KR100778943B1

KR100778943B1 - 귤피 또는 녹차추출물을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의배양방법 및 그 버섯균사체

Info

Publication number: KR100778943B1
Application number: KR1020050133989A
Authority: KR
Inventors: 김순동; 오승희; 이상일; 이현구
Original assignee: 유진바이오팜영농조합법인
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2005-12-29
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20070070944A

Abstract

본 발명은 귤피(citrus peel) 또는 녹차(green tea) 추출물을 함유한 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체에 관한 것이다. 본 발명의 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법은 (i) 소나무잔나비버섯 자실체로부터 균사체를 분리하여 균주를 제조하는 공정; (ii) 건조분쇄한 귤피 또는 녹차잎을 열수추출 및 여과하여 귤피 또는 녹차 추출물을 제조하는 공정; 및, (iii) 전기 수득한 귤피 또는 녹차 추출물, 포도당, 효모추출물, 펩톤, 맥아추출물 및 정제수가 함유된 배지를 이용하여 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하는 공정을 포함한다. 본 발명의 배양방법을 이용하면 일반적인 합성배지로 이용한 경우보다 소나무잔나비버섯 균사체의 수율이 증대되고, 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량이 증가되며, 배양액을 직접 가공식품 소재로 활용할 수 있으므로 소나무잔나비버섯의 약리활성물질을 효율적으로 수득하고, 이를 기능성 식품원료 등으로 사용할 수 있게 하는 효과가 있다.

소나무잔나비버섯, 균사체, 귤피 추출물, 녹차 추출물, 배양방법

Description

귤피 또는 녹차추출물을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체{Cultivation Method of Fomitopsis pinicola Mycelium Using Citrus Peel Extract or Green Tea Extract and Fomitopsis pinicola Mycelium thereof}

도 1은 30℃, 150rpm의 조건 하에서, pH 변화에 따른 YM 배지, 2 중량% 귤피 추출물 배지(CP 배지) 및 2 중량% 녹차 추출물 배지(GT 배지)에서 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 2는 pH 5.0, 150rpm의 조건 하에서, 온도의 변화에 따른 YM 배지, 2 중량% CP 배지 및 2 중량% GT 배지에서 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 3은 0.5 중량%의 포도당 및 0.5 중량%의 효모추출물의 조건 하에서, 귤피 추출물(CP)의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 0.5 중량%의 포도당 및 0.5 중량%의 효모추출물의 조건 하에서, 녹차 추출물(GT)의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 5는 0.5 중량% 효모추출물을 함유한 2 중량% CP 배지 하에서, 포도당의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 0.5 중량% 효모추출물을 함유한 2 중량% GT 배지 하에서, 포도당의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 7은 5.0 중량% 포도당을 함유한 2 중량% CP 배지 하에서, 효모추출물의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 8은 5.0 중량% 포도당을 함유한 2 중량% GT 배지 하에서, 효모추출물의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 9는 5.0 중량% 포도당 및 0.5 중량% 효모추출물을 함유한 2 중량% CP 배지 하에서, 펩톤의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 10은 5.0 중량% 포도당 및 0.5 중량% 효모추출물을 함유한 2 중량% GT 배지 하에서, 펩톤의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 11은 5.0 중량% 포도당, 0.5 중량% 효모추출물 및 0.5 중량% 펩톤을 함유한 2 중량% CP 배지 하에서, 맥아추출물의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 12는 5.0 중량% 포도당, 0.5 중량% 효모추출물 및 0.5% 중량 펩톤을 함유한 2 중량% GT 배지 하에서, 맥아추출물의 농도에 따라 배양된 생 균사체량의 중량을 나타낸 그래프이다.

도 13은 CP 배지를 이용하여 회수한 소나무잔나비버섯 균사체의 알칼리 가용성 다당류를 Sepharose CL-4B를 이용하여 겔여과한 크로마토그래피이다. 상단의 화살표 3개는 각각 분자량 마커이며, 좌측부터 순서대로 2×10⁶, 5×10⁵ 및 3×10⁵(MW)이다.

본 발명은 귤피(citrus peel) 또는 녹차(green tea) 추출물을 함유한 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 일반적인 합성배지로 배양한 경우보다 소나무잔나비버섯 균사체의 수율이 우수하고, 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량이 증가된, 귤피 또는 녹차추출물이 함유된 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체에 관한 것이다.

