KR100895627B1 - 자외선에 의한 세포 변이 억제 효과를 갖는 불가사리 추출물 및 그 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 불가사리에 방사선을 조사하여 자외선에 의한 세포 손상 또는 세포 변이에 따른 질환을 방지, 억제할 수 있는 추출물 및 그 추출 방법을 제안한다. 본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물은 예를 들어 자외선 노출로 인한 세포계획사, 세포막 변이, 세포분열 정지, DNA 변이와 같은 핵 성분의 파괴 등을 억제할 수 있음을 확인하였다.

불가사리(Starfish), 방사선(Radiation), 자외선(Ultraviolet lay), 세포계획사(Apoptosis), 세포주기(Cell Cycle), 수지상세포(dendritic cell, DC)

Description

자외선에 의한 세포 변이 억제 효과를 갖는 불가사리 추출물 및 그 추출 방법{Starfish Extract with Suppression of Cell Mutation by Ultraviolet lay and Extracting Process thereof}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리로부터 자외선 차단 효과를 갖는 추출물을 얻는 과정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다.

도 2는 마우스를 자외선에 노출시켰을 경우 자외선 강도에 따른 접촉성 과민반응이 억제되는 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 3a 내지 도 3e는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물로 처리한 마우스를 자외선에 노출시킨 뒤, 접촉성 과민반응을 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 4는 마우스의 수지상세포를 자외선에 노출시켰을 경우 자외선 강도에 따른 수지상세포 주기의 변화를 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 5a 내지 도 5e는 각각 본 발명의 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포를 자외선에 노출시킨 뒤, 세포 주기 상태를 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 6a 내지 도 6e는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물을 일정량 처리한 마우스의 수지상세포를 자외선에 노출시킨 뒤, 세포막 변화 또는 파괴 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물을 각각 일정량 처리한 마우스의 수지상세포를 자외선에 노출시킨 뒤 미토콘드리아막의 변이 또는 파괴 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물을 각각 일정량 처리한 뒤, 자외선에 노출된 마우스 수지상세포 내의 DNA 응축 정도를 측정한 사진.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻어진 추출물과 불가사리 분말에 방사선을 조사하지 않고 얻어진 추출물을 각각 일정량 처리한 뒤 자외선에 노출된 마우스 수지상세포 내의 DNA 래더(ladder) 형성 정도를 측정한 사진.

본 발명은 불가사리로부터 활성 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 불가사리에 방사선을 조사하여 특히 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분을 추출하는 방법 및 자외선 차단 효과를 갖는 불가사리 추출물에 관한 것이다.

불가사리(Sea star, Starfish)는 극피동물의 하나로 해저의 다양한 곳에서 서식한다. 불가사리는 극피동물 특유의 단단한 외골격을 가지고 있으며, 보통 이 외골격의 관족(管足, tube foot)으로 덮여있어 사냥감을 감싸 안고 소화액을 내어 전복, 조개, 굴, 홍합 등의 패류는 물론이고 죽은 물고기까지 무차별적으로 잡아먹는 포식성을 가지고 있다. 이 때문에 양식업에 큰 피해를 주는 '해적생물'이라고 알려져 있다. 불가사리는 해양에서 패류를 포식하며 강한 생명력을 갖고 있어 바다의 양식어장과 많은 연근해 어장에서 커다란 피해를 주고 있는 생물로서 마땅한 천적이 없어서 날로 늘어나고 있는 실정이다.

불가사리 한 마리가 6개월 동안에 섭취하는 양은 피조개로 환산하면 36마리에 달한다고 한다. 만약 양식장 1ha에 13,000 마리의 불가사리가 서식한다면 6개월 동안 피조개 약 47만 마리가 불가사리에 의해 없어진다는 계산이 나온다. 또한 불가사리는 해양생태계에 뚜렷한 천적이 없으며, 재생력이 뛰어나 구제하기가 매우 어렵다. 따라서 전복, 굴, 바지락, 백합, 피조개, 새꼬막 등이 자영서식 또는 양식되는 어장은 이들의 침입으로 인해 큰 피해를 입고 있으며, 연간 수확량의 10%가 줄어들 정도로 피해가 심각하다. 특히, 우리나라의 연안에서 불가사리의 서식밀도 는 우리나라 연안의 경우 1ha당 1,000마리 정도로 매우 높은 편이며, 그 중에서도 동해 연안의 암반 지역에서는 1ha당 16,000마리가 분포하는 것으로 보고되고 있다.

지금까지 불가사리의 구제를 가로막는 가장 큰 요인은 폐기처분이 어렵다는 것이며 특히 산발적으로 해녀와 잠수부들에 의해 불가사리 수거 작업이 이루어지고 있으나, 구제된 불가사리를 처리해주는 기관이나 단체가 없어, 거의 대부분이 해변에서 건조되어 제거하는 실정이고 이로 인한 악취로 어민들이 어려움을 겪고 있다. 최근에 불가사리 퇴치기구까지 만들어 어민들에게 보급했지만, 불가사리는 워낙 번식력이 강하고 이용가치가 없어 큰 효과를 거두지 못하고 있다.

그러나 최근 불가사리에서 추출한 천연물에 대한 연구가 많이 보고되고 있는데, 일례로 Sphaerodiscus placenta에서 polyhydroxysteroids와 steroidal glycosides(Zollo et al., 1987), Hecelia attenuata에서 polyhydroxylated sterol(Minale et al., 1982), Halityle regularis에서 분리된 starfish saponins(Iorizzi and Minale. 1986) 중에서 22, 23-epoxysteroidal glycoside sulfate(Riccio et al., 1985)와, Asterias vulgaris에서 asterosaponin은 소염, 진통작용을 가지고 있으며(Findlay et al., 1984), 아무르 불가사리(Asterias amurensis)의 egg jelly에서 추출한 steroidal saponins(sulfated glycoprotein)는 정자의 첨체반응(acrosome reaction)을 유도하고(Faulkner, 1988; Fugimoto et al,. 1987), 또한 난소에서 추출한 glycoside B₂는 난소의 성숙을 유도하는 세포분 열에 직접 관여하는 1-methyladenine의 형성을 저해한다는 보고(Ikegami et al., 1979)도 제시되었다. 스위스 연안의 불가사리인 Porania pulvillus에서 추출한 polyhydroxylated steroidal glycosides(crossasteroside A)는 혈구응집반응을 유도하고 종양세포의 성장을 억제한다고 보고(Andersson et al., 1987)되었고, Oreaster reticulatus에서 분리된 sulfated steroidal glycoside인 asterosaponin P-1(Segura de Correa et al., 1985), Nardoa속에 속하는 Nardoa novaecaledonia와 N. gomophia에서 분리된 sulfated glycoside인 marthasteroside A, thornasteroside A와 halityloside I(Riccio et al., 1986), 큰혹불가사리(Protoreaster nodosus)에서 분리된 toxin인 steroidal glycoside sulfate(nodososide)의 구조가 밝혀졌다(Riccio et al., 1982; Minale et al., 1984; Riccio et al., 1985).

영국암연구소(CRC)에서는 가시불가사리(Marthasterias glacialis)에 사이클린 의존성 키나제(CDK)라는 암세포 억제효소가 다량 존재하는 것을 확인하였으며, 미국 국립보건센터에서는 불가사리에 새로운 항생제 성분의 존재를 확인한바 있으나 국내에서는 불가사리의 포식습성에 관한 연구(박 등, 1985), 불가사리를 구제하기 위한 기구 개발에 관한 연구(박 등, 1997) 그리고 불가사리의 생화학적 특성분석 및 생리활성물질로서 이용방안 등이 일부 연구되어있다(조 등, 1998a, 1998b; 박, 1994; 해양수산부, 2000).

