JPH0217942A - Ｔｎｆに対する選択的吸着体及び血漿中のｔｎｆの分離，除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、Ｔ　ＨＰ　（Ｔ　ａｍｍ−Ｈｏｒｓｆａｌｌ
　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎ）を不溶性担体に結合させた、ヒト
Ｔ　Ｎ　Ｆ　（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔ
ｏｒ　）に対する選択的吸着体、及びこれを用いてヒト
ＴＮＦを血漿中より分離、除去する方法に関するもので
ある。

ｂ、従来技術 Ｔ　Ｉ−Ｉ　Ｐはウィルスによる赤血球凝集反応を抑制
する尿中因子として１９５０年に報告された［　Ｔ　ａ
ｌｌｌｌａｎｄ　ｔ（ｏｒｓｆａｌｌ　　；　ｐｒｏｃ
、ｓｏｃ、　Ｅｘａ、　Ｂ　ｉｏｌ、ａｎｄＭｅｄ、　
７４．　１０８（１９５０）　］　、以後、産生器官や
産生量等について研究が進められ、腎臓中の遠位のヘン
レ係蹄において産生され、健常人では、１日約８０１９
が尿中に放出されることが知られている［１−１ｕｎｔ
　ｅｔ　ａｌ　　；　３ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　　２２
７．　９５７（１９８５）　］。

このようにＴＨＰは尿中の主要タンパク質であるにもか
かわらず、その生理的意義等についてはほとんど不明で
あった。

一方、最近になって妊婦尿より、免疫反応を抑制する糖
蛋白としてウロモデュリン （Ｌｌ　ｒｏａ＋ｏｄｕｌｉｎ　）が単離れた［　Ｍ　
ｕｃｈｍｏｒｅ　ａｎｄＤｅｃｋｅｒ　；　３ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２９．４７９　　（１９８５）　］　。ウロモ
デュリンはｃＤ　Ｎ　Ａ配列の決定がなされ、Ｎ末のア
ミノ酸配列の相同性、プロテアーゼ分解したペプチド断
片のアミノ酸配列の部分相同性１分子量及び糖の含量等
よりＴＨＰとほぼ等しいものでアルコとが明らかとなっ
た［　ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ　；５ｃｉｅｎｃｅ
　　２３６．８３（１９８７）　、　）−１ｅｓｓ＋ｏ
ｎ　ｅｔ　ａｌ；５ｃｉｅｎｃｅ　　２３７．１４７９
　（１９８７）　］　。このウロモデュリンの免疫反応
抑制能は、インターロイキン１（ＩＬ−１）と結合して
ＩＬ−１のＩＬ−１リセプターへの結合を抑制すること
により発現されること、又、ウロモデュリンはＩＬ−１
以外にもＴＮＦと結合することが報告されている ［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｄｅｃｋｅｒ　：　Ｊ　
、　Ｂ　ｉｏｌ、ＣｈｅＩｍ。

２６１、１３４０４　　（１９８６）　、　Ｂｒｏｗｎ
　ｅｔ　ａｔ；　Ｐｒｏｃ、Ｎ。

Ａ　、　Ｓ　、８３．９１１９　（１９８６）　、　Ｍ
ｕｃｈａｉｏｒｅ　ａｎｄＤｅｃｋｅｒ　：　Ｊ　、　
　Ｉ　ｍ１ｕｎｏｌ、　　１３８．２５４１　（１９８
７）　］　。

Ｈｅ５ｓｉｏｎ　ｅｔ　ａｔ　：　５ｃｉｅｎｃｅ　　
２３７．１４７９（１９８７）　］。しかしながら、ウ
ロモデュリンがＩＬ−１活性を抑制するのに必要な構造
はその糖鎖であり、又ＩＬ−１活性の抑制能においてウ
ロモデュリンとＴ　ＨＰには差異が認められることより
、ウロモデュリンとＴＨＰが糖鎖まで含めた全構造にお
いて全く同一の分子であるとは考えにくい。

ところｔ’ＴＮＦは１９１５年にＣａｒｓｗｅｌ　ｌ　
らが報告して以来［Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ　　
：　Ｐｒｏｃ、Ｎ、　Ａ、　Ｓ。

７２、３６６６　（１９７５）　］　、腫瘍に対して選
択的に壊死をひきおこす生理活性蛋白質として興味を集
めた。

１９８５年に遺伝子配列が決定され［ｐｅｎｎｉｃａ　
ｅｔ　ａｔ　；Ｎａｔｕｒｅ　　３１２．　７２４（１
９８５）　、　５ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ　　；Ｎａｔ
ｕｒｅ　　３１３．　８０３（１９８５）　、　Ｗａｎ
ｏ　ｅｔ　ａｌ　　；３　ｃｉｅｎｃｅ　　２２８．　
１４９　（１９８５）　］　、純粋なＴＮＦや抗ＴＮＦ
抗体が利用されるようになると、当初期待された抗腫瘍
性以外にも種々の活性を有することが明らかとなった。