소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)은 진균류에 속하는 담자균류 버섯 중 민주름버섯목 구멍장이 버섯과 잔나비버섯속에 속하며, 소나무뿐만 아니라 각종 침엽수의 고목 또는 생목의 줄기에도 자생한다. 자루가 없고 갓은 나무줄기에 선반모양으로 붙어서 반원형을 이루며, 갓의 지름은 30cm, 두께는 15cm 정도되는 버섯으로 상단은 두꺼운 각피로 덮여 있어 단단하고, 버섯 갓 둘레 부분에 적갈색의 띠가 둘러져 있으며, 밑면은 황백색으로 미세한 관공이 밀포된 특징을 가지고 있다.

버섯류에서 알려지고 있는 생리활성으로는 항암, 면역증강, 콜레스테롤 및 혈당저하, 뇌졸중 및 심장병 예방과 치유, 감염 방어효과 등이 보고된 바 있으며 그 효과는 이들에 함유된 다당류에 의한 것으로 밝혀지고 있는데 그 대표적인 다당류로서는 Lentinus edodes로부터 추출된 β-1,3-글루칸, Coriolus versicolor의 배양균사체로부터 추출된 PS-K 등이 보고되고 있다. 또한, 대한민국 특허공개 제 2005-60726호에는 혈당강하 특성을 보이는 소나무잔나비버섯 추출물을 개시하고 있다.

버섯의 인공배양법으로는 고체 배양법과 액체 배양법이 이용되고 있으나 전자는 노동력과 소요비용이 높아 효율성이 낮은 반면, 후자는 효율성은 높으나 기반기술이 요구되는 문제점이 지적되고 있다. Lee 등은 표고버섯 균사체 배양의 최적조건으로 온도 25℃, pH 4.0, 교반속도 300rpm, 접종량 10%, 산소통기량 1.0v/v/m을 제시하였으며(참조: Lee, B.W., et al., 'Cultural characteristics and pilot scale fermentation for the submerged mycelial culture of Lentinus edodes', Kor. J. Appl. Microbial Biotechnol., 21, 609-614, (1993)), Fraser는 양송이 균사체 배양시 효모추출물과 카제인은 균사체 증식에 매우 효과적인 영양원으로 보고하였다(참조: Fraser, I.M. 'The growth promptive effect of several amino acids on the common cultivated mushroom', Mushroom Sci., 3, 190-200, (1956)). 균사체의 생육은 탄소원이나 질소원이외에도 비타민류, 금속이온 등 환경조건이 생육에 많은 영향을 미치며, 균사체의 수율증대를 위하여 인삼박 추출물 등 천연소재를 이용한 연구도 있다.

그러나, 상기와 같은 배양방법을 소나무잔나비버섯에 그대로 적용하는 데는 한계가 있었으며, 합성배지를 사용함에 따라 발생하는 위생상의 문제 및 균사체의 수율이 개선되지 않는 문제 등, 아직까지는 소나무잔나비버섯 배양을 위한 최적의 배양방법이 개발되지 않은 실정이다.

따라서, 천연배지를 이용하여 소나무잔나비버섯의 균사체를 배양함으로써 합성배지를 사용함에 따라 발생하는 위생상의 문제를 해결하고, 나아가 배양액을 직접 가공식품 소재로 활용하며, 또한, 균사체의 수율을 개선시킬 수 있는 소나무잔나비버섯의 배양방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 소나무잔나비버섯 균사체의 수율이 우수하고, 추출된 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량이 일반적인 합성배지로 배양한 것보다 증가된, 천연배지를 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 귤피 또는 녹차 추출물이 함유된 배지를 이용하여 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하면, 균사체의 수율도 좋아지고, 유리아미노산 및 다당류의 함량도 증가하며, 합성배지로 인한 위생상의 문제도 발생하지 않음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 소나무잔나비버섯 균사체의 수율을 증가시키고, 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량을 증가시키며, 위생상의 문제가 없는, 귤피 또는 녹차추출물을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법으로 제조된 소나무잔나비버섯 균사체이다.

본 발명의 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법은 (i) 소나무잔나비버섯 자실체로부터 균사체를 분리하여 균주를 제조하는 공정; (ii) 건조분쇄한 귤피 또는 녹차잎을 열수추출 및 여과하여 귤피 또는 녹차 추출물을 제조하는 공정; 및, (iii) 배지의 최종중량에 대하여, 전기 수득한 귤피 또는 녹차 추출물, 포도당, 효모추출물, 펩톤, 맥아추출물 및 정제수가 함유된 배지를 제조한 후, 일정한 배양조건 하에서, 전기 (i)의 균주를 접종하여 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하는 공정을 포함한다.

