KR100781679B1 - 프로브매체 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
프로브매체를 기재상에 스폿팅한 때에, 프로브를 효율좋고 안정적으로 기재상에 고정시킬 수 있다. 이 프로브매체는, 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브와, 유기용매를 함유하는 매체와, 상기 프로브를 상기 유기용매에 가용화시키는 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브를 포함하고 있는 프로브매체 및 해당 프로브매체의 제조방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 프로브를 기재상에 효과적으로 고정하는 데 유용한 프로브매체, 해당 프로브매체의 제조방법 및 해당 프로브매체를 이용한 프로브의 고정방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 프로브를 기재(혹은 기판)상에 고정함으로써 얻어진 프로브고정기재, 그리고, 해당 프로브고정기재를 이용해서 표적물질을 검출하는 검출소자 및 검출방법에 관한 것이다.
유전자공학 및 분자생물학을 포함한 생물공학의 분야에서의 최근의 진보에 의해, 감염증, 암, 유전자질환 등에 대해서 DNA, RNA 수준에서의 진단이 가능하게 되었고, DNA나 RNA 등의 핵산에 의한 진단에 사용되는 도구(tool)의 하나로서, DNA칩 및 DNA어레이가 주목되고 있다. DNA칩 및 DNA어레이를 포함하는 진단도구에 있어서, 핵산 등의 프로브를 기재상에 고정해놓고, 해당 프로브를 표적물질과 하이브리다이즈시킴으로써 이들 표적물질의 검출을 행한다. 이 DNA, RNA, 핵산 등의 표적물질에 특이적으로 결합가능한 프로브는, 물에 용해될 수 있으므로, 물에 용이하게 용해가능하지만, 에틸알콜, 이소프로필알콜, 이소아밀알콜, 디프로필렌글리콜, 클로로포름 등의 유기용매에는 거의 용해되지 않는 것이 알려져 있다.
스폿팅법(spotting method) 등에 의해 미리 준비된 DNA칩이나 DNA어레이 등의 프로브를 고정한 기재를 작성할 경우, 종래, 프로브를 기재상에 고정할 때에는 프로브를, 물 혹은 물과 pH조정용 물질과의 혼합물을 함유하는 수용액에 용해시킴으로써 프로브매체를 제작하고, 이 프로브매체를 기재와 접촉시킴으로써 프로브를 기재상에 고정하고 있었다. 구체적으로는, 예를 들면, 일본국 공개특허 평08-23975호 공보에는, DNA를 물에 용해시킨 프로브수용액을 조제한 후에, 이와 같이 해서 조제한 프로브매체를 표면처리한 웰플레이트(well-plate)중에 분배해서 적하함으로써 프로브를 기재상에 고정하는 방법이 기재되어 있다. 또, 일본국 공개특허 평05-192198호 공보에는, DNA를 10mM 트리스-HCl(pH 7.6)/1mM EDTA용액중에 용해시켜서, 이 완충액중의 DNA에 4배용적의 H2O와 5배용적의 고정화 완충액(1.5M NaCl, 0.3M 트리스-HCl(pH 8.0) 및 0.3M MgCl2)을 가해서 이들을 모두 혼합함으로써, 프로브매체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 일본국 공개특허 제 2000-146971호 공보에는, 5'-말단에 올리고뉴클레오타이드비오틴이 도입된 수용액을 준비하여 이소시아네이트화 슬라이드글래스상에 점착(dot)시키고, 배양기에서 37℃, 15분간 고정화시키는 방법이 기재되어 있다. 또, 일본국 특허등록 제 2794728호 공보에 있어서는, 1본쇄(本鎖) DNA를 TE완충액(10mM 트리스-HCl(pH 7.5)/1mM EDTA)으로 단계적으로 희석해서 프로브매체를 제조하고, 이와 같이 제조된 프로브매체를 니트로셀룰로스막에 점착시키고 나서, 공기건조 및 열건조시켜 기재상에 DNA를 고정하고 있다.
그러나, 종래 이용되고 있던 각각의 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브를 포함하는 프로브매체중에, 프로브를 기재상에 고정하기 위한 매체로서, 프로브를 해당 프로브가 불용성인 유기용매에 용해시킨 프로브매체는 없고, 또, 이들 중, 프로브가 불용성인 유기용매에 해당 프로브를 용해시킬 수 있는 물질을 함유하는 프로브매체도 없었다. 종래 이용되고 있던 프로브매체는, 각각 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브를 물, 혹은 물과 pH조정용 물질과 흡착을 저감시키기 위한 물질을 함유한 수용액에 용해시킨 것이었다. 또한, 프로브매체를 기재상에 스폿팅 등의 방법에 의해 점착시키는 데 적합하도록 글리콜계 용매 또는 알콜계 용매를 소량 첨가하는 것은 알려져 있으나, DNA, RNA 등의 핵산과 같은 프로브를 프로브불용성 유기용매중에 용해시켜 제조한 프로브매체는 없었다. 따라서, 유기용매중에 프로브가 불용성이기 때문에, 프로브매체를 기재상에 바람직하게 점착시키는 것이 적합하다고 해도, 물을 함유하지 않는 유기용매만의 프로브매체를 실현하는 것은 곤란하였다.
또, DNA나 RNA 등의 핵산과 같은 프로브를 유기용매중에 용해시키는 것은, 시료로부터 프로브를 추출하는 것이 공지되어 있었다. 그러나, 프로브를 기재상에 고정하는데 사용하는 프로브매체로서는, 프로브를 유기용매중에 용해시키는 프로브매체는 알려져 있지 않았다. 또한, DNA나 RNA 등의 핵산과 같은 프로브를 핵 산결합성 담체에 결합시키기 위해서 계면활성제를 함유하는 용액중에 현탁시킨 담체를 이용해서 핵산을 결합시켜 추출하는 것은 알려져 있었으나, 계면활성제를 함유하는 용액중에 프로브를 용해시킨 후, 얻어진 용액을 프로브매체로서 이용하는 경우는 없었다.
본 발명의 제 1목적은, 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브와, 유기용매와, 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 포함하는 프로브매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2목적은, 유기용매중에 프로브를 가용화시키는 물질에 대해서 해당 프로브를 용해시키는 용매를 작용시켜 해당 용매로부터 프로브를 분리하고, 해당 프로브에 대해서 상기 유기용매를 첨가해서 그 안에 해당 프로브를 용해시키는 것을 특징으로 하는, 용매중에 프로브를 용해시키는 데 있다.
본 발명의 제 3목적은, 프로브의 석출과 재용해로부터 유기용매중에 프로브를 가용화시키는 물질의 양을 확인하고, 그 물질의 양을 준비해서 해당 프로브를 석출시킴으로써, 유기용매중에 프로브를 효율적으로 용해시키는 데 있다.
상기 과제는, 후술하는 본 발명에 의해 해결될 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 구성을 포함한다.
[1] 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브와; 유기용매를 함유하는 매체와; 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브매체. 상기 프로브는 핵산프로브인 것이 바람직하다. 상기 유기용매는, 상기 프로브가 불용성인 용매인 것이 바람직하다. 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질이, 양친매성 물질인 것이 바람직하다. 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질은, n-헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, n-헥사데실 트리메틸 암모늄 클로라이드 및 세틸피리디늄 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 물질, 또는 이들 군으로부터 선택된 적어도 1종의 물질을 함유하는 혼합물인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 프로브매체는, 프로브를 기재상에 고정시키는 물질을 또 구비한다. 상기 프로브를 기재상에 고정시키는 물질은, 실란커플링제가 바람직하다. 바람직하게는, 상기 프로브매체는, 상기 프로브가 용해될 수 있는(즉, 가용성인) 용매를 또 구비한다. 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은, 상기 프로브매체의 백탁도를 관찰할 수 있는 범위내에서 조정되는 것이 바람직하다.
[2] 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브를 포함하는 프로브매체의 제조방법에 있어서, 프로브가 용해될 수 있는 용매에 해당 프로브를 용해시키는 공정과; 상기 용매에 대해서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 작용시킴으로써 해당 용매로부터 프로브를 분리하는 공정과; 상기 유기용매를 프로브에 첨가함으로써 해당 유기용매중에 상기 프로브를 용해시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브매체의 제조방법. 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은, 프로브의 길이와 프로브의 몰수와의 곱에 의거해서 정하는 것이 바람직하다. 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은, 상기 용매로부터 분리된 프로브의 양에 의거해서 정하는 것이 바람직하다.
[3] 프로브매체를 스폿팅에 의해 기재상에 제공함으로써 프로브를 기재상에 고정시키는 방법.
[4] 상기 프로브의 고정 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 검출소자.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 상세히 설명한다.
