KR101171159B1 - 소나무잔나비버섯으로부터 분리된 열안정성 자일라나제 및 이의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소나무잔나비버섯으로부터 분리한 자일라나제에 관한 것으로, 고온에서도 뛰어난 열안정성을 가지며 산성환경에서도 우수한 활성을 갖는 자일라나제를 제공한다.

Description

소나무잔나비버섯으로부터 분리된 열안정성 자일라나제 및 이의 생산방법{Thermostable xylanase purified from Fomitopsis pinicola sp.and method of production thereof}

본 발명은 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)으로부터 분리한 우수한 열안정성을 갖는 자일라나제 및 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.

자일란은 분화된 활엽수에서의 주요 헤미셀룰로스이다. 침염수가 15-25%의 헤미셀룰로스만을 포함하는데 반해 활엽수는 25-32%의 헤미셀룰로스로 구성되어 있어 바이오매스의 엄청난 보유고로 관심을 받고 있다. 자일란은 자연계에 존재하는 고정탄소의 중요한 보고로 여겨지고 있어, 이를 효과적이고 경제적으로 분해하기 위해 자일란 분해 효소인 자일라나제를 사용하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재 특성화되어있는 자일라나제 대부분은 대부분의 진균성 자일라나제에서는 약산성 pH 수치(pH 5.0-6.0)에서 최적의 활성을 보이는 반면 박테리아성 자일라나제의 pH 수치 최적조건은 일반적으로 약간 더 높다. 특성화된 자일라나제 대부분은 40℃ 내지 70℃의 온도에서 최적 활성을 보인다.

자일란은 4-O-메틸-글루코로노실, 4-O-아라비노실 및 아세트산 측쇄기를 포함하는 자일로피라노실 잔기의 β-1,4-결합 주쇄를 갖는 복합성 및 높은 가변성의 다당류이다. 엔도-1,4-β-D-자일라나제(EC 3.2.1.8)는 자일란 주쇄의 무작위 절단에 의한 것이므로 상업적으로 주목할만한 효소이다. 여러 엔도-1,4-β-D-자일라나제의 아미노산 서열 비교는 자일라나제가 주로 GH의 두 패밀리인 GH10 및 GH11로 분류됨을 나타낸다. 그러나, 다른 GH 패밀리인, 5, 7, 8 및 43 또한 증명된 엔도-1,4-β-D-자일라나제 활성을 갖는 별개의 촉매 도메인을 포함함이 발견되었다. 패밀리 GH11의 자일라나제는 낮은 pI 수치를 갖는 고분자량의 패밀리 GH10에 비해 pI 8-9.5를 갖는 저분자량을 나타낸다.

현재 공지된 자일라나제 진균은 대부분 자낭균류(ascomycetes)이며, 아르페르길루스(Aspergillus)(de Vries and Visser 2001) 및 트리코데르마(Trichoderma)(Wong and saddler 1992)에 의해 생성된 효소가 승인된 것이 특히 주목받고 있다. 펙티나아제와 함께 자일라나제 및 셀룰라제는 세계 효소 시장의 약 20%를 차지하고 있으며, 기존의 자일라나제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 및 pH 조건 하에서도 활성도를 유지하는 자일라나제를 개발하기 위한 노력이 계속되고 있다.

현재 알려진 국내의 자일라나제 관련 특허로는 자일라나제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 등록특허 10-0411771), 신규한 셀룰로시미크로비움 ｓｐ．ＨＹ?１２ 균주 및이로부터 생산되는 자일라나제에 대한 특허(대한민국 등록특허 10-080561) 및 신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주의 자일라나제(대한민국 공개특허 2007-0082329), 자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 ｓｐ. ＨＰＬ-001 균주, 및 신규한 자일라나아제 효소에 대한 특허(대한민국 공개특허 2010-0021175) 등이 있으나 실제로 국내에서 여러 분야에 사용되지 못하고 있는 실정이며, 또한 산성 환경이나 고온에서 활성을 유지하는 자일라나제의 개발에 대해서는 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 예의 연구를 진행한 결과 안출한 것으로, 특히 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)으로부터 분리한 우수한 열안정성을 갖는 자일라나제 및 이의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 소나무잔나비버섯으로부터 자일라나제를 분리하고 이의 특이 활성, pH, 환원당 수치를 측정하고, 분자량을 결정하고, pH 또는 온도에 따른 활성을 측정하고, 열 불활성화를 평가함으로써 달성하였다.

