KR100843745B1

KR100843745B1 - 스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100843745B1
Application number: KR1020070020635A
Authority: KR
Inventors: 박장서; 김동현; 최현경; 천동환; 오명진; 황경환; 조석철; 김정숙; 김해경
Original assignee: 동국대학교 산학협력단; 주식회사 라이트팜텍
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2008-07-04

Abstract

본 발명은 스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시킴으로써 제조된 스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 피부 생리 활성, 항산화 효능, 피부노화 억제 및 피부염증 완화 효과가 우수한 스피루리나 발효 추출물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물은 항노화 기능성 화장품의 원료, 기능성 식품 조성물의 원료 또는 약학적 조성물의 원료 등으로 폭넓은 응용이 가능하다.

스피루리나, 추출, 발효

Description

스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법{Fermented spirulina extract and method for preparing the same}

도 1은 대만산 스피루리나에 대한 초음파 파쇄 전 현미경 사진을 도시한 것이다.

도 2는 대만산 스피루리나에 대한 초음파 파쇄 후 현미경 사진을 도시한 것이다.

도 3은 파쇄하지 않은 스피루리나 혼합물 및 스피루리나 혼합물 상등액과 파쇄한 스피루리나 혼합물 및 스피루리나 혼합물 상등액의 항산화 활성 측정 결과를 비교한 TLC 사진을 도시한 것이다.

도 4는 스피루리나의 파쇄 조건과 추출 조건에 따른 항산화 활성 측정 결과를 비교한 TLC 사진을 도시한 것이다.

도 5는 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 활성탄 처리를 수행하기 전과 후의 항산화 활성을 측정한 다음, 측정 결과를 비타민C의 표준곡선에 대입시켜 비타민C에 준하는 항산화 활성을 측정한 그래프이다.

도 6은 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 TNF-α assay를 수행한 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 7은 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 IL-6 assay를 수행한 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 8은 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 항노화 효능 평가 결과를 도시한 그래프이다.

도 9는 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 멜라닌 분석에 의한 멜라닌 분비량을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

도 10은 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 멜라닌 함유량을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

도 11은 스피루리나 단순 추출물 및 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물에 대하여 타이로신 분석을 수행한 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 피부 생리 활성, 항산화 효능, 피부노화 억제 및 피부염증 완화 효과가 우수하여, 항노화 기능성 화장품의 원료, 기능성 식품 조성물의 원료 또는 약학적 조성물의 원료 등으로 폭넓은 응용이 가능한 스피루리나 발효 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

최근 식품·의약품 업계에는 고령화 사회 및 식습관에 기인하는 항노화, 미백, 피부치료를 위한 기능성 소재 개발을 위한 연구를 활발히 추진하고 있으며, 그 시장 규모도 급격하게 증가하고 있으며, 스피루리나 (spirulina)는 이를 위한 유망한 소재로서 많은 주목을 받고 있다.

스피루리나는 식품이나 동물사료 첨가물제로 사용되는 2 종의 시아노박테리아로서 아스로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아스로스피라 맥시마(Arthrospira maxima)가 여기에 속한다. 스피루리나의 주서식지는 열대 및 아열대 지역의 카보네이트 함량이 높고 알칼리성인 수질의 호수이며, 최근에는 사람의 건강기능성 식품 첨가물로서 상업화되어 인공배양도 이루어지고 있다.

스피루리나는 35억년 전에 탄생한 최초의 광합성 생명체로서, 이름은 “나선형 모양을 하고 있는 미생물”이라는 어원에서 유래되었으며, 1827년 독일의 해양학자 Turpin이 민물에서 처음 스피루리나를 분리하였고 이를 spirulina라고 명명하였다. 스피루리나는 이들이 자생하는 호수 주변에 살던 원주민들의 식품으로 이용되었으며, 16세기에는 아즈텍인 마야인들의 주식으로도 이용되었다.

스피루리나는 생물체가 필요로 하는 모든 영양소, 특히 단백질과 녹황색 야채가 가지고 있는 영양성분이 풍부한 고단위 천연 엽록 영양소로서 인체에 필요한 5대 영양소(각종 단백질, 탄수화물, 각종미네랄, 지방, 각종 비타민)와 2~3만 가지 종류의 고른 영양소가 함축되어 있다. 또한, 매우 높은 단백질 함량(55 ~ 77%)을 가지고 있고, 각종 성분이 인체와 거의 같은 비로 구성되어 있어 체내 소화흡수율이 95% 이상이며, 소화기능이 약화된 환자, 노약자, 유아 등이 섭취할 때 효과가 크고, 장기간 복용하여도 영양에 불균형을 일으키지 않는 강알카리성 완전식품이다. 특히, 건강식품으로서의 안전성과 영양면에서 완전식품으로 국제연합(UN), 세 계보건기구(WHO)와 미국식품의약국(FDA)등에서 공식 인정받았으며, 우주인들의 비상식량으로 미국항공우주국(NASA)에서 결정된 식품이기도 하다.

