CN1519381A - 探针介质及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
在将探针介质点样在基材上时，使探针有效率且稳定地固定在基材上。一种探针介质，所述探针介质具有能够特异性结合目标物质的探针、含有有机溶剂的介质和使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质。
Description
技术领域
本发明涉及含有能够特异性结合目标物质的探针的探针介质(probe medium)及此探针介质的制造方法。本发明还涉及用于有效地将探针固定在基材上的有用的探针介质、探针介质制造方法及使用此探针介质的探针的固定方法。而且，本发明还涉及通过将探针固定在基材上而获得的探针固定基材及使用此探针固定基材检测目标物质的检测元件及检测方法。
背景技术
随着遗传工程学、分子生物学等生物技术领域的进步，对于传染病、癌症或遗传疾病等也可以进行DNA、RNA水平的诊断。作为利用DNA、RNA等核酸进行的诊断中使用的工具之一，DNA芯片(chip)、DNA阵列(array)逐渐为人们所关注。用以DNA芯片、DNA阵列为代表的诊断工具，将核酸等探针预先固定在基材上，使探针与目标物质杂交，由此进行检测。已知能够与此DNA、RNA、核酸等目标物质特异性结合的探针显示了易溶于水的水溶性，在乙醇、异丙醇、异戊醇、双丙甘醇、氯仿等有机溶剂中几乎不溶。
根据斑点法(spotting)等方法，使用预先准备的探针，制作固定了DNA芯片、DNA阵列等探针的基材的情况下，在将探针固定在基材上时，使用使探针在水或含有水和用于调整pH的物质的水溶液中溶解的物质作为探针介质，使其与基材接触，由此将探针固定在基材上。具体而言，作为固定探针的方法，特开平08-23975号公报中记载了如下方法：调制使DNA溶解在水中得到的探针水溶液后，将经调制的探针介质分注并滴加入经表面处理的孔板(well plate)中，由此将探针固定在基材上。另外，在特开平05-192198号公报中记载了如下方法：用10mM Tris·HCl pH7.6、1mM EDTA溶液溶解DNA，进行浓度调整，在其中加入4倍容积的H2O和5倍容积的固定化缓冲剂(1.5M NaCl，0.3M Tris·HCl pH8.0，0.3M MgCl2)，进行混合，由此调制探针介质。另外，在特开2000-146971号公报中记载了如下方法：制备5’末端导入了生物素的寡核苷酸水溶液，点在异氰酸酯化载玻片上，在37℃的培养器内固定15分钟。日本专利第2794728号说明书中记载了如下方法：用TE缓冲液(pH7.5，100mM Tris·HCl，1mM EDTA)将单链DNA梯度稀释，由此调制探针介质；将调制成的探针介质点在硝化纤维素膜上，经风干、加热，将DNA固定在基材上。
但是，在目前使用的含有能够特异性结合目标物质的探针的探针介质中，作为用于将探针固定在基材上的介质，还没有使探针溶解在探针不溶的有机溶剂中的介质，而且在探针介质中也不存在含有使探针溶解在探针不溶的有机溶剂中的物质的介质。目前使用的探针介质是使能够特异性结合目标物质的探针溶解在水、或含有水和用于调整pH的物质、用于减少吸附的物质的水溶液中的介质。而且，为了利用斑点法等方法将探针介质点样在基材上，优选少量添加二醇类溶剂、醇类溶剂，但是，使以DNA、RNA等核酸为代表的探针溶解在探针不溶的有机溶剂中而调制成的探针介质还不存在。因此，即使为了适于进行探针介质在基材上的点样，只使用不含水的有机溶剂的探针介质虽然是适当的，但由于探针不溶解而难以实施。
另外，使核酸等探针溶解在有机溶剂中的方法已知在由试样中提取以DNA、RNA等核酸为代表的探针的情况下使用。但是，作为用于将探针固定在基材上的探针介质，不存在使探针溶解在有机溶剂中的介质。另外，在探针提取方面，已知为了使以DNA、RNA等核酸为代表的探针结合在核酸结合性载体上，使用混悬在含有表面活性剂的溶液中的载体，使其与核酸结合而将其提取出来；但是，使探针溶解在含有表面活性剂的溶液中作为探针介质使用还属未知。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种探针介质，所述探针介质含有能够特异性结合目标物质的探针、有机溶剂和使探针在有机溶剂中可溶化的物质。
本发明的第二个目的如下：使探针溶解在探针可溶的溶剂中后，将使探针在有机溶剂中可溶化的物质作用于该溶剂，由此将探针从溶剂中分离，通过添加有机溶剂使探针溶解在有机溶剂中。
本发明的第三个目的如下：利用探针的沉淀、再溶解，确认使探针在有机溶剂中可溶化的物质的量，进行调制以使探针沉淀，由此使其有效地溶解在有机溶剂中。
上述课题通过下述发明而解决。
即，本发明包括如下内容：
(1)一种探针介质，所述探针介质含有能够特异性结合目标物质的探针、含有有机溶剂的介质和使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质。上述探针优选是核酸探针。上述有机溶剂优选是上述探针不溶的溶剂。使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质优选为两亲性物质。使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质优选为溴化正十六烷基三甲铵，氯化正十六烷基三甲铵，十六烷基氯化吡啶鎓中的任一种物质，或至少含有其中一种的混合物。上述探针介质优选还含有用于将上述探针固定在基材上的物质。用于将探针固定在基材上的物质优选为硅烷偶联剂。上述探针介质还含有上述探针可溶的溶剂。使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量，优选在能够确认上述探针介质出现白色混浊的范围内进行调制。
(2)一种含有能够特异性结合目标物质的探针的探针介质的制造方法，其特征在于，所述方法具有如下步骤：使上述探针溶解在上述探针可溶的溶剂中的步骤；利用使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质的作用将上述探针从上述溶剂中分离的步骤；通过在上述探针中添加有机溶剂使上述探针溶解在有机溶剂中的步骤。使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量优选基于上述探针的长度与上述探针的摩尔数的乘积进行调整。使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量优选基于探针从溶剂中分离的量进行调整。
(3)一种探针固定方法，是利用斑点法将探针介质赋予基材，由此进行固定的方法。
(4)一种检测元件，是利用上述探针固定方法制成的检测元件。
根据本发明，通过使用具有能够特异性结合目标物质的探针、含有有机溶剂的介质和使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质的探针介质，可以将探针有效地固定在基材上。由于探针介质具有探针和使探针在有机溶剂中可溶化的物质，使探针溶解在有机溶剂中，因此在实施斑点法时能够获得优选的材料组成。另外，探针介质中含有将探针固定在基材上的物质时，能够使探针与将探针固定在基材上的物质有效地结合，能够有效率地将探针固定在基材上。而且，通过使探针与将探针固定在基材上的物质结合，因此能够将制造步骤中的控制简略化并缩短时间。