본 발명의 소나무잔나비버섯으로부터 분리된 자일라나제는 산성 환경 및 고온에서도 우수한 활성을 나타내는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 볏짚에서 소나무잔나비버섯 KMJ812에 의한 자일라나제 생성시 시간 경과에 따른 특이 활성, pH 및 잔여 환원당 수치를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 자일라나제의 PAGE 및 분자량 결정을 나타낸 것이다. 도 2a는 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 자일라나제의 PAGE로서, 라인 1은 분자량 마커이고 라인 2는 세포 추출물이며 라인 3은, DEAE 이온-교환 분획이고 라인 4는 MonoQ 이온 교환 분획의 SDS-PAGE이다. 도 2b는 세파크릴 S-300 고해상도 컬럼 상의 겔 여과 크로마토그래피에 의한 소나무잔나비버섯 자일라나제의 분자량 결정을 나타낸 것이다. 컬럼을 알도스(168 kDa), 오브알부민(43 kDa), 키모트립시노겐(25 kDa) 및 리보누클레아제 A(13.7 kDa)와 같은 표준 분자량 단백질로 조정했다.
도 3은 소나무잔나비버섯 자일라나제의 활성에서 pH 및 온도의 효과를 나타낸 것이다. 도 3의 (A)는 소나무잔나비버섯 KMJ812로부터 정제된 자일라나제의 활성에서 pH의 효과를 나타낸 것이다. 효소 활성을 요구되는 pH를 얻기위해 버퍼를 바꾸면서 표준 검정 방법으로 측정하였다. 버퍼로는 시트르산염(pH 3.0 내지 4.5), 아세트산나트륨(pH 4.5 내지 6.0) 및 인산염(pH 6.0 내지 8.0)을 사용했다. 도 3의 (B)는 소나무잔나비버섯 KMJ812로부터 정제된 자일라나제의 활성에서 온도의 효과를 나타낸 것이다. 효소 활성을 표준 검정 방법을 사용하여 다양한 온도에서 검정했다. 각 수치는 3회 측정치의 평균이며 평균으로부터 15% 이상 변하지 않는다.
도 4는 소나무잔나비버섯 자일라나제의 열 불활성화를 나타낸 것이다. 효소를 40℃, 50℃, 60℃, 65℃ 및 70℃에서 시간을 달리하여 배양했다. 시료는 각 시간 간격에서 회수되었으며 상대적 활성도를 측정했다.

여러 균주로부터의 자일라나제의 정제 및 특성이 보고되었지만, 본 발명은 담자균류인 소나무잔나비버섯으로부터의 자일라나제의 정제 및 특성화에 대해 처음으로 보고한 것이다. 소나무잔나비버섯으로부터 정제된 세포외 자일라나제는 58 kDa의 분자량을 갖는 단량체이다. 소나무잔나비버섯 자일라나제의 분자량은 다른 진균류로부터 특성화된 많은 세포외 자일라나제와 동일하다. 일반적으로, 자일라나제를 포함하는 GH는 상대적으로 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 특성화되었으며 소나무잔나비버섯 자일라나제 또한 상대적으로 광범위한 기질 특이성을 나타낸다.

본 발명의 자일라나제는 1) 소나무잔나비버섯 배양액을 원심분리한 후 세척하는 단계; 2) 세척액과 상청액을 혼합하고 농축한 후 여과하여 조효소액을 수득하는 단계; 및 3) 상기 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 통해 생산된다.

실시예 1. 자일라나제 생성 균주의 스크리닝

모든 진균류 균주들은 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)로부터 입수했다. 자일라나제를 생성하는 112개 진균류의 초기 스크리닝을 0.4% 레마졸 브릴리언트 블루(Remazol Brillinat Blue) 자일란을 포함하는 한천 평면배지에서 실시했다. 관찰된 클리어런스(clearance) 부분을 기초로, 15개 균주를 선택했다. 15개 균주 이외에, 효과적인 자일라나제-생성 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola) KMJ812(KACC로부터 입수)을 추가 연구를 위해 선택했다. 15개 균주를 8 g/l의 펩톤, 2 g/l의 이스트 추출물, 5 g/l의 KH₂PO₄, 5g/l의 K₂HPO₄, 3 g/l의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.005 g/l의 티아민ㆍHCl 및 오트 스펠트 자일란(Sigma, MO, USA)을 포함하는 3 ml 성장 배지에 접종하고 28 ℃에서 7일간 200 rpm으로 교반하면서 배양했다. 배양액의 자일라나제 활성을 1% 오트스펠트 자일란을 기질로 사용하여 분석했다. 분석 후에, 가장 높은 자일라나제 활성을 갖는 균주를 선택했다.