또한, 불가사리로부터 얻어진 추출물을 산업적으로 활용하기 위한 특허 문헌 이 있다. 일례로, 대한미국특허 제346927호에서는 불가사리 분말에 무기산을 혼합한 뒤 소정의 반응 조건에서 단백질 가수분해효소를 첨가하여 얻어지는 액상 비료의 제조 방법을 공개하고 있고, 대한민국특허 제408089호에서는 용매 추출 방법을 통하여 불가사리로부터 정제되어 있는 항-콜레스테롤 활성을 갖는 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국특허 제614682호에서는 불가사리에 증류수 및 단백질분해효소를 첨가하여 항산화 억제 효과를 갖는 불가사리 추출물에 대하여 개시하고 있다.

그렇지만 상술한 것과 같이 불가사리를 활용하기 위한 다양한 연구가 시도되었으나 여전히 불가사리에 포함된 성분의 효능에 대해서는 지속적인 연구가 필요하다. 특히 현재 거의 전량 폐기되고 있는 불가사리에서 예를 들어 의학적, 약학적인 목적으로 응용되고 적용될 수 있는 활성 성분을 추출하기 위한 연구가 더욱 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 예를 들어 자외선 조사 등에 의한 세포계획사 또는 세포 내 물질의 변환 등으로 야기될 수 있는 각종 질환 가능성을 억제함으로서, 의학적 또는 약학적으로 이용될 수 있는 불가사리 추출물 및 그 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 효과를 갖는 활성 성분의 수율이 크게 향상되도록 하고, 그 결과 생산성 내지는 경제성이 있는 공정을 통하여 산업적인 면에서 도 응용될 수 있는 불가사리 추출물 및 그 추출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 후술하는 발명의 구성 및 첨부한 도면을 통하여 보다 분명해질 것이다.

상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 불가사리로부터 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 활성 성분 추출방법으로서, 불가사리를 분말화하는 단계와; 상기 분말화된 불가사리에 방사선을 조사하는 단계와; 상기 방사선이 조사된 불가사리 분말을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함하는 불가사리로부터 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 활성 성분 추출 방법을 제공한다.

이때, 상기 방사선을 조사하는 단계에서 방사선은 10 ~ 300 KGy의 강도로 조사되는 것을 특징으로 하며, 상기 불가사리 분말을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계는 상온에서 상기 방사선이 조사된 불가사리 분말을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계와, 얻어진 상층액을 유기 용매를 사용하여 침전시키는 단계와, 상기 침전물을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계를 포함한다.

또한, 상기 불가사리 분말을 원심분리하여 침전 추출물을 얻는 단계 이후에, 상기 침전 추출물을 정제시키는 단계를 더욱 포함할 수 있는데, 상기 침전 추출물을 정제시키는 단계는 상기 불가사리 분말을 원심분리하여 얻어진 침전물을 투석하여 추출물을 회수하는 단계와, 회수된 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계와 회수된 상층액을 여과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 발명의 다른 관점에서는 불가사리 분말에 방사선을 조사하여 얻어지는 자외선에 의한 세포 변이를 억제할 수 있는 불가사리 추출물을 제공한다.

본 발명과 관련하여 상기 불가사리 추출물은 상기 불가사리 분말에 10 ~ 300 KGy 강도의 방사선을 조사하여 얻어질 수 있으며, 상기 불가사리 추출물은 상기 자외선이 조사된 불가사리 분말을 원심분리하여 얻어진 상층액을 유기 용매로 처리하여 침전시킨 후, 침전물을 정제하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻어지는 불가사리 추출물은 자외선에 의한 세포계획사를 억제하는 효과를 가지며, 예를 들어 자외선에 의한 세포막 파괴 방지, 미토콘드리아막 파괴 방지, 염색체 변이 방지 또는 DNA 단편화 방지 효과를 갖는다.

본 명세서 및 청구의 범위에서 '자외선 차단 효과' 또는 '자외선으로 인한 세포 변이 억제'라는 용어는 자외선 노출로 인하여 야기되는 비정상적 세포 형태의 변화 또는 세포 수준의 비정상적 반응을 차단, 억제, 방지한다는 의미로 사용된다. 이와 같은 비정상적 세포 형태의 변화 또는 세포 수준의 비정상적 반응으로는 접촉성 과민반응의 감소 내지는 억제, 세포막 파괴 등으로 인한 세포계획사, DNA 응축과 같은 염색체 변형 등을 포함하지만, 본 명세서에서는 자외선 노출로 인하여 야기될 수 있는 세포 수준에서의 모든 비정상적 반응 내지는 변형을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 첨부하는 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 불가사리로부터 추출한 성분의 효능에 대한 지속적인 연구를 통하여 불가사리 분말에 방사선을 조사한 뒤 얻어진 추출물을 마우스의 피부 등에 처리하면 자외선 노출로 인하여 야기될 수 있는 세포 수준에서의 비정상적 반응을 억제 또는 방지할 수 있다는 점을 확인하였다.

본 발명에 따라 자외선 차단 효과 또는 자외선 노출로 인한 세포 변이를 억제할 수 있는 불가사리 추출물을 얻는 공정에 대해서 설명한다. 도 1은 본 발명에 따라 불가사리로부터 자외선 차단 효과를 갖는 불가사리 추출물을 얻는 공정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다. 본 발명에 따라 자외선 차단 효과 내지는 자외선 노출로 인한 세포 수준에서의 변이 억제 효과를 갖는 불가사리 추출물을 얻기 위해서는 크게 불가사리를 분쇄하는 공정, 불가사리 분말에 소정 강도의 방사선을 조사하는 공정, 방사선이 조사된 불가사리 분말로부터 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분을 분리하는 공정 및 부가적으로 얻어진 활성 성분을 정제하는 공정으로 구분될 수 있다.

우선, 도 1에 도시된 것과 같이 본 발명에 따른 자외선 차단 효과를 갖는 추출물의 원료가 되는 불가사리를 충분히 건조시켜 준비하고(S100), 이를 분쇄하여 불가사리 분말을 제조한다(S102). 본 발명에 의하여 자외선 차단 효과를 갖는 추출물의 원료가 되는 불가사리에는 한국에서 많이 서식하고 있는 별불가사리 또는 아무르불가사리를 사용할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 별불가사리에 는 예를 들어 Asterina pectinifera, Asterina carinifera, 또는 Asterina batheri등을 들 수 있고, 아무르불가사리로는 Asterias amurenisis를 들 수 있으나, 본 발명이 결코 이에 한정되는 것은 아니다.

이어서, 분말 상태로 분쇄되어 있는 불가사리에 방사선을 조사한다(S104). 본 발명의 후술하는 실시예에 따르면 불가사리 분말에 일정 강도의 방사선을 조사한 경우 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분의 회수율이 크게 향상되어 전체적인 자외선 차단 효과 및 자외선 노출로 인한 세포 변이 억제 기능 역시 크게 개선되었음을 확인하였다. 본 발명과 관련하여 방사선은 불가사리 분말에 10 ~ 300 KGy의 강도로 조사될 수 있으며, 특히 본 발명의 실시예에 따르면 불가사리 분말에 25 ~ 200 KGy, 바람직하게는 25~100 KGy, 보다 바람직하게는 50~100 KGy 강도의 방사선이 조사되는 경우에 방사선이 조사되지 않고 얻어진 불가사리 추출물과 비교하여 전체적인 자외선 차단 효과가 향상되었다.