例えばローカルシュワルツマン反応の惹起［Ｍｏｖａｔ
　ｅｔ　ａｌ　；　Ａｍｅｒ、　　Ｊ　。

Ｐａｔｈｏｌ、１２９．　４３６（１９８７）　］　、
細菌感染によるエンドトキシンショックのメデイエータ
−としての活性［Ｔ　ｒａｃｅｙ　ｅｔ　ａｔ　　；　
３　ｃｉｅｎｃｅ　　２３４．　４７０（１９８６）、
Ｂｅｕｔｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ　：　　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　　２２９゜８６９　（１９８５）　］　、血管内
皮細胞への炎症反応の惹起［Ｇａ１ｂｌｅ　ｅＬ　ａｔ
　；　ｐｒｏｃ、　　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　８２゜８６６
７　（１９８５）　］　、発熱作用［Ｑ　１ｎａｒｅｌ
ｌｏ　ｅｔ　ａｌ　；Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　
１６３．１４４３（１９８６）　］　、炎症の起因物質
のひとつであるプロスタグランジン類の産生誘導［１３
ａｃｋｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｔ　　：　Ｂ、　Ｂ、　Ｒ，
Ｃ。

１３６、９４　＜１９８６）　］　、骨破壊作用［Ｂ　
ｅｒｔｏｌｉｎｉｅｔ　ａｌ；　Ｎａｔｕｒｅ　　３１
９．　５１６（１９８６）　。

５ａｋｌａｔｖａｌａ　；Ｎａｔｕｒｅ　　３２２．　
５４７（１９８６）　。

Ｔ　ｈｏｉｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ　　；　　Ｊ　　、
　　　［ｓｍｕｎｏｆ、　　１３８．　　７７５（１９
８７）　］などが挙げられる。

又、ＴＮＦはＩＬ−１の産生を促すことも知らレテイ８
　［Ｎａｗｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｔ　；　Ｊ　、　ＥｘＥ
ｌ、　Ｍｅｄ。

１６３、１３６３（１９８６）　］。

このようにＴＮＦは生体内において微量で、多様な作用
を示すホルモン様物質と考えられる。そしてＴＮＦの異
常六進は上述した様な作用機作に基き、生体に悪影響を
ひきおこす可能性があり、血漿中のＴＮＦｌｕを減少さ
せることができれば、このような病態の改善を図りうろ
ことを示唆しているものと考えられる。

Ｃ０本発明の構成 そこで本発明者は、ウロモデュリンと似た性質を有する
ＴＨＰに関して、鋭意研究を進めた結果、ヒトＴＮＦを
選択的に吸着しつる吸着体及びこの吸着体を用いてヒト
血漿中のＴＮＦを分離、除去しうろことを見出し、本発
明に到達したものである。

すなわち本発明はタムホースホールプロティン（Ｔ　Ｈ
Ｐ　）をリガンドとして不溶性担体に結合させた、ヒト
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する選択的吸着体であり、
またその吸着体を用いて、ヒト血漿中よりＴＮＦを選択
的に分離、除去する方法である。

一般に吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離、精製
に利用するクロマトグラフィーはアフイニティクロマト
グラフィーと呼ばれている［例えば千畑一部、土佐哲也
、松尾雄志著「実験と応用アフィニティクロマトグラフ
ィー」講談社サイエンティフィック参照］。本発明にお
けるアフィニティー、リガンド、不溶性担体、吸着体な
る詔はそれぞれ下記の意味に解するものとする。

７７４２７１２２種の物質量に存在する特異的親和力 リガント：吸着、精製あるいは除去を目的とする物質と
アフィニティを有する物質 不溶性担体：水に不溶性の支持体（これにはリガンドは
含まれない） 吸着体：リガンドを不溶性担体に固定化したちの次に、
本発明におけるヒトＴＮＦに対する選択的吸着体及びヒ
ト血漿中よりＴＮＦを分離、除去する方法について詳細
に説明する。

Ａ、ＴＨＰの単離、精製 リガンドとして用いるＴＨＰは哺乳動物の尿中に多量に
存在することが知られている。例えばヒト、ラットマウ
ス、ウサギの尿中に含まれていることが知られている。

どの動物由来のＴＨＰでもヒトＴＮＦに対してアフィニ
ティを有していれば使用することができるが、尿の採取
及び量などの点から、ヒト由来のＴＨＰが容易に大量に
得ることができる。

Ｔ）−ＩＰの尿からの精製は、ＴＨＰが高塩濃度下で容
易に凝集、析出する性質を利用する塩析によるものか、
あるいは抗ＴＨＰ抗体等をリガンドとする免疫吸着体に
よって行なうことができる。