실시예 2. 소나무잔나비버섯의 배양

플라스크 배양에서, 소나무잔나비버섯 KMJ812의 균사를 100 ml의 포테이토 덱스트로스 배양액에 접종했다. 전배양체(5 ml)를 1L 발효조 내에서 200 ml 자일란 배지에 접종했다. 이 배양 배지는 8 g/l의 펩톤, 2 g/l의 이스트 추출물, 5 g/l의 KH₂PO₄, 5g/l의 K₂HPO₄, 3 g/l의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.005 g/l의 티아민ㆍHCl 및 오트스펠트 자일란을 포함한다. 자일라나제 생성에서 탄소원 또는 질소원의 효과를 50 g/l의 탄소원 및 다양한 질소원으로 구성된 배지를 함유하는 플라스크에서 17일간 배양한 후 조사했다. 질소원의 농도는 Kjeldahl 방법을 사용하여 질소의 동일 함량으로 조절했다. 자일라나제 생산에 사용된 배지는 8 g/l의 펩톤, 2 g/l의 이스트 추출물, 5 g/l의 KH₂PO₄, 5g/l의 K₂H PO₄, 3 g/l의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.005 g/l의 티아민ㆍHCl 및 20 g/l의 볏짚을 포함한다.

실시예 3. 자일라나제 생성을 위한 탄소원 및 질소원의 최적화

자일라나제 생성을 위한 적합한 탄소원을 선택하기 위해, 소나무잔나비버섯 KMJ812을 효모 추출물(10 g/L) 및 다양한 탄소원(셀룰로스, 볏짚, 밀기울, 자일란, 아비셀, CMC, 셀로바이오스, 글루코스, 말토스, 락토스, 수크로스 또는 나무 섬유)를 포함하는 배지에 배양했다. 실험된 탄소원 중에서, 볏짚이 자일라나제 생성에 가장 적합한 탄소원임을 발견하였으며, 이는 플라스크 배양액 내에서 5.1 U mg-단백질^-1의 자일라나제-특이 활성을 이끌어낸다(표 1 참조).

세포외 효소의 형성을 좌우하는 메가니즘이 단백질 합성을 위한 전구체의 유효성에 의해 영향을 받으므로, 자일라나제 합성에서 무기 및 유기 질소원의 효과 또한 실험했다(표 1 참조). 볏짚(20 g/l)을 탄소원으로 사용했다. 다양한 질소원(펩톤, 옥수수 침출 분말, 효모 추출물, 요오드, 황산암모늄, 질산칼륨 및 질산나트륨) 중에서, 효모 추출물(5 g/l) 및 펩톤(5 g/l)의 조합에서 자일라나제 생성이 최대였고(5.4 U mg-단백질^-1) 그 다음이 효모 추출물이었으며, 그외 다른 질소원은 pH 조절이 없는 조건 하에서 적합하지 못했다. 볏짚, 효모 추출물 및 펩톤에서 성장한 소나무잔나비버섯에 의한 자일라나제 생성의 시간 경로를 실험했다(도 1 참조). 자일라나제 활성은 17일까지 증가한 후 차츰 감소했다.

실시예 4. 자일라나제 효소 검정

본 발명의 자일라나제 활성을 1 % (w/v) 오트스펠트 자일란을 기질로 사용하여 검정했다. 자일란을 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0)에 용해시켰다. 10 ㎍의 효소 및 2.5 mg의 기질을 포함하는 반응 혼합물을 50 ℃에서 30분간 배양했다. 자유 환원당의 양을 3, 5-디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid; DNS) 방법(Miller GL (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31: 426-428)에 따라 측정했다. 자일로스를 표준으로 사용했다. 자일라나제 활성의 한 유닛을 상기 조건 하에서 1분간 방출된 환원당(자일로스 등가물)의 μmol로 나타냈다. 셀룰로스 활성을 자일란 대신 낮은 점성의 카르복시메틸셀룰로스(1 %)를 사용하여 상기와 같이 검정했다.