본 발명에 의한 프로브매체는, 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브와, 유기용매를 함유하는 매체와, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 포함한다. 또, 본 발명의 프로브매체는, 프로브 가용성 용매에 해당 프로브를 용해시키는 공정과, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질에 프로브를 작용시킴으로써 해당 용매로부터 프로브를 분리하는 공정과, 프로브가 불용성인 유기용매를 상기 프로브에 첨가함으로써 해당 유기용매에 상기 프로브를 용해시키는 공정에 의해 제조된다. 본 발명에 의하면, 상기 공정을 포함하는 프로브매체의 제조방법이 제공된다. 또한, 본 발명에 의하면, 프로브를 기재상에 고정시키는 방법은, 상기 프로브매체를 기재상에 부착시키는 공정을 지닌다.
프로브로서는, 1본쇄 핵산 프로브, 1본쇄 DNA 프로브, 1본쇄 RNA프로브, 1본쇄 PNA프로브, 단당쇄 프로브 등을 들 수 있다. 프로브매체는, 해당 프로브매체중에서의 프로브의 안정성을 고려해서, 예를 들면, 2mer ~ 500mer(즉, 2량체 내지 500량체), 특히 2mer ~ 80mer의 프로브의 양이, 0.05 ~ 500μmol/리터(이하, "리터"는 "ℓ"로 약칭함), 특히 0.5 ~ 50μmol/ℓ의 범위로 되도록 조제한다.
이들 프로브는 기재에의 결합을 위해 반응부위를 지니는 것이어도 되고, 이 반응부위로서는, 작용기, 비오틴 등을 들 수 있다. 이 반응부위는 적당한 길이의 링커의 일부로서 제공된 것이어도 된다. 예를 들면, 작용기로서는, 아미노(NH2)기, 카르보닐(COOH)기, 메르캅토(SH)기, 수산(OH)기 등을 들 수 있다. 특히, 프로브작용기로서는, 프로브작용기합성의 용이성을 고려하면 아미노기가 바람직하고, 프로브작용기의 반응성을 고려하면 메르캅토기가 바람직하다.
프로브가 용해될 수 있는 용매(프로브 가용성 용매)로서는, 물, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 2종이상의 용매를 조합해서 이용해도 된다. 물은, 인산 등의 산이나 염화나트륨 등의 염이 첨가된 프로브용해 용액중의 하나이어도 된다.
프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서는, 양친매성인 것이 바람직하며, 특히, 계면활성제, 미셀촉매를 형성가능한 계면활성제 등을 들 수 있다. 이들중, 특히 바람직한 계면활성제로서는, 세틸피리디늄 클로라이드, 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드, 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드 등을 들 수 있다. 프로브의 안정성 및 프로브의 유기용매에의 용해성을 고려해서, 프로브매체중의 계면활성제의 함량은, 예를 들면, 0.2μmol/ℓ이상, 바람직하게는, 1μmol/ℓ이상이지만 400,000μmol/ℓ이하, 바람직하게는, 40,000μmol/ℓ이하로 되도록 조정한다. 프로브매체에 작용하는 계면활성제의 양은, 프로브의 길이와 프로브의 몰수와의 곱에 의거해서 조정한다. 또, 프로브매체에 작용하는 계면활성제의 양은, 용매로부터 분리된 프로브의 양에 의거해서 조정한다. 또한, 프로브매체에 작용하는 계면활 성제의 양은, 프로브의 석출 혹은 재용해를 검사함으로써 확인한 후, 프로브가 석출될 수 있도록 조정한다. 또한, 본 발명의 발명자들은, 계면활성제의 함량은 프로브매체가 백탁의 현탁을 일으키는 범위내에서 조정하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다.
프로브불용성 유기용매로서는, 알콜류나 케톤류뿐만 아니라, 기재에 프로브를 고정시킬 수 있는 것(예를 들면, 실란커플링제) 등의 기타 많은 유기용매를 들 수 있다. 또한, 프로브매체중의 유기용매는, 1종이어도 되고, 2종이상의 혼합물이어도 된다. 다른 물질의 개입없이, 예를 들면, 프로브불용성 유기용매중에서 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 함유시키는 일없이, 기재에 대해서 프로브가 결합될 경우, 프로브불용성 유기용매는, 프로브와 기재에 대한 반응부위를 지니지 않는 알콜류 등의 용매중의 하나인 것이 바람직하다. 또는, 프로브불용성 유기용매는, 프로브와 기재간의 반응을 통해 기재에 프로브를 고정시킬 수 있는 유기용매를 포함해도 된다. 특히, 프로브가 기재에 대해서 결합되지 않거나 기재에 대해서 거의 결합되지 않을 경우, 프로브불용성 유기용매는 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 함유하는 것이 바람직하다. 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매로서는, 프로브와 기재와의 반응부위를 지닌 용매로서 실란커플링제 등을 들 수 있다. 각종 실란커플링제가 공지되어 있으나, 그중, 바람직하게는, 에폭시 실란커플링제, 이소시아네이트 실란커플링제, 메르캅토 실란커플링제, 클로로프로필 실란커플링제, 아미노 실란커플링제 등을 들 수 있다. 기재에 대한 프로브의 고정성을 고려해서, 매체중의 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매의 함량은, 예를 들면, 프로브매체중에 0.05 내지 50,000μmol/ℓ, 특히 10 내지 500μmol/ℓ로 조정하는 것이 바람직하다. 프로브작용기와 유기용매간의 반응은, 바람직하게는, 그들의 화학반응의 결과로서 작용기간의 공유결합이다. 화학반응에 있어서, 프로브의 작용기가 아미노(NH2)기인 경우, 바람직한 유기용매로서는, 에폭시 실란커플링제, 이소시아네이트 실란커플링제, 메르캅토 실란커플링제, 클로로프로필 실란커플링제 등을 들 수 있다. 프로브의 작용기가 카르보닐(COOH)기인 경우, 바람직한 유기용매로서는, 아미노 실란커플링제, 메르캅토 실란커플링제 등을 들 수 있다. 프로브의 작용기가 메르캅토(SH)기인 경우, 바람직한 유기용매로서는, 에폭시 실란커플링제, 이소시아네이트 실란커플링제, 비닐 실란커플링제 등을 들 수 있다. 알콜류로서는, 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올 등을 들 수 있다. 또, 케톤류로서는, 아세톤, 메틸에틸케톤 등을 들 수 있다. 아미노 실란커플링제로서는, γ-아미노프로필 트리메톡시실란, N-β(아미노에틸)γ-아미노프로필 트리메톡시실란 등을 들 수 있다. 에폭시 실란커플링제로서는, γ-글리시독시프로필 트리메톡시실란, γ-글리시독시프로필 트리에톡시실란 등을 들 수 있다. 이소시아네이트 실란커플링제로서는, γ-이소시아네이트 프로필트리에톡시실란, γ-이소시아네이트 프로필트리메톡시실란 등을 들 수 있다. 메르캅토 실란커플링제로서는, γ-메르캅토프로필 트리메톡시실란 등을 들 수 있다. 클로로프로필 실란커플링제로서는, γ-클로로프로필 트리메톡시실란 등을 들 수 있다. 비닐 실란커플링제로서는, 비닐트리메톡시실란 등을 들 수 있다. 프로브불용성 유기용매는, 이들 유기용매의 혼합용매이어도 된다. 프로브불용성 유기용매는, 바람직하게는, 프로브, 프로브가용성 용매, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질 및, 프로브매체를 제조할 때 2상이상으로의 분리가 일어나지 않도록 하는 프로브불용성 유기용매를 혼합함으로써 제조된 유기용매, 또는 이들 유기용매의 혼합용매가 바람직하다.
또, 프로브매체에는, 필요에 따라 수용성 고분자재료를 혼합해도 된다. 수용성 고분자재료로서는, 폴리비닐알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 파오겐, 카르복시메틸셀룰로스(CMC), 하이드록시에틸셀룰로스(HEC), 덱스트란, 풀루란 등을 들 수 있다. 바람직한 수용성 고분자재료로서는, 폴리비닐알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등의 통상 이용되는 것을 들 수 있다. 이들 고분자재료는, 단독으로 혹은 필요에 따라 서로 조합해서 이용해도 된다.
수용성 고분자재료를 매체중에 혼합하는 바람직한 방법으로서는, 미리 수용성 고분자재료를 완전히 용해시킨 소정의 농도의 용액을 조제하고, 얻어진 고분자재료용액이 매체중에서 소정의 농도로 되도록 해당 고분자재료용액을 칭량하고, 그 칭량된 고분자재료용액을 매체중에 혼합하는 공정을 포함한다. 고분자재료용액의 구체예로서는, 적당량의 폴리비닐알콜분말을 칭량해서 해당 분말을 순수중에 0.5 내지 5질량% 농도로 되도록 첨가한 후, 가열하에 해당 분말을 수중에 용해시킴으로써 얻어진 것을 들 수 있다. 바람직하게는, 얻어진 고분자재료수용액은, 프로브매체중의 함량이 0.01 내지 1질량%가 되도록 프로브매체중에 혼합한다.