另外，根据本发明，将多种探针固定在一个基材上时，不仅能够对应于各探针种类选择结合物质种类和浓度，而且也能够选择对应于探针种类的探针固定物质。而且，能够对应于探针及将探针固定在基材上的物质调制探针介质的组成。因此，在一个基材上，能够按照每个探针种类、探针固定物质的组合，在最适条件下结合多种探针。
而且，使探针溶解在探针可溶的溶剂中后，利用使探针在有机溶剂中可溶化的物质的作用，分离探针，通过添加有机溶剂，使探针在有机溶剂中溶解，由此可以将探针有效地固定在基材上。
具体实施方式
本发明的探针介质具有能够特异性结合目标物质的探针、含有有机溶剂的介质和使上述探针在有机溶剂中可溶化的物质。另外，本发明包括如下的探针介质及探针介质制造方法：在使探针溶解在探针可溶的溶剂中后，利用使探针在有机溶剂中可溶化的物质的作用，将探针从溶剂中分离，通过添加探针不溶的有机溶剂，使探针溶解在有机溶剂中形成的探针介质和探针介质制造方法。另外，本发明的将探针固定在基材上方法包括使探针介质附着在基材上的步骤。
探针包括单链核酸探针、单链DNA探针、单链RNA探针、单链PNA探针、单链糖链探针等。作为介质中所含探针的量，从探针在探针介质中的稳定性方面考虑，将探针介质例如2mer～500mer，特别是2mer～80mer的探针调制成浓度为0.05～500μmol/l，特别是0.5～50μmol/l。
这些探针也可以是具有用于结合基材的反应部位的物质，此反应部位可以举出官能团、生物素等。此反应部位也可以是作为适当长度的连接物(linker)的一部分而被提供的物质。例如，作为官能团，可以举出氨基(NH2)、羧基(COOH)、巯基(SH)、羟基(OH)等官能团。特别是作为探针官能团，从探针官能团合成的容易性方面考虑，优选为氨基；从探针官能团的反应性方面考虑，优选为巯基。
作为探针可溶的溶剂，可以举出水、乙二醇、丙二醇等。另外，也可以根据需要使用这些溶剂中的2种或2种以上。作为水，也包括添加了氯化钠等盐、磷酸等酸的探针溶解溶液中的水。
作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质，只要是两亲性物质即可，具体而言，可以举出表面活性剂、形成微团(micelle)催化剂的表面活性剂等。作为表面活性剂，特别优选阳离子表面活性剂。作为阳离子表面活性剂，可以举出十六烷基氯化吡啶鎓，十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基氯化铵。作为在探针介质中的含量，从探针对有机溶剂的溶解性、探针的稳定性方面考虑，在介质中，例如将表面活性剂的量调制为0.2μmol/l或0.2μmol/l以上，优选为1μmol/l或1μmol/l以上的浓度，或400000μmol/l或400000μmol/l以下，优选为40000μmol/l或40000μmol/l以下的浓度。作用于探针介质的量基于探针的长度与探针的摩尔数的乘积进行调整。另外，作为作用于探针介质的量，基于探针从溶剂中分离的量进行调整。而且，作为作用于探针介质的量，通过探针的沉淀、再溶解进行确认，调整为使探针发生沉淀的量。另外，本发明者发现此用量优选调制为能够确认上述探针介质出现白色混浊的范围内。
作为探针不溶的有机溶剂，不仅有醇类、酮类，还可以为含有硅烷偶联剂等将探针固定在基材上的有机溶剂的多种有机溶剂。另外，作为探针介质中含有的有机溶剂的种类，不仅是1种，也可以使用多种有机溶剂。在探针不溶的有机溶剂中，不含有将探针固定在基材上的有机溶剂，探针未经其他物质即与基材结合时，作为探针不溶的有机溶剂，优选醇类等不具有与探针及基材反应的部位的物质。探针不溶的有机溶剂中，也可以含有利用与探针及基材的反应将探针固定在基材上的有机溶剂。特别是探针与基材不结合，或几乎不结合的情况下，优选含有将探针固定在基材上的有机溶剂。作为将探针固定在基材上的有机溶剂，具有与探针及基材反应的部位的物质可以举出硅烷偶联剂等。作为硅烷偶联剂可以举出多种物质，优选环氧基硅烷偶联剂，异氰酸酯硅烷偶联剂，巯基硅烷偶联剂，氯丙基硅烷偶联剂，氨基硅烷偶联剂等。作为将介质中所含的探针固定在基材上的有机溶剂的量，从探针对基材的稳定性方面考虑，优选将在探针介质中的浓度调整为0.05～50000μmol/l，特别优选10～500μmol/l。探针官能团与有机溶剂的反应优选为利用官能团间的化学反应形成共价键。作为化学反应，在探针具有的官能团为氨基(NH2)时，作为有机溶剂，优选环氧基硅烷偶联剂，异氰酸酯硅烷偶联剂，巯基硅烷偶联剂，氯丙基硅烷偶联剂。在探针具有的官能团为羧基(COOH)时，优选氨基硅烷偶联剂，巯基硅烷偶联剂。在探针具有的官能团为巯基(SH)时，作为有机溶剂，优选环氧基硅烷偶联剂，异氰酸酯硅烷偶联剂，乙烯基硅烷偶联剂。作为醇类，可以举出乙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇。作为酮类，可以举出丙酮、甲乙酮。作为氨基硅烷偶联剂，可以举出γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β(氨基乙基)γ-氨基丙基三甲氧基硅烷。作为环氧基硅烷偶联剂，可以举出γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-缩水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷。作为异氰酸酯硅烷偶联剂，可以举出γ-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷，γ-异氰酸根合丙基三甲氧基硅烷。作为巯基硅烷偶联剂，可以举出γ-巯基丙基三甲氧基硅烷。作为氯丙基硅烷偶联剂，可以举出γ-氯丙基三甲氧基硅烷。作为乙烯基硅烷偶联剂，可以举出乙烯基三甲氧基硅烷。作为探针不溶的有机溶剂，也可以为这些有机溶剂的混合溶剂。作为探针不溶的有机溶剂，优选将探针、探针可溶的溶剂、使探针在有机溶剂中可溶化的物质、探针不溶的有机溶剂混合，制成探针介质时各相不分离的有机溶剂或有机溶剂的混合溶剂。
另外，也可以根据需要在探针介质中混合水溶性高分子材料。作为水溶性高分子材料，可以举出聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Paogen、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、葡聚糖、支链淀粉等，优选聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等常用的高分子水溶性材料。可以使用其中的1种，也可以根据需要将其中的2种或2种以上组合后使用。
作为将水溶性高分子材料在介质中混合的方法，优选如下方法：预先制成使水溶性高分子材料完全溶解的规定浓度的溶液，秤量制成的水溶性高分子溶液以获得高分子材料溶液在介质中的规定浓度，进行混合。作为水溶性高分子材料溶液，具体而言可以举出如下获得的物质：秤量聚乙烯醇粉末，添加至纯水中制成浓度0.5～5质量％的溶液，边加热边使其溶解，得到所需的水溶性高分子材料溶液。优选将此水溶性高分子水溶液混合在探针介质中使其在探针介质中的浓度为0.01～1质量％。
作为制造探针介质的顺序可以举出多种顺序。
作为制造探针介质的方法，在探针不溶的有机溶剂中含有或不含有将探针固定在基材上的有机溶剂时并不相同。
