KR100797151B1 - 방사선을 이용하여 불가사리로부터 면역 활성 성분을추출하는 방법 - Google Patents

방사선을 이용하여 불가사리로부터 면역 활성 성분을추출하는 방법 Download PDF

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    • A61K35/616—Echinodermata, e.g. starfish, sea cucumbers or sea urchins

Abstract

본 발명에서는 불가사리에 방사선을 조사하여 불가사리로부터 면역 활성 성분의 추출 및 회수율을 극대화할 수 있는 방법을 기술한다. 본 발명에 따라 방사선 처리를 수행하면 B cell 등의 증식이 크게 활성화되었으며, 인터페론, 인터류킨, 면역글로불린 등의 각종 면역 활성 성분의 추출 및 회수율이 방사선 처리를 하지 않은 경우에 비하여 극대화되었음을 확인하였다.
불가사리(Starfish), 면역세포(Immune Cells), 방사선(Radiation), 사이토카인(cytokine), 면역글로불린(Immunoglobulin), 비장세포(Spleen Cells), 대식세포(Macrophage)

Description

방사선을 이용하여 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법{Process of Extracting Immune Activation Ingredients from Starfish Through Radiation}
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 과정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다.
도 2는 본 발명에 의하여 얻어진 불가사리 추출물의 농도에 따른 비장 세포의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 각각 본 발명에 따라 불가사리로부터 얻어진 면역 활성 성분 추출물이 비장 세포에서 사이토카인의 분비 유도 정도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 의하여 얻어진 불가사리 추출물의 농도에 따른 B cell의 증식 정도를 측정한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5e는 각각 본 발명에 따라 불가사리로부터 얻어진 면역 활성 성분 추출물이 B cell에서 유래하는 면역글로불린의 분비 유도 정도를 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 불가사리로부터 얻어진 면역 활성 성분 추출물이 특정 세포주에서 산화질소의 분비 유도 정도를 측정한 그래프이다.
도 7a 내지 도7c는 각각 본 발명에 따라 불가사리로부터 얻어진 면역 활성 성분 추출물이 특정 세포주에서 사이토카인의 분비 유도 정도를 측정한 그래프이다.
본 발명은 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방사선을 조사하여 효율적으로 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법에 관한 것이다.
불가사리(Sea star, Starfish)는 극피동물의 하나로 해저의 다양한 곳에서 서식한다. 불가사리는 극피동물 특유의 단단한 외골격을 가지고 있으며, 보통 이 외골격의 관족(管足, tube foot)으로 덮여있어 사냥감을 감싸안고 소화액을 내어 전복, 조개, 굴, 홍합 등의 패류는 물론이고 죽은 물고기까지 무차별적으로 잡아먹는 포식성을 가지고 있다. 이 때문에 양식업에 큰 피해를 주는 '해적생물'이라고 알려져 있다. 불가사리는 해양에서 패류를 포식하며 강한 생명력을 갖고 있어 바다의 양식어장과 많은 연근해 어장에서 커다란 피해를 주고 있는 생물로서 마땅한 천적이 없어서 날로 늘어나고 있는 실정이다.
불가사리 한 마리가 6개월 동안에 섭취하는 양은 피조개로 환산하면 36마리에 달한다고 한다. 만약 양식장 1ha에 13,000 마리의 불가사리가 서식한다면 6개월 동안 피조개 약 47만 마리가 불가사리에 의해 없어진다는 계산이 나온다. 또한 불가사리는 해양생태계에 뚜렷한 천적이 없으며, 재생력이 뛰어나 구제하기가 매우 어렵다. 따라서 전복, 굴, 바지락, 백합, 피조개, 새꼬막 등이 자영서식 또는 양식되는 어장은 이들의 침입으로 인해 큰 피해를 입고 있으며, 연간 수확량의 10%가 줄어들 정도로 피해가 심각하다. 특히, 우리나라의 연안에서 불가사리의 서식밀도는 우리나라 연안의 경우 1ha당 1,000마리 정도로 매우 높은 편이며, 그 중에서도 동해 연안의 암반 지역에서는 1ha당 16,000마리가 분포하는 것으로 보고되고 있다.
지금까지 불가사리의 구제를 가로막는 가장 큰 요인은 폐기처분이 어렵다는 것이며 특히 산발적으로 해녀와 잠수부들에 의해 불가사리 수거 작업이 이루어지고 있으나, 구제된 불가사리를 처리해주는 기관이나 단체가 없어, 거의 대부분이 해변가에서 건조되어 제거하는 실정이고 이로 인한 악취로 어민들이 고통을 받고 있다. 최근에 불가사리 퇴치기구까지 만들어 어민들에게 보급했지만, 워낙 번식력이 강하고 이용가치가 없어 큰 효과를 거두지 못하고 있다.
그러나 최근 불가사리에서 추출한 천연물에 대한 연구가 많이 보고되고 있는데, 일례로 Sphaerodiscus placenta에서 polyhydroxysteroids와 steroidal glycosides(Zollo et al., 1987), Hecelia attenuata에서 polyhydroxylated sterol(Minale et al., 1982), Halityle regularis에서 분리된 starfish saponins(Iorizzi and Minale. 1986) 중에서 22, 23-epoxysteroidal glycoside sulfate(Riccio et al., 1985)와, Asterias vulgaris에서 asterosaponin은 소염, 진통작용을 가지고 있으며(Findlay et al., 1984), 아무르 불가사리(Asterias amurensis)의 egg jelly에서 추출한 steroidal saponins(sulfated glycoprotein)는 정자의 첨체반응(acrosome reaction)을 유도하고(Faulkner, 1988; Fugimoto et al,. 1987), 또한 난소에서 추출한 glycoside B2는 난소의 성숙을 유도하는 세포분열에 직접 관여하는 1-methyladenine의 형성을 저해한다는 보고(Ikegami et al., 1979)도 제시되었다. 스위스 연안의 불가사리인 Porania pulvillus에서 추출한 polyhydroxylated steroidal glycosides(crossasteroside A)는 혈구응집반응을 유도하고 종양세포의 성장을 억제한다고 보고(Andersson et al., 1987)되었고, Oreaster reticulatus에서 분리된 sulfated steroidal glycoside인 asterosaponin P-1(Segura de Correa et al., 1985), Nardoa속에 속하는 Nardoa novaecaledonia와 N. gomophia에서 분리된 sulfated glycoside인 marthasteroside A, thornasteroside A와 halityloside I(Riccio et al., 1986), 큰혹불가사리(Protoreaster nodosus)에서 분리된 toxin인 steroidal glycoside sulfate(nodososide)의 구조가 밝혀졌다(Riccio et al., 1982; Minale et al., 1984; Riccio et al., 1985).
영국암연구소(CRC)에서는 가시불가사리(Marthasterias glacialis)에 사이클린 의존성 키나제(CDK)라는 암세포 억제효소가 다량 존재하는 것을 확인하였으며, 미국 국립보건센터에서는 불가사리에 새로운 항생제 성분의 존재를 확인한바 있으나 국내에서는 불가사리의 포식습성에 관한 연구(박 등, 1985), 불가사리를 구제하 기 위한 기구 개발에 관한 연구(박 등, 1997) 그리고 불가사리의 생화학적 특성분석 및 생리활성물질로서 이용방안 등이 일부 연구되어있다(조 등, 1998a, 1998b; 박, 1994; 해양수산부, 2000).
