KR100697236B1

KR100697236B1 - 오보바톨 또는 오보바탈을 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR100697236B1
Application number: KR1020050073915A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 손광희; 한동초; 이수경; 김정민; 고영희; 전효곤; 양재영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2007-03-22
Anticipated expiration: 2025-08-11
Also published as: US20070037889A1; US8367736B2; US20080312337A1; KR20070026901A

Abstract

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨(obovatol) 또는 다음 화학식 2로 표시되는 오보바탈(obovatal)을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포주의 성장과 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)를 효과적으로 저해하는, 후박나무 [Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]로부터 분리정제된 오보바톨 또는 오보바탈 화합물을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

화학식 2

본 발명의 조성물은 암세포주의 성장과 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)의 발현 및 활성을 효과적으로 저해함으로써 암 치료와 암 전이 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

후박나무, 오보바톨, 오보바탈, 암 치료 및 암 전이 억제

Description

오보바톨 또는 오보바탈을 포함하는 항암제 조성물{An Anticancer composition comprising obovatol or obovatal}

본 발명은 오보바톨(obovatol) 또는 오보바탈(obovatal)을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포주의 성장과 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)를 효과적으로 저해하는, 후박나무 [Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]로부터 분리정제된 오보바톨 또는 오보바탈 화합물을 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

문명이 발달되어 갈수록 암의 발생률이 증가되고 있음에도 불구하고 암 환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 나타내는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있다. 이러한 치료법들은 대개 조기 암환자나 특정 암에만 처치가 국한되어 있어서 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.

암 환자의 주된 사망요인은 초기 종양에 의해서라기보다는 암세포의 다른 조 직으로의 전이에 의한 것이다. 암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서 암세포의 침윤과 전이 기작 및 이를 억제하는 방법에 관한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

암세포의 전이과정을 살펴보면, 먼저 원발 종양으로부터 전이성 암세포가 떨어져 나와 정상조직의 간질과 기저막 등의 지지 구조체로 침윤해 들어가서 다른 목표조직의 모세혈관 벽에 부착하고 세포외기질과 기저막을 분해한 후 모세혈관으로 유출, 새로온 조직에서 혈관 신생이 동반되어 이차 종양이 형성된다.

즉, 전이과정은 접착, 침윤, 혈관신생의 세 가지 주요 단계로 구성되어 있으며, 이 단계들 가운데 어느 하나를 막을 수 있다면 암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상된다. 암세포의 침윤은 접착된 세포가 분비하는 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)가 중요한 역할을 한다.

MMPs는 콜라겐, 프로테오글리칸 등을 분해하는 효소로 간질 콜라겐 효소, MMP2, 스트로멜라이신(stromelysin) 등이 있는데, 이들 모두 활성 중심부에 Zn을 가지는 금속 효소이고 자이모겐(zymogen) 형태로 분비되어 다른 단백질 분해효소나 유기인 화합물에 의하여 활성화되고 MMP와 함께 분비되는 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)에 의해 활성이 저해되며 cDNA 배열에 있어서 상동성을 지니고 있어 MMPs로 분류된다. MMPs는 관절염, 조직 궤양, 비정상적인 상처 치유, 치근막 질환, 골질환, 암 전이 또는 침입, 및 HIV-감염(J. Leuk, Biol. 52(2): 244-248, 1992)과 같이 비정상의 결합조직 및 기초막 매트릭스 대사를 포함하는 다수의 병리학적 상태와 관련되어 있다고 알려져 있다. 실제 전이가 활발한 암 세포에서는 정상적인 세포나 비전이성 암세포에 비해 MMP2나 MMP9의 활성이 높으며 이를 저 해하는 물질들이 암 전이를 억제하는 것으로 나타났다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 오랫동안 생약제로 사용되어 온 후박나무 [Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]로부터 오보바톨과 오보바탈 화합물을 분리 정제하였다. 그리고 이 화합물들이 다양한 인체 암 세포주의 성장과 암 전이에 중요한 역할을 하는 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)의 발현과 활성을 억제시킴을 확인하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 오보바톨과 화학식 2로 표시되는 오보바탈을 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 오보바톨과 화학식 2로 표시되는 오보바탈을 포함하는 항암제 조성물을 이용한 암의 예방방법, 치료방법 및/또는 암 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 후박나무로부터 화학식 1의 오보바톨과 화학식 2의 오보바탈을 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨, 화학식 2로 표시되는 오보바탈, 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화합물은 MMPs 활성의 억제제이며 매트릭스 분해를 억제하므로 암의 예방, 치료 및/또는 암 전이 치료용 제제로서 유용하다.