최근까지 스피루리나의 영양면, 질병과의 연관성, 대기오염과의 관계 등에 관한 연구에 세계각국 학자들에 의하여 발표된 논문이 1,000 여편 이상이며 730여 건의 특허가 등록되고 있어 미래가치와 상업적 가치를 인정받고 있고, 현재 세계 70여 국에서 건강기능식품으로 좋은 평을 받고 있다. 더 나아가, 항암효과 및 각종 면역 기능 증강 효과 등 각종 효능에 관한 연구도 보고되어 있고, 높은 항산화 성분과 비타민 A, E, C 등을 상당량 함유하고 있어 우수한 기능성 화장품 소재로 개발될 수 있는 가능성도 있으나, 아직은 스피루리나를 기능성 화장품 소재로 이용하여 체계적인 피부 생리활성 및 피부효능을 규명한 예는 없다.

기능성 화장품 소재 개발은 크게, 피부노화를 억제하는 항노화 소재 개발과 표피층의 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성을 저해하거나 생성된 멜라닌이 표피세포로 전달되는 경로를 차단하는 미백 소재 개발이 주류를 이루고 있고, 피부 염증을 억제하는 항염증 소재와 항산화 효능의 소재는 항노화 소재 범주에 드는 소재로서 기능성 화장품 소재 개발의 주요 탐색 수단으로 사용되고 있다.

피부 노화(skin aging)는 자외선에 장기간 노출된 피부에서 관찰되는 광노화(photoaging)와 비노출부에서 관찰되는 내인성노화(intrinsic aging, chronological aging)로 분류될 수 있으며, 피부 노화 원인의 70% 이상은 광노화에 있다. 한편, 주름살의 주원인으로 진피 내 세포에서 생산되는 기질 단백질의 결핍이 중요하다고 생각되고 있다. 피부에서의 기질 단백질은 교원질(collagen)이 90% 이상을 차지하며, 탄력질(elastin)이 3-4% 정도를 차지하고 있는데, 자외선에 대한 피부의 지속적 노출은 특히 진피세포에서 조직학적인 큰 변화, 즉 비정상적 탄력질의 축적, 교원질의 감소 및 글리코스아미노글리칸의 축적 등의 변화를 유발하여 피부 노화를 진행시킨다. 지금까지 항노화 기능성 소재 선정 기준으로는, 1차적으로 특정 소재가 배양 중인 진피 세포의 procollagen-1의 생성을 증가시키는 효능과 이를 분해하는 MMP-1의 저해효능을 사용되고 있고, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인인 TNF-a와 IL-1a, IL-6 등의 증가를 억제하는 효능도 함께 사용되고 있다.

종래에 스피루리나는 선별, 가공 및 포장 등의 간단한 공정을 거쳐 음료용과 분말 및 환으로 제조되었을 뿐, 다른 용도의 적용을 위한 제품은 나와 있지 않으며, 가공법도 극히 제한적인 방법만이 적용되고 있다. 최근에는 스피루리나가 스킨케어 제품의 보습작용 및 피부수렴작용 성분으로 이용되고 있고 항염증 효능 소재로서 활용 가능성도 예상되지만, 이를 뒷받침하는 과학적 근거가 미흡한 실정이다.