在探针不溶的有机溶剂中含有将探针固定在基材上的有机溶剂的情况下，作为第一种方法，可以使用如下方法。首先，将探针与少量探针可溶的溶剂混合，使探针溶解。在溶解了探针的溶剂中，添加使探针在有机溶剂中可溶化的物质。作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质的添加方法，可以举出在溶解了探针的溶剂中混合物质的方法，预先将其溶解在探针可溶的溶剂中达到规定浓度的混合方法，预先将其溶解在探针不溶的溶剂中达到规定浓度的混合方法；从有效率地混合方面考虑，优选预先将其溶解在探针可溶的溶剂中的方法。作为将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在探针可溶的溶剂中达到的浓度，从使探针有效地溶解在有机溶剂中的方面考虑，优选使其达到尽可能高的浓度。将含有使探针在有机溶剂中可溶化的物质的溶液滴入溶解了探针的溶剂，进行混合。作为滴加量，将使探针在有机溶剂中可溶化的物质设定为在探针的摩尔数与探针链长数得到的乘积再乘以0.2～4得到的摩尔数，优选为乘以0.5～3得到的摩尔数。通过将使探针在有机溶剂中可溶化的物质添加入溶解了探针的溶剂，将探针从溶剂中分离。也可以利用离心沉淀等方法收集分离后的探针。在含有分离后的探针的溶剂中滴加将探针固定在基材上的有机溶剂，进行混合。混合量根据探针官能团、将探针固定在基材上的有机溶剂等的不同而改变，可以将其调制为探针摩尔数的0.5～500倍摩尔数，优选为1.5～50倍摩尔数。而且，从探针对基材的固定性方面考虑，调制成在探针介质中的浓度例如为0.05～50000μmol/l，特别优选为10～500μmol/l。作为混合方法，只要是将利用使探针在有机溶剂中可溶化的物质的添加而分离的探针与将探针固定在基材上的有机溶剂混合的方法，就没有特别限定。与探针可溶的溶剂的比重相比，将探针固定在基材上的有机溶剂的比重大时，缓慢滴入含有分离、沉淀后的探针的溶剂中，使其离心沉淀，由此可以使其有效地反应。也可以根据需要加热，加热时，也可以加热至40℃～80℃的范围内。与探针可溶的溶剂比重相比，将探针固定在基材上的有机溶剂比重小时，将探针在容器中充分分离、沉淀，固定在容器底部后，缓慢滴入含有探针的溶剂中。将容器密闭，通过倾斜或搅拌，可以使其发生反应。也可以与比值大的情况同样地根据需要进行加热。混合了将探针固定在基材上的有机溶剂后，探针介质优选为单相时，通过添加有机溶剂，能够获得单相。例如，将探针固定在基材上的有机溶剂为异氰酸酯硅烷偶联剂，探针可溶的溶剂为水时，通过添加2-丙醇、双丙甘醇，能够获得单相。在将探针固定在基材方面没有问题的前提下，从操作探针介质方面考虑，也优选单相。添加量无特别限定，在能够形成单相的范围内，将探针浓度设定为规定浓度，优选将其设定为能固定在基材上的范围。而且，根据需要也可以混合水溶性高分子和水。作为水溶性高分子及水的混合方法，从调制成水溶性高分子的水溶液方面考虑，优选滴加、混合成为规定量。
作为第二种方法，可以使用如下方法。首先，在放入了探针的容器中，滴加并混合将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在探针可溶的溶剂中获得的溶液。由此，使探针溶解在有机溶剂中，由于在探针可溶的溶剂中发生不溶化，因此出现沉淀。然后，在容器中滴加并充分混合将探针固定在基材上的有机溶剂。为了使探针和将探针固定在基材上的有机溶剂充分结合，优选调整混合时间、混合温度。有机溶剂的混合、水溶性高分子的混合及水的混合可以与第一种方法同样地进行。
第三种方法是预先对探针与使探针在有机溶剂中可溶化的物质进行混合处理。在使探针溶解在少量的探针可溶的溶剂中后，滴加并混合在探针可溶的溶剂中溶解了使探针在有机溶剂中可溶化的物质的溶液。确认探针发生不溶化、出现沉淀后，进行干燥，除去剩余的溶剂。容器中残留的物质是对探针与使探针在有机溶剂中可溶化的物质进行混合处理得到的物质。为了使其溶解在有机溶剂中，滴加并混合将探针固定在基材上的有机溶剂。为了使探针与将探针固定在基材上的物质充分结合，优选调整混合时间、混合温度。有机溶剂的混合、水溶性高分子的混合、及水的混合可以与第一种方法同样地进行。使用此方法将探针与使探针在有机溶剂中可溶化的物质混合得到的介质可以用作探针固定用试剂。
探针不溶的有机溶剂中不含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，作为第一种方法可以使用如下方法。首先，与含有将探针固定在基材上的有机溶剂时同样地混合探针、探针可溶的溶剂、使探针在有机溶剂中可溶化的物质，使探针从溶剂中分离。在含有分离后的探针的溶剂中滴加并混合探针不溶的有机溶剂。通过溶解从探针不溶的有机溶剂中分离的探针，探针介质成为有机溶剂与探针可溶的溶剂的混合介质。有机溶剂与探针可溶的溶剂的混合介质不是单相时，通过再混合其他的有机溶剂，能够使探针介质成为单相。在将探针固定于基材方面没有问题的前提下，从处理探针介质方面考虑，也优选为单相。而且，根据需要也可以混合水溶性高分子及水。作为水溶性高分子及水的混合方法，从调制水溶性高分子的水溶液方面考虑，优选滴加、混合成规定量。
作为第二种方法可以使用如下方法。首先，在放入了探针的容器中，滴加并混合将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在探针可溶的溶剂中获得的溶液。由此，使探针溶解在有机溶剂中，进行沉淀。然后，滴加并混合有机溶剂，由此使探针溶解。有机溶剂的混合也可以与第一种方法同样地进行。而且，水溶性高分子的混合及水的混合可以与第一种方法同样地进行。
第三种方法是预先对探针与使探针在有机溶剂中可溶化的物质进行混合处理。在使探针溶解在少量的探针可溶的溶剂中后，滴加并混合在探针可溶的溶剂中溶解了使探针在有机溶剂中可溶化的物质的水溶液。确认探针发生不溶化、出现沉淀后，进行干燥，除去剩余的溶剂。容器中残留的物质是对探针和使探针在有机溶剂中可溶化的物质进行混合处理得到的物质。因为可以溶于有机溶剂中，滴加并混合将探针固定在基材上的有机溶剂，由此使探针溶解。有机溶剂的混合可以与第一种方法同样地进行。水溶性高分子的混合、及水的混合可以与第一种方法同样地进行。
由此获得的探针介质，适合用作调制用于检测目标物质的固定化探针中使用的探针介质。
将得到的探针介质点样在基材上，由此可以制成探针固定基材。用于固定探针的基材无特别限定，但是从目标物质的检测或材料的广泛性方面考虑，优选石英基板材料或树脂基板、塑料基板、树脂膜。具体而言，优选1英寸×3英寸大小的载玻片基板。从探针固定的固定特性等方面考虑，探针介质中含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，优选玻璃材质中不含碱成分等的无碱材料载玻片基板，石英玻璃材料，二氧化硅涂层的玻璃材料或二氧化硅涂层的树脂材料。探针介质中不含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，优选在玻璃或树脂表面上实施了表面处理的材料。作为表面处理，优选使探针易于固定在基材上的处理，特别优选形成利用偶联剂等在基材表面上与探针形成共价键的官能团。
另外，目标物质检测方法对板状等的形状没有限定，但是，从检测方法及装置等的广泛性方面考虑，优选为板状。而且，希望为表面平滑性高的基板材料。
另外，作为用于固定探针的基材，为了将探针均匀且确实地固定在基材上，所述基材优选具有清洁表面。在固定探针前，预先洗涤基材，由此可以确保足够清洁的表面。作为清洁基材的方法，已知有水洗涤、药液洗涤、等离子体洗涤、UV臭氧洗涤、吹风(air blow)洗涤等多种方法。使用这些洗涤方法，优选根据基材的种类改变洗涤方法及洗涤条件等。