상기 (iii) 공정의 배지는 배지의 최종중량에 대하여, 귤피 또는 녹차 추출물 0.5 중량% 내지 3.0 중량%, 포도당 3.0 중량% 내지 7.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 펩톤 0.1 중량% 내지 1.5 중량%, 맥아추출물 0.1 중량% 내지 0.7 중량% 및 정제수 86.3 중량% 내지 95.8 중량%를 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (iii) 공정은 pH 4.0 내지 6.0, rpm 150 내지 200 및 온도 25 내지 30℃의 배양조건 하에서 배양하는 것이 바람직하다.

하기의 실시예를 통해서도 명백히 입증되는 바와 같이, 본 발명의 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하기 위한 최적의 배지조성은 귤피 또는 녹차 추출물 2.0 중량%, 포도당 5.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량%, 펩톤 0.5 중량% 및 맥아추출물 0.3 중량%이며, pH 5.0, rpm 150 및 온도 30℃에서 배양하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 배양방법으로 제조된 소나무잔나비비섯의 균사체를 포함한다.

본 발명자들은 안정성이 검증되고 보장된 식용 가능한 천연배지들을 이용하여 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하는 실험을 하던 중, 귤피 추출물 또는 녹차 추출물을 배지에 첨가하여 사용하면 배양액을 직접 가공식품 소재로 활용할 수 있을 뿐 아니라, 균사체의 수율도 증가하고, 유리아미노산 및 다당류 등의 기능성 물질의 함량도 증가됨을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 소나무잔나비버섯의 배양방법을 공정별로 나누어 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

제 1공정: 소나무잔나비버섯 균사체의 분리

소나무잔나비버섯 자실체를 일정한 크기로 절단하고, 70% 에탄올로 세척한 후, 감자, 설탕 및 펩톤을 함유하는 배지에 이식하여 수일간 진탕배양한다. 생성된 소나무잔나비버섯 균사체를 YM agar 배지에 접종하고, 25 내지 35℃에서 5 내지 6일간 배양하여 버섯균사체를 확인한 후, 10 내지 20일 간격으로 계대배양하여 균 주로 사용한다.

제 2공정: 귤피 또는 녹차 추출물의 제조

건조분쇄한 귤피에 증류수를 가하고 냉각관을 부착하여 2 내지 3시간 동안 가열한 후, 여과한 용액을 귤피 추출물 원액으로 한다. 또한, 녹차 추출물도 상기 귤피 추출물 제조방법과 동일한 열수추출법을 사용하여 제조한다. 즉, 녹차잎을 건조분쇄한 후, 증류수를 가하고 냉각관을 부착하여 2 내지 3시간 동안 가열한 후, 여과한 용액을 녹차 추출물 원액으로 한다. 상기 귤피 추출물 및 녹차 추출물은 하기의 제 3공정에서 0.5 중량% 내지 3.0 중량%의 농도로 최종배지에 그 농도를 조정하여 사용한다.

제 3공정: 최적의 배지조성을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양

전기 제 2공정에서 제조된 귤피 또는 녹차 추출물 0.5 중량% 내지 3.0 중량%이 첨가되고, 포도당 3.0 중량% 내지 7.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 펩톤 0.1 중량% 내지 1.5 중량%, 맥아추출물 0.1 중량% 내지 0.7 중량% 및 정제수 86.3 중량% 내지 95.8 중량%로 구성된 배지를 제조한 후, 이를 pH 4 내지 6, rpm 150 내지 200 및 온도 25 내지 30℃의 조건 하에서, 전기 제 1공정의 계대배양한 소나무잔나비버섯 균사체의 배지로 이용하여, 배양기로 배양한다: 이때, 배양조건은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 25 내지 35℃의 온도에서 7 내지 15일간 배양함이 바람직하다.

본 발명의 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법은 귤피 또는 녹차 추출물을 사용한 배지로 배양되는 방법이므로, 배양액을 직접 가공식품 소재로 사용할 수 있을뿐 아니라 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량을 증가시키는 효과를 나타내므로, 소나무잔나비버섯 균사체의 약리활성물질을 최대로 수득할 수 있는 새로운 배양방법으로서 상용화될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 하기의 실시예는 본 발명을 오로지 예시하여 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 소나무잔나비버섯 균사체의 분리

경북 포항시 소재 재생농산에서 분양받은 1년생 소나무잔나비버섯의 자실체로부터 소나무잔나비버섯 균사체를 분리하였다. 2×2×2mm의 크기로 절단한 자실체 일정량을 70% 에탄올로 세척한 후, 감자 2.0 중량%, 설탕 1.0 중량% 및 펩톤 0.6 중량%를 함유하는 배지에서 5.0 중량% 되도록 이식하여 10일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 전기 배양으로 생성된 소나무잔나비버섯 균사체를 YM agar 배지(효모추출물 0.5 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 맥아추출물 0.2 중량%, 포도당 1.0 중량% 및 아가 2.0 중량%, pH 6.5)에 접종하고, 30℃에서 5 내지 6일간 배양하여 버섯균사체를 확인한 후, 15일 간격으로 계대배양하여 균주로 사용하였다.