계속하여, 분쇄기 등을 통하여 얻어진 불가사리 분말에 방사선을 조사한 뒤에는 불가사리 분말로부터 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분을 분리, 추출하는 공정이 수행된다. 본 발명에 따라 불가사리 분말로부터 불가사리 분말로부터 자외선 노출로 인한 세포 변이를 방지, 억제할 수 있는 활성 성분을 분리, 추출하는 공정은 크게 방사선을 조사한 불가사리 분말을 원심분리하는 단계(S106)와, 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 유기 용매로 처리하여 침전물을 얻는 단계(S107)로 크게 구분될 수 있다.

우선, 방사선을 조사한 불가사리 분말을 증류수에 혼합하여 진탕배양한 다음에 원심분리를 통하여 자외선 차단 효과를 갖는 성분이 함유되어 있는 상층액을 얻을 수 있다. 본 발명과 관련하여 불가사리 분말을 원심분리하는 단계(S106)는 바람직하게는 2회 이상 수행될 수 있으며 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 일 실시예에 다르면 상대적으로 저속에서 1차 원심분리가 수행되고 이어서 고속에서 2차 원심분리를 수행하여 상층액을 얻을 수 있다.

이와 같은 불가사리 분말의 원심분리를 통하여 얻어진 상층액에 적절한 유기용매를 혼합하여 처리하면 자외선 차단 효과를 갖는 활성 성분이 포함된 침전물을 얻을 수 있다(S108). 이때, 사용될 수 있는 유기용매로는 아세톤 등의 비극성 유기용매를 포함하며, 초기 원심분리에 의하여 회수된 상층액과 유기용매는 약 1:1 ~ 1:3의 부피비율로 혼합시켜 회수된 상층액이 충분히 침전될 수 있도록 한다. 특히 유기 용매로의 처리 단계(S108)는 상온에 비하여 훨씬 낮은 온도, 예를 들면 -40 ~ -5℃, 바람직하게는 -30 ~ -10℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 이와 같이 유기용매에 의한 침전 처리가 이루어지는 경우에는 후기 원심분리를 수행하여 얻어진 침전물에 유기용매가 잔존할 우려가 있으므로 충분히 건조시키는 것이 좋다.

상술한 것과 같은 분리, 추출 공정을 통해서 얻어진 침전물 내에도 자외선 차단 효과 내지는 자외선 노출로 인한 세포 변이를 억제, 방지할 수 있는 활성 성분을 얻을 수 있으나, 바람직하게는 얻어진 침전물을 정제하는 공정이 수행됨으로써 자외선 차단 효과가 농축되어 있는 불가사리 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 이와 같은 정제 공정은 예를 들어 상술한 유기 용매 처리 단계(S106)를 통하여 얻어진 침전물을 원심분리하는 단계(S110)하여 추출물을 얻고, 얻어진 추출물을 투석(dialysis) 과정을 통하여 활성 성분을 얻는 단계(S112), 회수한 추출물을 소정의 속도로 원심분리한 뒤(S114), 최종적으로 여과(filter)하는 단계(S116)로 구성될 수 있다. 특히 최종적인 여과 단계(S116)는 2회 이상 연속적으로 수행될 수 있으며, 최종적으로 얻어진 추출물은 건조시켜 사용될 수 있다.

이와 같이 분쇄/분말 공정, 방사선 조사 공정, 활성 성분 추출 공정, 및 추출물 정제 공정을 통하여 얻어진 불가사리 추출물을 피부에 도포하거나 또는 세포 내로 처리한 마우스를 자외선에 노출시킨 결과 자외선 노출로 야기될 수 있는 다양한 세포 변이적 반응 또는 증상을 방지, 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.

현재까지의 자외선에 대한 연구 결과에 따르면, 적당량의 자외선은 살균 작용 및 건강한 피부 유지에 기여하지만, 자외선의 과잉 노출은 피부 노화의 원인이 되고, 홍반, 부종 등을 유발할 뿐만 아니라 피부암의 발생을 촉진시킨다.

특히, 파장이 280~320㎚인 UVB는 피부의 핵산, 단백질 등의 합성을 억제할 뿐만 아니라 면역학적 기능을 억제시켜 세포성 매개 면역에 심각한 장애를 일으키고 접촉성 항원 물질 및 다양한 감염증에 대한 피부 면역 기능을 억제시킨다. 최근의 연구에서는 UVB에 지속적으로 노출되었을 경우, T-cell 매개 면역 기능을 억제시켜 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity)을 감소시키는 것으로 확인되었다. 일반적으로 접촉성 과민반응이란 니켈, 크롬, 코발트 등의 화학물질이나 유기 화합물 등의 항원에 지속적으로 자극을 받으면 동일한 자극물질에 대한 기억 T-cell이 분열하여 림포카인을 분비함으로써 유발되는 피부의 염증 반응을 말하는데, 자외선에 지속적으로 노출되면 피부 내 면역 세포를 손상시켜 접촉성 과민반응을 억제하게 된다.

이와 같은 접촉성 과민반응과 관련하여 본 발명에 따라 방사선을 조사한 불가사리 분말로부터 얻어진 추출물을 마우스의 피부에 처리한 결과, 자외선 노출에 의하여 야기되는 접촉성 과민반응의 감소가 크게 억제, 방지되었다(도 3a 내지 도 3e).

한편, 자외선에 지속적으로 노출되면 세포의 핵에 존재하는 DNA에서 상보적 결합을 이루고 있는 A-T 결합은 G-C 결합으로 변이되고, 세포 내의 DNA 복구 시스템(DNA repair system)이 제대로 작동하지 않는 경우에는 조직 내에 A-T 결합으로 돌연변이가 일어난 세포가 존재하게 된다. 이때, 자외선에 지속적으로 노출된 세포에서는 세포 분열에 관여하는 cycline 또는 CDK와 같은 단백질의 조절이 일어나지 않게 될 뿐만 아니라 일부 변이가 일어난 세포에서는 프로그래밍에 따른 세포계획사(apoptosis)가 일어난다. 즉, 세포가 자외선에 노출되면 세포 내의 신호 전달(signal transduction) 기작을 통하여 NF-kB 또는 JNK와 같은 조절 인자를 활성화시킴으로써, 세포계획사(apoptosis)를 유도한다.

특히, 앞서 살펴본 바와 같이 접촉성 과민반응과 관련해서는 세포 내에 존재하는 면역관련 세포 중에서 수지상 세포가 큰 역할을 수행한다. 면역 반응에 관여 하는 다양한 세포 중에서 수지상세포(dendritic cell, DC)는 B lymphocyte 및 대식세포(macrophage)와 같은 전문적 항원제시세포로서, lymphocyte의 증식 및 분화를 유도할 수 있는 유일한 항원제시세포로 작용하여 바이러스 또는 세균 감염 등과 같은 항원에 대한 획득 면역 반응(adaptive immune response)의 유도 및 NK 세포의 활성 유도 등에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. 즉, 수지상세포는 표면의 나뭇가지 모양으로 뻗은 수상돌기를 이용하여 항원의 구조를 변화시키지 않고 B-cell에 항원을 전달하여 항체 생산을 유도하고, 식균 또는 흡음작용 등을 통하여 외부항원을 포획하여 활성화시킨 뒤, 외부항원을 분해하여 MHC 분자를 통하여 세포 표면에 제시함으로써 항원특이적인 T-cell의 활성을 유도한다.