한편, 불가사리로부터 추출한 성분을 산업적으로 활용하는 많은 국내 특허 문헌이 보고된 바 있다. 일례로, 대한민국특허 제346927호에서는 불가사리를 수세, 절단, 분말화 한 뒤에 무기산과 혼합, 교반하여 액상 비료를 제조하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국특허 제387936호에서는 불가사리를 파쇄, 가열, 발효시킨 뒤에 산기를 포함하는 화합물을 혼합하는 방법으로 pH를 적정화하여 칼슘을 추출하는 방법을 제안하고 있으며, 대한민국공개특허 제2005-120127호에서는 아무르 불가사리를 단백질분해효소로 처리하여 제조되는 기능성 화장품용 조성물이 보고된 바 있으며, 대한민국공개특허 제2005-17669호에서는 단백질 분해효소로 처리된 불가사리에서 유래된 피부 미백용 추출물이 제안되었다. 또한, 대한민국특허 제506400호에서는 하수 슬러지에 방사선을 조사한 뒤에 불가사리 탈수보조제를 혼합, 교반하여 하수 슬러지를 탈수하는 방법이, 대한민국특허 제408089호에서는 동결건조된 불가사리 원료의 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 항-콜레스테롤 작용을 갖는 약학 조성물이 각각 보고된 바 있다.
특히, 대한민국특허 제 531114호에서는 한국산 불가사리를 저온에서 분쇄한 후 증류수와 혼합, 교반하고 원심분리한 뒤 동결건조시키거나 증류수 교반 뒤에 황 산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시킨 뒤에 분획을 분리하여 동결건조시키는 방법을 통하여 면역증강용 불가사리 엑스의 추출 방법을 제안하고 있다. 위 대한민국특허 제531114호에 따른 추출물은 면역증강용으로 사용될 수 있다고는 하나, 실질적으로는 대식세포에 의하여 생성되는 단백질인 TNF과 IL-1β, IL-6등의 제한된 사이토카인의 분비를 유도하는 것만이 확인되었을 뿐이었다.
따라서 대식세포를 포함하여 면역 반응에 관여하는 각종 세포의 증식은 물론이고, 면역 과정에서 작용하는 각종 사이토카인 및 면역글로불린의 분비를 획기적으로 유도할 수 있는 면역 활성 성분을 불가사리로부터 추출함으로써, 현재 거의 폐기되고 있는 불가사리를 산업적으로 재활용할 수 있는 방법에 대한 연구는 여전히 필요한 실정이었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 면역 과정에 관여하는 대식세포, B cell 등의 면역 세포의 증식은 물론이고, 다양한 사이토카인의 분비를 극대화시킬 수 있도록 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 활성 성분의 회수율을 크게 개선시켜, 별다른 후속 조치를 취하지 않고도 산업적으로 큰 의미가 있도록 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부한 도면을 통하여 보다 분명해질 것이다.
상기와 같은 목적을 갖는 본 발명에 따르면, 면역 세포의 활성을 증가시키는 불가사리 추출물을 제조하는 방법으로서, (a) 불가사리를 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 불가사리에 방사선을 조사하는 단계; (c) 방사선이 조사된 불가사리 분말에 버퍼 용액을 첨가하여 진탕 배양하는 단계; 및 (d) 진탕 배양된 불가사리 분말을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 분쇄 처리에 의하여 분말 상태인 불가사리에 10 ~ 300 KGy(그레이)의 강도로 방사선이 조사되는 것을 특징으로 한다.
한편, 바람직한 실시예에 따르면, 방사선 조사 및 원심분리 단계 사이에 불가사리 분말에 버퍼 용액을 첨가하여 진탕 배양하는 단계가 더욱 포함될 수 있고, 상기 (d) 단계는 상기 진탕 배양된 불가사리 분말을 원심분리하여 회수된 상층액을 유기용매로 처리하여 침전시킨 뒤, 침전물을 원심분리하여 상층액이 제거된 침전 추출물을 얻는 단계를 포함한다. 이때, 상기 회수된 상층액과 상기 유기용매(예컨대 아세톤)는 1:1 ~ 1:3의 부피비로 처리될 수 있다.
특히 바람직한 실시예에 따르면, 상기 (d) 단계 이후에 얻어진 침전 추출물을 투석 처리하여 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계와, 상기 회수된 상층액을 여과시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 원료가 되는 불가사리는 한국산 별불가사리로서, 본 발명을 통하여 면역 세포의 활성 증가로 인하여 인터페론, 인터류킨, TNF(종양괴사인자), GM-CSF(과립세포-대식세포 집락자극인자) 등과 같은 사이토카인은 물론이고, 면역글로불린, 산화질소 등의 분비가 유도되는 것으로 확인되어, 본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물에는 면역 활성 성분이 다량 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
본 명세서 및 청구의 범위에서 '면역 활성 성분'이라는 용어는 생체내의 면역 반응에 관여하는 림프구, 대식세포(macrophage) 등의 면역 세포의 증식 또는 면역 과정에 관여하는 각종 사이토카인(cytokine), 면역글로불린 등과 같이 면역 반응 관여 성분의 분비를 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 이하, 첨부하는 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명에 따라 불가사리에 방사선을 조사하는 방법을 통하여 불가사리로부터 면역 활성 성분을 추출하는 방법을 개략적으로 도시한 플로 차트이다. 도시된 것과 같이 우선 충분히 건조시켜 본 발명의 원료가 되는 불가사리를 준비하고(S100), 이를 분쇄하여 불가사리 분말을 제조한다(S102).
이어서, 분말 상태로 분쇄되어 있는 불가사리에 방사선을 조사한다(S104). 본 발명에서는 일정 정도의 방사선을 조사한 불가사리 분말은 방사선을 조사하지 않은 경우에 비하여 면역 활성 성분의 회수율이 크게 향상되었으며, 이에 따라 전체적인 면역 활성 역시 크게 개선되었음을 확인하였다. 방사선은 10 ~ 300 KGy의 강도로 조사될 수 있고, 특히 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 25 ~ 200 KGy의 강도로 방사선이 조사되는 경우에 방사선이 조사되지 않은 경우와 비교하여 전체적인 면역 활성 유도가 증가하였다.
이어서, 방사선이 조사된 불가사리 분말 중에서 면역 활성 성분을 추출하기 위해서 원심분리를 실시하여 침전 추출물을 얻는다(S106). 침전 추출물을 얻기 위한 본 단계에서 바람직하게는 2회 이상의 원심분리 처리가 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서는 방사선이 조사된 불가사리 분말을 원심분리하여 상층액을 얻는 초기 원심분리 단계와, 얻어진 상층액을 원심분리하여 상층액이 제거된 침전 추출물을 얻는 후기 원심분리 단계로 이루어질 수 있다. 이때, 초기 원심분리 단계 역시 2회 이상 수행될 수 있으며, 초기 원심분리 단계가 상온에서 수행되는 반면에, 후기 원심분리 단계는 저온(예를 들어 2 ~ 8 ℃), 바람직한 실시예에 따르면 약 4℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다.