실시예 2: 열수추출법을 이용한 귤피 및 녹차 추출물의 제조

대구약령시에서 구입한 귤피(진피)를 건조분쇄(100mesh)하고, 전기 건조분쇄된 귤피 100g에 증류수 2.5L를 가한 다음, 냉각관을 부착하여 2시간 동안 가열한 후, Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과한 여액을 원액으로 한 귤피 추출물을 제조하였다.

또한, 녹차 추출물은 시판되는 설록차(태평양(주))를 사용하여 상기 귤피 추출물의 제조방법과 동일한 열수추출법으로 제조하였다. 즉, 건조분쇄(100mesh)한 녹차잎 100g에 증류수 2.5L를 가한 다음, 냉각관을 부착하여 2시간 동안 가열한 후, Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과한 여액을 원액으로 한 녹차 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 귤피 또는 녹차 추출물 배지의 최적조성 및 최적조건을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양

실시예 3-1: 최적 pH, 온도 및 rpm의 결정

소나무잔나비버섯 균사체 증식에 미치는 최적 pH를 조사하기 위하여, 배지의 pH를 4 내지 7까지 조정하여 30℃에서 150rpm으로 10일간 배양한 배양액의 균사체량을 측정하였다(참조: 도 1). 예비실험결과, 귤피 추출물 배지(citrus peel broth: CP 배지)와 녹차 추출물 배지(green tea broth: GT 배지) 만을 사용한 경우는 균사체의 성장이 불량하여 포도당과 효모추출물을 각각 0.5 중량% 혼합한 배지를 사용하였다. 그 결과, pH 5에서의 생 균사체량은 YM 배지의 경우, 9.36g/100mL, 2 중량%의 CP 배지의 경우는 9.86g/100mL, 2 중량%의 GT 배지의 경우는 11.23g/100mL로 pH 4, 6, 7의 경우보다 높았으며, 2 중량% GT 배지 > 2 중량% CP 배지 > YM 배지 순으로 2 중량% GT 배지에서 성장률이 높았다.

또한, 소나무잔나비버섯 균사체 증식에 미치는 최적 온도를 조사하기 위하여, 각 배지의 pH를 5, rpm은 150으로 고정한 후, 온도별(20 내지 40℃)로 10일간 배양한 배양액 내의 균사체량을 조사한 결과이다. 그 결과, 균사체 량은 YM 배지에서는 25℃ 내지 30℃에서 8.86 내지 8.93g/100mL, 2 중량% CP 배지의 경우는 9.67 내지 9.81g/100mL, 2 중량% GT 배지의 경우는 9.99 내지 10.12g/100mL로, 2 중량% GT 배지에서 가장 높았다. 25℃와 30℃는 유의적인 차이는 없었으나, 30℃의 경우가 다소 높은 값을 나타내었으며, 이보다 온도가 낮거나 높을 경우는 감소하였다(참조: 도 2).

rpm이 소나무잔나비버섯 균사체 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여, pH를 5, 온도를 30℃로 고정하고, rpm을 0에서 200rpm까지 조절하여 10일간 배양한 후 균사체 량을 비교한 결과, rpm이 증가할수록 균사체 량이 증가하였으며, 150rpm과 200rpm의 양상은 비슷하였다. 본원에서는 쉐이킹 속도를 150rpm으로 하여 배양하였다.

실시예 3-2: 최적 배양 기간 및 배지 내 귤피 및 녹차 추출물 함량의 결정

배양기간에 따른 균사체의 성장도를 알아보기 위하여, 배양온도 30℃, pH는 5 및 rpm은 150으로 고정한 후, YM 배지, 0.5 중량%의 포도당과 효모추출물을 함유하는 GT 및 CP 배지에서 GT와 CP의 농도를 달리하여 10일간 배양한 경우의 균사체량을 비교해 보았다. 전 배양기간을 통하여 CP 및 GT 배지의 경우가 YM 배지에 비하여 높은 값을 나타내었으며, YM 배지에서는 2일이 경과된 후부터 급속히 성장하여 6일째는 접종량의 약 9.5배를 나타내었으며, 8일 후부터는 성장이 둔화되어 10일째의 생 균사체량은 9.36g/100mL 이었다. CP 배지의 경우, 배양 10일째까지 직선적인 성장을 보였으나, GT 배지는 8일 이후부터 성장이 둔화되었다. 농도별로는 CP 배지와 GT 배지 모두 2 중량% 농도에서 성장이 가장 높았으며, 3 중량%에서는 성장이 다소 저해되었다(참조: 도 3 내지 4).