한편, 최근 토마토에서 추출된 라이코펜이라는 카로티노이드가 새로운 항산화제로서 기능성 식품 및 화장품 소재로 각광을 받고 있다는 점에서, 파이코시아닌을 비롯한 다양한 카로티노이드가 함유된 스피루리나를 이용한 새로운 기능성 화장품 소재를 개발하는 것이 매우 필요한 상황이다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는, 스피루리나가 포함하고 있는 생리활성성분을 효과적으로 추출하고 발효 가공을 거쳐 피부노화억제, 자외선에 의한 피부염증 완화를 통한 광노화억제 및 미백효능을 가지는 스피루리나 발효 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 두 번째 기술적 과제는, 상기 스피루리나 발효 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위해서,

스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시킴으로써 제조된 스피루리나 발효 추출물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 고초균주는 바실러스 서브틸리스 (TP6) 균주일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 상기 스피루리나 발효 추출물은 기능성 화장품 조성물의 원료, 기능성 식품 조성물의 원료 또는 약학적 조성물의 원료로 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위해서,

스피루리나 세포 건조물을 균질화하고, 상기 스피루리나 세포를 파쇄한 다음, 열수를 가하여 스피루리나 추출물을 제조하는 단계; 및

상기 스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시키는 단계

를 포함하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 균질화는 상기 스피루리나 건조물 1 중량부에 대해서 15 내지 25 중량부의 증류수를 혼합한 후, 상기 혼합물을 400 내지 600rpm의 교반 속도로, 10 내지 30분간 교반함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 상기 파쇄는 상기 균질화 혼합물을 15 내지 25초간의 초음파 처리 공정 및 5 내지 15초간의 휴지 공정을 포함하는 초음파 처리를 20 내지 40분 동안 수행하는 단계일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 열수는 상기 파쇄 혼합물 1 중량부에 대해서 5 내지 15 중량부의, 50 내지 100℃의 온도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 발효는 상기 스피루리나 추출물을 멸균하고, 상기 고초균주를 접종한 다음, 배양기 내에서 25 내지 35℃의 온도로 18 내지 30시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 고초균주는 상기 스피루리나 추출물 100 중량부에 대해서 0.5 내지 5 중량부의 함량으로 접종될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자들은 된장에서 분리해낸 고초균을 이용하여 스피루리나 추출물을 발효할 경우에, 발효 중에 발효균주가 생산하는 각종 효소 등에 의하여 각종 영양성분의 생리활성이 증가하며, 기존 스피루리나의 성분에 유기산 등의 유용성분이 첨가되어 스피루리나의 기능성을 높이게 된다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물은 스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시킴으로써 제조되며, 상기 고초균주는 바실러스 서브틸리스 (TP6) 균주인 것이 바람직하다.

고초균 TP6는 단백질 분해효소를 세포 밖으로 분비하여 스피루리나에 다량 함유된 단백질을 아미노산과 짧은 펩타이드로 분해하여 새로운 생리활성물질을 생성할 수 있게 된다. 분리된 발효에 의하여 소재의 생리 활성이 증가되는 사례는 최근에 들어서 활발히 밝혀지고 있는데, 홍삼의 경우 발효를 통하여 유용사포닌 함량이 증가된 제품이 상품화되어 있으며, 대두 펩타이드의 경우 유산균 발효를 거칠 경우 활성 이소플라본 함량이 증가하는 연구결과가 보고되고 있다.

따라서, 각종 영양성분의 보고인 스피루리나를 대표적인 식물성 고초균인 된장에서 분리한 고초균을 이용하여 발효할 경우, 스피루리나에 포함되어 있는 각종 성분의 활성 역시 증가된다. 뿐만 아니라, 발효가 끝난 스피루리나 발효액을 그 용도에 따라 탈색, 농축 등의 공정을 거치게 되면 기능성 화장품 조성물의 원료로 사용이 가능하며, 기능성 식품 조성물의 원료 또는 약학적 조성물의 원료 등으로 폭넓은 응용이 가능하다.

예를 들어, 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물을 약학적 조성물의 원료로 사용하고자 하는 경우에는, 약제학적으로 허용가능한 다양한 첨가제가 포함될 수 있으며, 이러한 첨가제로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 현탁화제 등 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 정제 또는 경질캅셀제 등의 고형제형으로 제조할 경우, 부형제로서 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 현탁화제로는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스테르류, 또는 폴리소르베이트류 등)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물을 포함하는 조성물은 고형 및 액상 형태를 포함한 다양한 형태의 제형으로 제제화할 수 있으며, 이들 제형은 정제, 캅셀제 (경질 또는 연질), 액제 (solution), 현탁제, 유제, 및 시럽제 등을 포함하고, 상기 스피루리나 발효 추출물을 첨가한 로션이나 껌과 같은 기능성 제품 또는 기능성 식품도 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물을 포함하는 다양한 형태의 조성물은 경구 또는 비경구를 포함한 다양한 투여방법으로 투여될 수 있으며, 그 투여량은 나이, 연령 및 성별과 같은 상태 및 질병의 경중 등에 따라 적당한 양으로 조정하여 투여될 수 있고, 이는 임상적으로 환자의 치료 또는 예방에 종사하는 당업자라면 용이하게 조절할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 이와 같이 스피루리나의 단순 추출물이 아닌 미생물 발효과정을 거쳐 생리활성을 강화시킨 발효 산물을 다양한 형태의 조성물로 제공할 수 있으며, 이는 피부 노화 억제, 자외선에 의한 피부 염증 완화를 통 한 광노화 억제 및 우수한 미백 효능 등의 특성을 갖는다.