프로브매체의 제조에는 수개의 수순이 있다.
프로브불용성 유기용매가 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유하고 있는지의 여부에 따라 상이한 수순을 선택한다.
프로브불용성 유기용매가 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유할 경우에는, 다음과 같은 제 1방법을 이용할 수 있다. 먼저, 프로브를 소량의 프로브가용성 용매와 혼합하여 프로브를 해당 용매중에 용해시킨다. 이어서, 상기 프로브가 용해된 용매에, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 첨가한다. 상기 물질의 첨가방법으로서는, 상기 물질을 프로브가 용해된 용매에 혼합하는 방법, 프로브가용성 용매에 상기 물질을 용해시켜 소정의 농도를 지니도록 한 후 혼합하는 방법, 프로브불용성 유기용매에 상기 물질을 용해시켜 소정의 농도를 지니도록 한 후 혼합하는 방법을 들 수 있다. 이들중, 혼합의 효율성의 관점에서 프로브가용성 용매중에 상기 물질을 용해시킨 후 혼합하는 방법이 바람직하다. 프로브가용성 용매에 있어서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 농도는, 프로브를 유기용매에 효율적으로 용해시키는 관점에서 가능한 한 높은 것이 바람직하다. 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 함유하는 용액을, 프로브가 용해된 용매에 적하해서 함께 혼합한다. 상기 물질의 적하량은, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 몰수가 프로브의 몰수와 프로브의 사슬길이와의 곱을 0.2 내지 4배, 바람직하게는, 0.5 내지 3배한 결과에 대응하도록 적절하게 설정한다. 프로브는, 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 프로브가 용해된 용매에 첨가함으로써 상기 용매로부터 분리할 수 있다. 또한, 분리된 프로브는, 원심분리에 의해 침전물이 모인 것이어도 된다. 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매는, 분리된 프로브를 함유하는 용매에 적하해서 혼합한다. 상기 유기용매의 혼합량은, 프 로브작용기 또는 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매에 그 양이 다르지만, 프로브의 몰수보다 0.5 내지 500몰배, 바람직하게는, 1.0 내지 50몰배 큰 몰수를 지니도록 적절하게 조정한다. 또, 기재상에의 프로브의 고정성을 고려해서, 프로브매체중에의 그의 함량은, 예를 들면, 바람직하게는, 0.05 내지 50,000μmol/ℓ, 보다 바람직하게는, 10 내지 500μmol/ℓ로 조정한다. 혼합방법은, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 첨가에 의해 분리된 프로브와 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 혼합하는 방법인 한 특히 제한되지 않는다. 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매의 비중이 프로브가용성 용매의 비중보다도 높으면, 분리·석출된 형태의 프로브를 함유하는 용매에 프로브고정용 유기용매를 서서히 적하시켜, 얻어진 혼합물을 원심분리해서 침강시킴으로써 효과적인 반응을 얻을 수 있다. 필요한 경우, 가열해도 된다. 가열할 때, 온도는 40 내지 80℃로 승온시켜도 된다. 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매의 비중이 프로브가용성 용매의 비중보다도 작을 경우, 프로브는, 용매로부터 충분히 분리해서 용기에 석출시켜 그 바닥부분에 프로브를 고정시킨 후, 프로브함유 용매에 프로브고정용 유기용매를 서서히 적하시킨다. 이어서, 용기를 밀봉한 후 기울여 놓거나, 그 내용물을 교반해서 서로 반응시킨다. 비중이 큰 경우와 마찬가지로, 필요한 경우 가열해도 된다. 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매와 혼합한 후, 얻어진 혼합물을 단상(單相)프로브매체로서 조제하는 것이 바람직할 경우, 유기용매의 첨가는, 그러한 단상을 실현하는 것이 가능하다. 예를 들면, 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매가 이소시아네이트 실란커플링제이고, 프로브가용성 용매가 물인 경우, 2-프로판올이 나 디프로필렌글리콜의 첨가에 의해 단상을 얻을 수 있다. 프로브를 기재상에 고정하는 데 어려움이 발견되지 않는 한, 프로브매체를 처리하는 관점에서 단상이 바람직하다. 이러한 유기용매의 첨가량은, 특히 제한되지는 않지만, 단상의 형성이 가능한 한, 프로브의 소정의 농도를 설정하여 프로브를 기재상에 고정하는 데 적합한 범위내인 것이 바람직하다. 또, 필요한 경우, 수용성 고분자와 물을 혼합시켜도 된다. 수용성 고분자와 물을 혼합하는 방법으로서는, 수용성 고분자의 수용액을 준비한 후, 소정량이 되도록 적하하여 혼합하는 것이 바람직하다.
제 2방법으로서는, 이하의 방법을 이용할 수 있다. 먼저, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 프로브가용성 용매중에 용해시켜 제조한 용액을 프로브함유용기내에 적하해서 혼합한다. 이어서, 프로브를 유기용매중에 용해시키면서 프로브가용성 매체에는 불용화시킨다. 그 결과, 프로브가 석출된다. 다음에, 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 용기내에 적하한 후 충분히 혼합한다. 프로브와 해당 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매간의 충분한 결합을 위해, 혼합시간과 혼합온도를 조정하는 것이 바람직하다. 유기용매의 혼합, 수용성 고분자의 혼합 및 물의 혼합은, 제 1방법의 것과 마찬가지의 절차로 행해도 된다.
제 3방법은, 프로브와 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 미리 혼합해 놓는 것이다. 프로브를 소량의 프로브가용성 용매에 용해시킨 후, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 프로브가용성 용매중에 용해시킴으로써 제조한 용액을, 프로브가 용해된 용매중에 적하해서 혼합한다. 상기 프로브가 불용화되어 침강된 것을 확인한 후, 과잉의 용매가 제거될 때까지 혼합물을 건조시킨다. 그 결과, 용기중의 잔류물은, 프로브와, 해당 프로브를 유기용매중에 가용화시키는 물질과의 혼합생성물이다. 이 잔류물은 어떠한 유기용매에도 용해될 수 있으므로, 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매에 해당 프로브를 적하, 혼합시킨다. 프로브와 해당 프로브를 기재상에 고정시키는 물질이 충분히 결합되도록, 혼합시간과 혼합온도를 조정하는 것이 바람직하다. 유기용매의 혼합, 수용성 고분자의 혼합 및 물의 혼합은, 제 1방법의 것과 마찬가지의 절차로 행해도 된다. 이 방법에 이용되는 유기용매에 프로브를 가용화시키는 물질과 프로브를 혼합해서 제조한 매체는, 프로브고정화 시약으로서 제공하는 것이 가능하다.
프로브불용성 유기용매가 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 함유하고 있지 않을 경우에는, 제 1방법은 이하의 공정을 취해도 된다. 먼저, 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 함유하는 경우와 마찬가지로, 프로브, 프로브가용성 용매, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 함께 혼합하고, 해당 용매로부터 프로브를 분리해낸다. 이어서, 분리된 프로브를 함유하는 용매에 프로브불용성 유기용매를 적하, 혼합한다. 상기 분리된 프로브를 상기 프로브불용성 유기용매에 용해시켜 유기용매 및 프로브가용성 매체로 이루어진 혼합매체로서 프로브매체를 제공한다. 유기용매 및 프로브가용성 매체로 이루어진 혼합매체가 단상으로 형성되어 있지 않은 경우, 해당 혼합매체에 추가의 유기용매를 혼합해서 상기 프로브매체를 단상매체로 변환시킨다. 프로브를 기재상에 고정시키는 데 문제가 없는 한, 프로브매체의 처리의 관점에서 단상 프로브매체가 바람직하다. 또, 필요한 경우, 수용성 고분자와 물을 혼합해도 된다. 수용성 고분자와 물을 혼합하는 방 법으로서는, 수용성 고분자의 수용액을 조제한 후, 소정의 양에 이르도록 적하, 혼합하는 것이 바람직하다.
제 2방법으로서는 이하의 방법을 이용할 수 있다. 먼저, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 프로브가용성 용매에 용해시켜 제조한 용액을 프로브함유용기에 적하하고 이들을 혼합한다. 다음에, 프로브를 유기용매에 용해시킨다. 그 결과, 프로브가 침강된다. 이어서, 유기용매를 적하한 후, 혼합해서 프로브를 용해시킨다. 유기용매는 제 1방법에서처럼 혼합해도 된다. 수용성 고분자의 혼합 및 물의 혼합은 제 1방법의 경우와 마찬가지로 행해도 된다.