실시예 5. 자일라나제의 정제

모든 과정을 4℃에서 실시했으며 다르게 언급되지 않는 한 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT)을 포함하는 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.0)를 정제 과정에 사용했다. 단백질을 우혈청 알부민을 표준으로 사용하여 Bradford 방법(Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254)으로 측정했다. 컬럼 유출물 내의 단백질을 280 nm에서 흡광도를 측정하여 찾아냈다. 모든 크로마토그래피 분리는 AKTA FPLC 시스템(AKTA, Sweden)을 사용하여 실시했다.

1단계: 조효소의 제조. 30분간 10,000 x g으로 원심분리하여 배양액으로부터 세포를 회수했다. 20 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0)로 세척한 후, 세척액과 상청액을 혼합하고 농축한 후 교반 셀(Amicon, Beverly, MA, USA)에서 폴리에스테르 술폰 맴브레인(30kDa 컷오프)를 통한 한외여과로 탈염시켰다.

2단계: DEAE 세파로스 크로마토그래피. 투석된 효소 용액을 pH 5.0의 20 mM 아세트산나트륨 버퍼로 평형화시킨 DEAE Sepharose^TM 패스트 플로우(Fast Flow) 컬럼 (1.6 x 10 cm, Amersham Biosciences)에 충진시킨 후 1.0 ml/분의 유속에서 동일한 버퍼 내의 0-0.5 M NaCl의 180-분 선형 구배로 단백질을 용출시켰다. 각각 1　mL의 구획을 모아 자일라나제 활성에 대해 검정했다. 활성 구획을 모아 동일한 버퍼에 대해 투석한 후 추가 정제를 위해 한외여과로 농축시켰다.

3 단계: 세파크릴(Sephacryl)겔 여과 크로마토그래피. 농축된 효소 용액을 pH 5.0의 100　mM NaCl을 포함하는 20 mM 아세트산나트륨 버퍼로 평형화시킨 HiPrep 16/60 세파크릴 S-300 HR 컬럼(1.0 cm x 120 cm, Amersham Biosciences)에 충진시키고 0.5 ml/분의 유속으로 동일한 버퍼로 단백질을 용출시켰다. 활성 분획을 모아 동일한 버퍼에 대해 투석시키고 한외여과하여 농축시켰다.

4 단계: MonoQ 이온 교환 크로마토그래피. 미리 20 mM 아세트산나트륨(pH 5.0)으로 평형화시킨 MonoQ 이온 교환 크로마토그래피 컬럼 5/50 GL　(1.0 x 10 cm, Amersham Biosciences)로 효소를 추가 정제하였다. 효소를 0.5 ml/분의 유속으로 동일한 버퍼 내의 0-0.5 M NaCl 의 180-분 선형 구배로 단백질을 용출시켰다. 결합된 활성 분획을 모아 농축하고 동일한 버퍼에 대해 투석하고 30 kDa 분자량 컷오프의 센트리온(Centricon) (Millipore, Bedford, MA, USA) 한외여과 장치로 농축시킨 후 다음 실험에서 정제된 효소로서 사용했다.

상기와 같이 정제한 후 그 결과를 표 2에 나타냈다.

한외여과에 의한 분획화는 자일라나제 활성의 13% 회수율로, 특이 활성이 약 2배 증가했다. 활성 분획을 DEAE 세파로스 컬럼에 적용시키고 자일라나제를 대략 0.1 M NaCl로 용출시켰다. 그 후의 겔 여과 단계로 단백질을 함유하는 3개의 피크를 생성했다; 두 번째 피크가 자일라나제 활성을 나타냈다. 0.5 M NaCl을 수반하는 MonoQ 이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 FPLC 용출로 활성 자일라나제 단백질 피크를 생성했다. 이러한 크로마토그래피 방법으로 0.1%의 회수율을 갖는 14배 정제된 자일라나제를 산출했다. SDS의 존재 하에 겔 전기영동에 의한 정제 효소의 분석(도 2a-4 레인)은 57,000의 M _r 을 갖는 하나의 밴드를 나타낸다. 세파크릴 S-300 고해상도 컬럼(high resolution column) 상의 크기 배제 크로마토그래피로 대략 58,000의 M _r 에 상응하는 대칭 피크로서 효소 활성의 용출을 실시했다(도 2b). 이러한 결과들은 효소가 온화한 조건 하에서 겔 여과시 단량체로서 이동하므로 또한 용액 내에서 단량체로 존재하고 활성화될 수 있음을 나타낸다.

