KR100633214B1 - 펩티드 합성 방법 및 그 조성물 - Google Patents

펩티드 합성 방법 및 그 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR100633214B1
KR100633214B1 KR1020007010534A KR20007010534A KR100633214B1 KR 100633214 B1 KR100633214 B1 KR 100633214B1 KR 1020007010534 A KR1020007010534 A KR 1020007010534A KR 20007010534 A KR20007010534 A KR 20007010534A KR 100633214 B1 KR100633214 B1 KR 100633214B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
peptide
side chain
fmoc
protected
Prior art date
Application number
KR1020007010534A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010042131A (ko
Inventor
명철 강
브라이언 브레이
메이나르드 리츠티
카테린 마데르
진 메루트카
Original Assignee
트라이머리스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 트라이머리스 인코퍼레이티드 filed Critical 트라이머리스 인코퍼레이티드
Publication of KR20010042131A publication Critical patent/KR20010042131A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100633214B1 publication Critical patent/KR100633214B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 펩티드 특히 T-20("DP-178"라고도 칭함, 서열:1) 및 T-20-유사 펩티드를 합성하는 방법에 관계한다. 이 방법은 고형 및 액상 합성 과정을 이용하여, 특정 펩티드 단편을 합성하고, 복합시켜, 원하는 펩티드를 얻는 것이다. 본 발명은 또한, 원하는 펩티드(T-20)를 합성하는데 중간 생성물로 작용을 할 수 있는 개별 펩티드 단편에 관계한다. 본 발명은 또한, 전장 T-20 및 T-20-유사 펩티드를 만들기 위해 함께 이용할 수 있는 펩티드 단편 군에 관계한다.

Description

펩티드 합성 방법 및 그 조성물{Methods and Compositions For Peptide Synthesis}
본 발명은 펩티드 특히 T-20("DP-178"라고도 칭함, 서열:1) 및 T-20-유사 펩티드를 합성하는 방법에 관계한다. 이 방법은 고형 및 액상 합성 과정을 이용하여, 특정 펩티드 단편을 합성하고, 복합시켜, 원하는 펩티드를 얻는 것이다. 본 발명은 또한, 원하는 펩티드(T-20)를 합성하는데 중간 생성물로 작용할 수 있는 개별 펩티드 단편에 관계한다. 본 발명은 또한, 전장 T-20 및 T-20-유사 펩티드를 만들기 위해 함께 이용할 수 있는 펩티드 단편 군에 관계한다. 본 발명은 또한, 펩티드, 특히, T-20 및 T-20-유사 펩티드 및 이들 펩티드를 합성하는데 있어서, 중간생성물로 작용하는 개별 펩티드를 정제하는 방법에 관계한다.
최근에, 융합-관련된 과정을 저해하는 능력 및 강력한 항-바이러스 활성을 나타내는 것으로 펩티드가 상당수 발견되었다. 예를 들면, 미국 특허 5,464,933: 5,656,480; PCT 공개공보 WO96/19495T-20등을 참고로 한다. 이들 펩티드는 치료요법제로 광범위하게 이용되기 때문에 대규모로 합성할 수 있는 방법이 절실히 요구된다.
펩티드 합성에 대한 기술은 Mergler et al., 1988, Tetrahedron letters 29:4005-4--8; Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al.,(eds), "Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden, 1992, 525-526; and Riniker et al., 1993, Tetrahedron Letters 49:9307-9320)에서 설명하고 있지만, T-20 및 T-20-유사 펩티드와 같은 용이하게 정제시킨 펩티드를 경제적으로 다량 생산하는데 이용할 수 있는 마땅한 기술은 아직 전무하다.
발명의 요약
본 발명은 펩티드, 특히 T-20("DP-178"라고도 칭함, 서열:1) 및 T-20-유사 펩티드를 합성하는 방법에 관계한다. 이 방법은 고형 및 액상 합성 과정을 이용하여, 특정 펩티드 단편을 합성하고, 복합시켜, 원하는 펩티드를 얻는 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 고형상에 T-20 또는 T-20-유사 펩티드의 중간 생성물로 특정 측쇄가 보호된 펩티드 단편을 합성하고, 용액상에서 보호된 단편을 결합시켜, 측쇄가 보호된 T-20 또는 T-20-유사 펩티드를 만들고, 측쇄의 보호기를 제거하여, 최종 T-20 또는 T-20-유사 펩티드를 얻는 것으로 구성된다. 본 발명의 적절한 구체예에서 서열:1로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 T-20 펩티드를 합성하는 것을 설명한다.
본 발명은 원하는 펩티드(예를 들면 T-20)의 합성에서 중간 생성물로 작용하는 개별 펩티드 단편에 관계한다. 본 발명의 펩티드 단편에는 다음의 표 1에서 설명하는 아미노산 서열을 가지는 펩티드등이 포함되나, 이에 국한시키지는 않는다.
Figure 112000019955474-pct00001
본 발명은 또한, 원하는 펩티드 합성에서 중간 생성물로 작용하는 특정 펩티드 단편 군에 관계한다. 본 발명의 펩티드 단편 군에는 다음의 표 2에서 설명하는 1-20군이 포함된다.
Figure 112000019955474-pct00002
Figure 112000019955474-pct00003
본 발명은 고형상 및 액상 합성 반응을 특정하게 복합시키면, 고순도의 T-20 및 T-20-유사 펩티드를 고산출량과 고수득율로 대량 제조할 수 있다는 발명자의 발 견에 일부 근거한다. 특히, 본 발명의 방법에 따르면, T-20 및 T-20-유사 펩티드는 1㎏이상의 규모로 합성할 수 있다. 고형상 합성을 위한 본 발명의 특정 T-20 펩티드 단편을 선택함으로써, 일상의 고형상 합성에서 요구되는 아미노산 및 시약의 3-, 4-, 5-배 과도한 양을 이용하지 않고도 매우 효율이 높은 고형상 결합 기술을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드 단편의 고형상 합성에서, 단지 1.5배 아미노산만을 이용한다. 필요한 아미노산 및 시약의 필요량을 감소시킨 본 발명의 비용 절감 방법으로, T-20 및 T-20 유사 펩티드를 대량 합성할 수 있다.
또한, 발명자들은 고형상 수지 g당 약 0.8 내지 1mmol을 로딩할 경우에 고형 상에서 특정 펩티드 단편이 합성된다는 놀라운 사실을 밝혀냈다. 이와 같은 로딩은 고형상 펩티드 합성에서 일반적으로 얻을 수 있는 수지 g당 0.25 내지 0.4mmol 로딩 범위보다는 상당히 많은 것이다. 또한, 발명자들은 산에 대한 초감응성 수지를 이용하여 고형상에서 선택된 펩티드 단편을 합성할 경우 순도가 상당히 높은 펩티드 단편을 만들 수 있다는 것도 밝혀냈다. 본 발명에 따라 얻을 수 있는 펩티드 단편을 정제하는데 크로마토그래피 기술이 필수적인 것은 아니며; 단편은 간편하게 사용하기 전에 침전 또는 분쇄 과정을 통하여 또는 수지로부터 바로 얻은 것을 이용한다. 산 초감응성 수지를 이용하는 경우, 측쇄 보호기를 동시에 제거할 필요없이 수지로부터 본 발명의 보호된 합성펩티드를 잘라낼 수 있다. 이로써, 불순물을 줄일 수 있고, 10개 이상의 아미노산으로 된 고순도의 펩티드를 합성할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 만들어진 고순도 펩티드 단편을 결합시켜, 용액상에서 합 성되는 T-20 및 T-20-유사 펩티드의 불순물 프로파일은 상당히 연관된 유사체를 제외하고는 결합하지 않은 단편이 주를 이룬다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 만들어진 T-20 및 T-20-유사 펩티드는 통상의 기술을 이용하여 만들어진 것보다는 훨씬 용이하게 정제할 수 있다. 단락 9, 11에서 제시한 실시예에서 복합 합성을 이용하여, T-20 전장 펩티드를 만드는 것에 대하여 설명하고 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 1㎏ 이상의 T-20 및 T-20-유사 펩티드 중간 생성물을 만들 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한, 염기성 pH 범위에서 이용될 수 있는 고성능 물질을 이용하여, T-20 및 다른 T-20-유사 펩티드 및 이 글에서 설명하는 특정 펩티드 단편들을 정제할 수 있다는 예상치 못한 발견을 하였다. 따라서, 본 발명은 펩티드, 특히, T-20 및 T-20-유사 펩티드 및 이들 펩티드 합성에서 중간 생성물로 작용하는 개별 펩티드 단편을 정제하는 방법에 관계한다.
정의
여기에서 이용되는 아미노산 명명법은 통상적인 것으로 다음과 같다:
Figure 112000019955474-pct00004
도 1은 4개 단편을 이용한 T-20 합성 경로: 다음의 단락 9.1에서 제시한 실시예에 기재된 전장 T-20을 합성하는 과정을 도시한 것으로, 상기 표 2에서 볼 수 있는 것과 같은 중간 생성물 펩티드 단편 군 6을 시발물질로 이용한다.
도 2는 4개 단편을 이용한 T20 합성 경로: 경로 2. 이 도면은 전장 T-20을 합성하기 위해 상기 표2에서 볼 수 있는 펩티드 단편 군 6에 결합하는 추가 4개 단편 과정을 설명하는 것이다.
도 3은 3개 단편을 이용한 T-20 합성 경로. 이 도면은 전장 T-20을 합성하기 위해, 하기 9.1에서 제시한 실시예에 따른 과정을 나타낸다.
도 4는 3개 단편을 이용한 T20 합성 경로: 경로 2. 이 도면은 전장 T-20을 합성하기 위해, 하기 9.2, 9.3, 9.4, 9.5에서 제시한 실시예에 따른 과정을 나타낸 다.
도 5는 2개 단편을 이용한 T20 합성 경로. 이 도면은 전장 T-20을 합성하기 위해 상기 표2에서 볼 수 있는 펩티드 단편 군 18을 결합시키는 과정을 설명한다.
5.1. 전장 펩티드
본 발명은 T-20 또는 DP-178로 공지된 펩티드를 합성하는데 이용할 수 있는 방법, 펩티드 단편, 펩티드 단편 군에 관계한다. T-20은 HIV-1LAI의 막통과 단백질 아미노산 잔기 638 내지 673에 상응하는 펩티드로써, 36개 아미노산으로 된 서열(아미노 말단 NH2에서부터 카르복시 말단, COOH까지)로 구성된다:
NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH
인지하는 바와 같이, T-20 펩티드를 비롯하여, 본 발명의 단편 및 단편 군을 선택하는데 이용되는 방법, 단편 및 단편 군, 기술을 이용하여, T-20-유사 펩티드를 합성할 수 있다. 여기에서 이용된 "T-20-유사"란 미국 특허 5,464,933; 5,656,480; PCT 공보 WO96/19495에서 나열된 임의 HIV 또는 HIV가 아닌 펩티드를 의미하고, 이들 문헌은 각 참고문헌으로 첨부한다.
상기에서 설명하는 T-20 및 T-20-유사 펩티드에 추가하여, 본 발명의 방법, 단편 및 단편 군을 이용하여, 변형된 아미노 또는 카르복시 말단을 가지는 펩티드를 합성할 수 있다. 예를 들면, T-20을 이용하여, 다음의 펩티드를 얻을 수 있다;
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
이때, X는 아미노기; 카르보벤조옥실, 단실, T-부틸옥시카르보닐에서 선택된 소수성기; 아세틸기; 9-플로오르에닐-메톡시-카르보닐(FMOC) 기; 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물에서 선택된 거대 분자 담체를 나타내고;
Z는 카르복실기; 아미도 기; T-부틸옥시카르보닐기; 파라-니트로벤질 에스테르 기; 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물에서 선택된 거대 분자 담체를 나타낸다. "X" 및 "Z"기를 추가하는 기술은 당분야에 공지된 것이다.
적절한 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 상기 서열(이때, X는 아세틸기, Z는 아미드 기)을 가지는 펩티드를 합성할 수 있다. 하기 단락 9에서 제시한 실시예에서, 단락 5.2에서 설명하는 중간 생성물 펩티드를 결합시켜, T-20 펩티드를 성공적으로 합성하는 것을 설명한다. 적절한 방법에서, T-20 및 T-20-유사 펩티드 및 중간 생성물은 임의 비-실리카계 컬럼 패킹(로딩율을 최대로 하기 위함)을 이용하여 정제할 수 있는데, 이때 이용될 수 있는 컬럼 패킹에는 지르코니움계 패킹, 폴리스티렌, 폴리아크릴 또는 높은 pH 범위(7이상)에서 안정적인 다른 고분자계 패킹이 포함되지만, 이들에 국한시키지는 않는다. 예를 들면, 이것 이상의 pH 값을 포함하는 광범위한 pH 범위를 가지는 비-실리카-실린 컬럼은 Tosohaus사(Montgomeryville, PA)에서 시판한다. 이와 같은 물질로 채워진 컬럼은 낮은 압력, 중간 압력 및 높은 압력에서 실행할 수 있다. 예를 들어, 하기 단락 10에서 제시한 정제 방법을 참고로 한다.