般には塩析による方法が多く用いられている。すなわち
ＮａＣ１を高濃度、好ましくは最終濃度０．５８　Ｍと
なるように尿に添加し、沈澱物を分離し、この沈澱物を
再度水に溶解する。ＴＨＰを完全に溶解させ不溶物を除
去した後、再度ＮａＣｌを溶液に添加し、沈澱を得る。

この塩析、溶解の操作を数置繰り返した後、水に完全に
溶解させた試料を凍結乾燥し、ＴＨＰを得る。

Ｂ、吸着体の作成 選択的吸着体に用いられる不溶性担体としては、種々の
ものが使用できる。例えば材質として、セファロース、
ポリアクリルアミド、セルロース。

デキストラン、またはマレイン酸ポリマー或いはこれら
の混合物が好ましく用いられる。これら不溶性担体の形
状としては粉末状９粒状、ペレット状、ビーズ状、フィ
ルム状、Ｉ雄状など種々の形態であることができる。

ＴＨＰを不溶性担体に化学的にリガンドとして結合させ
る方法も種々のものが考えられる。容易な方法としては
、不溶性担体に活性を有する官能基、例えばイミドカー
ボネート基、シアネートエステル基及び／又はＮ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル基を結合させた試薬が、
ＣＮＢｒａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　
４Ｂ等（ファルマシア社製）やＡ　Ｈｉ−Ｇ　ｅｌ　　
ｉｏ、　Ａ　Ｈｉ−Ｇ　ｅｌ　　１５等（バイオラッド
社製）として市販されており、これらを利用して前者の
場合はＴＨＰの第一級アミノ基と、後者の場合はＴＨＰ
のアルキルアミノ基や芳香族アミノ基と結合させること
ができる。このようにして市販の不溶性担体を利用して
ＴＨＰ−不溶性担体の吸着体を容易に作成することがで
きる。

Ｃ０吸着体によるＴＮＦの分離、除去 適当な不溶性担体に化学的にＴＨＰをリガンドとして結
合させた吸着体をカラムに詰め適当な緩衝溶液（例えば
２０１ＢＭリン酸バッファーｐｌ−１７，４゜０．１３
５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１）によって平衡化する。この吸着
体にヒトＴＮＦを含む試料を添加して試料中のヒトＴＮ
Ｆを吸着させる。次に適当な洗浄溶液（例えば２０　Ｉ
ＩＭリン酸バッフｙ　−ｐＨ７，４゜０．１３５Ｍ　　
Ｎ　ａ　Ｃｊ　）によって非吸着物質を吸着体から溶出
する。次いで、試料の“素通り画分”及び゛洗浄画分”
中のヒトＴＮＦ量を測定する。かくして、その値から試
料中からのヒトＴＮＦの分離、除去の程度を算出するこ
とができる。

以上、本発明によれば、ヒト血漿中のＴＮＦを分離、除
去することが可能である。又、１ｍ−１がＴＨＰに対し
て結合することも知られており［Ｈｅｓｓｉｏｎ　ｅｔ
　ａｔ　：　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　　２３７．１４７９（
１９８７）　］　ＴＨＰをリガンドとして不溶性担体に
結合した本発明の吸着体は、ＴＮＦと同じように各種炎
症反応のメデイエータ−として働＜ＩＬ−１も血漿中よ
りＴＮＦと同時に分離、除去できる可能性が考えられる
。

以下、実施例をあげて、本発明ついて詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例 Ａ　Ｈｉ−Ｇ　ｅｌ　　１０にＴＨＰをリガンドとして
化学的に結合させた吸着体（０，５ａｅ）をカラムに詰
め、！ｌｌ液液２０１Ｍリン酸バッファーｐｉ−１７，
４゜０．１３５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１）で十分に洗浄後、
ＴＮＦ８．２５μグをｍｉｉ液中に含む試料１ｄを添加
した。

さらに上記緩衝液１．ＯＩｄでカラム内壁を洗浄し、溶
出した画分を「素通り画分」とした。次に非吸着物質を
上記緩衝液２．Ｏｄで溶出し「洗浄画分」とした。以上
の操作はすべて４℃で行なった。

ヒトＴＮＦ検量線の作成 ヒトＴＮＦＩは、本発明者らが先に出願した明細書く昭
和６２年４月２４日付出願、特願昭６２−１０００１０
号：発明の名称“川崎病の診断方法とそのための試薬”
又は昭和６３年４月２５日付出願：発明の名称゛被験者
の病態の判定のための検出方法。

モノクローナル抗体および検出キット″）に記載された
サンドインチ法を用いて測定した。

本実施例で使用した抗体は前記明細書記載のモノクロー
ナル抗体のうち’１１０７Ｇ４”を下記の如く不溶性担
体くイムノアッセイプレート）に固定して用いた。また
“９０４Ｇ５”をウシ膵臓由来のアルカリ性ファスファ
ターゼ（シグマ）で標識して２次抗体として用いた。