이에, 본 발명에서는 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물을 마우스에 처리한 뒤, 일정시간 자외선에 노출시켰을 경우에 자외선 노출로 인한 세포계획사가 크게 억제 또는 방지되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 자외선을 조사하여 얻어지는 불가사리 추출물을 우선 처리한 뒤 자외선에 노출시킨 경우에 세포 주기상 휴지기에 해당하여 세포가 사멸한 것으로 인식되는 subG1기의 세포 수는 자외선만을 조사한 경우와 비교하여 감소하였으며(도 5a 내지 도 5e), 수지상세포 막의 파괴(도 6a 내지 도 6e), 미토콘드리아막의 붕괴 내지는 파괴(도 7)가 크게 줄어드는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 불가사리 추출물은 자외선 조사로 야기될 수 있는 염색체의 응축(도 8) 및 DNA의 단편화(도 9)를 또한 방지, 억제할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시예에 대하여 기술한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.

실시예 1 : 방사선을 조사한 불가사리로부터 활성 성분 추출

염분을 충분히 제거한 한국산 별불가사리(Asterina pectinifera)를 충분히 건조시킨 뒤 분쇄하여 분말로 만들었다. 이어서 분쇄된 불가사리 분말을 한국원자력 연구소에 의뢰하여 25 KGy의 강도로 방사선을 조사하였다. 방사선 조사는 한국원자력연구소 소재 저준위 감마선 조사 시설(Panoramic Co-60, UKAEA, UK)를 사용하였으며, Co-60 γ-선을 1 Gray/min의 선량율로 조사하였다.

방사선을 조사한 불가사리 분말 10g에 1차 증류수 100㎖을 넣고 80℃에서 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 25℃에서 3,000 rpm의 속도로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 분리된 상층액을 다시 20℃에서 9,000g의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 아세톤으로 처리(상층액과 아세톤은 1:2 v/v)하여 -20℃에서 침전시킨 후, 4℃에서 15,000g의 속도로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 추출하였다.

남은 침전물을 충분히 건조시켜 아세톤을 제거하고 인산식염수완충액(PBS)에 녹였다. 이어서 침전추출물을 투석막에 넣어서 PBS로 48시간 동안 투석시킨 뒤, 회수한 추출물을 25℃에서 40,000g의 속도로 30분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에서 불순물을 제거하기 위하여 상층액을 먼저 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 다음 다시 0.2 ㎛ 필터에 통과시켜 최종 추출물을 얻었다.

실시예 2 ~ 4 : 방사선을 조사하여 불가사리로부터 활성 성분 추출

본 실시예에서는 준비된 불가사리 분말에 각각 50 KGy, 100 KGy, 200 KGy의 강도로 방사선을 조사한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건에서 동일한 절차를 반복하여 추출물을 제조하였다.

비교실시예 : 방사선을 조사하지 않은 불가사리로부터 활성 성분 추출

본 비교실시예에서는 준비된 불가사리 분말에 아무런 방사선 처리를 하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건에서 동일한 절차를 반복하여 추출물을 얻었다.

실험예 1 : 불가사리로부터 얻은 활성 성분의 수율 측정

본 실험예에서는 상기 실시예 및 비교실시예로부터 얻은 최종 추출물 양과 이들의 건조중량을 비교하였다. 건조 중량을 측정하기 위하여 상술한 실시예로부터 얻은 상층액 추출물을 110℃에서 충분히 건조시킨 뒤에 건조중량을 측정하였다. 각 실시예에서 얻은 추출물의 중량은 하기 표 1에 표시되어 있다. 표 1에서 알 수 있는 것과 같이, 방사선을 조사한 경우나 조사하지 않은 경우 단위 건조중량은 모두 약 20 ㎎/㎖로 유사하였으나, 방사선을 조사하지 않은 경우 얻어진 회수량이 42 ㎖인데 비하여, 25KGy, 50KGy, 100KGy, 200KGy의 방사선을 조사한 경우에는 각각 66, 65, 101, 70㎖로 측정되어 회수량이 크게 증가하였다. 이에 따라 불가사리 분말 10g에서 얻어진 전체 추출량은 방사선을 조사하지 않은 경우에는 0.8568g (20.4 ㎎ /㎖ × 42 ㎖)이었으나, 100KGy의 방사선을 조사한 경우에는 2.1008g (20.8 ㎎/㎖ × 101 ㎖)로 측정되어 방사선을 조사한 경우 면역 활성 성분의 추출량이 최고 약 2.5배 증가한 것으로 확인되었다.

표 1 : 불가사리 추출물의 중량 측정

condition	최종추출량 (㎖)	건조중량 (㎎/㎖)	추출물의 총중량 (g)	전체 회수비율
0 KG	42	20.4	0.8568	1
25 KG	66	22.4	1.4784	1.725
50 KG	65	21.1	1.3715	1.600
100 KG	101	20.8	2.1008	2.452
200 KG	70	24.5	1.715	2.002

실험예 2 : 접촉성 과민반응 억제에 대한 자외선 조사량 결정

본 실험예에서는 접촉성 과민반응(CHS)을 유도하는 자외선 조사량을 결정하기 위하여 마우스의 복부에 일정량의 UVB을 조사하였다. 실험동물은 (주)대한바이오링크(충북 음성, 대한민국)에서 특정병원체부재(specific photogen free) C57BL/6 마우스를 공급받아 사육실에서 폴리카보네이트 사육 상자(18 × 20㎝)당 6개체의 밀도를 유지하여 사육하였다. 이들 마우스는 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 낮과 밤의 주기를 각각 12시간씩 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하면서 생후 8-12주 사이의 마우스를 실험에 사용하였다.

자외선을 조사하기 이틀 전, 사육된 마우스의 복부 털을 전기 제모기를 이용하여 제거하고, 화학제모제를 사용하여 완전히 제거하였다. 다음날 마우스를 diethyl ether로 마취하고 알루미늄 포일로 얼굴을 덮은 후, 접촉성 과민반응을 유 도하는 자외선 조사량을 결정하기 위하여 마우스의 복부에 10~300 mJ/㎠의 UVB를 조사하였다. UVB 조사를 위하여 F20T10 lamp(Sankyo, Japan)를 사용하였으며 UVB 방출량 측정은 UVB Solarmeter(Mat SCIENCE TECH)를 사용하였다.

UVB 조사 2시간 후에 피부 감작을 위하여 노출된 마우스의 복부에 항원으로서 1.5% 옥사졸론(Oxazolone, 4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one, Simga Chemicals, St. Louis, Mo, USA)을 용해시켜 마우스의 복부에 도포하고, 5일 후 아세톤 :올리브유(sigma chemical, St. Louis, MO, USA) (4:1)에 1% 옥사졸론을 용해시켜 마우스의 왼쪽 귀의 앞면과 뒷면에 각각 10㎕씩 도포하여 면역반응을 유도하였다. 24시간 후 마우스 왼쪽 귀의 부풀어 오른 두께를 Thick gauge를 이용하여 측정하였다. 마우스 왼쪽 귀에 1% 옥사졸론으로 면역하는 것을 3일 간격으로 3회 실시하였고, 그 측정 결과는 도 2에 도시되어 있으며, 하기 표 2에서 측정 결과를 나타내었다.