5.2. 중간 생성물 펩티드
본 발명에는 상기 표1에서 나열한 특정 아미노산 서열을 가지는 T-20 및 T- 20-유사 펩티드의 중간 생성물 펩티드 단편과 표 2에서 나타낸 중간 생성물 군이 포함되지만, 이들에 국한시키지는 않는다. 하기 표 2에서 나열한 군에 있는 특정 펩티드 중간 생성물을 이용하여, T-20 및 T-20-유사 펩티드를 만들 수 있다.
아미노산의 하나 또는 복수의 측쇄는 표준 보호기, 예를 들면, t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt), t-부틸옥시카르보닐(Boc)로 보호할 수 있다. t-Bu기는 아미노산 잔기 Tyr(Y), Thr(T), Ser(S), Asp(P)에 대한 바람직한 측쇄 보호기이고; trt기는 아미노산 잔기 His(H), Gln(Q), Asn(N)의 바람직한 측쇄 보호기이고; Boc기는 아미노산 잔기 Lys(K), Trp(w)의 바람직한 측쇄 보호기이다.
표1에 언급된 단편 1, 2, 3, 4의 합성동안, 히스티딘 잔기의 측쇄는 가급적 트리틸(try)보호기로 보호하여야 한다. 보호받지 못하는 경우, 수지에서 펩티드를 절단하기 위해 사용된 산이 히스티딘과 반응하여, 펩티드 단편이 분해되게 된다.
가급적, 본 발명의 펩티드 단편의 글루타민 잔기는 트리틸(trt)기로 보호한다. 하지만, 단편 1-16과 9-16의 카르복시-말단상의 글루타민 잔기의 측쇄는 보호하지 않는 것이 바람직하다. 1-16 단편의 카르복시 말단의 글루타민 잔기에 보호기가 없는 경우, 1-16 단편과 17-36단편과의 반응이 용이해져, 단편의 결합이 가능해지게 되는 것으로 밝혀졌다(라세미화반응 2%미만). 또한, 유기용매에서 본 발명 펩티드 단편의 용해도를 낮게 해야 하는 경우, 단편의 하나 또는 복수의 다른 글루타민 잔기에서 트리틸 보호기를 제거해야 한다.
가급적, 본 발명의 각 펩티드 단편의 모든 아스파라긴 잔기는 보호한다. 또한, 트립토판 잔기는 Boc기로 보호하는 것이 바람직하다.
표1에서 언급한 펩티드 화학식 1-18에 따른 보호 펩티드 단편에는 하기 표3에서 언급한 화합물이 포함되지만, 이들에 한정하지 않는다.
Figure 112000019955474-pct00005
Figure 112000019955474-pct00006
상기 표 3에서 언급한 펩티드의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 측쇄는 표준 측쇄 보호기, 예를 들면, 전술한 tBu, trt, Boc로 보호할 수 있다. 표3 펩티드의 대표적인 합성방법은 하기 단락 7과 8에서 제시하는데, 여기에는 단락 5.4에서 상술한 일반 기술을 이용한다.
5.3 펩티드 합성
전술한 바와 같이, 본 발명의 개별 펩티드 단편중 일부는 고형상 합성기술을 이용하여 합성하고, 본 발명의 다른 펩티드는 고형상과 용액상 합성기술을 이용하 여 만들 수 있는데, 상기 합성은 이 글에서 밝힌 T-20 또는 T-20-유사 펩티드의 생산으로 마무리된다. 하지만, 인지하는 바와 같이, 본 발명의 펩티드 단편은 당분야에 공지된 기술로 합성 또는 제조할 수 있다(Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY).
대안으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드의 아미노산 잔기를 연결하는 하나 또는 복수의 결합이 비-펩티드 결합이 되도록 합성할 수 있다. 이들 대체 비-펩티드 결합은 당분야에 공지된 반응을 이용하여 형성할 수 있는데, 이들 반응에는 이미노, 에스테르, 하드라지드, 세미카르바지드, 아조 결합이 포함되지만, 이들에 한정하지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 전술한 서열로 구성된 T-20과 T-20 유사 펩티드는 아미노 및/또는 카르복시 말단에 추가의 화학기가 존재하도록 합성하여, 펩티드의 안정성, 반응성 및/또는 용해성을 향상시킬 수 있다. 가령, 카르보벤조일, 단실, 아세틸 또는 t-부틸옥시카르보닐기와 같은 소수성 기는 펩티드의 아미노 말단에 부가할 수 있다. 유사하게, 아세틸기 또는 9-플루오르에닐메톡시-카르보닐기는 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수 있다(전술한 T-20의 "X"변형). 또한, 소수성 기 t-부틸옥시카르보닐 또는 아미도기는 펩티드의 카르보닐 말단에 부가할 수 있다. 유사하게, 파라-니트로벤질 에스테르기는 펩티드의 카르복시 말단에 위치할 수 있다(전술한 T-20의 "Z"변형). 이런 변형을 도입하는 기술은 당업자에게 공지된 것이다.
또한, T-20과 T-20-유사 펩티드는 입체구조가 변형되도록 합성할 수 있 다. 가령, 펩티드의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 D-이성질체는 일반적으로, L-이성질체보다 자주 사용된다.
또한, 본 발명 펩티드의 아미노산 잔기의 적어도 하나는 공지된 비-자연발생 아미노산 잔기로 치환할 수 있다. 이런 변형은 본 발명 펩티드의 용해성, 반응성 및 또는 안정성을 증가시키는 역할을 한다.
T-20 또는 T-20-유사 펩티드는 추가로, 아미노 및/또는 카르복시 말단과 공유결합하는 거대분자 담체를 보유하도록 합성할 수 있다. 이런 거대분자 담체에는 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 또는 추가의 펩티드가 포함된다. 따라서, 전술한 T-20의 "X"변형은 펩티드의 아미노 말단에 공유결합된 상기 거대분자 담체중 임의의 하나가 되는데, 이중 추가의 펩티드 기가 선호된다. 유사하게, T-20의 "Z"변형은 전술한 거대분자 담체중 임의의 하나가 된다.
가급적, 본 발명의 펩티드 단편은 표준 FMOC 프로토콜을 이용한 고형상 펩티드 합성(SPPS) 기술로 합성한다(Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749; Carpino et al., 1972, j. oRG. Chem. 37(22):3404-3409). 적절한 구체예에서, 본 발명 펩티드 단편의 고형상 합성은 과도산성(super acid) 민감성 고형지지체에서 실시하는데, 상기 지지체로는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946)와 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부틸산 수지(Seiber, 1987, Terahedron Letters 28(49): 6147- 6150, Richter et al., 1994, Terahedron Letters 35(27):4705-4706)를 예로 들 수 있지만, 이들에 한정하지 않는다. 2-클로로트리틸 클로라이드와 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부틸산 수지는 Calbiochem-Novabiochem Corp.(San Diego, CA)에서 구입할 수 있다.
고형상 펩티드 합성에 이용할 수 있는 수지의 생산과 로딩을 위한 일반절차는 이 글에서 제시한다. 수지 로딩은 다음의 기술을 이용하여 실시할 수 있다: 수지 가급적, 2-클로로트리틸 수지와 같은 과도산성 민감성 수지를 반응 체임버에 채운다. 수지는 디클로로메탄(DCM)과 같은 염소처리한 용매로 씻는다. 베드는 배수하고, 8-10 용량 디클로로에탄(DCE)에 녹인 1.5 당량 아미노산과 2.7 당량 디이소프로필에틸아민(DIEA)의 용액을 첨가한다. 아미노산의 N-말단은 가급적, Fmoc로 보호하고, 아미노산의 측쇄는 필요한 경우에, 보호한다. 혼합물은 2시간동안 질소 기포로 교반한다.
염소처리된 용매는 2-클로로트리틸 수지의 적당한 팽창을 위해 필요하다. 비록, 문헌에 따르면 DCE가 더 큰 로딩 효율을 제공하지만, 로딩동안의 환원체로 거의 치환되지 않는다.
교반후, 베드는 배수하고, DCM으로 씻는다. 수지의 활성위치는 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 20-30분동안 말단 캡핑한다. 베드는 물을 제거하고, DCM으로 4번 씻고, 질소 정화로 건조시켜, 로딩된 수지를 얻는다.
Fmoc는 아미노산의 N-말단에 대한 바람직한 보호기이다. 어떤 아미노산이 로딩되는 가에 따라, 이의 측쇄는 보호할 수도 있고 안 할 수도 있다. 가령, Trp가 로딩되는 경우, 이의 측쇄는 Boc로 보호하여야 한다. 유사하게, Gln의 축쇄는 trt로 보호한다. 하지만, 1-16 펩티드 단편 합성을 위해 Gln이 로딩되는 경우, 이 의 측쇄는 보호하지 않는다. Leu의 측쇄는 보호할 필요가 없다.
수지 로딩과 펩티드 합성에 사용된 Fmoc-보호된 아미노산은 필요한 경우, Sean 또는 Genzyme에서 얻은 측쇄 보호기와 함께 또는 측쇄보호기 없이 사용할 수 있다. 상기 절차에 대한 대안으로, 적당한 아미노산으로 로딩되어 있는 수지를 구매할 수도 있다.
단락 6에서 제시한 실시예는 전형적인 수지 제조방법을 설명한다.
고형상 펩티드 합성 기술은 다음의 기술에 따라 실시할 수 있다: 로딩된 수지를 반응 체임버에 첨가하고, 용매, 가급적, 메틸렌 클로라이드(DCM; 대략 10 용량)로 상태를 조절하면서, 15분동안 질소 교반하여 수지 비드를 팽창시켰다. DCM은 2-클로로트리틸 수지의 적당한 팽창에 필요하다. 비드가 팽창하고 활성위치가 열려 반응할 가능성이 증가함에 따라, 수지 용량은 2배 또는 3배로 증가한다. 수지가 팽창한 후, 용매는 반응 체임버에서 빼낸다.
수지의 말단으로부터 Fmoc(9-플루오르에닐-메틸옥시카르보닐)보호기의 제거는 10분동안 N-메틸-2-피롤리디논(NMP)에 녹인 20% 피페리딘 용액 1/2로 수지를 처리하여 달성한다. 각 부분용액에 필요한 NMP 용매의 20% 피페리딘 용액의 부피는 반응의 정도에 따라 달라진다. 수지는 이후, NMP(10 vol)의 부분용액으로 5-7번 세척하여, Fmoc 부산물(즉, 디벤조풀벤과 이의 피페리딘 부가생성물) 및 잔기 피페리딘을 제거한다.
클로라닐 검사를 이용하여, Fmoc 부산물과 잔기 피페리딘이 완전히 제거되었는 지 확인할 수 있다. 클로라닐 검사용액은 톨루엔에 녹인 클로라닐 포화용액 한 방울을 1㎖ 아세톤에 첨가하여 얻는다. NMP 세척은 세척액 한 방울을 클로라닐 검사용액에 첨가하여 조사할 수 있다. 남색 또는 보라색은 이차 아민 존재에 대한 양성 표시인데, 이것은 Fmoc 부산물 또는 잔기 피페리딘이 여전히 존재한다는 것을 암시한다. NMP 세척은 남색 또는 보라색이 사라질 때까지, 반복한다.
한편, 수지에 첨가되는 아미노산은 카르복시 말단에서 반응을 위해 순차적으로 활성화된다. 각 아미노산 아민말단은 Fmoc로 보호한다. 어떤 아미노산이 첨가되는 가에 따라, 이의 측쇄는 보호할 수도 있고 않을 수도 있다. 가급적, Tyr(Y), Thr(T), Ser(S), Asp(P) 측쇄는 t-BU로 보호하고, His(H), Gln(Q), Asn(N) 측쇄는 trt로 보호하고, Lys(K), Trp(w) 측쇄는 Boc로 보호한다. 하지만, 전술한 바와 같이, His 측쇄는 보호해야 한다. 또한, 단편 1-16과 9-16의 카르복시-말단상의 Gln 잔기의 측쇄는 보호하지 않는 것이 바람직하다. Len 또는 Ile 측쇄는 보호할 필요가 없다.
아미노산은 다음과 같이 활성화된다. Fmoc-보호된 아미노산(1.5 eq), 1-하이드록시벤조트리아졸 수산화물(HOBT) (1.5 eq), 디이소프로필-에틸아민(DIEA)(1.5 eq)은 실온에서, NMP (대략 7.5 vol)에 녹인다. 용액은 0-5℃로 냉각하고, 이후, 0-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오르포스페이트(HBTU) (1.5 eq)를 첨가하고, 5-15분동안 교반하여 분해하였다. 저온에서 활성화를 실시하여, 아미노산의 라세미화반응을 최소화시키는 것이 중요하다. HBTU 시약은 냉각 용액에 마지막으로 첨가하는데, 그 이유는 활성화 및 라세미화반응이 이의 부재하에서는 일어나지 않기 때문이다.