특히, 초기 원심분리 단계에서 얻어진 상층액에 대하여 바로 후기 원심분리를 수행하기 전에 회수된 상층액에 유기용매를 혼합하여 침전시킨 뒤에 후기 원심분리를 수행하는 것이 바람직하다. 이때, 사용될 수 있는 유기용매로는 아세톤 등의 비극성 유기용매를 포함하며, 초기 원심분리에 의하여 회수된 상층액과 유기용매는 약 1:1 ~ 1:3의 부피비율로 혼합시켜 회수된 상층액이 충분히 침전될 수 있도록 한다. 이와 같이 유기용매에 의한 침전 처리가 이루어지는 경우에는 후기 원심분리를 수행하여 얻어진 침전물에 유기용매가 잔존할 우려가 있으므로 충분히 건조시키는 것이 좋다.
상술한 원심분리에 의한 침전 추출물 단계(S106)에 의해서도 면역 과정에 관여하는 다양한 성분들을 유도할 수 있는 면역 활성 성분을 추출할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 침전 추출물을 재차 원심분리하여 상층액을 회수한 뒤(S108), 오염물을 제거하기 위하여 회수된 상층액을 여과(filtering)하는 단계(S110)가 더욱 포함될 수 있다. 이때, 침전물을 바로 원심분리(S108)하기에 앞서, S106 단계에서 얻어진 침전 추출물을 투석 처리하는 것이 좋고, 상술한 여과 단계에서도 2회 이상 수행될 수 있다.
이와 같은 공정을 통하여 얻어진 불가사리 추출물은 림프구 생산에 관여하는 비장 세포(spleen cell) 및 항체를 생성하는 B세포의 증식은 물론이고, 면역 반응에 관여하는 사이토카인, 림포카인 등의 분비를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 일례로, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물은 세포독성(cytotoxicity)에 관여하는 TH1 세포에 의하여 분비되어 B세포 증식(proliferation), 대식세포(macrophage) 활성화 및 NK(natural killer) 세포 활성화는 물론이고 T 임파구의 증식을 유도하는 사이토카인인 인터류킨-2(IL-2); B세포의 자극 및 성장을 유도하고, 인터페론베타2(Interferon-β2)를 자극시키거나, T세포 등의 성장 및 분화에 영향을 주는 사이토카인인 IL-6; TH1 세포에 의하여 분비되며, 대식세포 활성화, 임파구의 미토겐(mitogen) 유도, NK세포 및 TH1 세포 자극, MHC 분자 발현 자극, 항바이러스 기능 및 항암 작용을 갖는 물질로서 면역 인터페론으로도 알려진 물질인 인터페론-감마(INF-γ); 대식세포 활성화, MHC 발현 유도, 림프구 생성 유도, 세포자살(apoptosis) 유도, 종양괴사인자-알파(tumor nectosis factor-α, TNF-α); 활성화된 T세포에서 방출되어 대식세포 활성화, 항암치료시 면역체계에 시그널을 보내어 백혈구 감소, 조혈 기능, 인체성장 등에 관여하는 자가유래 과립세포-대식세포 집락자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF) 등의 사이토카인은 물론이고, IFN-γ 또는 TNF 등에 의하여 활성화된 대식세포에서 분비되어 peroxynitirtes의 생성에 의하여 병원균을 사멸시키는 등의 기능을 갖는 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 유도하는 것으로 확인되었다. 아울러, B세포에서 분비되는 다양한 면역글로불린의 생성 역시 유도하는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예에 대하여 기술한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
<실시예>
본 발명에 따라 불가사리로부터 얻어진 추출물의 면역 활성을 측정하기 위하여 사용된 실험동물은 대한실험동물센터(충북음성)에서 공급받은 특정병원체부재(specific pathogen free) 생쥐(C57BL/6)로 생후 6주-8주된 암컷을 사용하였고, 실험 전까지 고형사료와 1차 증류수를 공급하면서 사육실에서 사육하였다.
본 발명에서 사용된 시약은 다음과 같다. 세포배양에 필요한 배지 RPMI 1640과 배지에 첨가하는 항생제(antibiotic-antimycotic), FCS(fetal calf serum)는 Gibco BRL(USA) 제품을 사용하였으며, 2-ME(2-mercaptoethanol), sodium bicarbonate(NaHCO3), sulfanilamide와 N-1-naphthyl-ethylene-diamine는 Sigma(USA) 제품을 사용하였다. 또한 세포증식을 측정하기 위하여 사용된 시약(Cell titer 96® Aqueous One Solution Cell proliferation Assay)과 cytokine 측정에 필요한 항체는 Pharmingen(USA) 제품을 사용하였다.
실시예 1 : 방사선을 조사하여 불가사리로부터 면역 활성 성분 추출
염분을 충분히 제거한 한국산 별불가사리(Asterina pectinifera)를 충분히 건조시킨 뒤 분쇄하여 분말로 만들었다. 이어서 분쇄된 불가사리 분말을 한국원자력 연구소에 의뢰하여 25 KGy의 강도로 방사선을 조사하였다. 방사선 조사는 한국원자력연구소 소재 저준위 감마선 조사 시설(Panoramic Co-60, UKAEA, UK)를 사용하였으며, Co-60 γ-선을 1 Gray/min의 선량율로 조사하였다.
방사선을 조사한 불가사리 분말 10g에 1차 증류수 100㎖을 넣고 80℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 25℃에서 3,000 rpm의 속도로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 분리된 상층액을 다시 20℃에서 9,000g의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 유기용매인 아세톤으로 처리(상층액과 아세톤은 1:2 v/v)하여 침전시킨 후, 4℃에서 15,000g의 속도로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 추출하였다.
남은 침전물을 충분히 건조시켜 아세톤을 제거하고 인산식염수완충액(PBS)에 녹였다. 이어서 침전추출물을 투석막에 넣어서 PBS로 투석시킨 뒤, 회수한 추출물을 25℃에서 40,000g의 속도로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에서 불순물을 제거하기 위하여 상층액을 먼저 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 다음 다시 0.2 ㎛ 필터에 통과시켜 최종 추출물을 얻었다.
실시예 2 ~ 4 : 방사선을 조사하여 불가사리로부터 면역 활성 성분 추출
본 실시예에서는 준비된 불가사리 분말에 각각 50 KGy, 100 KGy, 200 KGy의 강도로 방사선을 조사한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건에서 동일한 절차를 반복하여 추출물을 제조하였다.
비교실시예 : 방사선을 조사하지 않은 불가사리로부터 면역 활성 성분 추출
본 비교실시예에서는 준비된 불가사리 분말에 아무런 방사선 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건에서 동일한 절차를 반복하여 추출물을 얻었다.
실험예 1 : 불가사리로부터 얻은 면역 활성 성분의 수율 측정
본 실험예에서는 상기 실시예 및 비교실시예로부터 얻은 최종 추출물 양과 이들의 건조중량을 비교하였다. 건조 중량을 측정하기 위하여 상술한 실시예로부터 얻은 상층액 추출물을 100℃에서 충분히 건조시킨 뒤에 건조중량을 측정하였다. 각 실시예에서 얻은 추출물의 중량은 하기 표 1에 표시되어 있다. 표 1에서 알 수 있 는 것과 같이, 방사선을 조사한 경우나 조사하지 않은 경우 단위 건조중량은 모두 약 20 ㎎/㎖로 유사하였으나, 방사선을 조사하지 않은 경우 얻어진 회수량이 42 ㎖인데 비하여, 25KGy, 50KGy, 100KGy, 200KGy의 방사선을 조사한 경우에는 각각 66, 65, 101, 70㎖로 측정되어 회수량이 크게 증가하였다. 이에 따라 불가사리 분말 10g에서 얻어진 전체 추출량은 방사선을 조사하지 않은 경우에는 0.8568g (20.4 ㎎/㎖ ㅧ 42 ㎖)이었으나, 100KGy의 방사선을 조사한 경우에는 2.1008g (20.8 ㎎/㎖ ㅧ 101 ㎖)로 측정되어 방사선을 조사한 경우 면역 활성 성분의 추출량이 최고 약 2.5배 증가한 것으로 확인되었다.