例如，探针介质中含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，优选使用药液洗涤基材表面。例如，可以举出如下方法：使用规定浓度的氢氧化钠水溶液充分洗涤基材表面，除去基材上附着的污垢。具体而言，准备加热至50℃左右的1mol/l氢氧化钠水溶液，在水溶液中擦拭基材表面，或边喷淋水溶液、边进行刷洗(brushing)，由此确实地除去附着在基材上的污垢。除去污垢后，用水充分洗去剩余的氢氧化钠。最后，也可以通过喷吹氮气等将水分除去。由此，可以获得能够均匀且确实地固定探针介质中的探针的基材。
探针介质中不含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，优选用水或溶剂洗涤基材表面，或进行吹风洗涤。例如可以举出使用纯水，充分洗涤基材表面，除去附着在基材上的异物的方法。具体而言，通过在基板表面上喷吹高压纯水浴(shower)(2流体浴)而将异物除去。除去异物后，再利用纯水浴进行漂洗，弃去混入异物的纯水。最后，也可以通过喷吹氮气等将水分除去。由此，可以获得能够均匀且确实地固定探针介质的基材。
将探针介质点样在基材上的方法已知有多种方法。作为具体方法，已知有针法、喷墨法、针&环法。其中，由于喷墨法能够高密度且正确地进行点样，因此是优选的点样方法。
在利用喷墨法进行点样的方法中，探针介质中所含的成分只要是如上所示作为探针介质从喷墨头中喷出时对探针、探针可溶的溶剂、探针不溶的有机溶剂及使探针在有机溶剂中可溶化的物质无实质性影响的物质，并且满足能够使用喷墨头从基材中正常喷出的介质组成，就没有特别限定。例如，喷墨头是具有对介质赋予热能而使其喷出的装置的喷墨头时，作为探针介质中所含的成分，优选含有甘油、硫二甘醇、异丙醇、炔属醇的液体。更具体而言，作为探针介质优选使用含有5～10质量％甘油、5～10质量％硫二甘醇和0.5～1质量％炔属醇的液体。另外，喷墨头为使用压电元件使介质喷出的喷墨头时，作为探针介质中所含的成分优选含有乙二醇、异丙醇的液体。更具体而言，作为探针介质优选使用含有5～10质量％乙二醇、0.5～2质量％异丙醇的液体。在这些介质成分中，就探针可溶的溶剂而言，也可以根据需要改变调制顺序，在混合水溶性高分子材料前进行添加。
将由此获得的探针介质由喷墨头喷出，附着在基材上时，点样的形状为圆形，喷出范围并不扩大。高密度地点样探针介质时，能够有效地抑制相邻斑点间的连接。需要说明的是本发明的探针介质的特性并不限定于上述内容。
由于将赋予基材的探针介质中所含的探针固定在规定的位置上，更确实地防止了相邻斑点中所含探针的污染，因此是有效的，并且作为将探针强力固定在基材上的有效方法，有使用具有能够使将探针固定在基材上的有机溶剂与基材、或探针与基材分别互相反应的官能团的物质的方法。
作为优选例，探针介质中含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，可以举出在将探针固定在基材上的物质一侧有硅烷醇基(SiOH)，基材上具有羟基(OH)的组合。利用这一组合，由斑点法赋予基材的探针介质中所含物质的硅烷醇基与基材的羟基发生反应，将物质固定在基材上。对于具体的基材而言，优选如下情况：在将探针固定在基材上的有机溶剂中，硅烷偶联剂为具有硅烷醇基的物质；在基材中，在上述玻璃材料、石英基板材料、树脂基板表面上涂覆了二氧化硅的材料为具有羟基的材料，适合使用。
作为探针介质中不含有将探针固定在基材上的有机溶剂时的优选例，可以举出探针上具有氨基(NH2)、基材侧具有环氧基的组合，探针具有氨基、基材侧具有异氰酸酯基的组合。利用这些组合，由斑点法赋予基材的探针介质中所含的探针的氨基与基材上的环氧基或异氰酸酯基发生反应，将探针固定在基材上。对于具体的基材而言，优选如下情况：探针为附加了氨基的DNA，基材为实施如上所述的表面处理、导入环氧基的树脂基板基材上具有环氧基的材料。
而且，探针介质中含有将探针固定在基材上的有机溶剂时，就探针与将探针固定在基材上的有机溶剂之间而言，在探针与上述物质之间，优选利用反应进行结合。利用反应将探针与上述有机溶剂强力地结合。其结果是能够将探针更强力地固定在基材上，使探针的点样形成在规定位置。特别是调制由具有氨基作为官能团的探针、及由具有异氰酸酯基作为能够与探针反应的官能团、具有硅烷醇基作为能够与基材官能团反应的官能团的物质构成的探针介质，为了达到规定的比率，调制混合了双丙甘醇、异丙醇等的探针溶液。使用喷墨头，将此探针溶液点样在具有羟基作为官能团的基材上时，使探针溶液在基材上形成稳定大小的点。由此，能够将探针固定在基材的规定位置上。
需要说明的是利用探针与将探针固定在基材上有机溶剂间的反应进行结合时，优选在探针介质中混合作为水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)。更优选使其完全溶解。通过在探针介质中混合水溶性高分子材料，使对基材上的点样状态的观察变得容易，点样后的点中的探针介质难以干燥，由此能够使探针介质与基材更确实地反应，从而进行固定。而且，从利用点样制成的探针固定基材的保存状态方面考虑，即使在利用点样形成的探针介质点干燥的情况下，在有效率且稳定地检测目标物质方面也是有效的。
优选使将探针介质点样在基材上得到的基材干燥。通过干燥，将探针介质中的探针确实地固定在基材上。作为干燥的方法，有真空干燥、加热干燥等多种方法，但是从能够简便且确实地实施方面考虑，优选加热干燥。作为加热干燥的方法，优选利用热板进行加热干燥。具体而言，在加热后的热板上静置点样了探针介质的基材。静置规定时间后，取出基材，使其自然冷却。从探针的耐热性方面考虑，热板的温度优选为100℃或100℃以下，更具体而言，优选为60℃～90℃。作为静置时间优选为30min或30min以下，更具体而言，优选为1～10min。
例如，将含有碱基长20mer的探针的探针介质调制成探针浓度为9μmol/l。使探针在有机溶剂中可溶化的物质的添加量基于在探针量上仅乘以碱基链长的数值得到的量进行调制。优选调制成在探针量与碱基链长的数值的乘积上再乘以0.5～3倍得到的量。使用喷墨头，将固相与喷墨头的喷嘴间隔设定为0.2～0.5mm左右，使探针介质从此喷嘴中喷出时(喷出量约为20微微升)，能够在固相上形成直径约170～250μm左右的点，另外，起因于液体由喷嘴喷出时的飞沫的点(以下称为“卫星点”)可以使用放大镜凭借目视观察而被完全确认。
此处，使用此探针固定基材，例如出于提高进行目标物质检测等时的检测精度(点积分强度)的目的，在将此探针固定在固相表面后，也可以进行阻断(blocking)，以便此基材的探针非结合部分不与样品中所含的目标物质等结合。阻断例如将此基材在室温的2％牛血清白蛋白水溶液中浸渍例如2小时而进行。从防止目标物质吸附在基材的探针固定部位之外的效果方面考虑，优选牛血清白蛋白水溶液。需要说明的是此阻断步骤也可以根据需要进行，例如，对应于各点限定地对此探针固定基材进行样品供给。样品对点以外部位的附着因构成基材的材料不同而不同。特别是基材为玻璃、石英、二氧化硅涂层的树脂时也可以不进行阻断处理。