실시예 3-3: 포도당, 효모추출물, 펩톤 및 맥아추출물의 최적함량 결정

균사체의 생육에 미치는 탄소원의 영향을 알아보기 위하여, 0.5 중량%의 효모추출물을 함유하는 2 중량% CP 배지 및 2 중량% GT 배지에 포도당 함량(0.5, 1.0, 3.0, 5.0 및 7.0 중량%)을 달리하여 30℃, 150rpm으로 배양하면서 생 균사체량을 조사한 결과, 최적 포도당 농도는 CP 및 GT 배지에서 모두 5 중량%이었다(참조: 도 5 내지 6).

또한, 균사체의 생육에 미치는 효모추출물의 영향을 알아보기 위하여, 포도당의 농도를 5 중량%로 고정하고, 효모추출물의 농도(0, 0.5, 1.0 및 1.5 중량%)를 달리하여 배양한 결과, CP 및 GT 배지 모두에서 효모추출물의 농도가 0.5 중량%일 경우에 성장이 가장 우수하였다(참조: 도 7 내지 8).

또한, 균사체의 생육에 미치는 펩톤의 영향을 알아보기 위하여, 포도당의 농도를 5 중량%, 효모추출물의 농도를 0.5 중량%로 고정한 후, 펩톤의 농도(0, 0.5, 1.0 및 1.5 중량%)를 달리하여 그 결과를 알아보았다. 그 결과, CP 및 GT 배지 모두에서 최적 펩톤 농도는 0.5 중량%로 나타났다(참조: 도 9 내지 10).

또한, 균사체의 생육에 미치는 맥아추출물의 영향을 알아보기 위하여, 포도당 5 중량%, 효모추출물 0.5 중량% 및 펩톤 0.5 중량%를 고정한 후, 맥아추출물의 농도(0, 0.3, 0.5 및 0.7 중량%)를 달리하여 그 결과를 알아보았다. CP 및 GT 배지 모두에서 최적 맥아추출물의 농도는 0.3 중량%로 나타났다(참조: 도 11 내지 12).

실시예 3-4: 최적배지 및 최적조건을 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양

전기 실시예 3-1 내지 3-3을 통하여, 2.0 중량%의 귤피 추출물, 5.0 중량%의 포도당, 0.5 중량%의 효모추출물, 0.5 중량%의 펩톤, 0.3 중량%의 맥아추출물 및 91.7 중량%의 정제수를 함유하는 귤피 추출물 배지(pH 5.0)를 제조하였으며, 귤피 추출물 대신 녹차 추출물(2.0 중량%)이 함유된 점을 제외하고는 상기 귤피 추출물 배지의 조성과 동일하게 녹차 추출물 배지(pH 5.0)를 제조하였다.

상기 제조된 귤피 추출물 배지(CP 배지) 및 녹차 추출물 배지(GT 배지)에 실시예 1에서 균주로 준비한 소나무잔나비버섯 균사체를 접종하고, 발효기(Biotron INC. Hanil R&D, Korea)를 사용하여 30℃, 150rpm에서 10일간 배양한 후, 전기 배양액을 Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과하여 생균사체를 수득하였다.

실시예 4: 배지에 따른 소나무잔나비버섯 균사체의 수율 및 배양여액의 탁도비교

소나무잔나비버섯 균사체의 성장에 미치는 천연배지의 영향을 알아보기 위하여, 대조구 배지로 사용한 YM 배지와 천연배지로서 CP 배지 및 GT 배지를 사용하여 각각 30℃, 150rpm에서 10일간 배양한 균사체의 수율과 그 여액의 탁도를 측정한 결과를 표 1에 나타내었다. 10일간 배양한 배양액을 Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과하여 얻은 생 균사체의 중량을 측정하여 수율을 구하였으며, 수분함량은 105℃ 건조법으로, 그 여액의 탁도는 660nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 1: 30℃, 10일간 YM, CP 및 GT 배지에서 배양한 균사체의 수율과 그 여액의 탁도