표 1 : 불가사리 추출물의 중량 측정
condition 최종추출량(㎖) 건조중량(㎎/㎖) 추출물의 총중량(g) 전체 회수비율
0 KG 42 20.4 0.8568 1
25 KG 66 22.4 1.4784 1.725
50 KG 65 21.1 1.3715 1.600
100 KG 101 20.8 2.1008 2.452
200 KG 70 24.5 1.715 2.002
실험예 2 : 비장세포(spleen cell) 증식 측정
비장은 말초 림프 기관으로 주로 T세포, B세포 및 대식세포 등으로 구성되어 있으며, 외부 항원의 침입에 대하여 이들 세포들은 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응을 유도한다. 그런데 모든 면역반응은 세포증식이 일어나는 것으로 시작하기 때문에, 본 실험예에서는 상기 실시예에서 얻은 불가사리 추출물이 비장 세포의 증식에 미치는 효과를 측정하였다.
먼저 생쥐(C57BL/6)의 비장을 분리한 다음, 핀셋이나 매쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI 1640 배양액으로 3회 세척한 다음, 5 × 106 cell/㎖ 농도가 되게 희석하고 96-well plate에 well당 100㎕, 즉 5 × 105 개씩 넣고, 음성대조군인 무처리 대조군(control)과, T세포 활성화에 관여하는 유전자의 발현을 유도하는 α-CD3(0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖), B세포를 자극하여 세포방어 시스템을 활성화시키는 LPS(1㎍/㎖, 10㎍/㎖)을 양성대조군으로 하였으며, 위 실시예에서 다른 방사선을 조사하여 얻은 각각의 불가사리 추출물(1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖, 1000㎍/㎖0.01 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양한 다음, Cell titer 96용액 (Promega, USA)을 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하는 방법으로 세포증식을 측정하였다. 구체적으로 세포증식 측정은 Cell titer 96® Aqueous Solution Cell proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하여, 세포 배양액 100㎕에 Cell titer 용액을 15㎕식 첨가하여 4~8시간 동안 배양한 다음, Microplate eader(Titet다 Multiscan Plus, Finland)로 490㎚에서 O.D.값을 측정하여 증식도를 측정하였다. 본 실험예에 따른 비장 세포의 증식 결과는 도 2 및 하기 표 2에 표시되어 있다.
표 2. 비장세포의 증식 측정
condition 샘플 농도(㎍/㎖)
0 1 10 100 1000
control 0.735± 0.04
LPS 1.437± 0.03 1.935± 0.09
α-CD3* 0.901± 0.09
α-CD3** 1.556± 0.05
0 KG 0.780± 0.01 0.853± 0.01 1.093± 0.06 1.979± 0.07
25 KG 0.715± 0.01 0.776± 0.01 1.059± 0.01 1.876± 0.06
50 KG 0.741± 0.01 0.761± 0.03 0.994± 0.02 1.931± 0.01
100 KG 0.679± 0.01 0.738± 0.01 0.899± 0.02 1.683± 0.05
200 KG 0.731± 0.01 0.746± 0.01 0.860± 0.05 1.371± 0.04
*: 0.01 ㎍/㎖
**: 0.1 ㎍/㎖
한편, 본 실험예를 통하여 측정된 비장세포의 증식결과를 토대로 각 불가사리 추출물의 전체적인 비장 세포 증식 활성 분석은 하기 표 3에 표시되어 있다. 이를 위하여, 불가사리 추출물에 있어서 비장세포의 증식이 가장 높게 유도된 농도(1000㎍/㎖)의 흡광도 값에 위 실험예 1에서 구한 불가사리 추출물의 전체 회수비율을 곱하는 방법으로 비장세포의 증식 활성 정도를 비교하였다. 이와 같이 전체 회수율을 감안하여 비장 세포의 증식 정도를 비교해 볼 때 방사선을 조사한 경우에 비장 세포의 증식 활성이 증가하였음을 확인하였다.
표 3. 불가사리 추출물의 비장 세포 증식에 대한 전체 활성
condition O.D. (1000㎍/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 1.979± 0.07 1 1.979 1
25 KG 1.876± 0.06 1.725 3.236 1.635
50 KG 1.931± 0.01 1.600 3.090 1.561
100 KG 1.683± 0.05 2.452 4.127 2.085
200 KG 1.317± 0.04 2.002 2.744 1.387
* : 표 1 참조
**: O.D (1000 ㎍/㎖) × 전체 회수율
실험예 3 : 불가사리 추출물의 비장세포에서의 사이토카인 분비 측정
비장세포의 증식반응이 일어나면 증식되는 세포는 면역반응을 매개하는 사이토카인을 분비하기 때문에 비장세포의 증식반응이 일어날 때 분비되는 사이토카인의 종류를 알면 사이토카인이 매개하는 면역반응과 증식하는 세포의 종류를 구분할 수 있다. 이를 위하여, 본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 분리한 비장세포를 대상으로 상기 실시예에서 얻은 불가사리 추출물의 사이토카인 분비 유도 활성을 측정하였다. 우선, 상술한 실험예 2에서 얻은 배양세포에 음성대조군인 무처리 대조군(control), 양성대조군으로 LPS(10 ㎍/㎖)와 α-CD3(0.1 ㎍/㎖), 상기 실시예에서 얻은 불가사리 추출물(1000 ㎍/㎖)을 첨가하여 배양한 상층액을 24시간 회수한 뒤, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 방법을 사용하여 상층액에 포함된 IL-2, IL-6, IFN-γ의 양을 측정하였다.
이를 구체적으로 살펴보면, flat-bottomed Microwell palte에 goat anti- mouse cytokine 1차 항체를 coating buffer (0.1M NaHCO3)를 이용하여 4℃에서 overnight incubation 한 후, 10% EBS-PBS 용액으로 2시간 동안 상온에서 blocking하였다. 위 실험예 2에서 얻은 세포배양 상층액을 적당한 비율로 희석하여 plate에 넣고, 실온에서 4시간 incubation시킨 후, biotinlyated anti-cytokine 2차 항체를 첨가하였다. 이어서, advidin-conjugated alkaline phosphate를 넣고 실온에서 1시간 incubation시키고, 기질로 p-nitiophenyl phosphate를 넣은 후 Micoplate reader로 450㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 사이토카인의 농도는 standard curve를 이용하여 환산하였다.