제 3방법은, 프로브와 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 미리 혼합하는 것이다. 프로브를 소정량의 프로브가용성 용매에 용해시킨 후, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 상기 프로브가용성 용매에 용해시켜 조제한 수용액을 적하해서 혼합한다. 프로브가 불용화해서 침강한 것을 확인한 후, 혼합물을 건조해서 과잉의 용매를 제거한다. 그 결과, 용기속의 잔류물은, 프로브와, 해당 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 혼합한 생성물이다. 상기 잔류물은 유기용매에 용해될 수 있으므로, 프로브를 기재상에 고정시키는 유기용매를 적하, 혼합해서 프로브를 용해시킨다. 유기용매의 혼합을 위해서, 제 1방법과 마찬가지의 수순을 행해도 된다. 또, 수용성 고분자의 혼합 및 물의 혼합은 제 1방법의 경우와 마찬가지로 행해도 된다.
이와 같이 해서 얻어진 프로브매체는, 표적물질을 검출하기 위한 고정화프로브의 제조에 이용되는 프로브매체로서 적합하다.
얻어진 프로브매체를 기재상에 스폿팅함으로써 프로브고정기재를 제작하는 것이 가능하다. 프로브를 고정하기 위한 기재로서는, 특히 제약되는 것은 아니나, 표적물질의 검출이나 그의 범용성을 고려해서 유리, 석영기판재료 혹은 수지기판, 플라스틱기판 또는 수지필름이 바람직하다. 바람직한 재료로서는, 1인치×3인치 크기의 슬라이드글래스가 적합하다. 프로브고정의 고정특성 등을 고려하면, 프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유할 경우에는, 유리재질중에 알칼리성분 등이 함유되지 않은 무알칼리유리재료로 이루어진 슬라이드글래스기재, 또는, 석영유리재료, 실리카코트유리재료 혹은 실라카코트수지재료로 이루어진 기재가 바람직하다. 프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유하지 않을 경우에는, 유리기판 혹은 수지기판의 표면상에 표면처리를 실시한 재료가 바람직하다. 표면처리로서는, 프로브가 기재상에 고정되기 쉽게 하는 것이 바람직하고, 특히, 커플링제 등에 의해 기재표면상에 프로브와 공유결합을 형성하는 작용기를 형성하는 것이 바람직하다.
또, 표적물질의 검출방법에 따라서는 기판형상 등의 기재의 형상이 제약되는 것은 아니지만, 검출방법 및 장치 등의 범용성으로부터 기재는 판형상인 것이 바람직하다. 또, 기재는 표면의 평활성이 높은 것이 바람직하다.
또한, 프로브를 고정시키는 물질로서는, 프로브를 균일하고 확실하게 고정하기 위해 청정면을 지니는 것이 바람직하다. 프로브를 고정하기 전에 미리 기재를 세정에 의해 충분히 청정면을 확보하는 것이 바람직하다. 기재를 청정화하는 방법으로서는, 많은 방법이 공지되어 있으며, 예를 들면, 물, 약물용액, 플라즈마, UV오존, 에어블로잉(air-blowing)에 의해 기재를 청정화하는 방법을 들 수 있다. 따라서, 이들 세정방법중 하나를 이용해서, 적용되는 기재의 종류에 따라 세정방법, 세정조건 등을 변경하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유할 경우에는, 약물용액을 이용해서 기재표면을 세정하는 것이 적당하다. 예를 들면, 소정 농도의 수산화나트륨(NaOH)수용액을 이용해서 기재표면을 충분히 세정하여, 기재상에 부착한 오염을 제거하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 50℃정도로 가열된 1mol/ℓNaOH수용액을 준비하여, 해당 수용액중에서 기재표면을 와이핑하거나 혹은 해당 수용액을 샤워링하면서 브러싱함으로써 기재상에 부착한 오염을 확실하게 제거한다. 오염을 제거한 후, 여분의 수산화나트륨분을 충분히 수세한다. 최후로, N2블로잉(blowing) 등에 의해 수분제거를 행하면 된다. 이와 같이 해서, 프로브매체중의 프로브를 균일하고 또 확실하게 고정할 수 있는 기재를 얻는 것이 가능하다.
프로브매체 중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유하지 않을 경우에는, 기재표면을 물 또는 용매에 의해 세정하거나, 혹은 에어블로잉에 의한 세정을 행하는 것이 적당하다. 예를 들면, 순수를 이용해서 기재표면을 충분히 세정하여, 기재상에 부착한 이물을 제거하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로 설명하면, 고압순수샤워(2-유체 샤워)를 기재표면상에 불어넣음으로써 이물을 제거한다. 이물제거후, 재차, 순수샤워에 의해 기재를 헹구어, 이물이 혼입된 순수를 씻어버린다. 최후로, N2블로잉 등에 의해 수분제거를 행하면 된다. 이와 같이 해서, 프로브매체중의 프로브를 균일하고 또 확실하게 고정할 수 있는 기재를 얻는 것이 가능하다.
프로브매체중의 프로브를 기재상에 스폿팅하는 방법으로서는, 몇가지 방법이 알려져 있다. 구체적인 방법으로서는, 핀법, 잉크젯법, 핀 & 링법 등이 알려져 있다. 이들 중에서도, 잉크젯법은 고밀도로 또 정확하게 스폿팅이 가능하므로 바람직한 스폿팅방법이다.
잉크젯법에 의한 스폿팅방법에 있어서, 프로브매체에 함유되는 성분은 상기 표시한 바와 같이 프로브매체가 잉크젯헤드로부터 토출된 때에 프로브, 프로브가용성 용매, 프로브불용성 유기용매 및 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질에 대해서 실질적으로 영향을 주지 않는 것이고, 또한, 잉크젯헤드를 이용해서 기재상에 정상으로 토출가능한 매체조성을 만족하는 것이면, 특히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 잉크젯헤드가 매체에 열에너지를 부여해서 토출시키는 기구를 갖춘 버블젯헤드인 경우, 글리세린, 티오디글리콜, 이소프로필알콜 또는 아세틸렌알콜을 함유하는 액체는 프로브매체에 포함되는 성분으로서 바람직한 것이다. 보다 구체적으로는, 글리세린 5 내지 10질량%, 티오디글리콜 5 내지 10질량%, 아세틸렌알콜 0.5 내지 1질량%를 함유하는 액체를 바람직한 프로브매체로서 이용할 수 있다. 또, 잉크젯헤드가 압전소자를 이용해서 매체를 토출시키는 피에조잉크젯헤드인 경우, 에틸렌글리콜 및 이소프로필알콜을 함유하는 액체는 프로브매체에 포함되는 성 분으로서 바람직하게 사용된다. 보다 구체적으로는, 에틸렌글리콜 5 내지 10질량% 및 이소프로필알콜 0.5 내지 2질량%를 함유하는 액체가 프로브매체로서 적합하게 이용된다. 이들 매체성분중, 필요한 경우 프로브가용성 매체의 제조수순은 변경해도 되고, 프로브가용성 매체는 수용성 고분자재료와 혼합하기 전에 첨가해도 된다.
이와 같이 해서 얻어진 프로브매체를 잉크젯헤드로부터 토출시켜 기재상에 부착시킨 때, 토출된 매체는, 스폿의 형상이 원형이고, 또 그의 경계가 퍼지는 일이 없다. 마찬가지로, 고밀도로 프로브매체를 스폿팅한 경우에도, 인접하는 스폿과의 연결을 유효하게 억제하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 프로브매체의 특성은 상기의 것에 한정되는 것은 아니다.
기재상에 부여된 프로브매체중에 포함되는 프로브를 소정의 위치에 고정하여, 인접하는 스폿에 포함되는 프로브와의 오염을 보다 확실하게 방지하는 데 유효하고, 또한, 프로브를 기재상에 강고하게 고정하기 위한 유효한 방법으로서, 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매, 서로 반응할 수 있는 작용기를 각각 지니는 기재를 이용하거나, 서로 반응할 수 있는 작용기를 각각 지닌 프로브와 기재를 이용하는 방법이 있다.
바람직한 예로서는, 프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유한 경우, 프로브를 기재상에 고정하는 물질측에 실란올(SiOH)기와 기재상에 수산(OH)기와의 조합을 들 수 있다. 이러한 조합에 의해 스폿팅에 의해 기재상에 부여된 프로브매체중에 함유되는 물질의 실란올기와 기재상의 수산기가 반응해서 기재상에 해당 물질이 고정화된다. 구체적인 기재의 예를 들면, 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매는 실란올기를 지닌 실란커플링제를 포함하는 것이 바람직하다. 또, 기재는, 표면이 실리카코팅된 앞에서 설명한 유리기판, 석영기판 또는 수지기판으로, 이들 각 기판은 수산기를 지닌 것이 바람직하다.