활성화된 아미노산 용액은 배수된 수지에 채우고, DCM(대략, 2.5 vol)으로 씻는다. 아미노산 활성화는 DCM에서 HBTU 불용성으로 인해, NMP에서 진행시킨다. 하지만, 이 시점에서, 반응물에 DCM을 첨가하여 수지 비드의 적당한 팽창을 유지시킨다. 반응물은 1시간동안 N2 기포로 교반한다. 결합 완결은 후술한 정성 닌하이드린 검사로 모니터할 수 있다.
정성 닌하이드린 검사를 이용하여 반응 종결을 검사하기 위해, 2-20mg의 수지 샘플을 뽑아내고, 메탄올로 깨끗하게 씻는다. 에탄올에 녹인 76% 페놀 용액 3방울, 피리딘에 녹인 0.2 mM KCN 용액 4내지 5방울, 에탄올에 녹인 닌하이드린 0.28 M 용액 3방울을 샘플에 첨가한다. 샘플은 에탄올로 0.5㎖ 용량으로 희석하고, 5-10분동안 75 ℃로 열 블럭하에 둔다. 남색 또는 보라색은 자유 아민 존재에 대한 양성 표시인데, 이것은 반응이 완결되지 않았다는 것을 암시한다. 샘플은 추가로, 3㎖ 용량으로 희석하여, 농축된 샘플에서 색깔 변화정도를 더 쉽게 측정할 수 있다.
양성 닌하이드린 검사를 1시간후에 관찰하는 경우, 결합 반응을 추가로 1시간동안 지속시킨다. 양성 닌하이드린 검사를 2시간후에 관찰하는 경우, 수지는 배수하고, 대략 10 용량의 NMP에서 3번 세척하고, 결합 반응은 1 당량의 활성 아미노산을 이용하여 반복한다.
결합 주기사이에 하룻밤동안 수지를 저장하는 경우, 수지는 배수하고, 질소 블랭킷하에 DCM으로 말단 캡핑한다. 대안으로, 베드는 배수하고, 질소 블랭킷하에 서 저장하고, 이후 다음 결합주기로 진행하기전 DCM 세척액으로 상태를 조절한다. 절단이전, 완성된 단편을 하룻밤동안 저장하는 경우, 수지 베드는 NMP없이 DCM으로 씻는데, 그 이유는 NMP에서 상당한 Fmoc 탈보호가 일어날 수 있기 때문이다.
결합이 완결된 것으로 판단되면, 수지는 1/3(10 vol) NMP 용액으로 씻는다. 주기는 다음 펩티드 단편에서 반복한다. 최종 결합반응 후, 수지는 1/4(10 vol) NMP, 이후 1/4(10 vol) DCM 용액으로 씻는다. 수지-결합 펩티드는 질소 정화로 건조시킨다.
고형상 합성기술을 통해 합성된 펩티드는 절단할 수 있고, 다음의 기술에 따라 분리할 수 있다: 펩티드는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 수지로부터 절단할 수 있다. 가령, DCM에 녹인 1% 또는 2% 트리플루오르아세트산(TFA) 또는 DCM에 녹인 1%와 2% TFA 용액의 혼합물을 이용하여 펩티드를 절단할 수 있다. 또한, 아세트산(HOAC)을 이용하여 펩티드를 절단할 수 있다. 특정 절단시약, 용매, 절단에 필요한 시간은 절단할 펩티드에 따라 달라진다. 절단후, 절단분취물은 일련의 표준 과정에 처리하여 펩티드를 분리한다. 일반적으로, 결합된 절단 분취물은 진공하에서 농축시키고, 이후 에탄올, 메탄올 또는 헵탄과 같은 용매로 재구성한다. 일반적으로, 펩티드는 물을 첨가하여 침전시키고, 진공여과하여 수득한다. 대안으로, 산물은 펩티드의 분리이전 분쇄한다.
하기 단락 7.1-7.6에서 제시한 실시예에서, 표 1, 2 및/또는 3에서 보인 펩티드 중간물질의 고형상 합성을 제시한다.
전장 T-20 펩티드 합성의 경우, 표 1의 펩티드 중간물질을 서로 결합시켜 T- 20 펩티드를 만들 수 있다. 가령, 상기 표 2에서 언급한 펩티드 중간물질을 서로 결합하여 T-20 전장 펩티드를 만들 수 있다. 중간물질 펩티드 단편으로부터 전장 T-20 합성의 전형적인 예는 단락 9에 제시하는데, 도 1-5에서 개략적으로 설명한다.
특정 구체예에서, T-20 합성을 위한 4개 단편 방식은 아래와 같다. "4개 단편 방식" 합성은 4개의 T-20 중간물질 펩티드 단편을 고형과 액체상 합성기술로 합성하고 결합하여 전장 T-20 펩티드로 만드는 T-20 합성방법을 의미한다. 표 2에서 보인 펩티드 중간단편 군 5, 6, 8, 9, 12-15가 바람직하다. 도 1과 2는 2가지 4개 단편 방식을 설명하는데, 여기서, 표 2의 펩티드 중간단편 군 6을 이용하여 전장 T-20을 합성한다. 이 군의 경우, 아미노산 잔기 36(T-20 카르복실-말단 아미노산 잔기)은 단편 결합과정동안 개별적으로 도입한다. 도 1에서 보인 T-20 합성개요의 정점은 단락 9.1.에서 제시한 실시예에서 알 수 있다.
다른 구체예에서, T-20 합성을 위한 3개 단편 방식은 아래와 같다. "3개 단편 방식"합성은 3개의 T-20 펩티드 중간 단편을 고형과 액체상 합성기술로 합성하고 결합하여 전장 T-20 펩티드로 만드는 T-20 합성방법을 의미한다. 표 2에서 보인 펩티드 중간단편 군 2-4, 7, 10이 바람직하다. 도 3과 4는 2가지 3개 단편 방식을 설명하는데, 여기서, 표 2의 펩티드 중간단편 군 3을 이용하여 전장 T-20을 합성한다. 이 군의 경우, 아미노산 잔기 36(T-20 카르복실-말단 아미노산 잔기)은 단편 결합과정동안 개별적으로 도입한다. 도 3에서 보인 T-20 합성개요의 정점은 단락 9.1.에서 제시한 실시예에서 알 수 있다. 도 4에서 보인 T-20 합성개요의 정 점은 단락 9.2-9.5에서 제시한 실시예에서 알 수 있다.
다른 구체예에서, T-20 합성을 위한 2개 단편 방식은 아래와 같다. "2개 단편 방식"합성은 2개의 T-20 펩티드 중간단편을 고형과 액체상 합성기술로 합성하고 결합하여 전장 T-20 펩티드로 만드는 T-20 합성방법을 의미한다. 표 2에서 보인 펩티드 중간단편 군 1과 16-20이 바람직하다. 도 5는 2가지 2개 단편 방식을 설명하는데, 여기서, 표 2의 펩티드 중간단편 군 20을 이용하여 전장 T-20을 합성한다. 이 군의 경우, 아미노산 잔기(T-20 카르복실-말단 아미노산 잔기)는 단편 결합과정동안 개별적으로 도입한다.
당업자에게 공지된 용액상 펩티드 합성기술을 이용하여 본 발명의 펩티드 중간단편을 합성할 수 있다. 단락 8.1-8.11에서, 표 1, 2 및/또는 3에서 언급한 펩티드 중간단편의 전형적인 용액상 펩티드 합성을 설명한다. 가령, 광범위한 pH 범위를 보이는 비-실리카-로딩된 컬럼 패킹은 Tosohaus(Montgomeryville, PA)에서 구입한다.
단락 6.1-6.3에서, 클로로트리틸 수지가 합성되는 실시예를 설명하는데, 이들 실시예는 이 글에서 밝힌 펩티드와 펩티드 중간단편의 고형상 합성에 관련하여 이용할 수 있다.
6.1 Fmoc-Trp(Boc)-2-클로로트리틸 수지의 준비
물질: MW eq mmoles grams mL
2-클로로트리틸클로라이드 수지 -- 1.0 25 25 --
From-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.5 19.7
디이소프로필에틸아민(DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
디클로로에탄(DCE) -- -- -- -- 250
디클로로메탄(DCM) -- -- -- -- 6X250
9:1메탄올:DIEA -- -- -- -- 200
과정:
2-클로로트리틸 클로라이드 수지(25 g, 1 eq)은 500㎖ 펩티드 체임버에 채우고, 250㎖ DCM으로 씻었다. 베드는 배수하고, 10 용량 DCE에 녹인 Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5 eq)와 DIEA(1.7 eq)의 용액을 첨가한다. 혼합물은 2시간동안 질소기포로 교반하였다.
베드는 배수하고, 250㎖ DCM으로 씻었다. 수지의 활성위치는 200㎖ 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 20분동안 말단 캡핑하였다. 베드는 배수하고, 4 ×250㎖ DCM으로 씻고, 질소 정화로 건조시켜 34.3g 로딩된 수지를 얻었다.
정량 HPLC 분석은 수지으로부터 Fmoc-아미노산을 절단하고, 기준에 대하여 분석하여 실시하였다. 상기 물질의 HPLC 분석에서, 수지의 로딩은 0.68mmol/g인 것으로 밝혀졌다.
컬럼: Phenomenox Jupiter C18; 300Å; 5 μ
유속: 1 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 아세토니트릴 65% B 등용매의 0.1% TFA
보유시간: ∼ 14 분
6.2. Fmoc-Gln-2-클로로트리틸 수지의 준비
물질: MW eq mmoles grams mL
2-클로로티리틸클로라이드 수지 -- 1.0 25 25 --
FmocGlnOH 368.39 1.5 37.5 13.8 --
디이소프로필에틸아민(DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
디클로로에탄(DCE) -- -- -- -- 75
N,N-디메틸포름아미드(DMF) -- -- -- -- 200
디클로로메탄(DCM) -- -- -- -- 6X250
9:1메탄올:DIEA -- -- -- -- 200
과정:
75㎖ DCE와 200㎖ DMF의 혼합물에 녹인 FmocGlnOH(1.5 eq)와 DIEA(1.7 eq)을 사용하여, 상기 6.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하였다. DMF를 첨가하면, FmocGlnOH가 안정화된다. 상기 반응에서 33.8g의 로딩된 수지가 만들어진다. 수지의 이론적 로딩은 0.74mmol/g으로 추정되는데, 상기 물질은 다음으로 이전시켰다.
6.3. Fmoc-Leu-2-클로로트리틸 수지의 준비
물질: MW eq mmoles grams mL
2-클로로트리틸플로라이드 수지 -- 1.0 250 250 --
fmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 --
디이소프로필에틸아민(DIEA) 129.25 1.7 425 55 75
디클로로에탄(DCE) -- -- -- -- 2000
디클로로메탄(DCM) -- -- -- -- 6X1500
9:1 메탄올:DIEA -- -- -- -- 1500
과정:
수지는 3ℓ 펩티드 체임버에 채우고, 1.5 DCM으로 씻었다. 베드는 배수하고, 8 용량 DCE에 녹인 FmocLeuOH (1.5 eq)와 DIEA(1.7 eq)의 용액을 첨가하였다. 혼합물은 질소 기포로 2시간동안 교반하였다.
베드는 배수하고, 1.5ℓDCM으로 씻었다. 수지의 활성위치는 1.5ℓ 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 30분동안 말단 캡핑하였다. 베드는 배수하고, 4 ×1.5ℓ DCM으로 씻고, 질소 정화로 건조시켜 345g 로딩된 수지를 얻었다.
정량 HPLC 분석은 수지으로부터 Fmoc-아미노산을 절단하고, 기준에 대하여 분석하여 실시하였다. 상기 물질의 HPLC 분석에서, 수지의 로딩은 0.72mmol/g인 것으로 밝혀졌다.
컬럼: Phenomenox Jupiter C18; 300Å; 5 μ
유속: 1 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 아세토니트릴 65% B 등용매의 0.1% TFA
보유시간: ∼ 8 분
7. 펩티드의 고형상 합성
하기의 단락 7.1-7.6에서, 표 1, 2 및/또는 3에서 언급한 펩티드 중간물질의 전형적인 고형상 펩티드 합성을 설명한다.
7.1 Fmoc-AA(1-8)-OH(단편 1b) 구조의 준비
구조:
From-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO:2)
C93H121N10O15
MW 1619.06
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Leu-2-클로로트리틸 수지 -- 1.0 15.6 20.0 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 23.4 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물*153.15 1.5 23.4 3.6 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플로오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 23.4 8.9 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 23.4 3.0 4.1
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 150
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 50
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2X200
세척용 NMP* -- -- -- -- 200(세척액 당)
DCM에 녹인 1% 트리플루오르아세트산(TEA) -- -- -- -- 300
0.5% TFA/DCM -- -- -- -- 200
피리딘 -- -- -- --
에틸알코올 -- -- -- -- 110
물 -- -- -- -- 200+100
* 결합주기 마다
이론 수득량: 25.3g 예상 수득율: 80-90%
실제 수득량: 20.0g
과정:
1ℓ 펩티드 반응 체임버에 20.0g Fmoc-Leu-2-클로로트리틸 수지를 채웠다. 수지는 200㎖(~10 vol) DCM에서, 15분 질소교반으로 상태조절하여 비드를 팽창시키고, 이후 배수하였다.