濃度１５μｇ／ｊＩｉ！のモノクローナル抗体（１１０
７Ｇ４）をイムノアッセイプレート（タイターチック）
上に４℃で一晩放置し固定化した。０．５％牛血清アル
ブミンを含む洗浄液（２０１Ｍリン酸バッフｙ−０，１
３５Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，０，０５％Ｔ　ｗｅｅｎ２０゜
０．２％Ｎａ　Ｎａ　）で３回洗浄したのち、１％牛血
清アルブミンを含むバッファー（２０１１Ｍリン酸バｙ
　７７−　０．１３５Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，０，２％Ｎａ
Ｎ５）を加えて室温で１時間放置した。前記洗浄液で、
３回洗浄したのち、種々の濃度のヒトＴＮＦを加え室温
で１時間反応させた。さらに前記洗浄液で３回洗浄した
のち、アルカリ性ファスファターゼで標識した２次抗体
（９０４Ｇ５）を加え、室温で１時間反応させた。前記
洗浄液で洗浄後、アルカリ性フォスファターゼの基質１
）　−Ｎ　１ｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ
、　Ｄ　１ｓｏｄｉｕａ＋を１　ｔｑ／ａｌの濃度で加
えＥＬＩＳＡ　　ＡＮＡＬＹＺＥＲ（東洋測置■製ＥＴ
Ｙ−９６）ｒ、４０５ｎｍの波長における１分間当りの
吸光度変化を測定した。その結果を添付図面に示した。

この図面から、ヒトＴＮＦを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を用いたサンドインチ法の酵素抗体免疫測定
法によってヒトＴＮＦの量を容易に測定することができ
る。

添付図面を検量線として用い、ＴＮＦを含む試料の「素
通り画分」及び「洗浄画分」のヒトＴＮＦ量を測定した
。

試料中のヒトＴＮＦ＠の測 濃度１５μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦモノクローナル抗体（１
１Ｄ７Ｇ４）をイムノアッセイプレート（タイターチッ
ク）上に４℃で一晩放置し固定化した。

０．５％牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０ｍＭリン
酸バッフＦ　＋、　　０，１３５Ｍ　　Ｎａ　Ｃｊ、　
　０．０５％Ｔ　ｗｅｅｎ２ｏ、　　０，２％Ｎａ　Ｎ
ａ　）で３回洗浄したのち、１％牛血清アルブミンを含
むバッファー（２０１Ｍリン酸バッフｐ−，０，１３５
Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，０，２％Ｎａ　Ｎ３）を加えて室温
で１時間放置した。前記洗浄液で、３回洗浄したのち、
緩衝液（２０１１１Ｍリン酸バッフｐ　−ｐＨ７，４，
０，１３５Ｍ　　ＮａＣＪ）で種々の濃度となるように
希釈した試料（前記「素通り画分」、「洗浄画分」及び
添加試料）を加え室温で１時間反応させた。

さらに前記洗浄液で３回洗浄したのち、アルカリ性ファ
スファターゼで標識した２次抗体（９０４Ｇ５）を加え
、室温で１時間反応させた。前記洗浄液で洗浄後、アル
カリ性フォスファターゼの基質１１−Ｎｉｔｒｏｐｈｅ
ｎｙｌ　　Ｐｈ０３Ｄｈａｔｅｉ、　ＤｉＳＯｄｉｕｌ
を１■／ｄの濃度で加えＥＬＩＳＡ　　ＡＮＡＬＹＺＥ
Ｒ（東洋測置■製ＥＴＹ−９６）ｔ−１４０５ｎｌ　（
７）波長における１分間当りの吸光度変化を測定した。

結果を下記表に示す。「素通り画分」には１．９０μ９
のＴＮＦが検出されたが、「洗浄画分」にはＴＮＦは検
出されず、全体として、添加したＴＮＦ量８．２５μ９
の約７７％が、試料中より分離、除去しうろことが確認
された。

表（各試料中のＴＮＦ量）

【図面の簡単な説明】

添付図面はヒトＴＮＦ測定の検量線図を示すものである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タムホースホールプロテイン（ＴＨＰ）を不溶性担
   体に結合させたヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する選
   択的吸着体。 ２、該不溶性担体がセフアロース、ポリアクリルアミド
   、セルロース、デキストラン及びマレイン酸ポリマーか
   らなる群から選ばれた少くとも一種である請求項１記載
   の選択的吸着体。 ３、ヒトＴＮＦ含有血漿をＴＨＰを不溶性担体に結合さ
   せた選択的吸着体に接触させることを特徴とする、ヒト
   ＴＮＦ含有血漿中よりヒトＴＮＦを分離、除去する方法
   。