한편, 본 발명에 따른 스피루리나 발효 추출물의 제조방법은,

스피루리나 세포 건조물을 균질화하고, 상기 스피루리나 세포를 파쇄한 다음, 열수를 가하여 스피루리나 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시키는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이, 상기 고초균주는 바실러스 서브틸리스 (TP6) 균주인 것이 바람직하다.

상기 균질화는 상기 스피루리나 건조물 1 중량부에 대해서 15 내지 25 중량부의 증류수를 혼합한 후, 상기 혼합물을 400 내지 600rpm의 교반 속도로, 10 내지 30분간 교반함으로써 수행될 수 있는데, 증류수의 첨가량이 상기 범위 미만이거나 상기 범위를 초과하는 경우에는 스피루리나 추출물의 농도가 너무 낮거나 높아지는 문제점이 있어서 바람직하지 않으며, 상기 혼합물의 교반 속도 또는 교반 시간이 상기 범위 미만이거나 상기 범위를 초과하는 경우에는 원활한 균질화가 이루어지지 않는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

또한, 상기 파쇄는 상기 균질화 혼합물을 15 내지 25초간의 초음파 처리 공정 및 5 내지 15초간의 휴지 공정을 포함하는 초음파 처리를 20 내지 40분 동안 수행함으로써 이루어지는 것이 바람직한데, 이는 초음파 처리 공정 및 각 초음파 처리 공정 사이의 휴지 공정에 소요되는 시간을 적절한 범위로 조절하여 세포의 고른 파쇄 효과를 달성하기 위함이다.

한편, 상기 열수는 상기 파쇄 혼합물 1 중량부에 대해서 5 내지 15 중량부 의, 50 내지 100℃의 온도를 갖는 것이 바람직한데, 열수의 함량이 상기 범위 미만이거나 상기 범위를 초과하는 경우에는 이어지는 발효 단계에 적절한 농도의 스피루리나 추출물을 얻을 수 없다는 문제점이 있고, 열수의 온도가 너무 낮거나 너무 높은 경우에는 원활한 추출 공정이 이루어지지 않거나 최종 추출물 중의 성분 변형 등이 발생될 수 있어서 바람직하지 않다.

스피루리나 추출물의 고초균주에 의한 발효 단계는 전술한 바와 같이 얻어진 스피루리나 추출물을 멸균하고, 상기 고초균주를 접종한 다음, 배양기 내에서 25 내지 35℃의 온도로 18 내지 30시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있는데, 배양 온도 및 배양 시간은 고초균주의 원활한 생육을 위한 최적의 범위 내로 설정된 것이다.

한편, 상기 고초균주의 접종량은 최적의 발효 조건을 고려할 때에, 상기 스피루리나 추출물 100 중량부에 대해서 0.5 내지 5 중량부인 것이 바람직하다.

본 발명에 개시된 스피루리나 추출 발효물은 반드시 그 활용범위가 기능성 화장품 용도에만 국한되는 것은 아니며, 이를 섭취용 제제로 개발할 경우 피부의 항노화 효능이나 미백 효능뿐만 아니라, 항염증 효능을 소구하는 제품개발에도 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 스피루리나 추출물의 제조

스피루리나 건조물 100g을 2L 증류수와 혼합한 후 균질기(homogenizer)를 사 용하여 500rpm의 속도로 20분간 균질화하였다. 균질화 후 10배수의 열수(50~100℃)를 가하여 12~24시간 동안 추출하여 스피루리나 추출물을 제조하였다. 한편 추출효율을 높이기 위해 초음파로 세포를 파쇄한 후 동일한 방법으로 추출하였다. 초음파 파쇄는 스피루리나 건조물 100g에 증류수 2L를 혼합한 후 3ml을 취하여 30분(process 20초, interval 10초)간 초음파 파쇄하고 세포 파쇄 여부를 현미경으로 관찰하였다. 추출된 스피루리나 추출물은 항산화 효능을 측정하여 추출효율을 판단하였으며, 항산화 효능은 TLC판에 파쇄된 시료를 점적(spot)하고 전개용매(에틸아세테이트: 포름산: 증류수 = 85: 20: 5)에 전개시킨 후 0.2% DPPH(wt%) 발색시약을 처리 후 건조시킴으로써 항산화 활성을 관찰하였다.