프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유하지 않는 경우에는, 프로브에 아미노(NH2)기, 기재측에 에폭시기를 지닌 조합과, 프로브에 아미노(NH2)기, 기재측에 이소시아네이트기를 지닌 조합을 바람직한 예로 들 수 있다. 이러한 조합에 의해 스폿팅에 의해 기재상에 부여된 프로브매체중에 포함되는 프로브의 아미노기와 기재상의 에폭시기 또는 이소시아네이트기가 서로 반응해서 기재상에 프로브가 고정화된다. 구체적으로는, 프로브에 아미노기를 부가한 DNA와, 전술한 표면처리를 실시한 수지기판에 에폭시기를 도입해서 제조한 에폭시기를 지닌 기재를 조합한 것이 바람직하다.
또, 프로브매체중에 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유할 경우, 프로브와 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매는, 상기 프로브와 상기 물질과의 반응에 의해서 함께 결합하고 있는 것이 바람직하다. 이러한 반응에 의해, 프로브와 유기용매는 서로 강고하게 결합하는 것이 가능하다. 그 결과, 프로브는 기재상에 보다 강고하게 고정화되어, 프로브의 스폿을 소정의 위치에 형성하는 것이 가능해진다. 특히 작용기로서 아미노기를 지닌 프로브 및 프로브와 반응할 수 있는 작용기로서 이소시아네이트기, 기재의 작용기와 반응할 수 있는 작용기로서 실 란올기를 지닌 물질을 포함해서 프로브매체를 제조하고, 해당 프로브매체에 소정의 비율로 되도록 디프로필렌글리콜, 이소프로필알콜 등을 혼합해서 프로브용액을 조제한다. 이 프로브용액을, 작용기로서 수산기를 지닌 기재상에 잉크젯헤드를 이용해서 스폿팅을 행한 경우, 프로브용액은 기재상에 안정한 크기의 스폿을 형성한다. 이와 같이 해서, 프로브를 기재상의 소정의 위치에 고정하는 것이 가능하다.
또, 프로브와 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매가 상호 반응을 통해 서로 결합할 경우에는, 프로브매체중에 수용성 고분자재료로서 폴리비닐알콜(PVA)을 혼합시켜 두는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 미리 완전히 용해시켜 두는 것이 바람직하다. 프로브매체중에 수용성 고분자재료를 혼합함으로써, 기재상에 있어서의 스폿팅상태의 관찰을 용이하게 하고, 스폿팅후의 스폿에 있어서의 프로브매체를 건조하기 어렵게 된다. 그 결과, 보다 확실하게 프로브매체와 기재상을 반응시켜, 프로브를 기재상에 고정시킬 수 있게 된다. 또한, 스폿팅에 의해 제작된 프로브고정기재의 보관상태를 고려하면, 스폿팅에 의해 형성된 프로브매체의 스폿이 건조한 경우에 있어서도 표적물질을 효율좋게, 또 안정하게 검출하는 데 유효하다.
프로브매체를 스폿팅한 기재를 건조시키는 것이 바람직하다. 기재를 건조시킴으로써 보다 프로브매체중의 프로브가 기재상에 확실하게 고정된다. 건조시키는 방법으로서는, 진공건조, 가열건조 등 여러가지 방법을 들 수 있으나, 간이적으로 확실하게 실시할 수 있으므로, 가열건조가 적당하다. 가열건조 방법으로서는 핫플레이트에 의한 가열건조방법이 바람직하다. 특히, 가열한 핫플레이트상에 프로브매체를 스폿팅한 기재를 정치한다. 소정 시간 정치한 후, 기재를 핫플레이트로부터 꺼내 자연적으로 냉각시킨다. 핫플레이트의 온도는, 프로브의 내열성을 고려한 경우, 100℃이하가 바람직하고, 보다 상세히 설명하면, 해당 온도는 60 내지 90℃가 바람직하다. 기판의 정치 시간으로서는 30분이하가 바람직하고, 보다 상세히 설명하면, 1 내지 10분이 바람직하다.
예를 들면, 염기길이 20mer의 프로브를 함유하는 프로브매체를 프로브농도가 9mol/ℓ로 되도록 조제한다. 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 첨가량은, 프로브의 양에 대해서 염기길이수만큼 곱해서 얻어진 양에 의거해서 조정한다. 바람직하게는, 프로브의 양과 염기사슬길이를 곱해서 얻어진 양을 또 0.5 내지 3배 되도록 조정한다. 고체상과 잉크젯헤드의 각 노즐간의 간격을 0.2 내지 0.5㎜정도로 설정하고, 해당 잉크젯헤드의 노즐로부터 프로브매체를 토출시킨 경우(토출량은 약 20피코리터), 고체상에는 직경 약 170 내지 250㎛정도의 스폿을 형성하는 것이 가능하며, 또, 액체를 노즐로부터 토출할 때의 비약에 유래하는 스폿(이하 "새틀라이트 스폿"이라 칭함)은, 루페(loupe)를 이용한 육안관찰에서는 전혀 관찰되지 않았다.
여기서, 프로브고정기재를 이용해서, 예를 들면, 표적물질의 검출 등을 행할 경우의 검출정밀도(스폿 적산 강도)의 향상을 도모하는 것을 목적으로 해서, 해당 프로브를 고체상의 표면에 고정한 후, 해당 기재의 프로브비결합부분이 샘플중의 표적물질 등과 결합하지 않도록 블로킹을 행해도 된다. 블로킹은, 예를 들면, 해당 기재를 실온의 2% 소혈청 알부민(BSA)수용액중에, 예를 들면, 2시간 정도 침지 함으로써 행한다. 기재상의 프로브고정부위이외의 부분에의 표적물질의 흡착을 방지하는 효과로부터 고려하면, BSA수용액이 적합하다. 또, 이 블로킹의 공정은, 필요에 따라서 행해도 되고, 예를 들면, 샘플의 해당 프로브고정기재에의 공급을 각각의 스폿에 대해서 한정적으로 행하므로, 스폿이외의 부위에의 샘플의 부착이 실질적으로 관찰되지 않을 경우에는 블로킹을 행하지 않아도 된다. 스폿이외의 부위에의 샘플의 부착은 기재로 되는 재료에 따라서도 다르다. 특히, 기재가 유리, 석영, 실리카코트수지인 경우에 있어서는, 블로킹처리는 행하지 않아도 된다.
이와 같이 해서 제작하는 프로브고정기재는 그 용도에 따라서, 예를 들면, 마찬가지 프로브를 함유하는 복수의 스폿을 지니도록 구성해도 되고, 또는, 이종의 프로브를 각각 함유하는 복수의 스폿을 지니도록 구성해도 된다. 프로브의 종류, 수량 및 배치는 필요에 따라서 적절하게 변경하는 것이 가능하다. 그리고, 이와 같은 방법에 의해서 프로브가 고밀도로 배치된 프로브고정기재를 준비한다. 그 후, 이러한 기재는, 표적물질의 검출이나, 표적물질의 염기서열의 특정 등에 이용된다. 예를 들면, 이 기재를, 샘플중에 포함되어 있을 가능성이 있는 염기서열이 알려져 있는 표적물질로서의 1본쇄 핵산의 검출에 이용할 경우에는, 해당 표적물질의 1본쇄 핵산의 염기서열에 대해서 상보적인 염기서열을 지닌 1본쇄 핵산을 프로브로서 이용해서, 해당 프로브를 함유하는 복수의 스폿이 고체상에 배치되어 있는 프로브고정기재를 준비하고, 해당 프로브고정기재의 각각의 스폿에, 샘플을 공급해서, 해당 표적물질의 1본쇄 핵산과 프로브가 하이브리다이즈하는 바와 같은 조건하에 놓은 후, 각각의 스폿에 있어서의 하이브리드의 유무를 형광검출 등의 기지의 방법으로 검출한다. 그것에 의해서, 샘플중에 있어서의 표적물질의 유무의 검출을 행하는 것이 가능하다.
또, 샘플중에 함유되어 있는 표적물질로서 제공되는 1본쇄 핵산에 있어서의 염기서열의 특정에 이용할 경우에는, 해당 표적물질의 1본쇄 핵산에 있어서의 염기서열의 2개이상의 후보를 설정하고, 해당 염기서열군에 대해서 각각의 상보적인 염기서열을 지닌 1본쇄 핵산을 프로브로서 해당 기재상에 스폿팅한다. 이어서, 각각의 스폿에 샘플을 공급해서 해당 표적물질의 1본쇄 핵산과 프로브가 하이브리다이즈하는 조건하에 놓은 후, 각각의 스폿에 있어서의 하이브리드의 유무를 형광검출 등의 기지의 방법으로 검출한다. 이것에 의해, 표적물질의 1본쇄 핵산에 대해서 염기서열의 특정을 행하는 것이 가능하다. 또, 본 발명에 관한 프로브고정기재의 기타의 용도로서는, 예를 들면, DNA결합단백질이 인식하는 특이적인 염기서열의 스크리닝이나 DNA에 결합하는 성질을 지닌 화학물질의 스크리닝에의 적용을 고려할 수 있다.