1) IL-2
본 실험예를 통하여 측정된 사이토카인 중에서 IL-2의 분비량 측정 결과가 도 3a에 도시되어 있고, 그 측정 결과 및 해석은 하기 표 4에 표시되어 있다. 도시된 것과 같이, B세포의 증식을 유도하는 것으로 알려진 LPS는 IL-2의 분비를 거의 유도하지 못한 반면에, T-세포의 증식을 유도하는 것으로 알려진 α-CD3는 비교적 많은 양의 IL-2의 분비를 유도하였다. 한편, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물은 LPS와 유사하게 IL-2의 분비는 거의 유도하지 못하였다. 본 실시예에 따르면, 방사선을 조사한 불가사리 추출물에 비하여 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물의 경우에 보다 많은 IL-2의 분비가 유도되었다. 그러나 불가사리 분말로부터 회수된 비율을 고려해 볼 때, 방사선을 조사한 경우에 방사선을 조사하지 않은 경우 보다 1.8배 이상의 IL-2의 분비를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.
표 4. 비장세포에서의 IL-2 분비량 측정
condition IL-2 (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 22.60± 2.83 1 22.60 1
25 KG 16.10± 0.71 1.725 27.77 1.229
50 KG 22.10± 2.12 1.600 35.36 1.565
100 KG 14.60± 1.41 2.452 35.80 1.584
200 KG 20.60± 5.66 2.002 41.24 1.825
* : 표 1 참조
**: IL-2 (pg/㎖)(1000 ㎍/㎖) × 전체 회수율
2) IL-6
본 실험예를 통하여 측정된 사이토카인 중에서 IL-6의 분비량 측정 결과가 도 3b에 도시되어 있고, 그 측정 결과 및 해석은 하기 표 5에 표시되어 있다. 도시된 것과 같이, LPS는 IL-6의 분비를 크게 유도한 반면에 α-CD3의 경우 상술한 IL-2만큼의 분비를 유도하지는 못하였다. 한편, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물은 LPS와 유사하게 IL-6의 분비를 유도하였다.
도 3b 및 하기 표 5에서 알 수 있는 것과 같이, 방사선을 조사하지 않은 경우에 약간 많은 IL-6의 분비를 유도하였으나, 불가사리 분말로부터 회수된 비율을 고려해 볼 때, 방사선을 조사한 경우에 방사선을 조사하지 않은 경우보다 1.3배 이상의 IL-6의 분비를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.
표 5. 비장세포에서의 IL-6 분비량 측정
condition IL-6 (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 1544.50± 17.68 1 1544.50 1
25 KG 1134.50± 31.82 1.725 1957.01 1.267
50 KG 1167.00± 98.99 1.600 1867.20 1.209
100 KG 832.00± 84.85 2.452 2040.10 1.321
200 KG 814.50± 31.82 2.002 1630.63 1.056
* : 표 1 참조
**: IL-6(pg/㎖)(1000 ㎍/㎖) × 전체 회수율
3) IFN-γ
본 실험예를 통하여 측정된 사이토카인 중에서 IFN-γ의 분비량 측정 결과가 도 3c에 도시되어 있고, 그 측정 결과 및 해석은 하기 표 6에 표시되어 있다. 도 3c에서 알 수 있는 것과 같이, LPS, α-CD3는 물론이고, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물에서도 비교적 많은 양의 IFN-γ의 분비가 유도되었음을 확인하였다.
특히, 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우에는 방사선을 조사하지 않은 경우보다 많은 양의 IFN-γ 분비를 유도하였는데, 특히 25 KG와 100 KG의 강도로 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우에는 방사선을 조사하지 않은 경우보다 각각 2.7배, 1.7배 많은 양의 IFN-γ의 분비가 유도되었다. 더욱이 상기 실험예 1에서 확인된 추출물의 전체 회수율을 고려해 보면 방사선을 조사한 경우에는 방사선을 조사하지 않은 경우보다 IFN-γ의 분비가 더욱 유도되었는데, 특히 25KG 및 100KG의 강도로 방사선을 조사한 경우에는 방사선을 조사하지 않은 경우보다 약 4 배 이상 IFN-γ의 분비를 유도하는 것으로 확인되었다.
표 6. 비장세포에서의 IFN-γ 분비량 측정
condition IFN-γ(pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 1610.00± 84.85 1 1610 1
25 KG 4395.00± 21.21 1.725 7581.38 4.709
50 KG 1905.00± 120.21 1.600 3048.00 1.893
100 KG 2775.00± 285.77 2.452 6804.30 4.226
200 KG 1935.00± 219.20 2.002 3873.87 2.406
* : 표 1 참조
**: IFN-γ(pg/㎖) (1000 ㎍/㎖) ×전체 회수율
결국, 본 실험예를 통하여 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물은 비장세포를 자극하여 IFN-γ와 IL-6의 분비를 유도하며, 특히 IFN-γ의 경우 방사선을 조사한 불가사리 추출물에서 조사하지 않은 추출물보다 많은 양이 분비되었음을 확인하였다. 또한, 전체 회수율과 관련하여 볼 때, 방사선을 조사한 추출물에서 조사하지 않은 추출물보다 많은 양의 사이토카인이 생산되었음을 확인하였다.
실험예 4 : B세포의 증식
본 실험예에서는 상기 실험예 2에서 증식된 비장세포가 어떠한 종류의 면역페소인지를 확인하기 위하여 먼저 B 세포를 분리한 뒤, 위 실시예에서 얻은 불가사리 추출물을 농도별로 처리하여 B세포의 증식반응을 관찰하였다.
이를 위하여 우선 위에서 분리된 비장세포를 10% FBS-RPMI 1640 10㎖에 희석한 후, T세포만이 가지고 있는 세포표면 특이 단백질인 Thy 1.2항원에 대한 항체인 anti-Thy12. mAb ascites 40㎕를 넣고 4℃에서 60분간 incubation하였다. 이어서, 4℃, 1200rpm에서 5분간 원심 침전한 후에 10% FBS-RPMI 1640 5㎖에 희석하고 rabbit complement 250㎕를 첨가하여 37℃ water bath에서 45분간 배양하여 T세포를 제거하였다. 다음 RPMI 1640으로 1200rpm에서 5분간 원심침전을 2회 반복하고, 10% FBS-RPMI 1640 medium 500㎕에 희석하여 Sephadex G-10 column을 통과시켜 나머지 부착성 세포들을 제거하여 B세포만을 수순하게 분리하였다.
분리한 B세포를 well당 3 × 105개 넣은 뒤, 위 실험예 2와 동일하게 음성대조군(control), α-CD3(0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖), LPS(1㎍/㎖, 10㎍/㎖), 그리고 위 실시예에서 얻은 각각의 불가사리 추출물(1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖, 1000㎍/㎖0.01 ㎍/㎖)을 첨가하여 48시간 배양한 다음 증식반응을 측정하였다. 그 증식결과는 도 4 및 하기 표 7에 표시되어 있다.