由此制成的探针固定基材也可以根据其用途构成为例如具有含有相同探针的多个点，另外，也可以构成为具有含有不同种类探针的多个点。探针的种类、数量、配置可以根据需要进行适当变更。利用此方法将探针高密度配置成的探针固定基材用于随后的目标物质检测或目标物质碱基序列的鉴定等。例如，用于检测作为样品中可能含有的、碱基序列已知的目标物质的单链核酸时，使用具有与此目标物质的单链核酸的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸作为探针，准备将含有此探针的多个点配置在固相上的探针固定基材，在此探针固定基材的各点中供给样品，在使此目标物质的单链核酸与探针杂交的条件下放置后，用荧光检测等已知方法检测各点中是否有杂交物。由此，进行样品中有无目标物质的检测。
另外，用于样品中所含目标物质的单链核酸中碱基序列的鉴定时，设定此目标物质的单链核酸中碱基序列的多个候补序列，将具有与此碱基序列组分别互补的碱基序列的单链核酸作为探针点样在此基材上。然后，将样品供给至各点，在使此目标物质的单链核酸与探针杂交的条件下静置后，用荧光检测等已知方法检测各点中是否有杂交物。由此能够确定相对于目标物质的单链核酸的碱基序列。另外，作为本发明的探针固定基材的其他用途，例如适用于识别DNA结合蛋白质的特异性碱基序列的筛选或具有在DNA上结合的性质的化学物质的筛选。
探针介质可以以含有有机溶剂的液体介质、探针、探针可溶的溶剂、探针不溶的有机溶剂、使探针在有机溶剂中可溶化的物质、根据需要添加的使探针固定在基材上的有机溶剂而构成的形式提供。也可以以将这些成分至少分成2种成分，分别在不同的容器中，以使用时能够混合的状态的试剂盒的形式提供。
将探针收纳在容器中时，为了不使其他杂质混入容器中，优选能够密闭的容器；另外，为了在固定时易于进行混合，必须是能够开启的容器。就容器的开启而言，没有特别限定。作为收纳在容器中的探针的状态没有特别限定，可以为溶液状，也可以为粉末状。官能团为巯基等时，从探针的稳定性方面考虑，优选在利用冻干法等进行粉末化后，保存在非高温条件下。即使在官能团为氨基等的情况下，为了确保探针的稳定性，保存状态也优选为冷冻保存；可以对应于保存时间、探针种类、探针官能团等变更保存状态。由此，也可以在将探针收纳并保存在容器中的状态下，在固定在基材上时进行混合。
在此用途中，使用表面活性剂作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质时，表面活性剂优选为溶液，但是也可以为粉末状固体，也可以溶解在溶剂中后使用。
将探针可溶的溶剂、探针不溶的有机溶剂、将探针固定在基材上的有机溶剂收纳在容器中时，为了不使其他杂质混入容器中，并且不发生因溶剂挥发而导致的减量，优选能够密闭或被密闭的容器；另外，为了在固定时方便混合，优选能够容易地开启的容器。但是，就容器的开启而言，无特别限定。容器中收纳的溶剂的状态无特别限定，可以为溶液状，也可以为固体状。而且，就将探针固定在基材上的有机溶剂而言，为了形成作为用于将探针固定在基材上的官能团实例的硅烷醇基，也可以为水解的溶液。作为保存状态，为了确保溶剂的稳定性，优选室温保存，可以对应于保存时间等变更保存状态。特别是使用水解后的溶液时，优选保存中温度不上升的情况。另外，对应于将探针固定在基材上的有机溶剂的官能团，优选通过调整水解时、水解后的pH获得稳定性的方法。
将探针固定在基材上时，将收纳在这些容器中的探针及固定探针的有机溶剂混合时，也可以根据需要添加水等溶液。另外，也可以将为了得到探针介质而充分混合的物质，例如水等溶剂预先收纳在其他容器中，在调制探针介质时进行混合。
(实施例)
通过下述实施例更详细地说明本发明。
(实施例1)
(1)探针的合成
作为能够与目标物质特异性结合的探针使用单链DNA探针。使用DNA自动合成机(Applied Biosystems社制，Model 1380A)合成序列号1的单链DNA探针。需要说明的是准备在序列号：1的单链DNA末端，5’末端的羟基经由磷酸基和亚己基结合氨基得到的18倍体寡聚物，用于下述试验。
序列号：1
5’H2N-(CH2)6-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA 3’
(2)探针溶剂
使用水作为探针可溶的介质。
(3)探针可溶化物质
使用十六烷基三甲基溴化铵(正十六烷基三甲基溴化铵)作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质。为了得到十六烷基三甲基溴化铵完全溶解的水溶液，在50℃的水浴中边加热，边使其溶解。
(4)探针不溶的溶剂
作为探针不溶的有机溶剂，在下述试验中使用含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(3-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名：KBE-9007，信越化学工业(株)社制)、异丙醇、双丙甘醇。
(5)探针介质的调制
准备将上述(1)中序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl的纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加并混合20μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基三甲基溴化铵的约65mmol/l水溶液。由此使DNA探针从水溶液中析出，探针介质成为白色混浊。将DNA探针离心沉淀后，滴加30μl上述探针固定物质。充分搅拌、混合后，静置30分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，将作为水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)溶解在纯水中得到浓度0.5质量％的溶液。为了使其完全溶解，在热水浴中边加热至80℃，边搅拌60分钟。在确认无不溶物后，为了在点样时不发生喷嘴堵塞而进行过滤，调制PVA水溶液。
在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
用纯水冲洗1英寸×3英寸的二氧化硅涂层的钠钙玻璃基板(厚度：约1.1mm)，除去表面上附着的异物。使用UV/O3洗涤装置对此基板进行5分钟处理，除去表面上附着的有机物。将经UV/O3洗涤的基板放入盒内，边浸渍在无机碱性洗涤剂(商品名：SEMICLN KG，横滨油脂工业(株)社)的5vol％水溶液中，边照射5分钟超声波。接下来，将盒与基板一同在纯水流中充分冲洗，将附着在基板与盒上的洗涤剂水洗除去。充分冲洗后，将盒与玻璃基板一同浸渍在纯水中，进行5分钟超声波洗涤。超声波洗涤后，在纯水流中充分冲洗，将附着在玻璃基板及盒上的微粒水洗并除去。对水洗后的玻璃基板按每盒进行旋转干燥。为了确认基板是否洗净，测定基板上的纯水接触角。结果为基板的所有部位均处于展开(spread)状态。
(7)探针介质的点样
使用喷墨装置，在基材上对在上述(5)中调制成的探针介质进行点样。对于喷墨头而言，使用压电头。在压电头内填充探针介质，在上述(6)中准备的玻璃基板上点样探针介质。此处，压电喷墨头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离约为0.5mm。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点序列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