이때, 자외선을 조사하지 않은 대조군에서는 항원을 피부의 수지상세포가 포획하여 인접 림프절로 이동시키는데, 이곳에서 T-cell이 활성화되어 기억 T-cell이 생성되기 때문에 진피 내에 도달한다. 따라서 대조군에서는 동일한 항원에 재차 노출되면 진피 내에 있는 기억 T-cell에 항원이 제시되고 T-cell은 각종 사이토카인을 분비하여 염증 반응이 진행되어 귀가 부풀어 오른다. 이에 반하여 자외선을 조사하면 T-cell을 활성화시키는 피부 수지상세포가 손상을 받기 때문에 사이토카인에 의한 염증반응이 유도되지 않아 귀가 부풀어 오르는 접촉성 과민반응이 억제된다.

하기 표 2에서 알 수 있는 것처럼 대조군의 경우에는 지속적으로 귀가 부풀어 올랐으나, 자외선 조사량이 증가함에 따라 귀가 부풀어 오르는 접촉성 과민반응이 억제되었다. 이를 통하여 접촉성 과민반응의 억제 방지 정도를 측정하기 위한 자외선 조사량으로 접촉성 과민반응을 약 50% 억제하는 100 mJ/㎠가 결정되었다.

표 2. UVB 조사에 따른 마우스의 귀 두께 변화

UVB (mJ/㎠)	Days after UVB irradiation
	3	8	11	14
(-)	230.0±14.14	525.0±35.36	675.0±35.36	920.0±42.43
10	222.5±12.58	470.0±14.14	555.0±35.36	745.0±35.36
30	225.0±17.32	490.0±14.14	555.0±7.07	795.0±35.36
100	217.5±5.00	350.0±42.43	495.0±21.21	635.0±35.36
300	225.0±12.91	325.0±21.21	460.0±14.14	555.0±7.07

실험예 3 : 불가사리 추출물의 접촉성 과민반응 억제 방지 효과

본 실험예에서는 자외선 조사로 억제된 접촉성 과민반응에 대한 불가사리 추출물의 회복/방지 효과를 살펴보았다. 우선 상술한 실시예 1~4를 통하여 일정량의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물과 비교실시예를 통하여 방사선을 조사하지 않고 얻은 불가사리 추출물이 0.6% 포함된 크림을 UVB를 조사하기 24시간과 15분 전에 면봉을 이용하여 마우스 복부에 마우스 한 마리당 0.2g을 골고루 도포한 후, 상기 실험예 3과 동일한 절차에 따라 옥사졸론을 도포하고, 100 mJ/㎠의 UVB을 조사한 뒤, 일정 간격마다 마우스의 귀가 부풀어 오르는 정도를 측정하였다.

도 3a 내지 도 3e는 각각 방사선을 조사하지 않고 비교실시예 1에서 얻은 불가사리 추출물을 도포한 마우스, 실시예 1~4에 따라 각각 25KGy, 50KGy, 100KGy, 200KGy의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물을 도포한 마우스의 귀의 부풀어로는 정도를 측정한 그래프이고, 하기 표 3에서는 본 실험예에 따라 측정된 마우스의 귀의 부푼 정도 및 회복율을 나타내고 있다.

표 3. 자외선 조사로 유도되는 마우스의 귀 두께 회복(0.01㎜)

시료	UVB(mJ/㎠)	UVB 노출 경과일
		3	8	11	14
		(회복율(%) )
Control	(-)	221.7±11.7	480.0±20.0	566.7±32.1	736.7±66.6
	100	216.7±13.7	393.3±23.1	466.7±32.1	570.0±36.1
0KG	100	213.8±9.2	442.5±12.6 (56.8)	545.0±12.9 (78.3)	682.5±20.6 (67.5)
25KG	100	213.8±15.1	435.0±17.3 (48.1)	535.0±42.0 (68.3)	633.3±40.4 (40.0)
50KG	100	215.0±7.6	452.5±17.1 (68.3)	550.0±14.1 (83.3)	715.0±26.5 (87.0)
100KG	100	218.8±13.6	465.5±17.1 (83.3)	535.0±19.1 (68.3)	650.0±20.0 (48.0)
200KG	100	215.0±10.5	406.7±5.8 (15.5)	490.0±17.3 (23.3)	606.7±46.2 (22.0)

표 3에서 알 수 있는 것과 같이, 본 발명에 따라 방사선을 조사한 불가사리 추출물을 크림에 섞어 마우스의 복부에 도포하였을 경우, UVB만을 조사하여 접촉성 과민반응을 억제한 대조군에 비하여 접촉성 과민반응이 유의하게 회복되었다. 특히, 50KGy의 방사선을 조사한 마우스의 경우에는 귀가 부풀어 오르는 것이 UVB을 조사하지 않은 음성 대조군과 비슷한 정도로 귀가 부풀어 올랐으며, 100KGy의 방사선을 조사한 불가사리 추출물을 도포한 마우스의 귀는 자외선 노출 초기에는 크게 부풀어 올랐다.

한편, 상술한 실험예 1에서 방사선을 조사한 불가사리 추출물의 회수율이 방 사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물과 비교하여 최고 2.5배 정도 향상되었다(표 1 참조). 따라서 이와 같은 추출물의 전체 회수율을 고려해 볼 때, 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물에서는 자외선 노출로 야기되는 접촉성 과민반응을 억제할 수 있는 활성 성분이 방사선을 조사하지 않고 얻어지는 불가사리 추출물에 비하여 훨씬 많이 생성됨에 따라 방사선을 조사하여 얻어진 불가사리 추출물의 접촉성 과민반응 억제를 방지할 수 있는 효과가 큰 것으로 확인되었다.

실험예 4 : 세포계획사를 유도하는 UVB 강도 결정

본 실험예에서는 세포 주기 중 프로그래밍에 의한 세포계획사(apoptosis)로 간주되는 subG1기에 해당하는 세포수를 측정하였다.

우선, 마우스의 수지상세포를 배양하기 위하여 C57BL/6 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 1㎖ 주사기를 이용하여 대퇴골(femur)과 결골(tibia)안에 있는 골수를 분리하여 단일세포로 만들었다. 적혈구 용해 완충액(Tris-buffered ammonium chloride; 90㎖ of 0.16M NH₄Cl, 10㎖ of 0.17M Tris, PH 7.2)을 처리하여 적혈구를 제거한 후, washing 용액으로 1,200 rpm에서 5분 동안 3회 원심분리하여 충분히 세척하고, 혈구계산반을 이용하여 세포수를 계산하였다.

골수세포를 수지상세포로 분화, 유도하기 위하여 재조합 마우스 GM-CSF(R&D, Minneapolis, USA, 1000 U/㎖)와 IL-4(R&D, 1000 U/㎖)와, 세포 배양에 필요한 항생제(antibiotic-antimycotic, Hyclone, Grand Island, NY, USA), FBS(Hyclone), 2-mercaptoethanol(2-ME, Sigma chemical), sodium biocarbonate(NaHCO₃, Sigma chemical), ovalbumin(OVA, Sigma chemical), Motomycin C(MMC, Sigma chemical)가 첨가되어 있는 배지 RPMI 1640(Hyclone, FCS 10%)에 부유된 골수세포(1×10⁶ 개/5㎖/well)를 6 well culture plate에서 배양하였다. 배양 4일 후 새 배지 1㎖과 동량의 GM-CSF, IL-4를 첨가하고 2~3일간 더 배양한 후 culture plate를 5분간 shaking하여 가볍게 부착되어 있는 세포를 회수하여 실험에 사용하였다.