도 1 및 도 2에는 대만산 스피루리나에 대한 초음파 파쇄 전후의 현미경 사진을 도시하였으며, 도 3에는 파쇄하지 않은 스피루리나 혼합물 및 스피루리나 혼합물 상등액 (도 3의 1 및 2)과 파쇄한 스피루리나 혼합물 및 스피루리나 혼합물 상등액 (도 3의 3 및 4)의 항산화 활성 측정 결과를 비교한 TLC 사진을 도시하였다. 도 3을 참조하면, 초음파 파쇄를 하지 않은 시료에 비해서, 초음파 파쇄를 수행한 시료의 경우에 항산화 활성이 더욱 우수함을 알 수 있다.

실시예 2. 스피루리나 발효액의 제조

실시예 1에서 제조된 스피루리나 파쇄 추출액을 700ml씩 분주하여 멸균한 다음, 바실러스 서브틸리스 (TP6)를 1% 접종하고 37℃ 진탕 배양기와 30℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 스피루리나 발효액을 제조하였다.

도 4에는 스피루리나의 파쇄 조건과 추출 조건에 따른 항산화 활성 측정 결 과를 비교한 TLC 사진을 도시하였다. 구체적으로, 도 4의 1, 2 및 3, 4 시료의 비교로부터 파쇄에 의한 항산화 활성 차이를 알 수 있고, 도 4의 3, 4 및 5, 6 시료의 비교로부터 추출에 의한 항산화 활성 차이를 알 수 있으며, 도 4의 5, 6 및 7, 8 시료의 비교로부터 발효에 의한 항산화 활성 차이를 알 수 있다. 도 4의 결과로부터, 파쇄, 추출 및 발효로 이어지는 일련의 과정을 거치면서 시료의 항산화 활성이 월등히 증가하는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 항산화 활성 측정

고초균 발효 과정을 거치지 않은 스피루리나 추출액 (시료 1) 및 바실러스 서브틸리스 (TP6)에 의한 발효 과정을 거친 스피루리나 추출 발효액 (시료 2)에 대해서 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)법을 수행함으로써 항산화 활성을 측정하였다. 한편, 대조군으로는 비타민C에 대해서 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질법을 수행하여 표준곡선을 작성하였다.

시료 1 및 시료 2를 각각 1/20 및 1/40의 농도로 희석하여 250μM의 2,2-다이페닐-1-피크릴하이드라질과 1:1로 암실에서 20분간 반응시켜 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 각 시료의 흡광도를 비타민C의 표준곡선에 대입시켜 비타민C에 준하는 항산화 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	희석 배수	흡광도 (nm)
시료 1	×20	0.394
시료 1	×40	0.542
시료 2	×20	0.389
시료 2	×40	0.527

DPPH용액과 각 시료들이 반응하여 색의 변화가 있다는 사실로부터 항산화 활성이 있음을 알 수 있고, 2가지 시료를 비교하면 스피루리나 추출 발효액의 항산화력이 가장 좋았다.

실시예 4. 활성탄 처리 및 처리 후의 항산화 활성 측정

실시예 3에 따른 시료 1 및 시료 2의 탈색 및 탈취를 위해서 활성탄을 처리하였으며, 그 후 DPPH법을 사용하여 항산화 활성을 측정하였다. 시료 1 및 시료 2 50ml 당 0.5%, 0.7%, 1.0% 및 1.5%의 활성탄을 넣고 멸균한 후 원심분리(8000rpm, 10분)하여 상등액을 취하였다. 채취한 각각의 상등액과 250μM 2-2-다이페닐-1-피크릴하이드라질을 1:1로 암실에서 20분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료	활성탄 처리량 (%)	흡광도 (nm)
시료 1	0	0.584
	0.5	0.342
	0.7	0.376
	1.0	0.307
	1.5	0.345
시료 2	0	0.486
	0.5	0.311
	0.7	0.318
	1.0	0.276
	1.5	0.223

또한, 도 5에는 측정 결과를 비타민C의 표준곡선에 대입시켜 비타민C에 준하는 항산화 활성을 측정한 그래프를 도시하였다.