用DNA自动合成机合成具有与上述(1)中序列号1的单链DNA探针互补的碱基序列的单链DNA探针，使罗丹明结合在5’末端，得到标记化的单链DNA探针。将此标记化的单链DNA溶解在1MNaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)中，使其最终浓度为50nM，将上述(7)中获得的探针固定基材浸渍在此溶液中，室温(45℃)下进行2小时的杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，Axon Instruments，Inc.制)评价此探针阵列上点的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为5531。点在532nm处的荧光强度积分值为6593912。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为40左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，在点样相同的探针介质得到的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，并且点以约300μm的间隔配置成格子状。
(实施例2)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针溶剂
与实施例1完全相同地使用水作为探针可溶的溶剂。
(3)探针可溶化物质
作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质，使用十六烷基三甲基氯化铵(正十六烷基三甲基氯化铵)。为了得到十六烷基三甲基氯化铵完全溶解的水溶液，在50℃的水浴中边加热，边使其溶解。
(4)探针不溶的溶剂
与实施例1完全相同地准备异氰酸酯硅烷偶联剂、异丙醇、双丙甘醇作为探针不溶的有机溶剂后，将其用于下述试验。
(5)探针介质的调制
准备将序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加并混合20μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基三甲基氯化铵的约163mmol/l水溶液。由此使DNA探针从水溶液中析出，探针介质成为白色混浊。将DNA探针离心沉淀后，滴加30μl上述探针固定物质。充分搅拌、混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，与实施例1完全相同地调制PVA溶液。在如上所述调制的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
与实施例1完全相同地进行基板洗涤，准备玻璃基板。
(7)探针介质的点样
使用在上述(5)中调制成的探针介质，与实施例1完全相同地进行点样，制成探针固定基材。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
与实施例1完全相同地进行杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)评价此探针阵列上点的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为5836。点在532nm处的荧光强度积分值为6377211。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为50左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，并且点以约300μm的间隔配置成格子状。
(实施例3)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针溶剂
与实施例1完全相同地使用水作为探针可溶的溶剂。
(3)探针可溶化物质
作为使探针在有机溶剂中可溶化的物质，使用十六烷基氯化吡啶鎓(十六烷基吡啶鎓氯化物)。为了得到十六烷基氯化吡啶鎓完全溶解的水溶液，边充分搅拌，使其溶解。
(4)探针不溶的溶剂
作为探针不溶的有机溶剂，在下述试验中使用含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(γ-异氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名：Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、异丙醇、双丙甘醇。
(5)探针介质的调制
准备将实施例1(1)中序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl作为探针溶剂的纯水，使探针溶解。充分搅拌至无溶解残留物，利用离心沉淀将溶液集中在容器底部。在溶解了探针的探针溶液中滴加5μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基氯化吡啶鎓的约65mmol/l水溶液，进行混合。由此使DNA探针从水溶液中析出，探针介质成为白色混浊。利用离心沉淀将DNA探针从溶液中分离后，仅滴加5μl上述探针不溶的溶剂中的硅烷偶联剂。轻轻地搅拌并混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，将作为水溶性高分子材料的聚乙烯醇(PVA)溶解在纯水中，使其浓度为0.5质量％。为了使其完全溶解，在热水浴中边加热至80℃，边搅拌60分钟。在确认无不溶物后，为了在点样中不发生喷嘴堵塞而进行过滤，调制PVA水溶液。
在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
用纯水冲洗1英寸×3英寸的二氧化硅涂层的钠钙玻璃基板(厚度：约1.1mm)，除去表面附着的异物。使用UV/O3洗涤装置对此基板进行5分钟处理，除去表面附着的有机物。将经UV/O3洗涤的基板放入盒内，边浸渍在无机碱性洗涤剂(商品名：SEMICLN KG，横滨油脂工业(株)社)的5vol％水溶液中，边照射5分钟超声波。接下来用纯水流充分冲洗盒及玻璃基板，将附着在玻璃基板及盒上的洗涤剂水洗并除去。充分冲洗后，将盒与玻璃基板一同浸渍在纯水中，进行5分钟超声波洗涤。超声波洗涤后，在纯水流中充分冲洗，将附着在玻璃基板及盒上的微粒水洗并除去。对水洗后的玻璃基板按每盒进行旋转干燥。为了确认基板是否洗净，测定基板上的纯水接触角。结果为基板的所有部位均处于展开状态。
(7)探针介质的点样
使用喷墨装置，在基材上对在上述(5)中调制成的探针介质进行点样。对于喷墨头而言，使用压电头。在压电头内填充探针介质，在上述(5)中准备的玻璃基板上点样探针介质。此处，压电喷墨头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离约为0.5mm。点样结束后，用放大镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