위와 같이 유도 배양하여 마우스 골수로부터 유도 배양된 수지상세포를 회수하여 PBS에 현탁한 후, 동량의 세포(3×10⁵)를 6 well culture plate에 넣고, 1200 rpm에서 3분(25℃)간 원심 침전하여 세포를 바닥에 가라앉힌 다음에 UVB 램프를 이용하여 24시간 동안 자외선을 조사하였다. 이때, 자외선의 강도는 UVB Solarmeter를 사용하여 1초에 1mJ/㎠의 에너지가 방출되도록 조절하였다. 본 실험예에서는 세포계획사를 유도하는 UVB의 강도를 확인할 수 있도록 자외선 강도를 달리하였다.

자외선을 조사한 뒤, 24 well culture plate에 24시간 더 배양한 뒤, 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 trypsin(Sigma chemical)을 처리하여 세포를 고정시킨 뒤, ribonuclease A(Sigma chemical)로 처리하였다. 이어서 propidium iodide(Sigma chemical, 416 ㎍/㎖)를 첨가하여 냉암소에서 2시간 염색한 뒤, 유세포 분석기(COULTER, Epics XL, USA)로 세포주기에 해당하는 세포수를 측정하였다. 본 실험예에 따라 자외선 강도에 따른 세포주기에 해당하는 세포 수 측정 결과는 도 4에 도시되어 있다.

도 4의 측정 결과에서 알 수 있는 것처럼 자외선 강도를 3, 10, 30, 100, 300 mJ/㎠로 증가시킴에 따라 세포내 DNA 함량이 세포휴지기인 G1보다 적은 상태로서 프로그래밍에 의한 세포 사멸, 즉 세포계획사를 나타내는 subG1기에 해당하는 세포수의 비율은 자외선에 노출시키지 않은 대조군의 13.8%와 비교하여 각각 16.3%, 31.7%, 52.2%, 48.9%, 53.9%로 증가하였다. 본 실험예를 통하여 자외선에 의한 세포계획사 억제를 확인하기 위한 자외선 강도로 30 mJ/㎠로 결정되었다.

실험예 5 : 불가사리 추출물 처리에 따른 세포주기 변화 측정

본 실험예에서는 본 발명에 따라 얻어진 방사선 조사 불가사리 추출물로 처리한 마우스에 일정강도의 자외선을 조사한 뒤의 마우스의 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수를 측정하였다. 우선 방사선을 조사한 불가사리 추출물 및 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물을 각각 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖, 1000㎍/㎖으로 농도를 달리하여 배양된 마우스 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 이어서 배양된 수지상세포를 수거하여 얻어진 5×10⁵개의 세포에 각각 30 mJ/㎠의 자외선을 조사한 후 24 well culture plate에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 실험예 4와 동일한 절차에 따라 세포수를 측정하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 불가사리 추출물을 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수를 또한 측정하였다.

도 5a는 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물을 농도를 달리하여 처리하고 자외선에 노출시킨 마우스의 수지상세포의 세포주기에 따른 세포수 측정 결과이고, 도 5b 내지 도 5e는 각각 25KGy, 50KGy, 100KGy, 200KGy의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물을 농도를 달리하여 처리하고 자외선에 노출시킨 마우스의 수지상세포의 세포주기에 따른 세포 수 측정 결과를 도시한 것이다.

한편 하기 표 4에서는 본 실험예를 통하여 불가사리 추출물로 처리한 마우스 수지상세포에 대한 subG1기 세포의 비율과 subG1기 억제 비율을 표시하고 있다. 표 4에 도시된 것과 같이 본 발명에 따라 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포는 자외선에 노출된 뒤에도 세포계획사 해당하는 subG1기의 세포수가 크게 감소하였고, 특히 세포에 처리한 불가사리 추출물의 농도에 의존하여 subG1기에 해당하는 세포 비율이 억제되었음을 확인하였다. 특히 50KGy 및 100KGy 강도의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물의 경우에는 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물에 비하여 subG1에 해당하는 세포수가 전체적으로 감소하였다. 특히 방사선을 조사한 경우에 불가사리 추출물의 회수율을 고려해 보면, 본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물은 자외선 조사로 인한 DNA 손상으로 발생하는 subG1 세포의 수가 크게 감소하는 것으로서, DNA 손상을 억제, 보호하는 효과가 있는 것으로 생각된다.

표 4. UVB에 유도되는 subG1 세포에 대한 불가사리 추출물의 억제

방사선 (KGray)	추출물 농도 (㎍/㎖)	UVB (mJ/㎠)	Cell population
			Sub G1	억제율(%)	전체 활성*
Control		-	9.9	0.0	-
		30	37.1	100.0	-
0KG	1	30	37.0	0.37	0.37
	10		36.7	1.47	1.47
	100		38.5	-5.15	-5.15
	1000		30.7	23.53	23.53
25KG	1	30	34.4	9.93	18.68
	10		35.6	5.51	10.36
	100		37.8	-2.57	-4.83
	1000		35.0	7.72	14.52
50KG	1	30	33.3	13.97	19.17
	10		34.9	8.09	11.10
	100		33.4	13.60	18.66
	1000		29.7	27.21	37.33
100KG	1	30	35.3	6.62	16.68
	10		34.2	10.66	26.86
	100		33.0	15.07	37.98
	1000		33.8	12.13	30.57
200KG	1	30	34.7	8.82	11.66
	10		35.1	7.35	9.72
	100		30.1	25.74	34.03
	1000		31.6	20.22	26.73

^*: 억제율 × 회수율(표 1 참조)

실험예 6 : 불가사리 추출물 처리에 따른 세포막 변화 측정

본 실험예에서는 불가사리 추출물로 처리한 마우스 수지상세포에 자외선을 조사하였을 경우에 세포막 변화의 억제 정도를 측정하였다.

본 발명의 실시예 1~4에서 일정 강도의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물과 방사선을 조사하지 않고 얻은 불가사리 추출물을 각각 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 100㎍/㎖, 1000㎍/㎖으로 농도를 달리하여 배양된 마우스 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양된 수지상세포를 수거하여 얻어진 5×10⁵개의 세포에 각각 30 mJ/㎠의 자외선을 조사한 후, 세포계획사(apoptosis)를 관찰하기 위하여 6시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에 배양하였다. 배양 후 회수한 수지상세포(5×10⁵개)의 세포막이 노출되는 phosphatidylserine의 양을 측정하기 위하여 phosphatidylserine에 특이적으로 결합하는 Annexin Ⅴ-FITC(PharMingen, SanDiego, USA)와 염색체에 특이적으로 결합하는 propidium iodide로 4℃, 어두운 곳에서 15분 동안 염색한 후, 유세포분석기(COULTER, Epics XL, USA)로 분석하였다.

세포가 자외선에 노출되면 세포계획사(apoptosis)가 유도되어 초기에는 세포막이 부분적으로 손상되어 세포막 중에서 세포질 쪽의 세포 내막에만 존재하는 phosphatidylserine 등이 세포의 외막으로 노출되는 초기 세포계획사(early apoptosis) 반응이 일어나고, 세포계획사가 계속 진행되면 세포막이 완전히 파괴되어 세포 외부의 물질이 자유롭게 세포 내로 유입되는 후기 세포계획사(late apoptosis) 반응이 일어난다. 본 실험예에서는 그 중에서 자외선 노출에 따른 수지상세포의 초기 세포계획사 반응의 억제 정도를 알아보기 위하여 phosphatidylserine에 특이적으로 결합하는 Annexin V-FITC를 사용하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 불가사리 추출물을 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 세포막 변화 정도를 또한 측정하였다.