표 2 및 도 5의 결과로부터, 활성탄 처리량에 따라 시료의 색과 향이 줄어듦을 알 수 있고, 표준곡선에 대비하여 구한 방정식으로 항산화력을 계산하면 스피루리나 발효 추출물의 경우 비타민C 187.54μM에 준하는 항산화력을 가지지만 활성탄처리 이전의 시료에 비해 활성이 떨어짐을 알 수 있다.

전술한 실시예 3 및 4의 결과로부터, 스피루리나는 우수한 항산화력을 지니는 물질이며, 그 항산화력은 파쇄, 추출 및 발효로 이어지는 일련의 과정에 의해서 증진되며 (발효물의 항산화력은 원추출물에 비하여 10배 이상 증가), 이를 화장품 조성물 등의 원료로 개발하기 위한 탈색 및 탈취 공정을 수행하더라도 항산화력이 크게 저하되지 않는다는 사실을 알 수 있다.

실시예 5. 세포 독성검사

실시예 5.1. 각질 형성 세포 독성

실시예 3 및 4의 시료 1과 시료 2의 세포 독성을 알아보기 위하여 MTT 분석방법을 사용하였다. 실험에 사용한 세포주로는 인체 피부 각질 형성 세포주를 사용하였다. 인체 피부 각질 형성 세포를 2 x 10⁵cell/well의 농도로 96-웰 플레이트에 접종하여 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS 용액 1 ml를 넣은 상태에서 자외선 처리(20 mJ/cm²)를 수행하였다. 자외선 처리가 끝난 후, 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM에 시료 1 및 시료 2를 각각 농도별로 투여하고, 48시간 동안 배양하였다. 투여 농도는 각각 0.1%, 0.5%, 1%로 하였다. 그 후 최종 농도가 0.33g/l 인 MTT 용액을 각 웰에 넣어 90분 동안 배양한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과로부터, 각 농도의 추출물과 발효물 모두 세포 독성을 보이지 않으며 세포 활성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

실시예 5.2. 멜라닌 형성 세포 독성

스피루리나 추출 발효물의 미백 효능 검증에 대한 실험에 앞서 추출 발효물에 대한 세포독성검사를 위해 MTT 분석방법을 사용하였다. 정상 세포인 인간 피부 색소 세포(Normal human melanocyte)와 멜라노마 세포(B16F10)를 이용하였고, 배지로는 1%의 항생제를 첨가한 254배지(254 media, PMA없는 HMGS-2 첨가물 포함)를 이용하였다. 색소 세포를 1×10⁵/well의 농도로 6웰-플레이트에 접종하였고, 접종 시 멸균된 에탄올로 0.1% 희석된 타입 1 콜라겐으로 코팅된 플레이트를 사용하였다. 시료 1 및 시료 2를 하기 표 3의 농도로 접종과 동시에 투여하였다.

시료	투여 농도 (%)
시료 1	1×10^-4	1×10^-3	1×10^-2
시료 2	1×10^-4	1×10^-3	1×10^-2

접종과 투여 후 37℃, 5%의 이산화탄소 배양기에서 4일 동안 배양하였으며, 배양 후 배지를 제거한 각 웰에 세포 배양 시의 배지와 동일한 양의 MTT용액(0.33g/1000ml PBS)를 37℃의 배양기에서 90분간 처리한 후, MTT용액을 제거하고 세포 배양 시의 배지와 동일한 양의 0.04N HCl 이소프로필 알콜 용액을 상온에서 30분간 처리하였다. 이후 이소프로필 알콜 용액을 회수하여 15000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 96-웰 플레이트에 200μl씩 2회 취하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성검사 결과, 2 종류의 시료가 1×10^-4%, 1×10^-3%의 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았고, 세포의 형태학적 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 세포 생존도가 20% 이상 감소된 1×10^-2% 농도의 경우, 세포의 형태가 변화되었고, 세포사가 관찰되었다. 멜라노마 세포를 이용한 스피루리나 발효 추출물의 세포 독성 검사 결과, 2 시료 모두 1×10^-5,1×10^-4의 농도에서는 세포 독성이 거의 나타나지 않았고(약 10% 미만), 세포의 형태학적 변화도 관찰되지 않았다.