상기 화학식 1 또는 2의 화합물의 항암 효과는 본 발명 이전에는 밝혀진 바 없는 새로운 용도로서, 본 발명자는 결장암, 유방암, 폐암 등의 인간 암세포주에 대해 WST-1 검정한 결과 5 내지 10 ug/ml에서 50 %의 성장 억제 효과(GI_{50_})를 나타내었다. 결장암 세포주를 면역결핍 생쥐에 이식한 후 오보바톨 또는 오보바탈을 경구로 투여하여 암조직의 성장이 억제됨을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 용어 "항암"은 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 작용 및 암세포의 전이를 억제하거나 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료 모두를 일컫는다.

본 발명에서 사용되는 용어"예방"은 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발명을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 췌장암, 혈액암 등의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 포함되는 화학식 1 또는 2의 화합물은 또한 이의 염의 형태로도 사용될 수 있으며, 이러한 염은 약제학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산과의 산 부가 염을 포함한다. 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산이 있다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카르복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등이 있다.

본 발명의 조성물은 상기한 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 또는 이들의 화합물 이외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸 렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "환자"는 본 발명의 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 원숭이, 개, 염소, 돼지, 또는 쥐 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 인간(치료, 억제 또는 예방)용일 뿐만 아니라 상업적으로 유용한 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함하는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 암과 암 전이를 억제하고, 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종래의 상기 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 50 mg, 바람직하게는 1 내지 10 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

화학식 1의 오보바톨 또는 화학식 2의 오보바탈은 천연 물질로부터 분리하거나 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 화학식 1 또는 2의 화합물을 분리할 수 있는 천연물질로서는 후박나무가 바람직하게 사용될 수 있다.

후박나무 [Magnolia obovata Thunberg]는 목련과 (Magnoliaceae) 식물로 한국, 일본, 중국의 대부분의 지역에 자생하는 높이 5 m의 낙엽수이다.

후박나무의 건조된 수피는 생약재로서 위장약 등의 용도로 사용되고 있다. 후박나무의 잎과 수피의 추출물에서 분리된 호노키놀이나 마그놀올 등의 다양한 생 리 활성에 대한 보고는 많이 있으나, 후박나무로부터 분리된 오보바톨과 오보바탈의 항암 효과를 갖는다는 것에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 후박나무를 알코올 추출하는 단계; (2) 단계 (1)에서 얻어진 추출물을 실리카겔 크로마토그래피하여 용출물을 얻는 단계; (3) 단계 (2)의 용출물을 박막 크로마토그래피하는 단계 및 (4) 단계 (3)의 분획물을 고속 액체 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 오보바톨과 오보바탈을 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서 알코올 추출 단계에서는 후박나무의 잎, 열매, 수피 또는 이들 모두를 사용할 수 있다. 추출 알코올은 특별히 제한되지는 않으며, 바람직하게는 메탄올이 사용된다.

오보바톨은 인간의 대장암세포 HCT116과 HCA-7에서 GI₅₀ 이 각각 5 ㎍/㎖과 6 ㎍/㎖로 가장 효과적인 저해를 보였다. 반면, 다른 대장암세포인 SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 전립선암세포 DU145, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 10, 20, 25, 18, 31 및 25 ㎍/㎖로 측정되었다. 오보바탈은 대장암세포 HCT116, HCA-7, SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 7, 10, 13, 11, 17, 20 및 21 ㎍/㎖로 측정되었다.

구체적 실시에서, 후박나무의 잎, 수피, 열매를 메탄올로 추출하고 이 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 칼럼을 실시하고 에틸아세테이트와 헥산을 사용하여 용출시켜 활성분획을 분리한 후, 분리된 활성 혼합물을 다시 일련의 크로마토그래피, 즉 C18 크로마토그래피 칼럼에 흡착시킨 후 메탄올과 물로 용출시켜서, 박막 크로마토그래피를 수행하고 고속 액체 크로마토그래피 칼럼에 메탄올과 물의 구배, 바람직하게는 50 : 50에서 70 : 30의 구배로 용출시켜 순수하게 분리하였다.

상기한 바와 같이 정제된 화합물은 UV 흡광도 측정, IR 흡광도 측정, 고 해상도 질량분석 및 NMR 분석을 통해 그 화합물이 항암 활성을 갖는 오보바톨 또는 오보바탈임을 확인하였다.