측정	YM 배지^a)	CP 배지^b)	GT 배지^c)
균사체의 양 (g/100mL)	9.89±0.41 (0.59±0.02)^d)	34.20±0.87 (2.62±0.0)^d)	42.30±1.35 (3.32±0.10)^d)
탁도(OD at 660nm)	0.22±0.02	0.16±0.01	0.14±0.01

a) YM 배지: 효모추출물 0.5 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 맥아추출물 0.2 중량%, 포도당 1.0 중량%, pH 6.5

b) CP 배지: 귤피 추출액 2.0 중량%, 포도당 5.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 맥아추출물 0.3 중량%

c) GT 배지: 녹차 추출액 2.0 중량%, 포도당 5.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 맥아추출물 0.3 중량%

d) 건조된 균사체의 양이며, 평균±표준편차로 기재됨

상기 표 1에서 보듯이, 생균사체 양은 GT 배지에서 42.3%(w/v), CP 배지에서 34.2%(w/v) 및 YM 배지에서 9.89%(w/v) 수득되었으며, 건물량으로는 각각 3.32%(w/v), 2.62%(w/v) 및 0.59%(w/v)으로 GT 및 CP 배지가 YM 배지에 비하여 각각 4.28 및 3.46배가 높았다. 균사체를 제거한 여액의 탁도는 GT 배지가 0.14로 가장 낮았으며 다음으로 CP 0.16, YM 0.22 순이었다.

녹차 및 귤피 추출물을 사용한 배지는 대조구로 사용한 YM 배지에 비하여 균사체 생육이 촉진되었으며 이것은 이들 배지에 균사체 생육에 필요한 아미노산과 비타민류를 비롯한 다양한 영양소를 함유한 때문이라 사료된다.

실시예 5: 배지에 따른 균사체 및 균체외 유리아미노산 및 유리아미노산 유도체의 함량 비교

YM, CP 및 GT 배지에서 30℃, 10일간 배양한 균사체 및 균체외 유리아미노산의 함량을 각 배지별로 비교해 보았다. 균사체 50g에 75% 에탄올 250mL을 가하여 균질화한 후, 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 40℃에서 감압농축하고, 0.2M 시트르산 완충액으로 용해시켜 50mL로 정용하였으며, 이를 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 아미노산 자동분석기(Hitachi L-8800, Japan)로 분석하였다. 분석조건은 하기와 같다: ultrapac II 양이온 교환수지 250mm, pH 2.80, 3.00, 3.15, 3.50 및 3.55의 시트르산 완충액, 20mL/hr의 완충액 유속, 20mL/hr의 닌히드린 유속, 35 내지 80℃의 컬럼온도, 2mm/min의 차트속도 및 40㎕의 주입량. 또한, 균체외 유리아미노산 측정은 배양여액 50mL에 75% 에탄올 250mL을 가한 후, 실온에서 24시간 방치한 다음, 원심분리부터 상기의 균사체 방법과 동일한 방법으로 전처리하여 아미노산을 분석하였다. CP 및 GT 배지에서 분리된 균사체의 구성 유리아미노산은 총 18종으로 전체함량은 CP 배지에서 1060.53mg%, YM 배지에서 928.19mg% 및 GT 배지에서 764.83mg%로 CP 배지에서 가장 높았으나 필수 아미노산 함량은 YM 배지에서 417.37mg%, CP 배지에서 394.79mg% 및 GT 배지에서 308.79mg%로 YM 배지에서 높았다.

또한, 균체외 유리아미노산의 결과를 살펴보면, 총 유리아미노산의 함량은 CP 954.55mg%, GT 838.69mg% 및 YM 659.75mg%로 나타났으며, 필수아미노산 함량은 CP 463.96mg%, GT 380.82mg% 및 YM 343.51mg%으로 CP 배지에서 가장 많았다(참조: 표 2).

표 2: 30℃, 10일간 YM, CP 및 GT 배지에서 배양된 균체외 유리아미노산의 함량(단위: mg/100mL)

아미노산	YM 배지	CP 배지	GT 배지
알라닌	78.43	111.32	82.73
β-알라닌	5.41	15.46	14.80
아르기닌^*	62.33	71.91	63.02
아스파르트산	35.81	62.50	60.49
시스타인	2.38	6.19	5.96
글루탐산	117.92	179.43	203.55
글리신	13.91	26.12	19.92
트레오닌^*	31.79	49.17	39.19
히스티딘^*	22.48	24.71	20.90
이소루신^*	23.57	40.83	35.37
루신^*	53.81	88.06	62.69
라이신^*	100.72	113.14	97.66
메티오닌^*	3.41	5.66	6.42
페닐알라닌^*	0.92	0.20	0.53
프롤린	16.57	27.55	19.65
세린	29.83	50.39	41.19
티로신	6.98	11.63	9.58
발린^*	44.48	70.28	55.04
총 필수 아미노산 총 아미노산	343.51 659.75	463.96 954.55	380.82 838.69