표 7. B세포 증식 측정
condition 샘플 농도(㎍/㎖)
0 1 10 100 1000
control 0.30± 0.03
LPS 1.91± 0.00 1.91± 0.03
α-CD3* 0.30± 0.01
α-CD3** 0.34± 0.02
0 KG 0.43± 0.00 0.52± 0.00 0.94± 0.10 1.77± 0.08
25 KG 0.33± 0.01 0.46± 0.03 0.95± 0.01 1.93± 0.19
50 KG 0.38± 0.02 0.44± 0.01 0.84± 0.06 1.52± 0.03
100 KG 0.33± 0.01 0.39± 0.00 0.77± 0.05 1.82± 0.08
200 KG 0.33± 0.00 0.45± 0.00 1.05± 0.15 1.17± 0.13
*: 0.01 ㎍/㎖
**: 0.1 ㎍/㎖
도 4 및 표 α-CD3에 의하여 증식이 되지 않고, LPS에 의해서 증식이 유도되는 것으로 B세포가 순수하게 분리된 것을 확인하였다. 불가사리 추출물의 경우에는 1000 ㎍/㎖의 농도에서 B세포의 증식을 가장 크게 유도하였으며, 26KG 및 100KG의 강도로 조사한 불가사리 추출물은 방사선을 조사하지 않은 경우보다 높은 Btp로 증식반응이 유도되었다. 한편, 하기 표 8은 본 실험예에서의 불가사리 추출물의 B세포 증식 결과에 대한 해석이다. 표 8에서 알 수 있는 것과 같이, 본 실험예에서 측정된 B세포 유도 정도와 상기 실험예 1에서 얻은 불가사리 추출물의 전체 회수율을 고려해 보면, 방사선을 조사하면 방사선을 조사하지 않은 경우보다 B세포의 분비를 더욱 유도하였으며, 특히 25KG와 100KG의 강도로 방사선을 조사한 불가사리 추출물은 조사하지 않은 경우보다 약 1.8, 2.5배 높게 나타났다.
표 8. 불가사리 추출물의 B세포 증식에 대한 활성 분석
condition O.D. (1000㎍/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 1.77± 0.08 1 1.77 1
25 KG 1.93± 0.19 1.725 3.33 1.881
50 KG 1.52± 0.03 1.600 2.43 1.372
100 KG 1.82± 0.08 2.452 4.46 2.520
200 KG 1.17± 0.13 2.002 2.34 1.322
* : 표 1 참조
**: O.D (1000 ㎍/㎖) × 전체 회수율
결론적으로, 본 발명에서 얻은 불가사리 추출물은 비장세포 중에서 B세포의 증식을 특이적으로 유도하며, 특히 25KG와 100KG의 방사선을 조사한 경우에 보다 높은 B세포 증식반응이 유도되었음을 확인하였다. 한편, 전체적인 회수율로 환산할 때, 방사선을 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 추출물보다 높은 B세포 증식 활성을 얻을 수 있었다.
실험예 5 : 면역글로불린의 생산 측정
B세포는 외부에서 침입한 항원에 대하여 항체로 성장하는 면역글로불린을 생산하는 방법으로 체액성 면역반응을 유발한다. 이에, 본 실험예에서는 B세포의 증식을 유도하는 것으로 확인된 본 발명의 불가사리 추출물이 B세포의 면역글로불린의 생산을 유도하는지를 확인하였다.
1) IgM 생산
우선 본 발명에서 얻은 불가사리 추출물이 B세포를 자극하여 생산하는 IgM의 양을 측정하기 위해서 B세포의 최대 증식반응을 유도하는 농도(1000 ㎍/㎖)의 불가사리 추출물을 첨가하여 48시간 배양한 후 상층액을 회수하고, 회수된 상층액에 포함된 IgM의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다. 아무런 처리를 하지 않은 음성대조군(control)과 함께, 양성대조군으로 LPS(10 ㎍/㎖) 역시 같은 방법으로 처리하였다. 그 측정 결과가 도 5a에 도시되어 있으며, 하기 표 9는 측정 결과 및 이에 대한 해석 결과를 표시한 것이다. 실험 결과, 불가사리 추출물은 B세포의 증식은 물론이고 IgM의 생산도 유도하는 것을 알 수 있었다. 특히 방사선을 조사하지 않은 경우에 조사한 경우보다 많은 양의 IgM의 분비가 유도되었으나, 실험예 1에서 얻은 전체 회수율을 고려해 볼 때, 전체적으로 방사선을 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 추출물에 비하여 조금 많은 양의 IgM의 생산을 유도하는 것으로 확인되었다.
표 9. 불가사리 추출물의 IgM 분비 활성 분석
condition IgM (ng/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
control 7.04± 0.18
LPS 620.70± 36.06
0 KG 357.60± 17.82 1 357.60 1
25 KG 257.40± 14.43 1.725 444.02 1.241
50 KG 335.10± 3.82 1.600 536.16 1.500
100 KG 145.20± 2.55 2.452 356.03 0.995
200 KG 170.10± 1.27 2.002 340.54 0.952
* : 표 1 참조
**: IgM (ng/㎖) × 전체 회수율
2) IgG 생산
항원 자극시 초기에는 IgM 항체가 많이 생성되지만, 항원 자극에 의하여 B세포가 분화됨에 따라 생성되는 항체의 형태가 IgM에서 IgG, IgA 또는 IgE로 변형되는 개별형 전환(isotype switching)이 일어난다. 본 실험예에서는 B세포의 항체 생산력, 항체 종류의 변화를 관찰하기 위하여 위에서와 동일한 절차에 따라 IgG의 subclass인 G1, G2a, G2b, G3 각각의 농도를 측정하였다.
가. IgG1
IgG1에 대한 측정결과는 도 5b에 도시되어 있으며, 하기 표 10은 그 측정 결과 및 해석을 표시한 것이다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 25KG, 50KG의 강도로 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 많은 양의 IgG1의 분비가 유도되었다. 또한, 상술한 실험예 1을 통하여 확인된 불가사리 추출물의 전체 회수량을 고려해 보면, 방사선을 조사한 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 활성이 최고 2배가량 증가하였음을 확인하였다.
표 10. 불가사리 추출물의 IgG1 분비 활성 분석
condition IgG1 (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 2063.00± 28.00 1 2063.00 1
25 KG 2378.00± 14.00 1.725 4102.05 1.990
50 KG 2133.00± 28.00 1.600 3412.80 1.654
100 KG 1673.00± 35.00 2.452 4102.20 1.990
200 KG 1641.00± 152.00 2.002 3285.28 1.592
* : 표 1 참조
**: IgG1 (pg/㎖) × 전체 회수율
나. IgG2a
IgG1에 대한 측정결과는 도 5c에 도시되어 있으며, 하기 표 11은 그 측정 결과 및 해석을 표시한 것이다. 그 결과에서 알 수 있듯이, IgG2a의 분비 유도와 관련하여, 방사선을 조사한 불가사리 추추물은 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물보다 많은 양의 IgG2a의 분비를 유도하였다. 특히, 불가사리 추출물의 전체 회수량을 고려해 보면, 방사선을 조사한 불가사리 추출물은 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물보다 최고 42배 정도 IgG2a 분비 유도 활성이 증가한 것으로 확인되었다.
표 11. 불가사리 추출물의 IgG2a 분비 활성 분석
condition IgG2a (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG < 100 1 100 1
25 KG 400.00± 88.00 1.725 690.00 6.90
50 KG 2650.00± 442.00 1.600 4240.00 42.40
100 KG 775.00± 619.00 2.452 1900.30 19.00
200 KG 150.00± 0.00 2.002 300.30 3.003
* : 표 1 참조
**: IgG2a (pg/㎖) × 전체 회수율
다. IgG2b
IgG2b에 대한 측정결과는 도 5d에 도시되어 있으며, 하기 표 12는 그 측정 결과 및 해석을 표시한 것이다. 그 결과에서 알 수 있듯이, 50KG의 강도로 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 많은 양의 IgG2b의 분비가 유도되었다. 또한, 불가사리 추출물의 전체 회수량을 고려해 보면, 방사선을 조사한 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 활성이 최고 1.7배가량 증가하였음을 확인하였다.