프로브매체는, 유기용매를 함유하는 액체매체와, 프로브와, 프로브가용성 용매와, 프로브불용성 유기용매 및 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질, 그리고, 필요에 따라서 첨가되는 성분으로서 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 함유해서 이루어진 것으로서 제공되어도 되고, 이들 성분을 적어도 2개의 군으로 분할해서 별도의 용기내에 각각 조제해 놓고, 사용시에 각 용기내의 성분을 혼합할 수 있는 상태로 한 시약키트로서 제공해도 된다.
프로브를 용기중에 수납할 때, 용기는 기타의 불순물 등이 혼입하는 일이 없 도록 밀폐하는 것이 가능한 것이 바람직하고, 또, 고정할 때에 혼합하는 것이 용이하도록 개봉할 수 있는 것일 필요가 있다. 그러나, 용기의 개봉에 대해서는, 특히 한정되는 것은 아니며, 용기중에 유지되는 프로브의 상태로서는 특히 한정되는 것은 아니나, 용액상태이어도 분말상태이어도 상관없다. 작용기가 메르캅토기 등인 경우, 프로브의 안정성을 고려해서, 프로브를 동결건조법 등에 의해 분말화한 후에, 고온으로 되지 않도록 보관하는 것이 바람직하다. 작용기가 아미노기 등인 경우에 있어서도, 보관상태로서는, 프로브의 안정성을 확보하기 위해 해당 프로브를 냉동보관하는 것이 바람직하나, 보관기간, 프로브종류, 프로브작용기 등에 따라서 보관상태를 변경하는 것은 가능하다. 이와 같이 해서, 프로브를 용기중에 수납해서, 보관한 상태에서 기재상에 고정할 때에 혼합해도 된다.
이와 같은 용도에, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서 계면활성제를 이용할 경우에는, 계면활성제는 용액형태인 것이 바람직하나, 계면활성제는 이것으로 한정되지 않고, 용매에 용해시켜서 사용하는 것이 가능하다면 분말고체상태이어도 된다.
프로브가용성 용매, 프로브불용성 유기용매 및 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매를 용기중에 수납할 때, 용기는 기타의 불순물 등이 혼입하는 일이 없도록, 또한 용매의 휘발손실을 방지하도록 기밀밀폐하는 것이 가능하다. 또, 용기는, 밀폐된 용기인 것이 바람직하고, 또한, 고정할 때에 혼합하는 것이 간이하도록 용이하게 개봉할 수 있게 설계하는 것이 바람직하다. 그러나, 용기의 개봉에 대해서는, 특히 한정되는 것은 아니다. 또, 용기중에 수납하는 용매의 상태는 특히 한정되는 것은 아니고, 용액상태이어도 고체상태이어도 상관없다. 또, 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매는, 프로브를 기재상에 고정하는 데 사용되는 작용기의 하나인 실란올기를 형성하기 위해 가수분해된 용액이어도 된다. 보관상태로서는, 용매의 안정성을 확보하기 위해 실온보관하는 것이 바람직하나, 보관기간 등에 따라서 보관상태를 변경하는 것은 가능하다. 특히, 가수분해된 용액인 경우에는, 보관중에 있어서의 온도상승을 피하는 것이 바람직하다. 또한, 프로브를 기재상에 고정하는 유기용매의 작용기에 따라서, 가수분해시와 가수분해후의 pH를 조정함으로써 안정성을 얻는 것이 바람직하다.
프로브를 기재상에 고정할 때에, 이들 용기에 수납된 프로브 및 프로브를 고정하는 유기용매를 혼합할 때, 필요에 따라서 물 등의 용액을 첨가해도 된다. 또, 프로브매체로 하기 위해 충분히 혼합하기 위한 물질, 예를 들면, 물 등의 용매를 개별 용기에 수납해 두고, 프로브매체 조제시에 혼합하는 것이어도 된다.
실시예
이하 실시예에 의거해서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
(1) 프로브의 합성
표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브로서 1본쇄 DNA프로브를 이용하였다. DNA자동합성기(Applied Biosystems, Co., Ltd.제품인 모델 380A)를 이용해서 서열번호 1인 1본쇄 DNA프로브를 합성하였다. 또, 서열번호 1인 1본쇄 DNA프로브의 말단에, 5'-말단의 수산기에 인산기와 헥사메틸렌을 개재해서 아미노 산기를 결합한 18량체의 올리고머를 준비해서, 이하의 실험에 이용하였다.
서열번호 1
5' H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA 3'
(2) 프로브 용매
프로브가용성 매체로서는 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서, 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(n-헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드)를 이용하였다. 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드가 완전히 용해된 수용액을 제조하기 위해, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드를 50℃의 수욕중에 가온하면서 용해시켰다.
(4) 프로브불용성 용매
프로브불용성 유기용매로서, 이소시아네이트기를 지닌 실란화합물(3-이소시아네이트 프로필트리에톡시실란)을 함유하는 실란커플링제(신에츠카가쿠공업(주) 제품인 상품명: KBE-9007), 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
상기 (1)항의 서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하였다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브수용액에, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드 약 65mmol/ℓ의 수용액 20㎕를 적하해서 혼합하였다. 이것에 의해, DNA프로브가 수용액중에 석출되어, 백탁의 프로브매체로 되었다. 상기 DNA프로브를 원심분리에 의해 침강시킨 후에, 상기 프로브고정물질을 30㎕ 적하하였다. 이 혼합물을 충분히 교반해서 혼합한 후에, 30분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 수용성 고분자재료로서의 폴리비닐알콜(PVA)을 농도 0.5질량%로 되도록 순수에 용해시켰다. PVA를 완전히 용해시키기 위해, 온욕(hot bath)중에서 80℃로 가온하면서 60분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅시에 있어서 노즐막힘이 발생하지 않도록 여과를 행하여 PVA수용액을 조제하였다.
상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치하여 프로브매체를 제조하였다.
(6) 기재(기판) 세정
1인치×3인치 크기의 실리카코트 소다라임유리기판(두께: 약 1.1㎜)을 순수로 헹구어, 해당 기판의 표면에 부착된 이물을 제거하였다. 이어서, 이 기판을 UV/O3세정장치를 이용해서 5분간 처리하여, 해당 기판의 표면에 부착한 유기물을 제거하였다. 다음에, UV/O3세정한 기판을 카세트에 넣고, 무기알칼리계 세제(요코하마유지공업(주) 제품인 상품명: 세미클린 KG)의 5체적% 수용액에 침지시키면서, 초음파를 5분간 조사하였다. 이어서, 순수의 유수중에서 상기 기판과 카세트를 충분히 헹구어, 유리기판과 카세트에 부착한 세제를 수세하여 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수중에 상기 카세트와 유리기판을 침지하여 초음파세정을 5분간 행하였다. 초음파세정 후, 순수의 유수 중에서 상기 카세트와 기판을 헹구어, 그위에 부착된 극히 작은 조각들(particles)을 제거하였다. 수세후, 유리기판과 카세트를 스핀건조시켰다. 기판이 세정된 것을 확인하기 위해, 기판상의 순수의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기판의 모든 부위에 있어서 퍼진 상태였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 잉크젯장치를 이용해서 기재상에 스폿팅을 행하였다. 이 경우, 장치의 잉크젯헤드로서는 피에조젯헤드를 이용하였다. 피에조젯헤드에 프로브매체를 충전하고, 상기 (6)항에서 준비한 유리기판상에, 프로브매체를 스폿팅하였다. 여기서, 피에조젯헤드의 액체토출면과 유리기판의 액체부착면과의 거리는 약 0.5㎜였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
상기 (1)항의 서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 1 본쇄 DNA프로브를 DNA자동합성기에서 합성하여, 해당 DNA프로브의 5'-말단에 로다민을 결합시켜 표식화한 1본쇄 DNA프로브를 얻었다. 이 표식화 1본쇄 DNA프로브를 1M NaCl/ 50mM 인산완충액(pH 7.0)에 최종농도 50nM이 되도록 용해시켰다. 이 용액중에, 상기 (7)항에서 얻어진 프로브고정기재를 침지하고, 실온(45℃)에서 2시간 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉(blowing)에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 5531이었다. 스폿의 532nm에서의 형광강도적산치는 6593912였다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 40이었다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형으로, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 거의 관찰되지 않았다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[실시예 2]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로, 프로브가용성 매체로서 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서, 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드(n-헥사데실 트리메틸 암모늄 클로라이드)를 이용하였다. 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드가 완전히 용해된 수용액을 제조하기 위해, 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드를 50℃의 수욕중에 가온하면서 용해시켰다.
(4) 프로브불용성 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브불용성 유기용매로서, 이소시아네이트기실란커플링제, 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하여, 용해시켰다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브수용액에, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸트리메틸 암모늄 클로라이드 약 163mmol/ℓ의 수용액 20㎕를 적하해서 혼합하였다. 이것에 의해, DNA프로브가 수용액중에 석출되어, 백탁의 프로브매체로 되었다. 상기 DNA프로브를 원심분리한 후에, 상기 프로브고정물질을 30㎕ 적하하였다. 이 혼합물을 충분히 교반해서 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, PVA용액을 제조하였다. 상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치하여 프로브매체를 제조하였다.