실시예 6. 최적 pH 및 온도 결정

본 발명의 자일라나제의 최적pH를 50　℃에서 상이한 버퍼(시트르산염(100　mM, pH 3-4.5), 아세트산나트륨(100　mM, pH 4.5-5.5), 인산염(100　mM, pH 5.5-8)) 내에 15분간 정제된 효소를 배양하여 결정했다. 최적 온도를 결정하기 위해, 효소를 25 내지 100　℃의 상이한 온도에서 15분간 아세트산나트륨 버퍼(100　mM, pH 5)에서 배양했다. 자일라나제의 열안정성을 결정하기 위해, 정제된 효소를 기질 없이 상이한 온도(40℃ - 80℃)에서 배양시켰다. 일정 시간 동안(0-25d) 동안 유지시킨 후, 잔여 자일라나제 활성을 상기와 같이 결정했다.

자일라나제의 최적 pH는 4.5로, pH 4.0 및 5.0에서 각각 98% 및 98%의 최대 활성을 나타낸다(도 3의 A). 등전점(pI)은 4.7로 결정되었으며, 이는 세포외 자일라나제에서 일반적인 것이다. 가수분해 작용을 위한 최적 온도는 70 ℃이며 50 및 80 ℃에서 각각 94% 및 96%의 최대 활성을 나타낸다(도 3의 B). 90 ℃에서는 대략 50%의 상대적 활성을 유지한다.

실시예 7. 소나무잔나비버섯 자일라나제의 열안정성

정제된 자일라나제의 열안정성을 40℃ 내지 80℃의 다양한 온도에서 실험했다. 정제된 소나무잔나비버섯 자일라나제는 40℃에서 25일간 배양했을 때 매우 안정하고 100%까지의 활성을 유지한다. 60℃에서 60시간 배양한 후 약 90%의 활성을 유지했다. 80℃ 이상의 온도에서, 자일라나제 활성은 배양 시간에 따라 급격하게 감소한다. 효소는 50℃, 60℃ 및 70℃에서 각각 410 시간, 96 시간 및 33 시간의 t_{1 /2} 수치를 나타낸다(도 4).

실시예 8. 자일라나제의 PAGE 및 분자 질량 결정

서브유닛 분자량의 결정에서, Laemmli(Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259): 680-5)의 문헌에 기재된 바와 같이 10% 겔에서 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실행했다. 단백질 밴드를 쿠마시 브리릴언트 블루 R-250 (Sigma)로 발색시켰다. 정제된 효소의 분자 질량을 AKTA FPLC 시스템(GE health care)에 수반된 Superose^TM 12 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피하여 결정했다. 효소를 0.5 ml/분의 유속으로 20 mM 아세트산나트륨(pH 5.0)으로 용출시켰다.

실시예 9. 자일라나제의 기질 특이성

정제된 효소의 기질 특이성을 하기 기질을 동일 농도(1%; w/v)로 포함하는 표준 검정 시스템에서 실험했다: 오트스펠트 자일란, 버치우드(birchwood) 자일란, 비치우드(beechwood) 자일란, 아비셀(avicel), 카르복실메틸 셀룰로스, pNP-β-D-자일로피라노사이드, p-니트로페닐-β-d-셀로비오사이드, pNP-β-갈락토피라노사이드, pNP-β-D-락토피라노사이드, p-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노사이드.

다양한 기질을 수반한 소나무잔나비버섯 자일라나제의 활성을 표 3에 나타냈다. 버치우드 자일란에서 가장 높은 활성(105%)이 관찰되었으며 그 다음으로는 오트스펠트 자일란에서의 활성(100%)이 높았다. 효소는 아비셀(11 %) 및 CMC (7.2 %)와 같은 셀룰로스 기질에 대해 낮은 활성을 나타냈다.

실시예 10. 자일라나제의 동역학적 파라미터 및 저해 상수의 결정

본 발명의 자일라나제의 미카엘리스 상수(Michaelis constant) (K_m) 및 최대 속도(maximum velocity) (V_max)의 수치를 0.5 내지 5　mg/ml 범위 농도의 오트스펠트 자일란과 함께 50 ℃에서 100 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5) 내에 배양시켜 결정했다. 자일로스에 의한 자일라나제의 저해를 오트스펠트 자일란을 기질로서 사용하여 결정했다. K_m 및 V_max 및 K_i 의 수치를 표준 선형 회귀 기술을 사용하여 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plots)으로부터 결정했다. 이에 따른 결과로서 K_m은 3.4 mM이고, V_max는80.2 mol min^-1 mg^-1이며 K_i은 13.4 mM의 수치를 나타낸다.