본 발명의 방법으로 후박나무로부터 분리정제된 오보바톨과 오보바탈은 암세포주에 대하여 성장 억제효과를 나타낸다. 또한, 상기 화합물들은 MMP2와 MMP9에 대한 발현 억제활성이 우수하여 본 발명에 따른 오보바톨과 오보바탈은 암세포의 억제뿐만 아니라 암세포의 전이를 억제하는데에도 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 후박나무로부터 오보바톨 및 오보바탈 화합물의 추출 및 분리 정제

후박나무(대한민국 중부지방에 자생하는 것을 채취)의 잎, 열매 또는 수피를 잘게 분쇄하고 메탄올을 첨가하여 상온에서 48시간 동안 방치한 후 교반하여 여과지를 이용해서 액상과 고체부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 메탄올에 용해시켰다.

활성물질을 함유하고 있는 유기 용매 층을 모아 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해하고 실리카겔(Merck, Art No. 9385)에 첨가하여 활성물질을 흡착시킨 다음, 에틸아세테이트와 헥산의 비율을 90 : 10 내지 80 : 20으로 변화시키면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 활성분획을 분리하였다.

수득한 분획물을 C18 칼럼에 흡착시킨 다음 메탄올과 물로 용출시켜 부분 정제한 활성 물질을 얻었다. 부분 정제된 화합물을 대상으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 순수한 화합물을 얻었다.

최종적으로 잎 2 ㎏을 메탄올로 추출하여 추출물 120 g를 얻었으며, 이로부터 순수한 화합물 오보바톨과 오보바탈을 각각 25 g 과 1.5 g의 수율로 얻었다.

실시예 2 분리된 화합물의 구조분석

UV 흡광도 분석, IR (infrared) 흡광도 분석 및 고해상도 질량분석기 분석을 실시하여 상기 순수 정제된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정하였다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 시마주사의 UV-265 분광광도계(Shimadzu UV-265 spectrophotometer)로 측정하였으며, IR 흡광도는 바이오-라드사의 디지랩 디비존 FTS-80 분광광도계(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophotometer)로 측정하였고, 분자량 및 분자식은 VG70-SEQ 질량 분광계(mass spectrometry; MS)를 이용한 고해상도(High resolution) MS를 측정하여 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 ㎒, 500 ㎒ NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³C-NMR 스펙트럼을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.

하기 표 1은 실시예 1에서 얻어진 오보바톨의 이화학적 특성을 나타내었고, 표 2는 오보바탈의 이화학적 특성을 나타낸 것이다.

오보바톨

¹H-NMR (CDCl₃): 6.28(H-4, d, J = 1.8 Hz), 6.56 (H-6, d, J = 1.8 Hz), 3.18 (H-7, d, J = 6.6 Hz), 5.97 (H-8 and H-8', m), 5.09 (H-9 and H-9', m), 6.93 (H-2' and H-6', d, J = 9 Hz), 7.14 (H-3' and 5', d, J = 9 Hz), 3.36 (H-7', d, J = 6.6 Hz).

오보바탈

¹H-NMR (CDCl₃): 9.35 (H-9, d, J = 7.5 Hz), 7.38 (H-7, d, J = 15.3 Hz), 7.07 (H-3' and H-5', d, J = 9 Hz), 6.98 (H-4, d, J = 1.8 Hz), 6.78 (H-2' and 6', d, J = 9 Hz), 6.75 (H-6, d, J = 1.8Hz), 6.42 (H-8, dd, J = 7.5, 15.3 Hz), 4.51 (H-8', m), 5.09 (H-9', m), 3.30 (H-7', d, J = 6.6 Hz).

외형(appearance)		엷은 녹색
분자식		C₁₈H₁₈O₃
분자량		282
융점(℃)		액체
용해성	가용성	알코올, DMSO
	불용성	헥산, H₂O

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C₁₈H₁₆O₃
분자량		280
융점(℃)		161-162 ^oC
용해성	가용성	알코올, DMSO
	불용성	H₂O

실시예 3 암세포주의 성장 억제

실시예 1에서 분리 정제한 화합물의 인간 암세포주 성장 억제를 WST-1을 사용하여 측정하였다. 인간 암세포주를 10 % 소태아혈청(FBS)이 포함된 배지에서 37 ℃, 5 % 이산화탄소를 유지하며 배양하였고, 0.05 % 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 이용하여 세포를 떼어내었다.

96 웰 플레이트의 각 웰에 헤마토사이토미터(hematocytometer)로 계산한 4,000개(A549, MDA-MB-231), 5,000개(HEK293, NCI-H23) 또는 6,000개(HCA-7, HCT116, SW620, DU145)의 세포를 각각 투여하였다.