*: 필수 아미노산

또한, YM, CP 및 GT 배지에서 30℃, 10일간 배양한 균사체 및 균체외 아미노산 유도체의 함량을 조사하였다. YM, CP 및 GT 배지에서 분리된 균사체의 아미노 산 유도체의 총 함량은 CP 배지 258.77mg%, GT 배지 234.81mg% 및 YM 배지 226.56mg%로 CP 배지에서 가장 높았으며, 또한, YM, CP 및 GT 배지의 균체외 아미노산 유도체의 함량은 하기 표 3에서 보듯이, CP 배지 210.55mg%, GT 배지 206.14mg% 및 YM 배지 126.47mg%로 균사체의 아미노산 유도체의 함량과 동일한 경향을 나타내었다.

표 3: 30℃, 10일간 YM, CP 및 GT 배지에서 배양한 균체외 아미노산 유도체의 함량

아미노산 유도체	YM 배지	CP 배지	GT 배지
α-아미노아디프산	2.26	3.89	2.75
α-아미노이소부티르산	2.44	3.15	2.37
β-아미노이소부티르산	0.83	2.00	1.42
γ-아미노이소부티르산	6.02	11.89	3.93
암모니아	13.89	12.02	10.14
안세린	13.31	16.57	16.06
카르노신	0	0	0
시스타티오닌	18.70	22.48	14.01
에탄올아민	1.04	2.14	2.13
히드록시프롤린	25.44	68.80	79.59
DL-5-히드록시라이신	3.65	5.56	5.49
3-메틸히스티딘	0.55	0.54	1.23
오르니틴	7.02	11.88	12.91
포스포에탄올아민	2.56	5.83	4.23
포스포세린	15.52	23.60	20.95
사코신	2.54	3.12	18.20
타우린	2.04	4.43	4.48
요소	8.66	11.65	6.25
총합	126.47	210.55	206.14

상기 표 3에서 보듯이, YM, CP 및 GT 배지에서의 균체외 주 아미노산 유도체는 히드록시프롤린(25.44 내지 79.59mg%)으로 GT 배지에서 가장 높았으며, 다음으로 포스포세린, 시스타티오닌 및 안세린 순으로 분포하였다. 반면 균사체에서는 미량으로 존재하던 카르노신이 여액에서는 존재하지 않았다.

실시예 6: 배지에 따른 균사체와 균체외 다당류의 함량

YM, CP 및 GT 배지에서 30℃, 10일간 배양한 배양액으로부터 분리한 균사체 및 배양여액 내의 알콜 불용성 물질(AIS)의 함량과 산 및 알칼리 가용성 다당류의 함량을 측정하였다. 균사체 및 균사체를 제거한 배양액을 각각 100g과 100mL을 취하고, 80% 에탄올 250mL을 가하여 균질화한 후, 80℃에서 10분간 중탕하여 효소를 불활성시켰다. 그런 다음 다시 80% 에탄올로 3회 세척, 여과하여 알콜 불용성 물질을 수득하였다. 산 가용성 다당류 함량은 AIS에 0.05N 황산을 100mL 가하여 100℃에서 5시간 가열한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 알콜 침전물로 하였다. 알카리 가용성 다당류의 함량은 HAS(homogenization after alkali swelling)법으로 측정하였다. 즉, 산 가용성 다당류를 제거시킨 잔사에 2N KOH를 잔사량과 동일한 양으로 가하여 1시간 동안 팽윤, 균질화시킨 후 100mesh의 체를 사용하여 분리하고 HCl로 중화시킨 다음 dialysis cellulose tube(MW cut off 12,000)에 넣어 증류수에서 72시간 투석한 후 동결건조한 것을 알칼리 가용성 다당류로 하였다. 함량을 측정한 결과를 아래 표 4에 나타내었다.

표 4: 30℃, 10일간 배양한 소나무잔나비버섯 균사체 및 배양여액에서의 알콜 불용성 물질(AIS), 산 가용성 다당류 및 알칼리 가용성 다당류의 함량비교

샘플	배지	AIS	산 가용성 다당류	알칼리 가용성 다당류
균사체 (%, w/w)	YM 배지	6.51±0.29 (0.64±0.01)	0.39±0.03 (0.04±0.00)	4.56±0.20 (0.45±0.02)
	CP 배지	7.44±0.32 (2.54±0.10)	0.18±0.01 (0.06±0.00)	5.21±0.31 (1.78±0.09)
	GT 배지	7.29±0.33 (3.08±0.12)	0.69±0.04 (0.29±0.01)	5.18±0.27 (2.19±0.13)
배양여액 (%, w/v)	YM 배지	4.89±0.21 (0.48±0.04)	0.09±0.00 (0.01±0.00)	3.57±0.11 (0.35±0.02)
	CP 배지	4.18±0.23 (1.43±0.08)	0.69±0.03 (0.24±0.01)	3.01±0.13 (1.03±0.06)
	GT 배지	9.84±0.52 (4.16±0.22)	0.87±0.04 (0.37±0.02)	6.79±0.31 (2.87±0.12)