用DNA自动合成机合成具有与上述(1)中序列号1的单链DNA探针互补的碱基序列的单链DNA探针，使罗丹明结合在5’末端，得到标记化的单链DNA探针。将此标记化的单链DNA溶解在1MNaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)中，使其最终浓度为50nM，将上述(7)中获得的探针固定基材浸渍在此溶液中，室温(45℃)下进行2小时的杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，Axon Instruments，Inc.制)评价此探针阵列上点的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为22180。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为45左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，点以约300μm的间隔配置成格子状。
(实施例4)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针溶剂
与实施例1完全相同地使用水作为探针可溶的溶剂。
(3)探针可溶化物质
与实施例3完全同样地调制将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在纯水中得到的溶液，将此溶液用于如下试验。
(4)探针不溶的溶剂
作为探针不溶的有机溶剂，与实施例3完全同样地在下述试验中使用含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(γ-异氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂、异丙醇、双丙甘醇。
(5)探针介质的调制
准备将序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加10μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基氯化吡啶鎓的约65mmol/l水溶液，进行混合。由此使DNA探针从水溶液中析出，探针介质成为白色混浊。将DNA探针离心沉淀后，仅滴加5μl上述探针不溶的溶剂中的硅烷偶联剂。充分搅拌、混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，搅拌混合5分钟。
然后，与实施例1完全同样地调制PVA水溶液。在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
与实施例1完全同样地进行基板洗涤，准备玻璃基板。
(7)探针介质的点样
使用在上述(5)中调制成的探针介质，与实施例1完全同样地进行点样，制成探针固定基材。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
与实施例1完全同样地进行杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)评价此探针阵列的点所发出荧光的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为19570。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为45左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，点以约300μm的间隔配置成格子状。
(实施例5)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针溶剂
与实施例1完全相同地使用水作为探针可溶的溶剂。
(3)探针可溶化物质
与实施例3完全同样地调制将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在纯水中得到的溶液，将此溶液用于如下试验。
(4)探针不溶的溶剂
作为探针不溶的有机溶剂，与实施例3完全同样地在下述试验中使用含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(γ-异氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名：Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、异丙醇、双丙甘醇。
(5)探针介质的调制
准备将序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加并混合20μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基氯化吡啶鎓的约65mmol/l水溶液。在混合使探针在有机溶剂中可溶化的物质的同时，滴加20μl使探针介质成为白色混浊的物质，不发生因混合而再次出现的白色混浊，仅能确认极微量的白色混浊。将DNA探针离心沉淀，取出上清液后，仅滴加5μl上述探针不溶的溶剂中的硅烷偶联剂。充分搅拌、混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，与实施例1完全同样地调制PVA水溶液。在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
与实施例1完全同样地进行基板洗涤，准备玻璃基板。
(7)探针介质的点样
使用在上述(4)中调制成的探针介质，与实施例1完全同样地进行点样，制成探针固定基材。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
与实施例1完全同样地进行杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)评价此探针阵列的点所发出荧光的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为7322。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为45左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，与各实施例相比，点的轮廓部分模糊，难以识别，点的大小变为约1/2左右的大小。在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，点以约300μm的间隔配置成格子状。
(实施例6)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针溶剂
与实施例1完全相同地使用水作为探针可溶的溶剂。
(3)探针可溶化物质
与实施例3完全同样地调制将使探针在有机溶剂中可溶化的物质溶解在纯水中得到的溶液，将此溶液用于如下试验。
(4)探针不溶的溶剂
作为探针不溶的有机溶剂，与实施例3完全同样地在下述试验中使用含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(γ-异氰酸根合丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名：Y-5187，日本UNICAR(株)社制)、异丙醇、双丙甘醇。
(5)探针介质的调制
