンを夾雑するプラスミノゲンを含
有する水溶液を前記固定化天然性プラスミン阻害
剤と接触させるとプラスミンが特異的に担体に吸
着され、プラスミノゲンは吸着されない。これに
よつて両者は分離される。

原料プラスミノゲン含有水溶液をこの吸着剤と
接触させる時のPHは４〜11が好ましく、また塩濃
度は塩化ナトリウムとして1.5M以下であればよ
い。接触は吸着塔を用いてもよくバツチ式でもよ
い。

この固定化天然性プラスミン阻害剤100mlはPH
7.8、イオン強度0.15Mの溶液中でプラスミンの
約3000〜5000CU〔カゼイン単位：Vox Sanguinis
５巻、357〜376頁（1960年）〕を吸着する能力を
有し、プラスミノゲンは全く吸着しなかつた。使
用後の固定化天然性プラスミン阻害剤はPH４以下
あるいは高塩濃度水溶液により洗浄することによ
つて再使用できる。

固定化天然性プラスミン阻害剤との接触処理を
おこなつたプラスミノゲンを含有する水溶液は、
前処理によつて高度精製されたものはそのまま、
粗精製のものはさらに精製をおこなつた後プラス
ミノゲンの凍結乾燥品として提供される。

本発明の方法は、比較的安価であり、又プラス
ミンの回収も同時におこなうことができ、産業上
効率がよく、さらにプラスミンをほとんど夾離し
ないプラスミノゲンを確実に提供しうるものであ
る。而して、保存安定性にも優ぐれた高品質の試
薬・医薬品の生産の達成が可能となつた。

本発明を実施例によつて詳細に説明するが、こ
れらは本発明を何んら限定するものではない。

実施例 １ コーンの分画５Kgを用い、特公昭53−1805の
方法に従つてリジン・セフアロースカラムクロマ
トグラフイーによつてプラスミノゲンを精製し、
得られたプラスミノゲン水溶液から前記方法にお
いて溶出に用いたイプシロン・アミノカプロン酸
を透析により除去し、このものを５cm×25cmの
Kunitz法（前記）によつて得た大豆トリプシン
阻害剤をアガロースにブロムシアンによつて固定
化した吸着剤を充填したカラム（0.1Mトリエタ
ノールアミン緩衝液PH7.8で平衡化）と接触、展
開させ、プラスミンを吸着除去し、通過してくる
プラスミノゲンを含有する水溶液を回収した。こ
の処理によつて通過前６％のプラスミンを含んで
いたものが、通過後は全く検知されなかつた。水
溶液は通常の方法に従つて凍結乾燥標品とする。
プラスミノゲンの収量は、分画から計算して約
80％、190000CUであり、得られたプラスミノゲ
ンの比活性は90CU/mg、窒素であつた。

実施例 ２ 実施例１と同様に原材料コーンの分画（５
Kg）を用い、リジン・セフアロースカラムクロマ
トグラフイーによつて精製し、さらに前処理とし
て、セフアデツクスＧ―25（10×90cmのカラム：
0.05Mトリス緩衝液によつて平衡化、展開）を用
いてリジン等の夾雑物を除去後、プラスミノゲン
を含有する水溶液を回収して、これに人尿性トリ
プシン阻害剤（前記）をブロムシアンによつてア
ガロースに固定化した吸着剤500mlを投入し、約
２時間撹拌し、ろ過によつて吸着剤を除去し、プ
ラスミノゲンを含有する水溶液を回収する。吸着
剤投入前のプラスミノゲン水溶液では、総プラス
ミンとして、約７％の遊離のプラスミンを含んで
いたが、吸着処理後には、遊離のプラスミンは検
出されなかつた。水溶液は凍結乾燥標品とする。
収量はコーンの分画から計算して75％、
180000CUであり、得られたプラスミノゲンの比
活性は、110CU/mg窒素であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プラスミンを夾雑するプラスミノゲン水溶液
   をPH４〜11および塩濃度1.5M以下の条件下に固
   定化天然性プラスミン阻害剤と接触させ、夾雑す
   るプラスミンをほぼ完全に吸着除去し、プラスミ
   ンをほとんど含まないプラスミノゲンを製造する
   方法。