실시예 6. 항염증 효능 검사

시료 1 및 시료 2가 항염증 효과가 있는지 알아보기 위하여 2× 10⁵cell/well의 농도로 96-웰 플레이트에 접종된 인체 피부 각질 형성 세포를 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후, PBS 용액 1 ml를 넣은 상태에서 자외선 처리(20 mJ/cm²)하였다. 자외선 처리가 끝난 후, 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM에 시료 1 및 시료 2를 각각 농도(%)별로 투여한 후 48시간 동안 배양하였다. 분석방법으로는 TNF-α ELISA assay와 IL-6 ELISA assay 방법을 이용하였다. 흡광도는 두 방법 모두 490 nm에서 측정하였다.

실험 결과, TNF-α assay의 경우 자외선 처리 후 시료 1 및 시료 2를 투여한 경우가 비투여의 경우보다 모든 농도에서 TNF-α 생성을 50% 이상 억제함을 관찰할 수 있었고, 자외선 처리하지 않을 상태보다도 TNF-α 생성을 억제하는 경우도 관찰할 수 있었다. 시료 2의 경우 발효 농도 의존적 경향을 보이지는 않지만 3가지 농도 범위 모두에서 항염증에 효과를 나타내었다. 도 6에는 이러한 TNF-α assay의 실험 결과를 도시하였다.

IL-6 assay의 경우, 자외선 처리한 후 처리하기 전보다 3배 이상 IL-6 분비량을 증가시켰고, 자외선 처리 후 시료를 각 농도별로 처리한 경우 각 시료의 최소농도에서 이미 최대의 항염증 효능을 나타내고 있어 우수한 항염증 효능을 가지고 있다고 판단되었다. 이상의 결과로부터, 스피루리나 추출물이 자외선에 의해 증가된 염증 유발 사이토카인인 TNF-a 와 IL-6를 모두 자외선 무처리 대조군 수준 이하로 낮추는 효능이 있음을 확인하였다. 따라서, 이들이 자외선에 의한 광노화 및 염증성 피부질환의 치료 및 증상 완화에 효과가 있을 것으로 예상된다. 도 7에는 이러한 IL-6 assay의 실험 결과를 도시하였다.

실시예 7. 항노화 효능평가 - 신생 콜라겐 정량

시료 1 및 시료 2의 콜라겐 합성을 알아보기 위하여 2 x 10⁵ cell/well의 농도로 96-웰 플레이트에 접종된 인체 피부 각질형성세포를 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후, PBS 용액 1 ml를 넣은 상태에서 자외선 처리(20 mJ/cm²)가 끝난 후 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM에 시료 1 및 시료 2를 각각 농도(%)별로 투여한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포만 회수하여 Sircol collagen assay 방법을 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

실험결과, 자외선 처리 후 2 가지 시료 각 농도별로 투여한 모든 범위에서 자외선 처리로 감소한 콜라겐 합성량을 자외선 처리 전 수준으로 회복시키는 정도를 지나 최대 3배 이상의 신생 콜라겐 합성량을 증가시켰다. 시료 1의 경우 농도 의존적으로 콜라겐 합성량이 증가하는 경향을 보였다. 이는 시료 1 및 시료 2 모두가 강력한 피부 주름 개선효과로서 피부 항노화 효능을 가지고 있음을 말해준다. 도 8에는 항노화 효능 평가 결과를 그래프로 도시하였다.

실시예 8. 미백효능과 타이로신 억제효능 검사

스피루리나 추출 발효물 활성 농도에서 각 시료의 미백효능을 검증하기 위하여 멜라닌 분석방법을 이용하였고, 타이로시나제 억제 효능 분석을 위해 타이로신 분석방법을 이용하였다. 세포주로는 멜라노마(B16F10 melanoma)를 이용하였고, 배지로는 우태아 혈청(FBS)이 10% 포함되고 페놀레드(Phenol red)가 포함되지 않은 DMEM을 이용하였다. 멜라노마를 2×10⁵/well의 농도로 6웰-플레이트에 접종하였고, 접종 시 멜라닌합성 자극 호르몬(α-MSH)을 100nM의 농도로 첨가하였다. 시료 1 및 시료 2를 하기 표 4의 농도로 접종과 동시에 투여하였다.