실시예 11. 금속 및 시약의 효과

본 발명의 자일라나제 활성에서 1　mM의 다양한 금속 이온 및 시약의 효과를 30℃에서 20 mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0) 내에 개별 시약과 함께 효소를 30분간 미리 배양하여 결정했다. 그런 다음 활성을 금속 이온 또는 시약의 존재 하에 50℃에서 15분간 측정했다. 금속 이온 및 시약 없이 검정된 활성을 100%로 기록했다. 자일라나제 활성을 금속 이온, 금속 킬레이트제 (EDTA) 및 그외 다양한 화합물의 존재 및 부재시에 대해 검정한 결과를 표 4에 나타냈다.

자일라나제 활성은 활성을 강하게 저해하는 BaCl₂, NaCl. CuCl₂, HgCl₂ 및 MnCl₂에 의해 약간 활성화되며 CaCl₂, CoCl₂, FeCl₂, MgCl₂ 및 ZnCl₂ 은 훨씬 더 제한된 저해 효과를 갖는다. 1 내지 10 mM 범위의 농도에서 EDTA에 의해 저해된다.

소나무잔나비버섯으로부터의 자일라나제에서 설프히드릴 화합물의 효과 또한 실험했다(표 4). 10 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol) 및 시스테인을 반응 혼합물에 첨가하여 효소 활성이 각각 135.3 및 119.3% 증가했다. 이러한 결과는 설프히드릴 화합물이 감소된 스테이트에서 활성 효소를 유지시킴을 제시한다. 이는 다만 쉽게 감소되는 이황화 결합에 자일라나제가 쉽게 접근할 수 있음을 나타낸다.

실시예 12. 자일라나제의 내부 아미노산 서열

본 발명의 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분해시킨 후 폴리비닐리덴 트리플루오라이드 맴브레인(Bio-Rad) 상에 일렉트로블롯팅시켰다(electroblotted). 펩티드 맴핑을 위해 100 ng 의 엔도프로테나제 Asp-N 또는 엔도프로테나제 Lys-C 또는 트립신(Promega, Madison, WI, USA)과 함께 37 ℃에서 4시간 동안 단백질 절단을 실시하여 50 ㎕의 100 mM (NH₄)₂CO₃ (pH 8.5) 내의 20 ㎍의 정제된 효소를 분해했다. 결과적으로 생성된 펩티드 단편을 SDS-PAGE (15% 폴리아크릴아미드)로 분리하고, 분리된 펩티드를 일렉트로블롯팅하여 폴리비닐리덴 트리플루오라이드 맴브레인 상으로 옮겼다. 펩티드 밴드를 40% 메탄올 내의 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색으로 발색시켰다. 부분 아미노산 서열을 농업과학공동기기센터(The National Instrumentation Center for Environmental Management; Seoul, Korea)에서 자동 단백질 서열기(model 491A; Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer)를 사용하여 에드만 분해로 결정했다. 부분 아미노산 서열을 논리던던트 단백질 데이터베이스(nonredundant protein database)의 BLAST 검색을 통해 유사 단백질을 확인하는데 사용했다.

실시예 13. 부분적 펩티드 단편의 동정

본 발명의 정제된 효소(1.5-mg)를 10% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 맴브레인으로 블로팅시켰다. 효소 단백질의 자동화 에드만 분해가 실패하였는데 이는 효소의 N-말단이 차단되었음을 의미한다. 자일라나제를 트립신, 엔도프로테나제 Asp-N 및 엔도프로테나제 Lys-C로 부분적으로 절단한 후, 12.5% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 맴브레인 상에 블롯팅했다. Lys-C 단편(LYS), Asp-N 단편(ASP) 및 트립신 단편(TRY)의 3개 단편을 자동화 단백질 서열결정기로 서열결정했다. LYS 단편은 YKEFFKIGAAVTVK 절편을 포함한다. TRY 및 ASP 단편은 각각 LSDVEEAIRIVR 및 NNESLICTNSDGTLD 절편을 포함한다.