5 % 이산화탄소를 포함한 37 ℃ 배양기에서 10 % FBS가 포함된 배지에서 배양하고, 24시간 후에 대조군(0.1 % DMSO)과 실시예 1에서 분리 정제한 각각의 화합물을 농도별로 포함(DMSO에 녹인 화합물을 배지로 희석)한 새로운 배지로 교환하였다. 48시간 동안 처리한 후에 각 웰에 WST-1(Roche사 제품) 10 ㎕씩을 첨가하고 2시간 동안 배양한 다음, ELISA 판독기(ELISA Reader, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 5 내지 15 ㎍/㎖ 농도에서 50 % 성장 억제 효과가 관찰되었으며, 각각의 화합물 마다 특정 암세포주에 민감하게 나타났다. 오보바톨은 인간의 대장암세포 HCT116과 HCA-7에서 GI₅₀ 이 각각 5 ㎍/㎖과 6 ㎍/㎖로 가장 효과적인 저해를 보였다. 반면, 다른 대장암세포인 SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 전립선암세포 DU145, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 10, 20, 25, 18, 31 및 25 ㎍/㎖로 측정되었다. 오보바탈은 대장암세포 HCT116, HCA-7, SW620, 폐암세포 NCI-H23과 A549, 유방암세포 MDA-MB-231, 신장암세포 HEK293에 대해서 GI₅₀ 이 각각 7, 10, 13, 11, 17, 20 및 21 ㎍/㎖로 측정되었다.

실시예 4 오보바톨과 오보바탈의 MMP9 발현억제능 측정

1 × 10⁵세포/㎖ 의 HT1080 인간 파이브로사르코마 세포를 10 % FBS를 함유한 배지를 이용하여 96-웰 마이크로플레이트에서 하루 배양한 후, 본 발명의 시료를 처리하기 전에 무혈청 배지로 바꾸어 준 다음 시료 처리 3시간 후에 5 ng/㎖의 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor α, TNF-α)를 처리하고 17시간을 배양하였다.

배양 후 세포의 모양과 세포독성을 확인하고 배양액만을 취하여 글리세롤과 발색시약이 함유된 충전 완충용액과 각각 섞어 전기영동하였고 대조구와 비교하여 MMP9 발현 억제활성을 확인하였다. 대조구는 종양괴사인자-알파를 암세포를 활성화시켜주는 유도제로 사용하였는데 처리구와 비처리구로 나누어 유도되는 양상을 육안으로 확인하였고 시료를 첨가한 배양액에서 MMP-9의 발현양상을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.

그 결과, 오보바톨과 오보바탈은 MMP9의 발현을 각각 10 및 5 ㎍/㎖에 50 % 이상 억제시키는 것으로 나타났다.

실시예 5 오보바톨과 오보바탈의 MMP2 발현억제능 측정

7-메톡시쿠마린(Methoxycoumarin)-4-일-아세틸-Pro-Leu-Gly-Leu-(2-[2,4-디니트로페닐]-2,3-디아미노프로피오닐)-Ala-Arg-NH2 (Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2)를 기질로, 전효소 MMP2를 0.5 mM ρ-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)와 함께 반응 완충용액에서 37 ℃에서 15분간 활성화된 것을 효소로 하여 TNBC 완충액 (20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl₂, 0.15 M NaCl, pH 7.5)을 이용하여 반응값을 측정하였다.

오보바톨과 오보바탈을 처리한 시료 처리군과 대조군으로 나누어 각각에 대하여 일정한 반응시간 간격으로 파장 480 nm에서 반응값을 비교 측정하였다. 오보바톨과 오보바탈은 MMP2의 활성을 각각 0.3 및 90 ㎍/㎖에 50 % 이상 억제시켰다.

실시예 6 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다: 군 당 2 마리씩의 SD계 랫트에 실시예 1에서 얻어진 오보바톨과 오보바탈을 주사용 증류수에 용해시켜 1 g/kg/㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강 장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

본 발명에 따른 오보바톨과 오보바탈은 모든 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 500 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판정되었다.

본 발명에 따르면, 화학식 1로 표시되는 오보바톨과 화학식 2로 표시되는 오보바탈은 암세포주의 성장과 매트릭스 분해 메탈로프로테인 효소(MMPs)를 효과적으로 저해함으로써 암의 치료와 암 전이 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 오보바톨, 화학식 2로 표시되는 오보바탈, 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 포함하는 항암제 조성물.

화학식 1

화학식 2
제 1항에 있어서, 상기 암이 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 또는 췌장암인 항암제 조성물.
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