(6) 기재(기판) 세정
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 기판세정을 행하여 유리기판을 준비하였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 이용해서, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서 스폿팅을 행하여 프로브고정기재를 제작하였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 5836이었다. 스폿의 532nm에서의 형광강도적산치는 6377211이었다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 50이었다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형으로, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 거의 관찰되지 않았다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[실시예 3]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로, 프로브가용성 매체로서 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서, 세틸피리디늄 클로라이드를 이용하였다. 세틸피리디늄 클로라이드가 완전히 용해된 수용액을 제조하기 위해, 세틸피리디늄 클로라이드를 충분히 교반하면서 수중에 용해시켰다.
(4) 프로브불용성 용매
프로브불용성 유기용매로서, 이소시아네이트기를 지닌 실란화합물(γ-이소시아네이트 프로필트리메톡시 실란)을 함유하는 실란커플링제(닛폰유니카(주) 제품인 상품명: Y-5187), 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
상기 실시예 1의 상기 (1)항에 기재한 서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 프로브용매로서 20㎕의 순수를 적하하여 프로브를 용해시켰다. 프로브가 용해되지 않고 남아 원심분리에 의해 용기의 바닥부에 그 용액이 침강되지 않도록 이 혼합물을 충분히 교반하였다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브용액에, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸피리디늄 클로라이드 약 65mmol/ℓ의 수용액 5㎕를 적하해서 혼합하였다. 이것에 의해, DNA프로브가 수용액중에 석출되어, 백탁의 프로브매체로 되었다. 상기 DNA프로브 를 원심분리에 의해 침강시켜 용액으로부터 분리시킨 후에, 상기 프로브불용성 용매중 실란커플링제 5㎕만 적하하였다. 이 혼합물을 교반에 의해 서서히 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 수용성 고분자재료로서의 폴리비닐알콜(PVA)을 농도 0.5질량%로 되도록 순수에 용해시켰다. PVA를 완전히 용해시키기 위해, 온욕중에서 80℃로 가온하면서 60분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅시에 있어서 노즐막힘이 발생하지 않도록 여과를 행하여 PVA수용액을 조제하였다.
상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치하여 프로브매체를 제조하였다.
(6) 기재(기판) 세정
1인치×3인치 크기의 실리카코트 소다라임유리기판(두께: 약 1.1㎜)을 순수로 헹구어, 해당 기판의 표면에 부착된 이물을 제거하였다. 이어서, 이 기판을 UV/O3세정장치를 이용해서 5분간 처리하여, 해당 기판의 표면에 부착된 유기물을 제거하였다. 다음에, UV/O3세정한 기판을 카세트에 넣고, 무기알칼리계 세제(요코하마유지공업(주) 제품인 상품명: 세미클린 KG)의 5체적% 수용액에 침지시키면서, 초음파를 5분간 조사하였다. 이어서, 순수의 유수중에서 상기 기판과 카세트를 충분히 헹구어, 유리기판과 카세트에 부착된 세제를 수세하여 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수중에 상기 카세트와 유리기판을 함께 침지하여 초음파세정을 5분간 행하였다. 초음파세정 후, 순수의 유수 중에서 상기 카세트와 기판을 헹구어, 그위에 부착된 극히 작은 조각들을 제거하였다. 수세후, 유리기판과 카세트를 스핀건조시켰다. 기판이 세정된 것을 확인하기 위해, 기판상의 순수의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기판의 모든 부위에 있어서 퍼진 상태였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 잉크젯장치를 이용해서 기재상에 스폿팅을 행하였다. 이 경우, 장치의 잉크젯헤드로서는 피에조젯헤드를 이용하였다. 피에조젯헤드에 프로브매체를 충전하고, 상기 (6)항에서 준비한 유리기판상에, 프로브매체를 스폿팅하였다. 여기서, 피에조젯헤드의 액체토출면과 유리기판의 액체부착면과의 거리는 약 0.5㎜였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 루페에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
상기 (1)항의 서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브와 상보적인 염기서열을 지닌 1본쇄 DNA프로브를 DNA자동합성기에서 합성하여, 해당 DNA프로브의 5'-말단에 로다 민을 결합시켜 표식화한 1본쇄 DNA프로브를 얻었다. 이 표식화 1본쇄 DNA프로브를 1M NaCl/ 50mM 인산완충액(pH 7.0)에 최종농도 50nM이 되도록 용해시켰다. 이 용액중에, 상기 (7)항에서 얻어진 프로브고정기재를 침지하고, 실온(45℃)에서 2시간 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 22180이었다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 45였다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형으로, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 거의 관찰되지 않았다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[실시예 4]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로, 프로브가용성 매체로서 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질이 순수에 용해된 용액을 준비하고, 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브불용성 용매
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브불용성 유기용매로서, 이소시아네이트기를 지닌 실란화합물(γ-이소시아네이트 프로필트리메톡시 실란)을 함유하는 실란커플링제, 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을, 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하여, 해당 순수에 프로브를 용해시켰다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브수용액에, 프로브를 용기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸피리디늄 클로라이드 약 65mmol/ℓ의 수용액 10㎕를 적하해서 혼합하였다. 이것에 의해, DNA프로브가 수용액중에 석출되어, 백탁의 프로브매체로 되었다. 상기 DNA프로브를 원심분리에 의해 침강시킨 후에, 상기 프로브불용성 용매중 실란커플링제만을 5 ㎕ 적하하였다. 이 혼합물을 충분히 교반해서 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하여 혼합하였다.
(6) 기재(기판) 세정
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 기판세정을 행하여 유리기판을 준비하였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 이용해서, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서 스폿팅을 행하여 프로브고정기재를 제작하였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위 해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 19570이었다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 45이었다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형으로, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 거의 관찰되지 않았다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[실시예 5]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로, 프로브가용성 매체로서 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 순수에 용해시킨 용액을 조제해서 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브불용성 용매
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브불용성 유기용매로서, 이소시아네이트기를 지닌 실란화합물(γ-이소시아네이트 프로필트리메톡시 실란)을 함유하는 실란커플링제(닛폰유니카(주) 제품인 상품명: Y-5187), 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을, 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하여, 해당 순수에 프로브를 용해시켰다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브수용액에, 프로브를 용기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸피리디늄 클로라이드 약 65mmol/ℓ의 수용액 20㎕를 적하해서 혼합하였다. 여기에 먼저 유기용매에 프로브를 가용화시키는 물질을 혼합함으로써 상기 프로브매체가 흐려지게 되었다. 그러나, 상기 용액 20㎕를 모두 적하, 혼합한 후에는, 백탁이 점차로 줄어 약간만 남아 있는 것이 확인되었다. 상기 DNA프로브를 원심분리에 의해 침강시켰다. 상청액을 제거한 후에, 상기 프로브고정물질중 실란커플링제만을 5㎕ 적하하였다. 이 혼합물을 충분히 교반해서 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, PVA용액을 제조하였다. 상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치 하여 프로브매체를 제조하였다.
(6) 기재(기판) 세정
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 기판세정을 행하여 유리기판을 준비하였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 이용해서, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서 스폿팅을 행하여 프로브고정기재를 제작하였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 7322이었다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 45였다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형이었다. 다른 실시예와 비교한 바, 스폿의 윤곽이 또렷치 않게 되어 거의 식별할 수 없었고, 그 스폿의 크기는 약 1/2였다. 또, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 없었다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[실시예 6]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브 용매
실시예 1과 전적으로 마찬가지로, 프로브가용성 매체로서 물을 이용하였다.
(3) 프로브를 가용화시키는 물질
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 순수에 용해시킨 용액을 조제해서 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브불용성 용매
실시예 3과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브불용성 유기용매로서, 이소시 아네이트기를 지닌 실란화합물(γ-이소시아네이트 프로필트리메톡시 실란)을 함유하는 실란커플링제(닛폰유니카(주) 제품인 상품명: Y-5187), 이소프로필알콜 및 디프로필렌글리콜을, 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 프로브매체의 제조
서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하여, 해당 순수에 프로브를 용해시켰다. 상기 프로브를 용해시킨 프로브수용액에, 프로브를 용기용매에 가용화시키는 물질로서의 세틸피리디늄 클로라이드 약 65mmol/ℓ의 수용액 2.5㎕를 적하해서 혼합하였다. 여기에 먼저 유기용매에 프로브를 가용화시키는 물질을 혼합함으로써 상기 프로브매체가 약간 흐려지게 되었다. 상기 DNA프로브를 원심분리에 의해 침강시켰다. 상청액을 제거한 후에, 상기 프로브불용성 용매중 실란커플링제만을 5㎕ 적하하였다. 이 혼합물을 충분히 교반해서 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, PVA용액을 제조하였다. 상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치하여 프로브매체를 제조하였다.