실시예 14.다양한 자일라나제의 특성 비교

표 5는 많은 상이한 미생물로부터의 다양한 자일라나제의 특성을 비교한 것이다. 본 발명의 소나무잔나비버섯 자일라나제는 오트스펠트 자일란에 대해 74.4 U mg-단백질^-1의 주목할만한 특이 활성을 갖는다. 이에 비해, 다른 진균류로부터 정제된 자일라나제의 특이 활성 수치는 7.4 내지 894 U mg-단백질^-1 범위이다(표 5). 최적 온도에 따라, 효소는 중온성(40-60℃), 호열성(50-80℃) 및 초고온성(>80℃)으로 분류될 수 있다. 최근에, 호열성 미생물 및 심지어는 극한 미생물이 우수한 안정성을 갖는 효소를 생산하므로 이들로부터 효소를 분리하려는 많은 노력이 있어왔다. 탈라로마이세스 에멀소나이(Talaromyces emersonii), 터모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus) 및 터모아수스 아우라티아쿠스(Thermoascus aurantiacus)와 같은 호열성 균주로부터의 자일라나제는 60 내지 80℃의 최적 온도를 가지며 이 범위에서 매우 안정하다. 호열성 미생물로부터의 많은 엔도자일라나제(endoxylanases)는 중온성 미생물로부터의 엔토자일라나제와 같은 정도의 구조 상동성을 갖는다. 중온성 미생물인 소나무잔나비버섯으로부터의 자일라나제는 고온에서 상당한 안정성을 보인다. 본 발명의 소나무잔나비버섯 자일라나제 효소는 70^oC에서 33시간의 반감기를 갖는 가장 높은 열안정성을 나타낸다(표 5).

실시예 15. 소나무잔나비버섯 자일라나제의 분류

패밀리 10 자일라나제는 (β/α)₈ 배럴 구조를 갖는 것으로 알려져 있으며 소위 GH의 4/7 슈퍼패밀리에 속한다. 패밀리 10 자일라나제의 천연 및 복합 형태의 촉매 도메인 구조는 수도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)(Pell G, Taylor EJ, Gloster TM, Turkenburg JP, Fontes CMGA, Ferreira LMA, Nagy T, Clark SJ, Davies GJ, Gilbert HJ ( 2004a) The mechanisms by which family 10 glycoside hydrolases bind decorated substrates. J Biol Chem. 279: 9597-9605), 스트렙토마이세스 올리바세오비리디스(Streptomyces olivaceoviridis)(Fujimoto Z, Kaneko S, Kuno A, Kobayashi H, Kusakabe I, Mizuno H (2004) Crystal structures of decorated xylooligosaccharides bound to a family 10 xylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86. J Biol Chem 279: 9606-9614) 및 게오바실루스 스테아로터모필루스(Geobacillus stearothermophilus)(ZZolotnitsky G, Cogan U, Adir N, Solomon V, Shoham G, Shoham Y (2004). Mapping glycoside hydrolase substrate subsites by isothermal titration calorimetry. Proc Natl Acad Sci USA 101: 11275-11280)를 포함하는 다수의 미생물로부터 입수할 수 있다. 소나무잔나비버섯 자일라나제의 내부 아미노산 서열은 GH 패밀리 10 자이라나제에 유사성을 보인다. 소나무잔나비버섯 자일라나제의 다른 단편 YKEFFKIGAAVTVK, SDVEEAI 및 ESLICTNSDGTLD은 각각 아나에로셀룸 터모필룸(Anaerocellum thermophilum),박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 스핑고박테리움 스피리티보룸(Sphingobacterium spiritivorum)과 유사하다. 효소학 및 생물정보학 실험으로부터의 증거들이 소나무잔나비버섯 자일라나제가 GH 패밀리 10의 맴버로 분류될 수 있음을 제시하고 있다.

본 발명의 자일라나제는 뛰어난 열안정성 및 산성 환경에서의 우수한 활성을 갖는 특징이 있어 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 소나무잔나비버섯 균사를 100 mL의 포테이토 덱스트로스 배양액에 접종하는 단계; 및
   1L 발효조 내에서 상기 단계에서 얻은 배양체 5 mL를 8 g/L의 펩톤, 2 g/L의 이스트 추출물, 5 g/L의 KH₂PO₄, 5g/L의 K₂HPO₄, 3 g/L의 MgSO₄ㆍ7H₂O, 0.005 g/L의 티아민ㆍHCl 및 20 g/L의 볏짚을 포함하는 오트스펠트 자일란으로 구성된 자일란 배지에 접종하는 단계
   를 포함하는 소나무잔나비버섯 균사체의 생산방법.
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3. 삭제

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