시료	투여 농도 (%)
시료 1	1×10^-5	1×10^-4
시료 2	1×10^-5	1×10^-4

접종과 투여 후 37℃, 5%의 이산화탄소 배양기에서 3일 동안 배양하였으며, 세포 독성 검사를 위해 MTT분석 방법을 사용하였고, 미백 효능 분석을 위해 멜라닌 분석방법을 이용하였다. 멜라닌 분석은 배지의 경우, 3일간 배양 후 배지를 회수하여 10000rpm으로 5분 동안 원심분리 후 상등액을 96-웰 플레이트에 200μl씩 2회 취하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 경우, 1분간 PBS처리, 5분간 트립신 처리한 후, 세포를 회수하여 800rpm으로 5분간 원심분리 후 상등액을 제거하고, PBS를 넣어 다시 1000rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1N NaOH를 220μl씩 넣고 4℃에서 24시간 처리하였다. 용해된 세포는 3초간 교반한 후 10000rpm으로 3분 동안 원심분리 후 상등액을 96-웰 플레이트에 200μl씩 2회 취하여 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 타이로시나제 억제효능 분석의 경우, 회수된 세포에 PBS로 희석된 5% 트리톤-X(Triton-X)를 200μl 넣어 4℃에서 24시간 처리하였다. 용해된 세포는 3초간 교반한 후, 10000rpm으로 3분 동안 원심분리 후 취한 상등액 180μl에 증류수로 희석시킨 L-DOPA(0.002g/ml)를 20μl씩 첨가하여 총 200μl를 96-웰 플레이트에 취하여 475nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

멜라닌 분석에 의한 멜라닌 분비량은 2가지 시료 모두 1×10^-5의 농도에서 비교군의 90% 정도였고,1×10^-4의 농도에서는 비교군의 70%를 나타내었다 (도 9). 멜라닌 함유량은 2가지 시료 모두 비교군의 90%(±5%)로 나타났다 (도 10). 타이로신 분석 결과, 시료 1의 1×10^-4의 농도에서 비교군의 90%로 나타났고, 시료 2의 경우 1×10^-4의 농도에서 비교군의 60%로 나타났다 (도 11).

전술한 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 스피루리나 추출물을 고초균으로 발효시킨 발효물의 경우 피부생리 활성이 증가되었으며, 항산화효능이 원 추출물에 비해 10배 정도 증가하였다. 자외선 조사 후 증가하는 염증성 사이토카인 TNF-a와 IL-6 의 생성량이 발효물을 처리하였을 때 80% 이상 감소하는 결과로 보아 자외선에 의한 피부노화 및 피부염증을 완화하는데 우수한 효능을 가지고 있어 항노화 기능성 화장품 및 선제품의 기능성 소재로 활용이 가능한 것으로 나타났다. 한편, 신생 콜라겐 합성이 대조군에 비하여 최대 3배 이상 증가하는 것으로 보아 주름억제용 기능성 화장품 소재로 사용될 수 있다.

Claims

스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시킴으로써 제조된 스피루리나 발효 추출물.
제1항에 있어서, 상기 고초균주는 바실러스 서브틸리스 (TP6) 균주인 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물.
제1항에 있어서, 상기 스피루리나 발효 추출물은 기능성 화장품 조성물의 원료, 기능성 식품 조성물의 원료 또는 약학적 조성물의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물.
스피루리나 세포 건조물을 균질화하고, 상기 스피루리나 세포를 파쇄한 다음, 50 내지 100℃의 열수를 가하여 스피루리나 추출물을 제조하는 단계; 및

상기 스피루리나 추출물을 된장으로부터 분리된 고초균주로 발효시키는 단계

를 포함하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 고초균주는 바실러스 서브틸리스 (TP6) 균주인 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 균질화는 상기 스피루리나 건조물 1 중량부에 대해서 15 내지 25 중량부의 증류수를 혼합한 후, 상기 혼합물을 400 내지 600rpm의 교반 속도로, 10 내지 30분간 교반함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 파쇄는 상기 균질화 혼합물을 15 내지 25초간의 초음파 처리 공정 및 5 내지 15초간의 휴지 공정을 포함하는 초음파 처리를 20 내지 40분 동안 수행하는 단계인 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 열수는 상기 파쇄 혼합물 1 중량부에 대해서 5 내지 15 중량부인 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 발효는 상기 스피루리나 추출물을 멸균하고, 상기 고초균주를 접종한 다음, 배양기 내에서 25 내지 35℃의 온도로 18 내지 30시간 동안 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 고초균주는 상기 스피루리나 추출물 100 중량부에 대해서 0.5 내지 5 중량부의 함량으로 접종되는 것을 특징으로 하는 스피루리나 발효 추출물의 제조방법.