도 6a는 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물을 농도를 달리하여 처리하 고 자외선에 노출시킨 마우스의 수지상세포의 세포막 변화 정도를 측정한 결과이고, 도 6b 내지 도 6e는 각각 25KGy, 50KGy, 100KGy, 200KGy의 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물을 농도를 달리하여 처리하고 자외선에 노출시킨 마우스의 수지상세포의 세포막 변화 정도를 측정한 결과를 도시한 것이다. 한편 하기 표 5에서는 본 실험예와 관련하여 수지상세포의 초기 세포계획사 비율과 억제 정도를 표시하고 있다.

표 5. 자외선으로 유도되는 세포막 변이에 대한 불가사리 추출물의 억제효과

방사선 (KGray)	농도 (μg/㎖)	UVB (mJ/㎠)	초기 세포계획사 (%)	억제율	전체활성*
Control		-	27.4	0.0	-
		30	40.1	100.0	-
0KG	1	30	37.9	17.32	17.32
	10		34.3	45.67	45.67
	100		33.9	48.82	48.82
	1000		26.1	110.24	110.24
25KG	1	30	41.1	-7.87	-14.80
	10		34.3	45.67	85.91
	100		32.6	59.06	111.09
	1000		25.6	114.17	214.75
50KG	1	30	40.4	-2.36	-3.24
	10		35.1	39.37	54.02
	100		34.1	47.24	64.81
	1000		25.7	113.39	155.57
100KG	1	30	38.8	10.24	25.80
	10		39.4	5.51	13.89
	100		36.0	32.28	81.35
	1000		27.3	110.79	279.19
200KG	1	30	32.1	62.99	83.27
	10		39.2	7.09	9.37
	100		35.4	37.01	48.93
	1000		32.8	57.48	75.99

^*: 억제율 × 회수율(표 1 참조)

표 5에서 알 수 있는 것과 같이 자외선을 조사하지 않은 마우스 수지상세포의 초기 세포계획사는 27.4%에 불과한 반면에 자외선을 조사한 마우스 수지상세포의 초기 세포계획사는 40.1%로 크게 증가하여, UVB에 의하여 수지상세포의 세포막이 손상되어 세포 내막의 phosphatidylserine이 외막으로 노출되는 세포계획사가 유도된다는 점을 확인하였다. 그런데, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물을 처리한 수지상세포에 자외선을 조사한 경우에는 세포계획사의 비율이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 드러났다. 특히, 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물을 1000 ㎍/㎖로 처리한 마우스의 수지상세포의 경우에는 초기 세포계획사가 크게 억제되는 것으로 확인되었다. 전체적인 초기 세포계획사 억제 정도를 고려해 볼 때 특히 방사선을 25KGy, 50KGy의 강도로 조사하여 얻은 불가사리 추출물의 경우에는 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물에 비하여 초기 세포계획사가 억제되는 것으로 확인되었다. 또한 방사선을 조사한 경우에 불가사리 추출물의 회수율을 고려해 보면, 본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물은 자외선에 의한 세포막의 변화를 억제, 감소시키는 효과가 크게 향상된 것임을 알 수 있다.

실험예 7 : 불가사리 추출물 처리에 따른 미토콘드리아막 전위차 변화 측정

본 실험예에서는 불가사리 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포에 자외선을 조사한 경우에 세포 내부의 미토콘드리아막의 전위차(Δψm) 변화를 측정하였다.

본 발명의 실시예 및 비교실시예를 통하여 얻은 불가사리 추출물 1000㎍/㎖을 각각 배양한 마우스의 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양된 수지 상세포를 수거하여 얻어진 1×10⁶개의 세포에 각각 30 mJ/㎠의 자외선을 조사한 후, 24 well plate에서 6시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에 배양하였다. 미토콘드리아막의 전위차 변화를 JC-1 assay kit(Eugene, OR, USA)를 이용하여 관찰하였다. 즉 수지상세포 (1×10⁶개)를 인산완충용액 1㎖에 현탁한 후, 50μM이 되도록 carbonyl cyanide-3-chlorophenyl hydrazone(CCCP, Eugene)를 첨가하여 37℃에서 5분 동안 처리하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 불가사리 추출물을 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 미토콘드리아막의 변화를 또한 측정하였다.

5,5'6,6'-tetrachloro-1,1'-3,3'-tetraethylbenaimidazolylcarbocyanine (JC-1, Eugene)의 최종 농도가 2μM이 되도록 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 15~30분 동안 반응시켰다. 그 다음에 이를 원심 침전하여 세포를 분리한 후, 인산완충용액에 현탁하여 유세포분석기로 분석하였다.

자외선과 같은 외부자극에 의하여 세포에 손상이 생기면 미토콘드리아막은 탈분극되어 세포계획사를 유도한다. 미토콘드리아막의 탈분극은 미토콘드리아로부터 pro-apoptotic 인자인 cytochrome c의 방출을 증가시키는데, 방출된 cytochrome c는 활성 인자 Apaf-1과 결합하여 세포계획사를 일으킨다. 이와 같은 미토콘드리아막의 탈분극으로 인한 세포계획사를 측정하기 위하여 cationic dye인 JC-1을 사용하였다. JC-1은 미토콘드리아막의 투과성이 높을 경우에는 적색 형광(590㎚)에서 나타나지만 막 투과성이 낮을 경우에는 녹색 형광(525㎚)에서 관찰된다. 즉, 자외선과 같은 자극에 의하여 미토콘드리아막의 탈분극이 일어나 막 투과성이 낮아지면 적색 형광/녹색 형광의 비율이 감소한다. 도 7은 본 실험예에 따라 미토콘드리아막의 탈분극으로 인한 막 투과성 저하를 알아보기 위하여 JC-1의 적색 형광과 녹색 형광의 발생 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 하기 표 6은 본 실험예에 따른 미토콘드리아막의 전위 변화 비율과 불가사리 추출물에 의한 억제율을 표시하고 있다.

표 6. 자외선에 의한 미토콘드리아막 전위 변화에 대한 불가사리 추출물의 억제

방사선 (KGray)	UVB (mJ/㎠)	Green fluorescence positive cells(%)	억제율	전체 활성*
Control	-	15.2	0.0	-
	30	43.4	100.0	-
0(1,000 ㎍/㎖)	30	17.8	90.8	90.8
25(1,000 ㎍/㎖)		18.8	87.2	164.0
50(1,000 ㎍/㎖)		23.4	70.9	97.3
100(1,000 ㎍/㎖)		24.1	68.4	172.4
200(1,000 ㎍/㎖)		21.0	79.4	105.0

^* : 억제율 × 회수 비율(표 1)

도 7 및 표 6에서 알 수 있는 것과 같이 자외선을 조사하지 않은 마우스 수지상세포에서 녹색 형광을 나타내는 세포는 15.2%에 불과하지만 UVB만을 조사한 대조군은 43.4%로 크게 증가하여 자외선에 의하여 미토콘드리아막의 투과성이 크게 감소한다는 점을 알 수 있다. 그런데, 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포에서는 미토콘드리아막의 탈분극으로 인한 막 준위 변 화가 크게 감소하여 세포계획사가 억제된다는 점을 알 수 있다. 특히, 방사선을 조사한 경우에 불가사리 추출물의 회수율을 고려해 보면, 본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물은 방사선을 조사하지 않은 불가사리 추출물과 비교하여 자외선에 의하여 야기되는 미토콘드리아막의 전위차 변화를 억제, 감소시키는 보호효과가 있는 것으로 나타났다.