말단아민으로부터 Fmoc(9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐)제거는 각각 10분동안 NMP에 녹인 2 ×200㎖의 20% 피페리딘 용액을 이용하여 달성하였다. 수지는 이후, 200㎖(~10vol) NMP로 5-7번 세척하여, Fmoc 부산물(즉, 디벤조풀벤과 이의 피페리딘 부가생성물) 및 잔기 피페리딘을 제거하여, 음성 클로라닐 검사로 측정하였다.
한편, 서열상의 다음 아미노산 Fmoc-Ser(tBu)는 카르복시 말단상의 반응을 위해 활성화시켰다. Fmoc-보호된 아미노산(1.5 eq)인 HOBT (1.5 eq)와 DIEA(1.5 eq)는 실온에서, 150㎖(~7.5 vol) NMP에 녹였다. 용액은 0-5℃로 냉각하고, 이후, HBTU(1.5 eq)를 첨가하고 5-15분 교반하여 분해시켰다. 활성화된 산용액은 배수된 수지에 채우고, 50㎖ DCM(~2.5 vol)으로 씻었다. 반응물은 1시간동안 N2 기포로 교반하였다. 결합 완결은 정성 닌하이드린 검사로 모니터하였다. 결합 반응이 종결된 것으로 판단되면, 수지는 배수하고, 3 ×200㎖(1 vol) NMP로 씻었다.
각 1.5 당량의 Fmoc-보호 아미노산 His(trt), Ile, Leu, Ser(tBu), Thr(tBu), Tyr(tBu)를 이용하여, 다른 펩티드 단편에 상기 사이클을 반복한다. 최종 결합 반응후, 수지는 4 ×200㎖(10 vol) NMP로 씻고, 이후, 4 ×200㎖(10 vol) DCM으로 씻었다. 수지는 질소 정화로 건조시켜, 42g 수지-결합된 펩티드를 얻었다.
펩티드는 2분동안, DCM에 녹인 300㎖의 1% TFA, 이후 DCM에 녹인 200㎖의 0.5% TFA를 이용하여, 21g 수지로부터 절단하였다. 절단분취물은 피리딘(TFA와 1:1 부피)으로 수거하였다. 절단세척액은 모으고, 진공하에서 ~50 ㎖부피로 농축시키고, 이후, 110㎖ 에탄올로 재구성하고, 동시에, 계속 농축하여 잔기 DCM를 제거하고 최종 부피는 ~250㎖가 되도록 하였다. 산물은 200㎖ 물을 첨가하여 침전시켰다. 슬러리는 30분동안 실온에서 교반하였다. 고체는 진공여과하여 수득하고, ~100㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜, 95% HPLC 순도의 20.0g(79%) Fmoc- AA(1-8)-OH를 얻었다.
컬럼: Phonomenox Jupiter C18
유속: 1 ㎖/min
검출: 160nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 20분동안 80% B 내지 99% B 아세토니트릴로 구배된 0.1% TFA
보유 시간: 대략 23분
7.2 Fmoc-AA(9-15)-OH(단편 5b) 구조의 준비
Fmco-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-OH (SEQ ID NO:6)
C127H129N10O13
MW 1963.39
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Gln(trt)-2-클로로리틸 수지 -- 1.0 12.0 20.0 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 18.0 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물153.15 1.5 18.0 2.8 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플루오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 18.0 6.8 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 18.0 2.3 3.1
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 150
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 50
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2x200
세척용 NMP* -- -- -- -- 200(세척액 당)
절단용 DCM -- -- -- -- 160
아세트산(HOAc) -- -- -- -- 20
트리플루오르에탄올 -- -- -- -- 20
헵탄 -- -- -- -- 250+250+100
메틸-t-부틸에테르 -- -- -- -- 100
이소프로판올 -- -- -- -- 60
물 -- -- -- -- 60+50
* 결합주기 마다
이론 수득량: 23.6g 예상 수득율: 89-95%
실제 수득량: 21.1g
과정:
단락 7.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하는데, 이때, 20.0g Fmoc-Gln(trt)-2-클로로트리틸 수지와 Fmoc-보호 아미노산 Asn(trt), Gln(trt), Ser(tBu), Glu(tBu), Gln(tBu), Ile을 사용하였다.
최종 결합반응후, 수지는 4 ×200㎖(10 vol) NMP, 이후, 4 ×200㎖(10 vol) DCM으로 씻었다.
펩티드는 2시간동안, 200 ㎖의 8:1:1 DCM:TFE:HOAc를 이용하여 수지로부터 절단하고, 이후, 2 ×100㎖ DCM 세척액으로 절단하였다. 모아진 용리액은 진공하에 ~100㎖ 부피로 농축하고, 이후, 250㎖ 헵탄으로 재구성하고, 동시에, 계속 농축하여 잔기 DCM을 제거하고, 최종부피가 ~250㎖가 되도록 하였다. 헵탄층은 이중 상 혼합물로부터 분리하였다. 산물은 250㎖ 헵탄과 100㎖ MTBE를 첨가하여 침전시키고, 이후 실온에서 하룻밤동안 분쇄하여 원하는 농도의 물질을 만들었다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 대략 100㎖ 헵탄으로 씻었다. 산물은 재가공하여 잔류한 아세트산을 제거하였다. 여과된 고체는 50℃에서, 60㎖ 이소프로판올에 녹였다. 용액은 얼음 용액기에서 0-5℃로 냉각시키고, 이후, 60㎖ 물을 빠른 방울속도로 첨가하였다. 산물 슬러리는 얼음 용액기에서 ~1시간동안 교반하면서 분쇄하였다. 고체는 진공여과하여 분리하고, ~50㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜 95% HPLC 순도의 21.1g(90%) Fmoc-AA(9-15)-OH를 얻었다.
컬럼: Phenomenox Jupiter C18
유속: 1 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상 : A: 0.1% 수용성 TFA
B: 20분동안 80% B 내지 99% B 아세토니트릴로 구배된 0.1% TFA
보유 시간: 대략 23분
7.3 Fmoc-AA(1-16)-OH(단편 3d)의 준비
구조
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Gln(tBu)-Ser(tBu)Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO:4)
C199H245N22O32
MW 3457.30
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Gln(trt)-2-클로로리틸 수지 -- 1.0 24.1 32.5 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 36.2 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물153.15 1.5 36.2 5.5 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플루오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 36.2 13.7 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 36.2 4.7 6.3
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 200
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 75
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2x250
세척용 NMP* -- -- -- -- 250(세척액 당)
1% 트리플루오르 아세트산/DCM -- -- -- -- 4x50
피리딘 -- -- -- -- 4x0.5
헵탄 -- -- -- -- 150+50
메탄올 -- -- -- -- 50
물 -- -- -- -- 50+25
* 결합주기 마다
이론 수득량: 48.9g 예상 수득율: 85-90%
과정:
단락 7.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하는데, 이때, 32.5g Fmoc-Gln-2-클로로트리틸 수지 및 필요한 Fmoc-보호 아미노산을 사용하였다. 반응은 단락 6.1의 실시예에서 밝힌 대로 실행하였는데, 상기 물질 단락에서 지시한 바와 같이 약간 상이한 부피의 용매를 사용한 점은 예외로 한다.
최종 결합반응후, 수지는 4 ×250㎖(8 vol) NMP로 씻고, 이후, 4 ×250㎖ (8 vol) DCM으로 씻었다. 수지는 질소 정화로 건조시켜, 97.4g의 결합된 펩티드를 얻었다.
17.7-g 크기로, 수지-결합 펩티드는 DCM에 녹인 2 ×190㎖의 1% TFA를 이용하여, 1-2분동안 수지로부터 절단하고, 이후, DCM에 녹인 1 × 120㎖로 절단하였다. 절단분취물은 피리딘(TFA와 1:1 부피)으로 수거하였다. 분취물과 세척액은 모으고, 진공하에서 ~50㎖부피로 농축시키고, 이후, 200㎖ 에탄올로 재구성하였다. 계속 농축하여 잔기 DCM를 제거하고 최종 부피는 ~50㎖가 되도록 하였다. 산물은 250㎖ 물을 첨가하여 침전시키고, 30분동안 실온에서 교반하였다. 고체는 진공여과하여 수득하고, ~50㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜, 12.8g(84%)을 얻었다. 산물은 재가공하여 피리디니움염을 제거하였다. 여과된 고체는 실온에서 150㎖ 메탄올에 녹였다. 실온에서 200㎖ 물을 첨가하여 산물을 침전시켰다. 산물은 진공여과하여 분리하고, 50㎖물로 씻었다. 물질은 대거 건조시켜, 12.8g (84%) Fmoc-AA(1-16)-OH를 얻었다.
컬럼: Phonomenox Jupiter C18
유속: 1 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 20분동안 80% B 내지 99% B 아세토니트릴로 구배된 0.1% TFA
보유 시간: 대략 25분
7.4 Ac-AA(1-16)-OH(단편 3c)의 준비
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO:4)
C186H237N22O31
MW 3274.76
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Gln-2-클로로리틸 수지 -- 1.0 24.1 32.5 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 36.2 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물*153.15 1.5 36.2 5.5 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플루오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 36.2 13.7 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 36.2 4.7 6.3
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 200
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 75
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2x250
세척용 NMP* -- -- -- -- 250(세척액 당)
1% 트리플루오르아세트산/DCM -- -- -- -- 4x50
피리딘 -- -- -- -- 4x0.5
헵탄 -- -- -- -- 150+50
메탄올 -- -- -- -- 50
물 -- -- -- -- 50+25
* 결합주기 마다
이론 수득량: 48.9g 예상 수득율: 85-90%
과정:
단락 7.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하는데, 이때, 32.5g Fmoc-Gln-2-클로로트리틸 수지 및 필요한 Fmoc-보호 아미노산을 사용하고, 용매 부피는 상기 물질단락에서 지시하였다.
최종 결합 반응후, 수지는 4 ×250㎖(8 vol) NMP로 씻고, 이후, 4 ×250㎖ (8 vol) DCM으로 씻었다. 수지는 질소 정화로 건조시켜, 97.4g의 결합된 펩티드를 만들었다.
10-g 크기로, 수지-결합 펩티드는 30분동안 100㎖의 3:1 NMP:DCM에서 아세트산 무수물과 피리딘(각각, 5 eq)으로 아세틸화시키고, 이후, 2 ×25㎖ DCM으로 씻었다. 펩티드는 DCM에 녹인 3 ×50㎖의 1% TFA, 이후, 2 ×50㎖ DCM 세척액으로 절단하였다. 절단분취물은 피리딘(TFA와 1:1 부피)으로 수거하였다. 분취물과 세척액은 모으고, 진공하에서 100㎖부피로 농축시키고, 이후, 3 ×50㎖ 헵탄을 조금씩 첨가하여 재구성하고, 동시에, 계속 농축하여 잔류한 DCM를 제거하고 최종 부피는 ~150㎖가 되도록 하였다. 산물은 초기에 다소 점착성 물질로 침전되는데, 0-5℃ 얼음 용액기에서 30분동안 교반하여 여과가능한 고체로 분쇄한다. 고체는 진공여과하여 수득하고, ~50㎖ 헵탄으로 씻었다. 산물은 재가공하여 피리미디움염을 제거하였다. 여과된 고체는 실온에서 50㎖ 메탄올에 녹였다. 용액은 얼음 용액기에서 0-5℃로 냉각하고, 이후, 50㎖ 물은 빠른 방울속도로 첨가하였다. 물질은 초기에 점착성 고체로 침전되는데, 얼음 용액기에서 1시간동안 교반하여 여과가능한 경도로 분쇄한다. 산물은 진공여과하여 분리하고, ~25㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜, 7.0g (90%) AcAA(1-16)-OH를 얻었다. 계속해서, 산물은 전술한 바와 같이 재가공하여, 96% HPLC 순도의 6.2g(수득율 89%) 물질을 얻었다.
컬럼: Zorbax LP C8, 100Å, 20 μ
유속: 1 ㎖/min
검출: 220nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 20분동안 80% B 내지 99% B의 0.05% TFA로 구배된 1:1 ACN:IPA
보유 시간: 대략 15분
7.5 Fmoc-AA(17-26)-OH(단편 10b)의 준비
구조
Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO:11)
C127N167N13O25
MW 2275.82
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Gln-2-클로로리틸 수지 -- 1.0 19.5 25.0 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 30.0 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물*153.15 1.5 30.0 4.6 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플루오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 30.0 11.4 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 30.0 3.9 5.2
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 200
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 75
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2x250
세척용 NMP* -- -- -- -- 250(세척액 당)
1% 트리플루오르아세트산/DCM -- -- -- -- 3X400
피리딘 -- -- -- -- 3X4
에탄올(변성됨) -- -- -- -- 300
물 -- -- -- -- 300
* 결합주기 마다
이론 수득량: 44.4g 예상 수득율: 95-105%
실제 수득량: 46.9(105%)
과정:
단락 7.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하는데, 이때, 25.0g Fmoc-Leu-2-클로로트리틸 수지 및 필요한 Fmoc-보호 아미노산을 사용하고, 용매 부피는 상기 물질단락에서 지시하였다.