准备将序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加并混合20μl纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加2.5μl使探针在有机溶剂中可溶化的物质即十六烷基氯化吡啶鎓的约65mmol/l水溶液。伴随混合使探针在有机溶剂中可溶化的物质，探针介质出现少量白色混浊。将DNA探针离心沉淀，除去上清液后，仅滴加5μl上述探针不溶的溶剂中的硅烷偶联剂。充分搅拌、混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，与实施例1完全同样地调制PVA水溶液。在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制探针介质。
(6)基板洗涤
与实施例1完全同样地进行基板洗涤，准备玻璃基板。
(7)探针介质的点样
使用在上述(4)中调制成的探针介质，与实施例1完全同样地进行点样，制成探针固定基材。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针阵列)。
(8)杂交处理
与实施例1完全同样地进行杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)评价此探针阵列的点所发出荧光的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为8976。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为45左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，与各实施例相比，点的轮廓部分模糊，难以识别，点的大小变为约1/2左右的大小。在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，点以约300μm的间隔配置成格子状。
(比较例1)
(1)探针的合成
与实施例1完全相同地准备单链DNA探针后，将其用于如下试验中。
(2)探针可溶化物质
在下述试验中不使用上述实施例1及2中使用的使探针在有机溶剂中可溶化的物质。
(3)探针固定物质
与实施例1完全同样地准备作为探针固定物质的异氰酸酯硅烷偶联剂后，将其用于如下试验。
(4)探针介质的调制
准备将序列号：1的单链DNA探针分注成18nmol并进行干燥得到的样品，在其中滴加20μl纯水，使其溶解。在溶解了探针的探针水溶液中滴加30μl上述探针固定物质。充分搅拌并混合后，静置60分钟。
然后，将作为有机溶剂的双丙甘醇、异丙醇分别滴加500μl、1000μl，混合5分钟。
然后，与实施例1完全同样地调制PVA水溶液。在如上所述调制成的探针溶液中，滴加50μl如上所述调制成的PVA水溶液。最后，滴加纯水至探针介质总量为2ml，混合5分钟。混合后，放置30分钟，调制成探针介质。
(5)基板洗涤
与实施例1完全同样地进行基板洗涤，准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
使用在上述(4)中调制成的探针介质，与实施例1完全同样地进行点样，制成探针固定基材。点样结束后，用显微镜观察玻璃基板时，确认玻璃基板表面上形成矩阵状的点阵列。将点样结束后的玻璃基板在加热至80℃的热板上静置5分钟。将经热板处理的基板保存在干燥器中。由此制成探针固定基材(探针排列)。
(7)杂交处理
与实施例1完全同样地进行杂交处理。然后，用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)洗涤探针阵列，洗去未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后，用纯水除去剩余的盐分，吹入氮气使探针阵列干燥。然后，使用荧光扫描仪(商品名：Gene Pix 4000B，AxonInstruments，Inc.制)评价此探针阵列的点所发出荧光的荧光强度。评价时，将激光强度设定为100％，将PMT设定为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描评价结果时，对于与标记化的单链DNA探针完全匹配的序列号：1的DNA探针的点而言，532nm处荧光强度高的部位的辉度为5744。点在532nm处的荧光强度积分值为419192。另外，DNA探针的点部分之外的荧光强度观察结果为40左右。在用荧光观察各DNA探针的点的状态下，各点的形状大致为圆形，与各实施例相比，点的大小缩小至1/4左右。在点样相同的探针介质的点间，几乎确认不到荧光强度的差异。另外，可以观察到相邻点的间隔大致均等，点以约300μm的间隔配置成格子状。
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA探针
<400>1
<>actggccgtc gttttaca 18
Claims (14)
1、一种探针介质，其中含有能够特异性结合目标物质的探针、含有有机溶剂的介质和使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质。
2、如权利要求1所述的探针介质，其中，所述探针为核酸探针。
3、如权利要求1所述的探针介质，其中，所述有机溶剂为所述探针不溶的溶剂。
4、如权利要求1所述的探针介质，其中，使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质为两亲性物质。
5、如权利要求4所述的探针介质，其特征在于，使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质为正十六烷基三甲基溴化铵，正十六烷基三甲基氯化铵，十六烷基氯化吡啶鎓中的任一种物质，或至少含有其中任一种的混合物。
6、如权利要求1所述的探针介质，其中，所述探针介质还含有用于将所述探针固定在基材上的物质。
7、如权利要求6所述的探针介质，其中，用于将所述探针固定在基材上的物质为硅烷偶联剂。
8、如权利要求1所述的探针介质，其中，所述探针介质还含有所述探针可溶的溶剂。
9、如权利要求1所述的探针介质，其中，使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量被调制在确认上述探针介质出现白色混浊的范围内。
10、一种制造含有能够特异性结合目标物质的探针的探针介质的方法，其特征在于，所述方法具有如下步骤：使所述探针溶解在所述探针可溶的溶剂中的步骤；利用使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质与所述溶剂的作用将所述探针从所述溶剂中分离的步骤；和通过添加有机溶剂使所述探针溶解在有机溶剂中的步骤。
11、如权利要求10所述的制造方法，其中，基于所述探针的长度与所述探针摩尔数的乘积，调整使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量。
12、如权利要求10所述的探针介质制造方法，其中，基于所述探针从溶剂中分离的量，调整使所述探针在有机溶剂中可溶化的物质的量。
13、一种探针固定方法，是通过将如权利要求1所述的探针介质利用斑点法赋予到基材上而将探针固定在基材上的方法。
14、一种检测元件，是利用如权利要求13所述的探针固定方法制成的检测元件。
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