표 12. 불가사리 추출물의 IgG2b 분비 활성 분석
condition IgG2b (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 12433.00± 236.00 1 12433.00 1
25 KG 8767.00± 236.00 1.725 15123.08 1.220
50 KG 13100.00± 1650.00 1.600 20960.00 1.690
100 KG 8100± 707.00 2.452 19861.20 1.600
200 KG 8767.00± 236.00 2.002 17551.53 1.411
* : 표 1 참조
**: IgG2b (pg/㎖) × 전체 회수율
라. IgG3
IgG1에 대한 측정결과는 도 5e에 도시되어 있으며, 하기 표 13은 그 측정 결과 및 해석을 표시한 것이다. 결과에서 알 수 있듯이, 25KG, 50KG, 100KG의 강도로 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 많은 양의 IgG3의 분비가 유도되었다. 또한, 상술한 실험예 1을 통하여 확인된 불가사리 추출물의 전체 회수량을 고려해 보면, 방사선을 조사한 경우, 방사선을 조사하지 않은 경우보다 활성이 최고 2.8배가량 증가하였음을 확인하였다.
표 13. 불가사리 추출물의 IgG3 분비 활성 분석
condition IgG3 (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 3186.00± 505.00 1 3186.00 1
25 KG 3829.00± 606.00 1.725 6605.03 2.073
50 KG 4186.00± 505.00 1.600 6697.60 2.102
100 KG 3614.00± 101.00 2.452 8861.53 2.781
200 KG 2114.00± 0.00 2.002 4232.23 1.330
* : 표 1 참조
**: O.D (1000 ㎍/㎖) × 전체 회수율
3) 결론
본 실험예를 통하여 불가사리 추출물이 면역 반응 초기에 관여하는 IgM의 생 산을 유도하는 것은 물론이고, IgG subclass로의 개별형 전환을 유도하는 것을 확인하였다. 특히, IgG1에서는 25, 50KG 강도의 방사선을 조사한 불가사리 추출물이, IG2a에서는 방사선을 조사한 불가사리 추출물 모두, IgG2b에서는 50KG 강도의 방사선을 조사한 불가사리 추출물이 각각 방사선을 조사하지 않은 추출물 보다 많은 면역글로불린의 분비를 유도하였다. 또한, IgG3의 경우도 24, 50, 100KG의 방사선을 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 경우보다 많은 양의 IgG3 분비를 유도함을 알 수 있었다. 한편, 전체 회수율과 관련하여 방사선을 조사하지 않은 경우보다는 방사선을 조사한 경우가 많은 양의 면역글로불린의 분비를 유도하였다.
실험예 6 : 대식세포주의 일산화질소 생산 활성 측정
대식세포에 의하여 인식된 박테리아는 대식세포 내의 살균작용에 의하여 죽고 분해된다. 이와 같이 박테리아를 죽이기 위하여 대식세포가 분비하는 물질 중에서 최근에 일산화질소(NO)가 밝혀진 바 있다. 이에, 본 실험예에서는 불가사리 추출물이 일산화질소 생산에 어떠한 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 안정된 산화물인 NO2(Nitrite)는 Griess 반응을 이용하여 측정하였다.
우선, 생쥐 단핵/대식세포 계열의 세포주(RAW264.7, 한국세포주은행, 서울대학교 의과대학 암연구소)를 well당 5 × 104개씩 넣고, LPS(1, 10 ㎍/㎖, 양성대조군)와 위에서 얻은 불가사리 추출물(1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖)을 첨가하여 48시간 배양한 다음, 배양 상층액을 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고, 여기에 Griess 시약(0.1% N-1-naphthyl-ethlenediamin in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 = 1 : 1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, Microplate reader로 550㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite를 64μM에서부터 0.5μM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 계산하였다.
대식세포주의 일산화질소 생산 측정 결과는 도 6에 도시되어 있으며, 하기 표 14는 그 결과 및 해석 자료를 표시한 것이다. 도 6에 도시된 것과 같이, 불가사리 추출물을 1000 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였을 경우에 무처리 대조군(control)에 비하여 현저히 많은 양의 일산화질소가 생산되었다. 특히, 방사선을 25KG의 강도로 조사하여 얻은 불가사리 추출물의 경우 방사선을 조사하지 않은 경우와 비교하여 조금 많은 양의 일산화질소가 생산된 것으로 나타났다.
표 14. 대식세포주에 대한 일산화질소 생산 측정 결과
condition 샘플 농도(㎍/㎖)
0 1 10 100 1000
control 0.80± 0.07
LPS 13.80± 0.70 16.26± 0.99
0 KG 0.94± 0.10 1.00± 0.08 3.78± 0.42 6.82± 0.59
25 KG 0.83± 0.16 1.14± 0.26 2.71± 0.41 7.43± 0.88
50 KG 0.94± 0.07 0.85± 0.03 2.90± 0.13 6.81± 0.56
100 KG 0.72± 0.07 0.73± 0.04 1.63± 0.11 5.72± 0.32
200 KG 1.39± 0.19 1.03± 0.09 2.07± 0.18 6.23± 0.17
한편, 하기 표 15는 본 실험예를 통하여 측정된 일산화질소와 상기 실험예 1 에 측정된 불가사리 추출물의 전체 회수율을 고려하여 분석된 불가사리 추출물의 전체적인 일산화질소 생산에 대한 분석을 나타낸 것이다. 표 15에서 알 수 있는 것과 같이, 불가사리 추출물의 전체 회수율을 고려해 볼 때, 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 경우에는 방사선을 조사하지 않은 경우와 비교하여 최고 2배 정도 활성이 증가하였음을 알 수 있었다. 결론적으로, 불가사리 추출물은 대식세포를 활성화시켜 일산화질소 생산을 직접적으로 유도하는 것으로 생각되며, 전체 회수율을 감안하면 방사선을 조사한 불가사리 추출물에서 일산화질소 생산을 더욱 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.
표 15. 불가사리 추출물의 일산화질소 분비 활성 분석
condition NO (㎍/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 6.82± 0.09 1 6.82 1
25 KG 7.43± 0.88 1.725 12.82 1.880
50 KG 6.81± 0.55 1.600 10.90 1.598
100 KG 5.72± 0.32 2.452 14.03 2.057
200 KG 6.23± 0.17 2.002 12.47 1.828
* : 표 1 참조
**: NO (㎍g/㎖) × 전체 회수율
실험예 7 : 대식세포주에서의 사이토카인 분비 측정
대식세포는 항원의 자극을 받아 활성화되면 IL-6, TNF-α, GM-CSF 등을 분비하여 면역반응을 조절한다. 본 실험예에서는 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출 물이 대식세포를 활성화시켜 사이토카인의 생산에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하였다.
이를 위하여, 위 실험예 6에서 배양된 대식세포주(RAW 264.7)를 well당 5 × 105개씩 넣고, 불가사리 추출물을 NO 생산의 최대반응을 유도하는 농도인 1000㎍/㎖의 농도로 첨가하여 24시간 배양한 후, 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 배양 상층액에 포함되어 있는 사이토카인의 농도와 종류는 실험예 3에서와 동일한 절차를 따라 ELISA로 측정하였다.