(6) 기재(기판) 세정
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 기판세정을 행하여 유리기판을 준비하였다.
(7) 프로브매체의 스폿팅
상기 (5)항에서 제조한 프로브매체를 이용해서, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서 스폿팅을 행하여 프로브고정기재를 제작하였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(8) 하이브리다이제이션 처리
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 (8)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강 도가 높은 부위에서의 휘도는 8976이었다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 45였다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형이었다. 다른 실시예와 비교한 바, 스폿의 윤곽이 또렷치 않게 되어 거의 식별할 수 없었고, 그 스폿의 크기는 약 1/2였다. 또, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 없었다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
[비교예 1]
(1) 프로브의 합성
실시예 1과 마찬가지로 해서 1본쇄 DNA프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브를 가용화시키는 물질
실시예 1 및 2의 각각에서 이용한 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질은, 이하의 실험에 이용하지 않았다.
(3) 프로브고정물질
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 프로브고정물질로서, 이소시아네이트 실란커플링제를 준비해서, 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브매체의 제조
서열번호 1의 1본쇄 DNA프로브를 18nmol로 분배해서, 건조한 것에, 각각 20㎕의 순수를 적하하여, 해당 순수에 프로브를 용해시켰다. 상기 프로브를 용해시 킨 프로브수용액에, 상기 프로브고정물질 30㎕를 적하하고, 교반에 의해 충분히 혼합하였다. 혼합한 후에, 60분간 정치하였다.
이어서, 유기용매로서의 디프로필렌글리콜 500㎕ 및 이소프로필알콜 1,000㎕를 상기 혼합물에 적하하고, 5분간 교반하였다.
또, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, PVA용액을 제조하였다. 상기와 같이 해서 제조한 프로브용액중에, 상기와 같이 해서 조제한 PVA수용액 50㎕를 적하하였다. 최후로, 프로브매체 전체량으로 2㎖가 되도록 순수를 적하하고, 얻어진 혼합물을 5분간 교반해서 혼합하였다. 혼합한 후, 해당 혼합물을 30분간 방치하여 프로브매체를 제조하였다.
(5) 기재(기판) 세정
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 기판세정을 행하여 유리기판을 준비하였다.
(6) 프로브매체의 스폿팅
상기 (4)항에서 제조한 프로브매체를 이용해서, 실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서 스폿팅을 행하여 프로브고정기재를 제작하였다. 스폿팅종료후, 유리기판을 현미경에 의해 관찰한 바, 유리기판표면에 매트릭스형상의 스폿배열이 형성되어 있는 것이 관찰되었다. 스폿팅종료후의 유리기판을 80℃로 가열된 핫플레이트상에 5분간 정치하였다. 핫플레이트에서의 처리를 한 기판은 데시케이터내에 보관하였다. 이와 같이 해서, 프로브고정기재(프로브어레이)를 제작하였다.
(7) 하이브리다이제이션 처리
실시예 1과 전적으로 마찬가지로 해서, 하이브리다이제이션처리를 행하였다. 그 후, 프로브어레이를 1M NaCl/50mM인산완충액(pH 7.0)으로 세정해서 프로브의 핵산과 하이브리다이제이션되지 않았던 1본쇄 DNA프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수로 여분의 염분을 제거한 후, 질소블로잉에 의해 프로브어레이를 건조시켰다. 다음에, 해당 프로브어레이의 스폿의 형광을, 형광스캐너(Axon Instruments, Inc.제품인 상품명: Gene Pix 4000B)를 이용해서 형광강도를 평가하였다. 평가를 위해, 레이저파워를 100%로 설정하고, PMT를 400V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 (7)항에서의 형광스캐너의 평가결과를 해석한 바, 표식화 1본쇄 DNA프로브와 완전히 일치된 서열번호 1의 DNA프로브의 스폿에서는, 532nm에서의 형광강도가 높은 부위에서의 휘도는 5744였다. 스폿의 532nm에서의 형광강도적산치는 419192였다. 또, DNA프로브의 스폿부이외의 부분의 형광강도를 관찰한 바, 약 40이었다. 각 DNA프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 결과, 각각의 스폿형상이 거의 원형이었다. 다른 실시예와 비교한 바, 그 스폿의 크기는 약 1/4로 작아졌다. 또, 마찬가지 프로브매체를 스폿팅한 스폿간에 있어서는 형광강도의 차이는 거의 없었다. 또, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하였고, 약 300㎛의 간격으로 격자형상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브와, 유기용매를 함유하는 매체와, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 구비한 프로브매체를 이용함으로써, 프로브를 기재상에 효율좋게 고정시키는 것이 가능하다. 프로브매체는, 프로브와 해당 프로브를 유기용매중에 가용화시키는 물질을 함유함으로써, 프로브를 유기용매에 용해시킬 수 있으므로, 프로브매체를 기재상에 스폿팅하기 위한 적합한 조성을 지닌 것으로 제조하는 것이 가능하다. 또한, 프로브매체가 프로브를 기재상에 고정시키는 물질을 포함할 경우, 프로브와 해당 프로브를 고정하는 물질을 효과적으로 결합시킬 수 있어, 프로브를 기재상에 효율적으로 고정시킬 수 있게 된다. 또, 프로브와 해당 프로브를 기재상에 고정시키는 물질을 결합시킴으로써, 제조공정의 제어를 간략화할 수 있고, 제조시간도 단축할 수 있다.
또, 본 발명에 의하면, 다종의 프로브를 하나의 기재상에 고정할 경우, 각 프로브종류에 대응해서 결합물질의 종류와 그의 농도를 선택하는 것이 가능하며, 그 밖에도, 프로브종류에 따른 프로브고정물질을 적합하게 선택하는 것이 가능하다. 또한, 프로브 및 해당 프로브를 기재에 고정하는 물질에 따라서 프로브매체의 조성을 조정하는 것이 가능하다. 따라서, 1개의 기재상에 있어서 다종의 프로브를 프로브종류 및 프로브고정물질의 조합마다 가장 바람직한 조건하에 결합시키는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 의하면, 프로브가용성 용매에 프로브를 용해시킨 후, 해당 용매에 대해서, 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질을 작용시켜 해당 용매로부터 프로브를 분리시키고, 해당 프로브에 상기 유기용매를 가해서 해당 유기용매에 상기 프로브를 용해시킴으로써, 프로브를 기재상에 효율적으로 고정시킬 수 있다.
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Claims (15)
- 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브;유기용매를 함유하는 매체;상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질;프로브를 기재상에 고정시키기 위한 물질; 및상기 프로브가 용해될 수 있는 용매를 구비한, 프로브검출소자의 제조에 이용되는 프로브매체.
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 핵산프로브인 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 상기 프로브가 불용성인 용매인 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질은 양친매성 물질인 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질은 n-헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, n-헥사데실 트리메틸 암모늄 클로라이드 및 세틸피리디늄 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 물질, 또는 이들 군으로부터 선택된 2종 이상의 물질을 함유하는 혼합물인 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브를 기재상에 고정시키기 위한 물질은 실란커플링제인 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은 상기 프로브매체의 백탁도를 관찰할 수 있는 범위 내에서 조정되는 것을 특징으로 하는 프로브매체.
- 표적물질에 대해서 특이적으로 결합가능한 프로브를 포함하는 프로브매체를 이용한 프로브 검출소자의 제조방법에 있어서,프로브가 용해될 수 있는 제 1용매에 프로브를 용해시키는 공정;상기 제 1용매에 대해서, 프로브를 제 2유기용매에 가용화시키는 물질을 작용시킴으로써 상기 제 1용매로부터 프로브를 분리해서 프로브 매체를 생성하는 공정;상기 프로브 매체에, 프로브를 기재에 고정화시키는 물질을 첨가하는 공정;제 2유기용매를 프로브 매체에 첨가함으로써 상기 제 2유기용매에 상기 프로브를 용해시키는 공정; 및상기 프로브 매체를 기재에 고정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브 검출소자의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은 프로브의 길이와 프로브의 몰수와의 곱에 의거해서 정하는 것을 특징으로 하는 프로브 검출소자의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 프로브를 유기용매에 가용화시키는 물질의 양은 상기 용매로부터 분리된 프로브의 양에 의거해서 정하는 것을 특징으로 하는 프로브 검출소자의 제조방법.
- 프로브를 기재상에 고정하는 방법에 있어서, 제 1항에 기재된 프로브매체를 스폿팅에 의해 기재상에 제공하는 것을 특징으로 하는 기재상에의 프로브의 고정방법.
- 제 13항의 프로브의 고정방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 검출소자.
- 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 기재에의 결합을 위한 반응부위를 지니는 것을 특징으로 하는 프로브매체.
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