상기 표 4에서 보듯이, 생균사체 100g 당의 AIS 함량은 YM 배지의 경우 6.51%(w/w)이었으나, CP 및 GT 배지의 경우는 각각 7.44%(w/w) 및 7,29%(w/w)로 대조구로 사용한 YM 배지에서보다 높았다. 배양여액에서의 AIS 함량은 YM 배지와 CP 배지에서는 각각 4.89%(w/v) 및 4.18%(w/v)이었으나 GT 배지에서는 9.84%(w/v)로 2배 이상의 높은 함량을 나타내었다. 균사체 및 배양여액의 산 가용성 다당류의 함량은 GT 배지가 각각 0.69%(w/w) 및 0.87%(w/v)로 CP 및 YM 배지에 비하여 높았다. 균사체의 알칼리 가용성 다당류 함량은 CP 및 GT 배지가 5.18 내지 5.21%(w/w)의 비슷한 값으로 YM 배지 4.56%(w/w)보다 높았으며, 배양여액의 알칼리 가용성 다당류 함량은 GT 배지 6.79%(w/v), CP 및 YM 배지에서는 3.01 내지 3.57%(w/v)로 GT 배지에서 현저하게 높았다.

실시예 7: 알칼리 가용성 다당류의 겔 여과

실시예 6에서 CP 배지를 이용하여 회수한 균사체 알칼리 가용성 다당류를 Sepharose CL-4B를 이용한 겔여과 결과(참조: 도 13), 47 내지 54번 분획에서 1개의 단백질 피크가 나타났으며, 39 내지 48번 분획에서 헥소스(hexose) 피크가 나타났고, 펜토스(pentose) 피크는 검출되지 않았다. 따라서, 소나무잔나비버섯의 알칼리 가용성 다당류는 헥소스 중합체와 단백질이 결합하는 단백 다당체인 것으로 추정된다. 이들 구성 다당체의 평균 분자량은 300,000 내지 500,000 dalton이며, 여기에 분자량 10,000 dalton 이하의 단백질이 결합된 것으로 사료된다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 귤피 또는 녹차추출물을 함유한 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법 및 그 버섯균사체에 관한 것이다. 본 발명의 배양방법을 이용하면 일반적인 합성배지로 이용한 경우보다 소나무잔나비버섯 균사체의 수율이 증대되고, 유리아미노산 또는 다당류 등의 기능성 물질의 함량이 증가되며, 배양액을 직접 가공식품 소재로 활용할 수 있으므로 소나무잔나비버섯의 약리활성물질을 효율적으로 수득하고, 이를 기능성 식품원료 등으로 사용할 수 있게 하는 효과가 있다.

Claims

(i) 소나무잔나비버섯 자실체로부터 균사체를 분리하여 균주를 제조하는 공정;

(ii) 건조분쇄한 귤피 또는 녹차잎을 열수추출 및 여과하여 귤피 또는 녹차 추출물을 제조하는 공정; 및,

(iii) 전기 (ii)에서 수득한 귤피 또는 녹차 추출물, 포도당, 효모추출물, 펩톤, 맥아추출물 및 정제수가 함유된 배지를 제조한 후, 전기 (i)의 균주를 접종하여 소나무잔나비버섯 균사체를 배양하는 공정을 포함하는, 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법.
제 1항에 있어서,

상기 (iii) 공정의 배지는 배지의 전체 중량에 대하여, 귤피 또는 녹차 추출물 0.5 중량% 내지 3.0 중량%, 포도당 3.0 중량% 내지 7.0 중량%, 효모추출물 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 펩톤 0.1 중량% 내지 1.5 중량%, 맥아추출물 0.1 중량% 내지 0.7 중량% 및 정제수 86.3 중량% 내지 95.8 중량%가 함유된 배지임을 특징으로 하는 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법.
제 1항에 있어서,

상기 (iii) 배양 공정은 pH 4.0 내지 6.0, rpm 150 내지 200 및 온도 25 내지 30℃의 배양 조건 하에서 진행하는 것을 특징으로 하는 소나무잔나비버섯 균사체의 배양방법.
제 1항에 의한 배양방법으로 제조된 소나무잔나비버섯 균사체.