1) IL-6
IL-6는 간세포가 fibrinogen과 같은 몇 가지 혈장단백질 합성을 유도하며, B 세포 분화를 활성화시키는 B세포 성장인자로 작용하는 사이토카인이다. 본 실험예에 따라 대식세포주에서 IL-6의 생산 측정 결과가 도 7a에 도시되어 있으며, 하기 표 16은 그 측정결과 및 해석을 나타낸 것이다. 대식세포를 활성화시키는 것으로 알려진 LPS에 의하여 IL-6의 생산량이 현저히 증가하였으며, 불가사리 추출물의 경우에도 IL-6의 생산을 유도하는 것으로 나타났다.
IL-2의 생산과 관련해서는 방사선을 25KG, 50KG, 200KG의 강도로 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물에 비하여 많은 양의 IL-6를 생산하였다. 특히, 각 불가사리 추출물의 전체 회수율과 관련해서는 방사선을 조사한 경우, 최고 2.7배 이상 IL-6의 생산량이 증가하는 것으로 나타났다.
표 16. 불가사리 추출물의 대식세포주에 대한 IL-6 분비 활성 분석
condition IL-6 (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 39520.00± 3041.00 1 39520.00 1
25 KG 40320.00± 2758.00 1.725 69552.00 1.760
50 KG 50670.00± 3111.00 1.600 81072.00 2.051
100 KG 36220.00± 3748.00 2.452 88811.44 2.247
200 KG 53770.00± 2828.00 2.002 107647.54 2.723
* : 표 1 참조
**: IL-6 (pg/㎖) × 전체 회수율
2) TNF-α
TNF-α는 종양사괴인자로 알려진 물질로 종양세포를 파괴하는 사이토카인이다. 본 실험예에 따라 대식세포주에서 TNF-α의 생산 측정 결과가 도 7b에 도시되어 있으며, 하기 표 17은 그 측정결과 및 해석을 나타낸 것이다. 대식세포를 활성화시키는 것으로 알려진 LPS에 의하여 TNF-α의 생산량이 현저히 증가하였으며, 불가사리 추출물의 경우에도 TNF-α의 생산을 유도하는 것으로 나타났다.
TNF-α의 생산과 관련해서는 방사선을 50KG의 강도로 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물에 비하여 많은 양의 TNF-α를 생산하였다. 특히, 각 불가사리 추출물의 전체 회수율과 관련해서는 방사선을 조사한 경우, 최고 2배 이상 TNF-α의 생산량이 증가하는 것으로 나타났다.
표 17. 불가사리 추출물의 대식세포주에 대한 TNF-α 분비 활성 분석
condition TNF-α(pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 56748.00± 2843.00 1 56748.00 1
25 KG 51138.00± 424.00 1.725 88213.05 1.544
50 KG 59538.00± 280.00 1.600 95260.80 1.680
100 KG 47688.00± 1994.00 2.452 116930.98 2.060
200 KG 49698.00± 764.00 2.002 99495.40 1.753
* : 표 1 참조
**: TNF-α(pg/㎖) × 전체 회수율
3) GM-CSF
GM-CSF는 성장과 분화를 자극하는 사이토카인이다. 본 실험예에 따라 대식세포주에서 GM-CSF의 생산 측정 결과가 도 7c에 도시되어 있으며, 하기 표 18은 그 측정결과 및 해석을 나타낸 것이다. 대식세포를 활성화시키는 것으로 알려진 LPS에 의하여 GM-CSF의 생산량이 현저히 증가하였으며, 불가사리 추출물의 경우에도 GM-CSF의 생산을 유도하는 것으로 나타났다.
GM-CSF의 생산과 관련해서는 방사선을 25KG, 50KG, 200KG의 강도로 조사한 불가사리 추출물이 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물에 비하여 많은 양의 GM-CSF를 생산하였다. 특히, 각 불가사리 추출물의 전체 회수율과 관련해서는 방사선을 조사한 경우, 최고 2.5배 이상 GM-CSF의 생산량이 증가하는 것으로 나타났다.
표 18. 불가사리 추출물의 대식세포주에 대한 GM-CSF 분비 활성 분석
condition GM-CSF (pg/㎖) 전체 회수율* 전체 활성** 활성 비율
0 KG 1232.00± 184.00 1 1232.00 1
25 KG 1776.00± 45.00 1.725 3063.60 2.490
50 KG 1987.00± 33.00 1.600 3179.20 2.580
100 KG 942.00± 40.00 2.452 2309.78 1.874
200 KG 1466.00± 153.00 2.002 2934.93 2.382
* : 표 1 참조
**: GM-CSF (pg/㎖) × 전체 회수율
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 기술하였으나, 이는 어디까지나 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고해 낼 수 있을 것이다. 그러나 그와 같은 변형과 변경은 본 발명의 기본정신을 훼손하지 아니하는 범위 내에서 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 후술하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물에는 면역 과정에 관여하는 대식세포, B세포 등의 증식은 물론이고 이들 세포의 활성화 및 분화 과정을 유도하는 각종 사이토카인 및 일산화질소의 분비를 유도할 수 있는 면역 활성 성분을 추출할 수 있었다.
특히, 불가사리 분말에 방사선을 조사한 경우에는 그렇지 않은 경우와 비교하여 최고 약 2.5배 많은 면역 활성 성분 추출물을 회수할 수 있었고, 이로 인하여 전체적인 면역 활성 또한 증가하였음을 확인하였다.
결국, 본 발명은 현재 대부분 전량 폐기되고 있는 불가사리에서 면역 활성 성분을 갖는 추출물을 제조함으로써, 불가사리의 재활용이 가능하도록 하여 관련 산업계에서도 충분히 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 면역 세포의 활성을 증가시키는 불가사리 추출물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 불가사리를 분쇄하는 단계;
    (b) 분쇄된 불가사리에 방사선을 조사하는 단계;
    (c) 방사선이 조사된 불가사리 분말에 버퍼 용액을 첨가하여 진탕 배양하는 단계; 및
    (d) 진탕 배양된 불가사리 분말을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 방사선은 10 ~ 300 KGy의 강도로 조사되는 것을 특징으로 하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (d) 단계는 상기 진탕 배양된 불가사리 분말을 원심분리하여 회수된 상층액을 유기용매로 처리하여 침전시킨 뒤, 침전물을 원심분리하여 상층액이 제거된 침전 추출물을 얻는 단계를 포함하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 회수된 상층액과 상기 유기용매는 1:1 ~ 1:3의 부피비로 처리되는 것을 특징으로 하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (d) 단계 이후에 얻어진 침전 추출물을 투석 처리하여 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계를 더욱 포함하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 회수된 상층액을 여과시키는 단계를 더욱 포함하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 불가사리는 한국산 별불가사리인 것을 특징으로 하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포의 활성 증가에 의하여 분비 유도되는 물질은 사이토카인, 면역글로불린, 산화질소인 것을 특징으로 하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포의 활성 증가에 의하여 분비 유도되는 물질은 인터류킨, 인터페론, TNF(종양괴사인자), GM-CSF(과립세포-대식세포 집락자극인자)인 것을 특징으로 하는 불가사리 추출물을 제조하는 방법.
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