최종 결합 반응후, 수지는 4 ×250㎖(10 vol) NMP로 씻고, 이후, 4 ×250㎖ (10 vol) DCM으로 씻었다.
펩티드는 DCM에 녹인 3 ×400㎖(-15 vol)의 1% TFA, 이후, 1 ×200㎖(7.5 vol) DCM으로 절단하였다. 절단분취물은 피리딘(TFA와 1:1 부피)으로 수거하고, 이후, 분취물과 세척액은 산물 함량을 조사하였다. 산물을 함유한 분취물은 모으고, 진공하에서 ~100㎖ 부피로 농축시키고, 이후, 200㎖ 에탄올로 재구성하였다. 계속 농축하여 잔기 DCM를 제거하고 최종 부피는 ~250㎖가 되도록 하였다. 교반된 용액에 300㎖ 물을 첨가하여 산물을 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, ~50㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜, 97% HPLC 순도의 46.4g(105%) Fmoc-AA(17-26)-OH를 얻었다.
컬럼: Phenomenox Jupiter C18
유속: 1 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 20분동안 75% B 내지 99% B의 아세토니트릴로 구배된 0.1% TFA
보유 시간: 대략 25분
7.6 Fmoc-AA(27-35)-OH(단편 16b) 구조의 준비
구조
Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH (SEQ ID NO:17)
C121H148N14O24
MW 2182.61
물질: MW eq mmoles grams mL
Fmoc-Gln-2-클로로리틸 수지 -- 1.0 22.4 33.0 --
Fmoc-아미노산* -- 1.5 33.6 -- --
l-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)수화물*153.15 1.5 33.6 5.1 --
O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움
헥사플루오르포스페이트(HBTU)* 379.25 1.5 33.6 12.7 --
디이소프로필에틸아민(DIEA)* 129.25 1.5 33.6 4.3 5.8
N-메틸-2-피롤리디논(NMP)* -- -- -- -- 225
메틸렌 클로라이드(DCM)* -- -- -- -- 75
20% 피페리딘/NMP* -- -- -- -- 2x250
세척용 NMP* -- -- -- -- 250(세척액 당)
트리플루오르에탄올 -- -- -- -- 30
절단용DCM -- -- -- -- 240
에탄올(변성됨) -- -- -- -- 300.100
물 -- -- -- -- 300.150
DCM에녹인 1% 트리플루오르아세트산 -- -- -- -- 2X250
피리딘 -- -- -- -- 2X2.5
* 결합주기 마다
이론 수득량: 48.9 g 예상 수득율: 85-90%
과정:
단락 7.1의 실시예에서 이용한 과정을 반복하는데, 이때, 33.0g Fmoc-Trp(Boc)-2-클로로트리틸 수지, 필요한 Fmoc-보호 아미노산, 상기 물질단락에서 지시한 용매를 사용하였다.
최종 결합 반응후, 수지는 4 ×250㎖(7.5 vol) NMP로 씻고, 이후, 4 ×250㎖ (7.5 vol) DCM으로 씻었다.
펩티드는 300㎖(~10 vol)의 8:1:1 DCM:TFE:HOAc 용액을 2시간동안 처리하여 수지로부터 절단하였다. 수지는 배수하고, 2 ×250㎖ DCM으로 씻었다. 절단용액 과 세척액은 모으고, ~50㎖ 부피로 농축시키고, 이후, 250㎖ 에탄올로 재구성하였다. 용액은 얼음 용액기에서 교반하면서, 0-5℃로 냉각하였다. 교반된 용액에 125㎖ 물을 첨가하여 산물을 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, ~50㎖ 물로 씻었다. 산물은 대거 건조시켜, 95% HPLC 순도의 32.0g(65.4%) Fmoc-AA(27-35)-OH를 얻었다
수지는 DCM에 녹인 2 ×250㎖의 1% TFA 용액으로 처리하고, 이후, 100㎖ DCM으로 씻었다. 절단분취물은 TFA와 1:1 부피로 피리딘에 모았다. 모아진 용리액과 세척액은 ~50㎖ 용량으로 농축시켰다. 용액에 100㎖ 에탄올을 첨가하고, 이후, 150㎖ 물을 첨가하였다. 산물 슬러리는 진공여과로 10.7g(21.9%)(95% HPLC 순도)의 이차 산물을 산출하여, 통합 87.3%의 수득율을 얻었다. 1% TFA/DCM 절단은 향상된 효능과 줄어든 부피로 인해 선호된다.
컬럼: Phenomenox Jupiter C5, 300Å, 5μ
유속: 0.75 ㎖/min
검출: 260nm UV
이동상: A: 0.05% 수용성 TFA
B: 10분동안 70% B 내지 97% B의 1:1 IPA:MeOH로 구배된 0.1% TFA
보유 시간: 대략 25분
8. 펩티드 단편의 용액상 합성
하기 단락 8.1-8.11에서, 표 1, 2 및/또는 3에서 언급한 펩티드 중간물질의 전형적인 용액상 펩티드 합성을 설명한다.
8.1 글루타민의 파라 니트로벤질에스테르(OPNB)와 Fmoc-AA9-150H의 결합을 통한 Fmoc-AA9-160PNB 단편의 준비
구조
Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:7)
C129H141N13O22MW 2227.65
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA9-15OH 1963.39 1 9.7 19 --
HBrGlnOPNB(BaChem.#509709) 362.19 1.1 10.6 3.85 --
HOAT 136 1.1 10.6 1.45 --
HBTU 379.25 1.1 10.6 4.04 --
EtPr2N(d=0.755) 129.25 2.1 20.3 2.62 3.48
NMP -- -- -- -- 200
0.5N HCl -- -- -- -- 250
에틸 아세테이트 -- -- -- -- 250
헥산 -- -- -- -- 250
이론 수득량: 21.5 g 예상 수득율: 90-105%
과정:
FmocAA9-150H(단락 7.2에서 합성), HBrGlnOPNB, HOAT, EtPr2N은 자석 교반막대가 들어있는 1ℓ밑 둥근 플라스크에 모으고, NMP(200㎖)를 첨가하였다. 생성된 용액은 질소대기하에 두고, 교반하면서 0-5℃로 냉각하였다. 냉각 용액에 HBTU를 첨가하였다. 용액은 0-5℃에서 15분동안 교반하고, 얼음 용액기는 제거하고, 2.5시간동안 교반을 지속하였다(note 1).
반응 혼합물은 0-5℃로 냉각하고, 0.5N 수용성 HCl(250㎖)을 첨가하여 보호펩티드를 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 필터 플라스크에서 건조시켜, 24g의 정제안된 FmocAA9-160PNB를 만들었다. 고체는 에틸 아세테이트(250㎖)에 녹이고, 황산마그네슘(10g)에서 건조시키고, 여과하고, 100㎖ 용량으로 농축시켰다. 용액은 0-5℃로 냉각하고, 헥산(250 ㎖)을 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 건조시켜 21.5g FmocAA9-16OPNB(100% 수득율, 91-94% HPLC 순도)(note 2)를 얻었다.
Note:
1. 기준 과정(IPC), 박막 크로마토그래피(TLC)
90/10 클로로포름/에탄올
UV, 요오드 검출
Rt FmocAA9-15OH 0.46
Rt FmocAA9-16OPNB 0.57
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분동안 70-97%B, 8분동안 97%B
보유 시간: 13.3분
8.2 HCl HAA9-16OPNB 단편의 준비
구조
HCl H-Ili-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:7)
C144H131CIN13O20
MW 2041.02
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA9-16OPNB 2227.65 1 9.43 21 --
피페리딘 -- -- -- -- 10
THF -- -- -- -- 190
메틸 테트라부틸 에테르(MTBE) -- -- --- -- 250
헥산 -- -- -- -- 350
메탄올 -- -- -- -- 150
0.5N HCl -- -- -- -- 100
2-프로판올 -- -- -- -- 100
이론 수득량: 19.2 g 예상 수득율: 85-105%
과정:
자석 교반 막대가 들어있는 1ℓ 밑 둥근 플라스크는 FmocAA9-16OPNB(단락 8.1에서 합성)과 20:1 테트라하이드로퓨란/피페리딘으로 채웠다. 생성된 용액은 60분동안 실온에서 질소대기하에 교반하였다(note 1). 헥산(350 ㎖)을 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 용매는 점착성 고체로부터 따라냈다. 고체는 실온에서 18시간동안 MTBE(200㎖)로 분쇄하였다. 고체는 진공여과하여 수거하고, 건조시켜 18.9g의 HAA9-16OPNB를 얻었다(note 2)
고체는 메탄올(150 ㎖)에 녹이고, 교반하면서 0-5℃로 냉각하였다. 0.5N 수용성 염산(100 ㎖)을 첨가하여, 펩티드를 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 물(50㎖)과 2-프로판올(50㎖)로 씻고, 건조시켜 17.7g의 HCl HAA9-16OPBN(92% 수득율, HPLC 순도 92A%)를 얻었다(note 3)
Note:
1. 기준 과정, HPLC
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분간 70-97%B, 8분간 97%B
보유 시간: FmocAA9-16OPNB, 13.3분 HAA9-16OPNB, 10.7분
2. 이 시점에서 분리된 HAA9-16OPNB는 미량의 피페리딘과 벤질풀벤 피페리딘 부산물을 함유한다. 둘 모두 RAA1-8OH와 결합시키기 전에 제거한다.
3. Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분간 80-100%B, 5분간 100%B 5
보유 시간: HAA9-16OPNB, 7.2분
TLC 조건:
90/10 디클로로메탄/에탄올
UV, 요오드 검출
Rf: HAA9-16OPNB, 0.64
8.3 AcAA1-8OH와 HAA9-16OPNB 단편의 용해-상 결합에 의한 AcAA1-16OPNB 단편의 준비
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:4)
C194H246N23O34MW 3427.43
물질: MW eq mmols grams mL
AcAA1-80H 1440.86 1.3 0.13 0.186 --
HClH119-16OPNB 2041.02 1 0.10 0.204 --
HBTU 379.25 1.1 0.11 0.042 --
HOAT 136.1 1.1 0.11 0.015 --
EtPr2N 129.25 2.1 0.21 0.027 0.036
DMF -- -- -- -- 4.5
DMSO -- -- -- -- 0.5
물 -- -- -- -- 7
MTBE -- -- -- -- 3.5
이론 수득량: 0.38 예상 수득율: 85-105%
과정:
자석 교반막대가 들어있는 25㎖ 밑 둥근 플라스크는 AA1-8OH(단락 7.1에서 합성), HCl HAA9-16OPNB(단락 8.2에서 합성), HOAT로 채웠다. 고체는 EtPr2N을 함유한 9:1 DMF:DMSO(5 ㎖)에 녹이고, 이후, 질소대기하에서 0-5℃로 냉각하였다(note 1). 냉각 용액에 HBTU를 첨가한다. 반응혼합물은 15분동안 0-5 ℃로 교반하고, 이후, 실온으로 가열하고, 추가로 60분동안 교반하였다. 펩티드는 물(7 ㎖)을 첨가하여 용액으로부터 침전시켰다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 물(10 ㎖)로 세척하고, 건조시켜 0.36g의 정제안된 AcAA1-16OPNB를 얻었다. 고체는 실온에서 1.5시간동안 MTBE(3.5 ㎖)로 분쇄하고, 진공여과하여 수득하고, 건조시켜 0.335g의 AcAA-16PONB(88% 수득율, 82A% HPLC 순도)를 얻었다(note 3)
Note:
1. 모든 고체는 0-5℃로 냉각하고, HBTU를 첨가하기 전에, 용액상태로 존재해야 한다.
2. 기준 과정, TLC, HPLC
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분간 80-100%B, 5분간 100%B
보유 시간: HAA9-16OPNB, 7.2분(Ac1-8OH는 260nm에서 흡수없슴)
보유 시간: AcAA1-16OPNB, 12.45
TLC 조건:
90/10 클로로포름/에탄올
UV, 요오드 검출
Rf : HAA9-16OPNB, 0.64
Rf : Ac1-8OH, 0.35
Rf : Ac1-16OH, 0.48
3. Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분간 70-97%B, 8분간 97%B
보유 시간: Ac1-16OPNB, 16.4
8.4. FmocAA1-8OH 및 HCl HAA9-160PNB 단편의 용액 상 결합을 이용하여, FmocAA1-160PNB 단편 준비
구조
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:4)
C207H253N23O34
MW 3607.49
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA1-8OH 1620.92 1 7.84 12.7 --
HCl HAA9-16OPNB 2041.02 1 7.84 16.0 --
HBTU 379.25 1.2 9.42 3.57 --
HOAT 136.1 1.2 9.42 1.28 --
EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.5 19.6 2.55 3.36
DMF -- -- -- -- 250
10% 염화나트륨/물(wt/vol) -- -- -- -- 450
메탄올 -- -- -- -- 200
물 -- -- -- -- 100
이론 수득량:28.3g 예상 수득율:85-100%
과정:
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 1ℓ밑 둥근 플라스크에 FmocAA1-8OH(상기 7.1에서 합성), HCl HAA9-16OPNB(상기 단락 8.2에서 합성한), HOAT, DMF(250 ㎖)를 넣는다. 이 용액에 EtPr2N을 첨가시킨다. 용액은 0-5℃로 냉각시키고, HBTU를 첨가시킨다. 반응 혼합물은 0-5℃에서 15분간 교반시키고, 실온으로 만든 다음, 추가 70분(note 1)간 교반시킨다. 반응 혼합물은 0-5℃로 냉각시키고, 10% 염화나트륨/물(200㎖)을 첨가시켜, 펩티드를 침전시킨다. 진공 여과를 이용하여, 고체를 모으고, 물(50㎖)로 씻은 다음 건조시켜, 정제 안된 FmocAA1-16OPNB 27g을 얻는다. 고체는 메탄올(200㎖)에 용해시키고, 교반된 염화나트륨 수용액(10% Wt/vol, 300㎖)에 첨가시킨다. 진공 여과를 이용하여, 고체를 수득하 고, 물(50㎖)로 씻은 후에, 건조시켜 26g FmocAA1-16OPNB(수득율 92%, HPLC에 의한 순도 90A%(note 1))를 얻는다.