실험예 8 : 불가사리 추출물 처리에 따른 염색체 응축 측정

본 실험예에서는 불가사리 추출물로 처리한 마우스 수지상세포에 자외선을 조사하였을 경우에 세포 내의 염색체 응축 정도의 변화를 측정하였다.

본 발명의 실시예 1~4 및 비교실시예를 통하여 얻은 불가사리 추출물 1000㎍/㎖을 배양한 마우스의 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양된 수지상세포를 수거하여 5×10⁵개에 30mJ/cm² 자외선을 조사한 후 6 well culture plate에서 6시간 동안 37℃, 5% CO² incubator에서 배양한 수지상세포(5×10⁵개)를 수거하여 인산완충용액에 현탁한 다음, Hoechst 33342(Eugene, OR, USA)를 10 ㎍이 되도록 처리하고 37℃, 5% CO² incubator에 15분 동안 반응시켰다. 인산완충용액을 이용하여 Hoechst 33342를 제거한 후, 광학현미경(Olympus BX50, Japan)에 장착된 SPOT digital camera(Nicon, JP)를 이용하여 핵 내 염색체의 응축 정도를 관찰하고 사진 촬영을 하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 불가사리 추출물을 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 염색체 응축 정도 를 또한 측정하였다. 자외선에 의하여 세포계획사가 유도되면 다른 세포내 변화가 일어나는데 우선 핵 내의 염색체가 응집하여 세포전체가 위축하면서 단편화하여 apoptotic body를 형성하게 된다. 이러한 현상은 염색체를 특이적으로 염색하는 시약인 Hoechst33342를 이용하면 세포를 염색하고 형광 현미경으로 관찰하면 육안으로 관찰할 수 있다.

도 8은 본 실험예에 따라 불가사리 추출물로 처리하거나 처리하지 않은 마우스의 수지상세포에 UVB를 조사한 뒤, 각 수지상세포에서의 DNA 응축 정도를 촬영한 사진이다. 도 8에서 알 수 있는 것처럼 UVB에 의하여 세포계획사가 유도된 실험군은 정상적인 세포의 형태를 보이는 대조군에 비하여 대부분의 세포가 apoptotic body를 형성하고 있다. 이에 반하여 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물로 처리한 마우스의 수지상세포에서는 UVB만 조사한 대조군과 비교하여 apoptotic body를 형성하는 세포의 수가 크게 감소하였고, 정상적인 형태의 세포의 수가 증가하였다. 따라서 본 발명에 따라 얻어진 불가사리 추출물로 처리한 경우 자외선에 의하여 염색체가 응축되는 등의 염색체 손상을 억제하여 세포를 보호하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

실험예 9 : 불가사리 추출물 처리에 따른 DNA 단편화 측정

본 실험예에서는 불가사리 추출물로 처리한 마우스 수지상세포에 자외선을 조사하였을 경우에 세포 내의 염색체 응축 정도의 변화를 측정하였다.

본 발명의 실시예 1~4 및 비교실시예를 통하여 얻은 불가사리 추출물 1000㎍/㎖을 배양한 마우스의 수지상세포에 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양된 수지상세포를 수거하여 2×10⁶개에 30 mJ/cm² 자외선을 조사한 후 6 well culture plate에서 24시간 동안 37℃, 5% CO² incubator에서 배양한 수지상세포를 회수하여 DNA ladder를 확인하였다. 즉, UVB 조사 후 24시간 배양한 세포를 회수하여 원심 침전한 후, NET Buffer(NaCl 0.1M, TrisHCl 10mM, EDTA 1M), proteinase K(100㎕/㎖)와 SDS(20%)를 첨가하여 55℃에서 4시간 동안 lysis시킨 다음, phenol, chloroform, isoamylalcohol을 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA는 에탄올을 이용하여 침전시켰고 TE Buffer(Tris 10mM, EDTA 1mM)에 녹여 RNase(50㎍/㎖)을 처리한 후, ethidium bromide가 첨가된 2% agarose gel에서 전기영동하여 UV로 확인하고 사진 촬영을 하였다. 비교를 위하여 자외선에 노출시키지 않은 수지상세포와 불가사리 추출물을 처리하지 않고 자외선만을 노출시킨 수지상세포의 DNA 단편화 정도를 또한 측정하였다.

세포계획사로 죽어가는 세포 내에서는 DNA의 단편화, 즉 DNA 단위체인 뉴클레오좀(nucleosome) 사이의 DNA가 endonuclease에 의해 무작위적으로 절단되는 현상이 일어나는데, 이 때 DNA를 추출하여 전기영동을 하게 되면 약 200염기쌍(base pair) 간격으로 DNA 절편이 나타나 사다리모양이 나타낸다(DNA ladder). 즉 자외선에 의한 endonuclease 활성을 DNA 절편 형성 유무로 확인할 수 있다.

도 9는 본 실험예에 따라 불가사리 추출물로 처리하거나 처리하지 않은 마우스 수지상세포에 대한 DNA 단편 형성 정도를 측정한 사진이다. 도시된 것과 같이 UVB를 조사하지 않은 무처리 대조군에 비해 UVB 만을 조사한 실험군의 경우에 DNA가 200염기쌍 단위로 잘려 형성된 laddering이 확연히 증가하는데 반해, 불가사리 추출물을 처리한 후 UVB를 조사했을 때 형성되는 DNA laddering이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 결국, 본 발명에 따른 불가사리 추출물을 세포에 처리하였을 때 자외선에 의한 endonuclease 활성의 증가가 감소하는 것으로 나타나 DNA 절편 현상을 보호하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 기술하였으나, 이는 어디까지나 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고해 낼 수 있을 것이다. 그러나 그와 같은 변형과 변경은 본 발명의 기본정신을 훼손하지 아니하는 범위 내에서 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 후술하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

본 발명에 따라 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물에는 특히 자외선의 노출로 인하여 야기될 수 있는 각종 세포 변이를 억제 또는 방지할 수 있음을 확인하였다.

특히, 본 발명에 따르면 방사선을 조사하여 얻은 불가사리 추출물에는 접촉성 과민반응의 억제를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 세포계획사, DNA 변이 등을 방지할 수 있고, 수율이 크게 개선되었다.

따라서, 본 발명은 현재 대부분 전량 폐기되고 있는 불가사리로부터 세포 변이를 억제, 방지 기능을 갖는 추출물을 대량으로 재활용할 수 있도록 경제성을 재고함으로써, 관련 업계에서 용이하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

1. 불가사리 분말에 방사선을 조사하여 얻어지는 불가사리 추출물을 유효 성분으로 함유하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 상기 불가사리 분말에 10 ~ 300 KGy 강도의 방사선을 조사하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 상기 방사선이 조사된 불가사리 분말에 증류수를 혼합하여 진탕 배양하고, 진탕 배양된 불가사리 분말을 원심분리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 상기 원심분리에 의하여 얻어진 상층액을 유기 용매로 처리하여 침전시킨 뒤, 침전물을 정제하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 상기 침전물을 투석하여 회수된 추출물을 다시 원심분리하여 상층액을 회수하고, 회수된 상층액을 여과시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
6. 제 4항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 자외선에 의한 세포계획사를 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불가사리 추출물은 자외선에 의한 세포막 파괴 방지, 미토콘드리아막 파괴 방지, 염색체 변이 방지 또는 DNA 단편화 방지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.
9. 삭제
10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불가사리는 한국산 별불가사리(Asterina pectinifera)인 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 접촉성 과민반응 억제를 방지하는 약학적 조성물.

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