Note 1
기준 과정, HPLC
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B, 5분간 100%B
보유 시간: HAA9-16OPNB; 7.2분, FmocAA1-8OH; 7.9분
보유 시간: FmocAA1-16OPNB; 14.5분
8.5. 단편 H-AA1-16OPNB의 준비
구조
H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Gln(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:4)
C192H243N23O32
MW 3384.41
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA1-16OPNB 3607.49 1 0.28 1.0 --
피페리딘 -- -- -- -- 0.6
디클로로메탄 -- -- -- -- 11.4
헥산 -- -- -- -- 45
이론 수득량: 0.94g 예상 수득량:90-105%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 50㎖ 밑 둥근 플라스크에 FmocAA1-16OPNB(상기 8.4에서 합성), 디클로로메탄(11.4㎖), 피페리딘(0.6㎖)을 넣는다. 용액은 90분간 질소 대기하에 실온에서 교반시킨다(note 1). 반응 혼합물에 헥산(45㎖)을 첨가시키고, 진공 증류시켜, 용액의 용량을 25㎖로 줄인다. 생성된 고체는 진공 여과에 의해 수득하고, 건조시켜 0.96g HAA1-16OPNB(수득율 102%)를 얻는다. 고체를 HPLC로 분석하면, 72A% HAA1-16PONB, 18A% 풀벤(fulvene), 피페리딘-풀벤 부가 생성물로 구성됨을 알 수 있다.
Note 1
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분이상 80-100%B, 5분간 100%B
보유 시간: FmocAA9-16OPNB; 14.1분
보유 시간: HAA9-16OPNB; 11.6분
보유 시간: 풀벤 및 피페리딘-풀벤 부가 생성물, 각 5.5 및 4.8분
8.6. HAA1-16PONB의 N-말단의 아세틸화반응에 의한 단편 Ac-AA1-16OPNB 준비
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO:4)
C194H246N23O34
MW 3427.43
물질: MW eq mmols grams mL
HAA1-16OPNB 3384.41 1 0.28 0.95 --
아세트 무수물(d=1.08) 102.09 3 0.84 0.086 0.080
피리딘(d=0.978) 79.1 3 0.84 0.67 0.068
DMF -- -- -- -- 10
물 -- -- -- -- 30
MTBE -- -- -- -- 10
헥산 -- -- -- -- 10
이론 수득량:0.96g 예상 수득량:80-100%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 50㎖ 밑 둥근 플라스크에 HAA1-16OPNB(상기 8.5에서 합성), DMF(10㎖), 무수 아세트산, 피페리딘을 넣는다. 반응 혼합물은 60분간 질소 대기하에 실온에서 교반시킨다(note 1). 물(20㎖)을 첨가시켜, 펩티드를 침전시킨다. 고체는 진공 여과를 이용하여 수득하고, 물(10㎖)로 씻은 후에, 건조시켜 0.87g AcAA1-16OPNB을 얻는다. 잔류 풀벤 및 피페리딘-풀벤 부가생성물을 제거하기 위해, 고체를 1:1 MTBE/헥산(20㎖)으로 4.5분간 실온에서 가루로 얻는다. 고체는 진공 여과를 이용하여 수득하고, 건조시켜 0.82g AcAA1-16OPNB(수득율 85%, HPLC에 의한 순도는 90A%이상(note 1)을 얻는다.
note 1
1. 기준 과정, HPLC
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B ; 15분간 100%B
보유 시간: HAA9-16OPNB; 10.7분
보유 시간: AcAA1-16OPNB; 12.1분

TLC, 10% 에탄올/디클로로메탄
UV, 요오드 감지
Rf AcAA1-16OPNB, 0.69
8.7 His(trt) 존재하에서 AcAA1-16OPNB로부터 선택적으로 파라니트로벤질 보호기를 제거함으로써 단편 AcAA1-16OH을 준비
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO:4)
C187H241N22O32
MW 3276.4
물질: MW eq mmols grams mL
AcAA1-16OPNB 3424.86 1 0.23 0.80 --
10% Pd/C, Degussa, 50% 물 -- -- -- 0.30 --
포름산 암모늄 63.06 15 3.5 0.22 --
DMF -- -- -- -- 15
물 -- -- -- -- 120
에틸 아세테이트 -- -- -- -- 100
헥산 -- -- -- -- 44
메탄올 -- -- -- -- 10
포화된 수용성 NaCl -- -- -- -- 5
MTBE -- -- -- -- 4
이론 수득량:0.76g 예상 수득량:70-85%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 25㎖ 밑 둥근 플라스크에 AcAA1-16OPNB(상기 단락 8.6에서 합성), DMF(10㎖)를 넣는다. 이 용액에, 포름산 암모늄염 수용액(0.5㎖)을 첨가시킨 다음 탄소상의 젖은 팔라디윰(Degussa, 10%, 50%물)을 첨가시킨다. 슬러리는 120분간 실온, 질소 대기하에서 교반시킨다(note 1). 조밀하게 채워진 셀라이트를 통하여 슬러리는 90㎖ 물로 걸러낸다. 여과물 덩어리를 DMF(5 ㎖)로 씻어낸다. 수용성 현탁액을 에틸 아세테이트(100㎖)로 씻어낸다. 그 다음 에틸 아세테이트를 용량이 20㎖이 되도록 농축시킨다(note 2). 헥산(40㎖)을 첨가하여, 침전을 끝내고, 용매를 버린다. 고체를 메탄올(10㎖)에 용해시키고, 4:1 물/포화된 수용성 염화나트륨(25㎖)을 첨가시켜, 펩티드를 침전시킨다. 고체는 진공 여과로 수득하고, 물(10㎖)로 씻은 후에, 건조시켜 0.62g AcAA1-16OH를 얻는다. 고체는 15시간동안 실온에서 50% MTBE/헥산(8㎖)으로 가루를 만든 후에, 수득하고, 건조시켜 0.59g AcAA1-16OH(수득율 77%, HPLC에 의한 순도는 90A%)(note 3)를 얻는다.
Note
1. 기준 과정에서, TLC
80/20 디클로로메탄/에탄올
UV, 요오드 감지
Rf : AcAA1-16OPNB, 0.90
Rf : Ac1-16OH, 69
2. 용매 용량이 감소되기 시작하면서 AcAA1-16OH가 침전되기 시작한다.
3. Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B : 5분간 100%B
보유 시간: AcAA1-16OH; 10.73분
8.8. HPheNH 2 와 FmocAA27-35OH의 용액상 결합을 이용하여, 단편 FmocAA27-36NH 2 준비
구조
Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-rp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:18)
C130H159N16O24
MW 2329.64
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA27-35OH 2182.61 1 18.4 40.2 --
HPheNH2 162.21 1.2 22.1 3.6
HBTU 379.25 1.2 22.1 8.4
HOAT 136.1 1.2 22.1 3.0
EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.1 38.7 5.0 6.6
DMF 500
이론 수득량: 42.8g 예상 수득량: 90-105%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 2ℓ밑 둥근 플라스크에 FmocAA27-35OH(상기 단락 7.6에서 합성), HOAT, HpheNH2, DMF(500㎖)를 넣는다. EtPr2N을 첨가하고, 용액을 0-5℃로 냉각시킨 후, HBTU를 첨가시킨다. 반응 혼합물은 15분간 0-5℃에서 교반시킨 후에, 실온으로 만든 다음 추가 70분간 교반시킨다. 용액을 0-5℃로 냉각시킨 후, 물(500㎖)을 넣어 펩티드를 침전시킨다. 고체는 진공 여과를 이용하여 수득한 후에, 물(100㎖)로 씻은 다음 건조시키면, 43g FmocAA27-36NH2(수득율 100%, HPLC에 의한 순조는 93A%)를 얻는다.
Note:
1. 기준 과정, TLC
88/12 디클로로메탄/메탄올
UV, 요오드 감지
Rf : FmocAA27-35OH, 0.49
Rf : FmocAA27-36NH2, 0.63
2. Phenomenex Jupiter, C18, 5μ, 300A
1.0㎖/min, 260nm
A H2O/0.1% TFA
B ACN
20분 이상 75-99%B : 5분간 99%B
보유 시간: 29.4분
8.9. 단편 H-AA(27-36)-NH 2 의 준비
구조
H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2 (SEQ ID NO:17)
C115H149N16O22
MW 2106.56
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA(27-36)-NH2 2328.8 1.0 9.3 21.7 -
피페리딘 85.15 5.0 46.6 4.0 4.6
메틸렌 클로라이드(DCM) - - - - 100
ANF - - - - 2X100
메틸-t-부틸 에테르(MTBE) - - - - 100+30
이론 수득량:19.6g 예상 수득량: 85-95%
과정
자석을 이용한 교반 막대와 질소 블랭킷이 들어있는 250㎖ 밑 둥근 플라스크에 상기 단락 8.8에서 합성한 Fmoc-단편, 염화 나트륨(~5용량), 피페리딘을 넣는다. 용액을 만든 후에, 1.5시간 동안 실온에서 교반시킨다.
2 ×100㎖ 물로 용액을 헹군다. 층간이 분리되고, 용기 층은 진공하에서 농축시켜, 원래 용량의 대략 절반이 되도록 한다. MTBE를 나누어 첨가하면서, 2 ×50㎖, 농축을 지속하여, 다량 침전될 시점까지 DCM를 제거시켜, 최종 포트 용량이 150㎖이 되도록 한다.
생성된 슬러리는 교반시켜, 약 1시간 동안 0-5℃상에서 얼음 용액기안에서 차갑게 만든다. 고체는 진공 여과를 이용하여, 분리한 후 2 ×15 ㎖ MTBE로 씻어낸다. 생성물을 대거 건조시켜, 17.6g(89.6%) H-AA(27-36)NH2(HPLC에 의한 순도 95%)를 얻는다.
note
1. HPLC를 이용하여 반응의 완결을 모니터한다;
컬럼: Phenomenox Jupiter C18; 300Å; 5μ
유속: 1㎖/min
감지: UV, 260nm
이동 상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 0.1% TFA/아세토니트릴
20분간 75% B 내지 99% B로 농도차를 준다.
보유 시간: 약 18분
2. Fmoc 부산물인 디벤조풀벤, 이의 피페리딘 부가 생성물 모두는 작업동안에 효과적으로 제거되지만, 앞으로 재료를 사용하지 전에 반드시 사용자 검사를 해야 한다. 재료가 사용자 검사에서 기준에 미달하는 경우에, 고체를 DCM(5 vol)에 용해시켜, 검사 과정을 반복하고, 상기에서 설명하는 과정을 진행한다.
8.10. FmocAA17-26OH에 HAA27-36NH 2 를 용액상 결합시켜, 단편 FmocAA17-36NH 2 를 준비
구조
Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:12)
C242H313N29O45
MW 4364.38
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA17-26OH 2275.82 1 9.5 21.6
HAA27-36NH2 2106.56 1 9.5 20
HOAT 136.1 1.2 11.4 1.55
HBTU 379.25 1.2 11.4 4.33
EtPr2N (d=0.755) 129.25 2 19.0 2.46 3.25
DMF 400
물 600
2-(프로판올) 1100
이론 수득량: 41.5g 예상 수득량: 80-85%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 2ℓ밑 둥근 플라스크에 FmocAA17-26OH(상기 단락 7.5에서 합성), HAA27-36NH2(상기 단락 8.9에서 합성), HOAT, DMF(400㎖)를 넣는다. EtPr2N을 첨가시키고, 교반된 용액은 질소 대기하에서 0-5℃로 냉각시킨 후에, HBTU를 첨가한다. 반응 혼합물은 15분간 0-5℃에서 교반시킨 후 실온으로 만든 후, 추가 2.5시간(note 1)동안 교반시킨다. 물(500㎖)을 반응 혼합물에 넣어서, 펩티드를 침전시킨다(note 2). 생성된 슬러리를 45분간 교반시키고, 고체 를 진공 여과를 통하여 수득하고, 물(100㎖)로 씻은 후에 건조시킨다. 자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 2ℓ밑 둥근 플라스크에 고체를 다시 넣고, 60℃ 2-프로판올(1.1ℓ)을 첨가한다. 슬러리는 하룻밤동안 실온으로 냉각시킨 후에 질소 대기하에서 교반시킨다. 진공 여과를 이용하여, 고체를 수득하고, 건조시키면 37.5g FmocAA17-36NH2(수득율 90%, HPLC에 의한 순도는 95.5A%)를 얻는다.
Note;
1. 기준 과정, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.75 ㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B: 25분간 100%B
보유 시간: FmocAA17-26OH: 8.2분
보유 시간: HAA26-36NH2: 8.4분
보유 시간: FmocAA17-36NH2: 13.3분
2. 물을 첨가할 때, 반응 혼합물의 온도를 38℃로 데워놓는다.
8.11. 단편 H-AA(17-36)-NH 2 의 준비
구조
H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH2 (SEQ ID NO:19)
C227H303N29O44 HCl
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA17-(17-36)-NH2 4364.36 1.0 5.2 22.5 -
5 N NaOH(ag) - - - - 55
테트라하이드로퓨란(THF) - - - - 170
1 N HCl - - - - 13
포화된 NaCl(aq) - - - - 2X55
헵탄 - - - - 3X25+50
이론 수득량: 21.6g 예상 수득량: 95-100%
과정
자석을 이용한 교반 막대와 질소 블랭킷이 들어있는 250㎖ 밑 둥근 플라스크에 상기 단락 8.10에서 합성된 Fmoc-단편, THF(약 7.5 vol), 5N NaOH(~2.5 vol)를 넣는다. 이중 상 용액이 만들어지고, 10-15분간 실온에서 교반시킨다(note 1).
층간이 분리되고, 유기상의 pH는 1N HCl를 이용하여, pH 2-3으로 조정한다. 이후, 용액을 포화 염용액 2 ×55 ㎖ (2.5 vol)로 씻는다(note 2). 층간이 분리되 고, 유기층은 진공하에서, 15-20℃로 농축시켜, 원래 용량의 약 1/2이 되도록 한다. 헵탄(3 ×25 ㎖)을 조금씩 나누어 넣고, 농축을 지속하여, 다량으로 침전되는 시점까지 THF를 제거하여, 최종 포트 용량이 100㎖이 되도록 한다(note 2).
생성된 슬러리는 약 2시간 동안 실온에서 교반시킨다. 고체는 진공 여과를 이용하여, 분리한 후 50㎖ 헵탄으로 씻어낸다. 생성물을 대기 건조시키면, 21.0g (97.5%) H-AA (17-36)NH2를 얻는다.
잔류 디벤조풀벤 부가생성물을 제거시키기 위해 재가공할 수 있다. 생성물은 3시간 동안 200㎖ 헵탄내에서 실온상태로 슬러리화시킨다. 재료를 여과시킨 후에, 약 50㎖ 헵탄으로 씻은 후에, 대기 건조시키면, 20.8g (96.6%) 생성물(HPLC에 의한 순도는 95%)을 얻는다.
note;
1. HPLC를 이용하여 반응의 완결을 모니터한다.
컬럼: Zorbax LP C8; 1 OOA; 2011 유속 1㎖/min
감지: UV, 260nm
이동 상: A: 0.1% 수용성 TFA
B: 0.05% TFA/1:1 ANC:IPA
20분간 80%B 내지 99% B로 농도차를 줌
보유 시간: 약 18분
2. 고체는 처음에는 교반성이 남아있는 납질성 검으로 침전되고, 추가 농축 시켜, 여과가능한 고체로 분쇄한다.
9. 실시예: 전장 T-20 펩티드 합성
하기 단락 9.1-9.5에서는 전장 T-20 펩티드를 만들기 위한 중간 생성물 펩티드 단편을 이용하는 것을 예시하고 있다.
이 단락에서 제시하는 실시예에서는 중간 생성물 펩티드 단편으로부터 전장 T-20 펩티드를 만들기 위한 고형상, 용액상 합성 기술을 성공적으로 결합시키는 것에 대해 설명한다.
9.1. AcAA1-16OH에 HAA17-36NH 2 를 용액상 결합시켜, 단편 AcAA1-36NH 2 를 준비
여기에서 설명하는 합성 경로는 도 1 및 3에서 도시한 4개 단편을 이용한 T-20을 만드는 것이다. AcAA1-16OH을 고형 상 기술을 통하여 합성할 경우에, 도 1에 제시한 방법을 따르고, AcAA1-16 OH을 용액 상 기술을 통하여 합성할 경우에, 도 3에 제시한 방법을 따른다. 여기에서 합성된 전장 T-20 펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 가지고, 이의 아미노 말단에는 아세틸 변형되어 있고("X"), 카르복시 말단에는 아미도 변형("Z")이 되어 있다.
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)- Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:1)
C414H543N51O74
MW 7411.95
물질: MW eq mmols grams mL
AcAA1-1OH 3276.4 1 0.24 0.79
HClHAA17-36NH2 4178.56 1 0.24 1.0
HOAT 136.1 1.1 0.26 0.036
HBTU 379.25 1.0 0.95 0.25
EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.8 0.67 0.087 0.115
DMF 20
물 25
포화된 NaCl 5
MTBE 10
헥산 10
이론 수득량: 1.77g 예상 수득량: 85-100%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 100㎖ 밑 둥근 플라스크에 AcAA1-16OH( 상기 단락 7.4에서 고형 상 기술을 통하여 합성된 또는 상기 단락 8.7에서 용액 상 기술을 통하여 합성), HOAT, DMF(20㎖)을 첨가시키고, 이어서 EtPr2N(0.074㎖)을 첨가한다. 용액을 질소 대기하에서 0-5℃로 냉각시킨 후에, HBTU를 첨가한다. 용액을 15분간 0-5℃에서 교반시킨 후에 HClHAA17-36NH2(단락 8.11에서 합성된)를 첨가하고, 이어서, 0.041㎖ EtPr2N을 첨가한다. 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 2시간동안 교반시킨다(note 1). 펩티드를 침전시키기 위해, 물(25㎖)과 포화 수용성 염화나트륨(5㎖)을 첨가한다. 진공 여과를 통하여 고체를 얻어, 물(10㎖)로 씻은 후에, 건조시켜, 정제안된 1.74g AcAA1-36NH2(note 2)를 얻는다. 2.5시간 동안 실온에서 50% MTBE/헥산을 이용하여, 고체를 분쇄한 후에, 진공 여과를 이용하여 수득한 후 건조시키면, 1.70g(수득율 96%, HPLC에 의한 순도는 92A%)을 얻는다.
note:
1. 기준 과정에서, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260 nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B : 15분간 100%B
보유 시간: AcAA1-16OH; 11.8분
보유 시간: HCl HAA17-36NH2; 12.7분
보유 시간: AcAA1-36NH2; 22.9분
2. 물을 떨어뜨리면, 매우 고운 침전물을 얻을 수 있다. 이중 여과가 필요하다.
9.2. FmocAA1-16OH에 HAA17-36NH 2 를 용액상 결합시켜, 단편 FmocAA1-36NH 2 (T-20)를 준비
이 단락에서 설명하는 실시예에서는 중간 생성물 펩티드 단편으로부터 T-20 펩티드를 만들기 위한 고체 및 액상 합성 기술을 성공적으로 결합시키는 것을 설명하고 있다. 특히, 여기에서 설명하는 합성 경로는 도 4에서 볼 수 있는 3개 단편을 이용하여, FmocAA1-36NH2를 합성하는 방법이다.
구조
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:1)
C427H551N51O75
MW 7593.01
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA1-16OH 3453.89 1 0.12 0.41
HClHAA17-36NH2 4174.88 1 0.12 0.50
HOAT 136.1 1.25 0.15 0.020
HBTU 379.25 1.25 0.15 0.057
EtPr2N (d=0.755) 129.25 2.5 0.30 0.039 0.051
DMF 10
물 18
2-프로판올 14
이론 수득량: 0.91g 예상 수득량: 85-100%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 25㎖ 밑 둥근 플라스크에 FmocAA1-16OH(상기 단락 7.3에서 합성), HCl HAA17-36NH2(상기 단락 8.11에서 합성), HOAT, DMF(10㎖)을 넣는 다음, EtPr2N을 첨가한다. 질소 대기하에서 용액을 0-5℃로 냉각시키고, HBTU를 첨가시킨다. 반응 혼합물은 0-5℃에서 15분간 교반시킨 후에, 실온으로 만들고, 1.5시간 동안 교반시킨다(note 1). 물을 첨가시켜, 펩티드를 침전시키고, 진공 여과를 통하여 고체를 수득한 후에, 건조시킨다. 실온에서 15시간동안 2-프로판올(14㎖)로 고체를 분쇄하고, 물(3㎖)을 첨가하여, 용액으로부터 원하 는 생성물을 유도한다. 진공 여과를 통하여 고체를 수득한 후, 건조시키면, 0.80g FmocAA1-36NH2(수득율 88%, HPLC에 따른 순도 85A%)를 얻는다.
note:
1. 기준 과정에서, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상, 80-100%B: 15분간 100%B
보유 시간: FmocAA1-16OH; 11.4분
보유 시간: HCl HAA17-36NH2; 12분
보유 시간: FmocAA1-36NH2; 20.4분
TLC, 9/1 디클로로메탄/에탄올
UV, 요오드 감지
Rft : FmocAA1-36NH2, 0.71
9.3. 단편 HAA1-36NH 2 (T-20)의 제조
이 단락에서 설명하는 실시예에서는 중간 생성물 펩티드 단편으로부터 T-20 펩티드를 만들기 위한 고체 및 액상 합성 기술을 성공적으로 결합시키는 것을 설명하고 있다. 특히, 여기에서 설명하는 합성 경로는 도 4에서 볼 수 있는 3개 단편을 이용하여, H-AA1-36-NH2를 합성하는 방법이다.
구조
H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:1)
C412H541N51O73
MW 7370.94
물질: MW eq mmols grams mL
FmocAA1-36NH2 7593.01 1 0.105 0.80
피페리딘 0.5
DMF 9.5
물 20
포화된 수용성 NaCl 5
MTBE 5
헥산 5

이론 수득량: 77g 예상 수득량: 85-95%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 25㎖ 밑 둥근 플라스크에 FmocAA1-36NH2(상기 단락 9.2에서 합성), DMF(9.5㎖), 피페리딘(0.5㎖)을 넣는다. 용액은 질소대기하에서 2시간동안 실온에서 교반시킨다. 물(20㎖), 포화 염화나트륨 용액(5㎖)을 첨가시켜, 펩티드를 침전시킨다. 진공 여과를 통하여 고체를 수득하고, 건조시키면, 풀벤 및 피페리딘-풀벤 부가 생성물이 포함된 0.77g HAA1-36NH2를 얻을 수 있다. 실온에서 15시간 동안 50% MTBE/헥산으로 고체를 분쇄시키면, 풀벤 및 피페리딘-풀벤 부가 생성물을 제거할 수 있다. 진공 여과를 통하여 고체를 수득하고, 건조시키면, 0.73g HAA1-36NH2(수득율 90A%, HPLC에 의한 순도 90A%)를 얻는다.
note:
1. 기준 과정에서, HPLC
Phenomenox Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분 이상 80-100%B; 15분간 100%B
보유 시간: FmocAA1-36OH; 20.4분
보유 시간: HCl HAA1-36NH2; 19.9분
TLC, 9/1 디클로로메탄/에탄올
UV, 요오드 감지
Rt : FmocAA1-36NH2, 0.71
2. 생성물과 시작 물질이 TLC 또는 역상 HPLC에서는 잘 분리되지 않는다. 생성물이 형성되고, 풀벤 및 피페리딘-풀벤 부가 생성물도 관찰된다.
9.4. HAA1-36NH 2 N-말단 아세틸화 반응에 의해 단편 AcAA1-36NH 2 (T-20)의 제조
이 단락에서 설명하는 실시예에서는 중간 생성물 펩티드 단편으로부터 T-20 펩티드를 만들기 위한 고체 및 액상 합성 기술을 성공적으로 결합시키는 것을 설명하고 있다. 특히, 여기에서 설명하는 합성 경로는 도 4에서 볼 수 있는 3개 단편을 이용하여, Ac-AA1-36-NH2를 합성하는 방법이다.
구조
Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)- Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:1)
C414H543N51O74
MW 7411.95
물질: MW eq mmols grams mL
HAA1-36NH2 7370.94 1 0.096 0.71
아세트무수물 (d=1.08) 102.09 3 0.29 0.029 0.027
피리딘 (d=0.978) 79.1 6 0.58 0.046 0.046
DMF 10
물 17.5
포화된 수용성 NaCl 7.5
이론 수득량: 0.71g 예상 수득량: 85-100%
과정
자석을 이용한 교반 막대가 들어있는 25㎖ 밑 둥근 플라스크에 HAA1-36NH2(상기 단락 9.3에서 합성), DMF(10㎖), 피리딘(0.046㎖), 무수 아세트산(0.027㎖)을 넣는다. 용액을 4시간 동안 질소 대기하에 실온에서 교반시킨다(note 2). 물(7.5㎖) 및 포화 염화나트륨(7.5㎖)을 첨가시켜, 보호된 펩티드를 침전시킨다. 진공 여과를 통하여 고체를 수득하고, 물(10㎖)로 씻은 후에, 건조시키면, 0.65g AcAA1- 36NH2(수득율 91%, HPLC에 의한 순도 90A%)를 얻는다(note 3).
note:
1. 이 반응에서 용매로 디클로로메탄을 이용할 수도 있다.
2. 기준 공정에서, HPLC
Phenomenex Jupiter, C5, 5μ, 300A
0.8㎖/min, 260nm
A H2O/0.05% TFA
B 50% IPA/MeOH/0.05% TFA
10분이상 80-100%B : 15분간 100%B
보유 시간: HAA1-36OH; 23.3분
보유 시간: AcAA1-36NH2; 22.7분
3. 생성물과 시작 물질이 TLC 또는 역상 HPLC상에서는 잘 분리되지 않는다.
9.5. AcAA1-36NH 2 측쇄의 보호기를 제거함으로써 T-20 준비
이 단락에서 설명하는 실시예에서는 중간 생성물 펩티드 단편으로부터 T-20 펩티드를 만들기 위한 고체 및 액상 합성 기술을 성공적으로 결합시키는 것을 설명하고 있다. 특히, 여기에서 설명하는 합성 경로는 도 4에서 볼 수 있는 3개 단편을 이용하여, T-20을 합성하는 방법이다.
구조
Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys- Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2 (SEQ ID NO:1)
C414H543H51O74
MW 4492.1
물질: MW eq mmols grams mL
AcAA1-36NH2 7411.95 1 0.035 0.26
트리플루오르아세트산 2.25
물 15.1
디티오트레이톨 0.12
MTBE 170
아세토니트릴 15
이론 수득량: 157㎎ 예상 수득량: 25-50%
과정
90:5:5(v/v/wt%) 트리플로오르아세트산/물/디티오트레톨 용액에서 질소를 이용하여 기체를 제거하고, 0-5℃로 냉각시킨다. 냉각된 용액에 AcAA1-36NH2(상기 9.4에서 합성된)를 첨가한다. 고체가 완전하게 용해될 때까지(약 5분), 슬러리를 0-5℃에서 교반시키고, 실온으로 만든 다음, 추가 2.5시간 동안 교반시킨다. 용액에 0-5℃ MTBE(70㎖)를 첨가하여, 펩티드를 침전시킨다. 2200rpm에서 5분간 슬러 리를 원심분리시킨 후에, 고체에서 MTBE를 따라낸다. 고체를 다시 MTBE(50㎖)에서 재현탁시키고, rpm에서 5분간 원심분리시킨 후에, MTBE를 따라낸다. 이 과정을 1회 이상 반복하고, 고체를 1:1 물/아세토니트릴(30㎖)(1 vol% 아세트산을 포함)에 용해시키고, 24시간 동안 실온에서 저장한다(note 1). 그 다음 용액을 냉동시키고, 리포필라이져(lypholyzer)를 이용하여 냉동 건조시켜, 정제안된 T-20 155㎎을 얻는다. 미리 준비된 HPLC를 이용하여 정제하면, 55㎎ 전장 T-20 펩티드(HPLC에 의한 순도가 95A%)를 얻을 수 있다.
note:
1. Trp(Boc)의 tBu 측쇄를 빨리 제거하면, TrpCOOH만 남는다. TrpCOOH의 카르복실기를 제거하기 위해서는 수용성 아세트산에서 실온, 최소 24시간이 소요된다.
2. 예비 HPLC
2″YMC, 120A, 10μ, C18
220nm, 50㎖/min
A H2O/0-1% TFA
B ACN/0.1 % TFA
39-49% B/40분
10. 실시예: T-20 펩티드 정제
여기에서 설명하는 실시예는 펩티드의 순도를 상당히 증가시키는 조건하에서 T-20 및 T-20-유사 펩티드를 정제할 수 있는 방법을 설명한다.
재료
이용된 컬럼: Amberchrom CG-300S(Tosohaus; Montgomeryville, PA) 35㎛ 크기 입자로 채워진 20 ×30㎝ 컬럼.
완충액 준비
완충액 A=100mM 아세테이트 암모늄염(NH4OH를 이용하여, pH를 8.5로 조정).
완충액 B=아세토니트릴
1. 6배 컬럼 용량의 20% B 칼럼.
2. 펩티드 g당 50-100㎖ 85%A/15%B에 T-20을 용해시킨다. pH는 2M K2CO3를 이용하여, 8~10으로 조절한다. T-20 샘플에서 아세토니트릴 농도는 15-20%를 넘지 않는다.
3. T-20 용액은 컬럼의 압력을 모니터하면서, 분당 500㎖로 로딩한다.
4. T-20 용액을 로딩시킨 후에, 컬럼 용량의 3배(10ℓ) 80%A/15%B 용액을 워쉬아웃 라인에 로딩시킨다.
5. 컬럼 용출액은 303mn에서 모니터하고, 전체 로딩 과정동안에 용출액을 모은다. 실시하는 동안에 파장 또는 감쇠를 조절하여, 피크 스케일을 유지시킨다. 흡수도는 파장 및 셀 경로 길이에 대한 함수이다.
6. 전체 과정 동안에 압력을 모니터하면서, 다음과 같이 그래디언트 작업을 시작한다(시간당 B는 1.6% 변화);
시간(분) %B 유속(㎖/min)
0 15 330
788 36 330
7. 용출 피크가 시작될 때 10분 분취물을 수득하였다(3.3ℓ). 35%B에서 전체 T-20이 용출되어야 한다. 평균, 35-40 분취물이 수득된다. 분취물은 푸울에 대한 분취물이 결정될 때까지, 0-5℃에 저장한다.
8. 감지 흡수도가 0.1 AU미만 또는 주요 용출 피크후 주요 변화 포인트에 이를 때까지, 분취물을 수득한다.
9. 각 분취물의 순도는 분석용 역상 HPLC로 모니터한다.
결과
T-20 펩티드는 pH 7이상의 pH 범위에서 용해성이 훨씬 크다. 펩티드를 정제하는데 통상적으로 이용되는 컬럼 지지체는 실리카계이고, 이와 같은 실리카계 지지체가 높은 pH 범위에서는 용해되는 경향이 있기 때문에 이 pH 범위에서만 이용한다.
여기에서 설명하는 방법은 광범위한 pH 범위(pH 1-14)에서 안정한 폴리스티렌계 수지 지지체를 이용한다. 이 방법을 이용할 경우에 T-20의 산출량이 10g 내지 250-450g으로 증가되고, 이로 인해 컬럼의 능력이 크게 증가된다(8″직경 ×30 ㎝ 컬럼).
11. 실시예: T-20 펩티드 수지의 대규모 합성 및 정제
FmocTrp(Boc)OH는 시작 수지 g당 1.2mmol 또는 이 이상의 수준으로, 활성이 매우 큰 2-CTC 수지에 로딩시킬 수 있다. 시작 수지 g당 1.1mmol FmocTrp(Boc)OH이상의 로딩 수준(로딩된 수지상에서 g당 0.72 mmol)에서는 단편의 마지막 3개 아미노산에 대한 음성 닌하이드린 검사를 하기가 곤란하다. 비슷하게, FmocLeuO-수지가 0.85mmol/g이상으로 로딩될 경우에, FmocAA17-26O-수지를 만드는 것이 곤란하고, FmocGlnOH-수지에 0.75 mmol/g이상이 로딩되는 경우에 AcAA1-16O-수지를 만드는 것이 곤란하다.
구입한 수지를 수령할 때, 약 1g 2-CTC 수지를 이용하여 로딩할 각 아미노산으로 사용 검사를 실시한다. 사용 검사의 목적은 원하는 로딩 범위를 알기 위해 로딩 동안에 이용할 수 있는 아미노산의 양을 결정하는 것이다. 0.8, 1.0, 1.5 당량의 FmocGlnOH; 1.0 1.2, 1.5 당량의 FmocTrp(Boc)OH; 각각(수지의 보고된 활성에 대해)에 대해 0.5eq 과량의 DIEA를 함유한 0.8, 1.0, 1.5당량 FmocLeuOH을 이용한다. 1 mole FmocLeuOH가 1㎏ 2-CTC 수지에 로딩되지 않을 경우에, 2-CTC를 구입해서는 안된다. 다음에는 FmocLeuOH, FmocGlnOH, FmocTrp(Boc)OH에 대한 수지 로딩 목표를 설명하고 있다.
1.0 내지 1.1 moles의 FmocLeuOH를 2-CTC 수지(㎏)에 로딩시킨다. HCl 손실량을 고려하여, FmocLeuOH 로딩 후에, 수지의 건중량이 시작 수지 중량의 1.32 내지 1.35배가 되어야 하고, 측정된 로딩량은 0.75 내지 0.81mmole/g이 되어야 한다.
0.8 내지 1.0 moles의 FmocGlnOH를 2-CTC 수지(㎏)에 로딩시킨다. HCl 손실량을 고려하여, FmocGlnOH 로딩 후에, 수지의 건중량이 시작 수지 중량의 1.27 내지 1.33 배가 되어야 하고, 측정된 로딩량은 0.63 내지 0.75mmole/g가 되어야 한 다.
0.9 내지 1.1 moles의 FmocTrp(Boc)OH를 2-CTC 수지(㎏)에 로딩시킨다. HCl 손실량을 고려하여, FmoTrp(Boc)OH 로딩 후에, 수지의 건중량이 시작 수지 중량의 1.44 내지 1.54 배가 되어야 하고, 측정된 로딩량은 0.63 내지 0.72mmole/g가 되어야 한다.
중량 증가를 정확하게 분석하기 위해, 시작 수지의 건중량에서의 손실량(LOD)을 측정해야 한다. 1%를 초과해서는 안된다. 건조과정에서(로딩 후)잔류 용매(또는 DIEA/HCl)가 완전하게 수지로부터 제거되지 않을 경우, 분리되는 중량이 더 많고, 측정되는 로딩량은 더 작아지게 된다. 그러나, 로딩된 총 몰은 상기 범위에 속해야 한다. 언급한 아미노산중 어느 한 가지 경우에 대해 하이-엔드(high-end) 로딩 수준이 10%이상 초과되는 경우(시작 수지㎏당 로딩된 총 moles), 적은 아미노산을 이용하여, 사용 검사를 실시한다. FmocGlnOH의 경우에 특히 중요하다.
11.1. 대규모 Fmoc-AA(Boc)-2-클로로트리틸 수지 제조
다음 단락의 목적은 고형 상 펩티드 합성(SPPS)을 위해 다량의 펩티드를 준비하는데 적합한 대규모 수지 로딩을 실행하는 것이다. 수지에는 다음을 각각 채운다: FmocTrp(Boc)OH; FmocGln(Boc)OH; FmocLeu(Boc)OH. 각 시작 잔기는 대략 4㎏ 2-CTC 수지에 로딩시킨다.
적화된 AA 2-CTC 적화된 중량 치환 로딩된 전체 몰
(Kg) (Kg) (mmol/g)
FmocTrp(Boc)OH 3.7 4.493 0.56 2.52
(0.56) (2.52)
FmocLeu(Boc)OH 2.2 2.436 1.07 2.6
(0.647) (1.58)
FmocGln(Boc)OH 3.65 3.856 0.55 2.12
(0.52) (2.0)
1. 첫 숫자는 Fmoc-AA 기준에 대한 중량기초의 HPLC 분석으로 계산하였다. 괄호안의 수치는 시작 2-CTC 수지에서 12% LOD를 고려한 중량증가로 계산하였다.
시작 2-CTC 수지는 Colorado BioTech에서 구입하는데, 보고에 따르면, g당 1.4 meq의 로딩량을 가진다. 3.7㎏ 2-CTC을 시작물질로 하여, 표준 로딩 과정, 2시간 동안 실온에서 1.5eq FmocTrp(Boc)OH, 1.7eq IEA/DCM(5vol)을 이용하였다. 이로써 4.493㎏ FmocTrp(Boc)O-수지를 제공하는데, 이 수지는 0.56mmol/g(총 2.52mole)에서 계산된 로딩량을 가진다(수지로부터 절단된 후에 FmocTrp(Boc)OH의 중량계 HPLC 검사를 이용). 수지의 중량 증가로 인하여, 로딩은 준비된 총 1.62mole에 대해 0.36mmol/g로 계산된다. 그러나, 시작 2-CTC 수지상의 12% LOD를 고려하면, 증가된 중량으로 계산한 로딩은 총 2.53mole에 대해 0.56 mmole/g으로 동일하기 때문에, 목표 로딩인 수지 4㎏당 4moles FomcTrp(Boc)에 상당히 모자란다.
표준 로딩 과정을 이용하여 2회 실시한 3.9㎏ 2-CTC로부터 총 4.59㎏ FmocLeuO-수지를 만들 수 있다.
그러나, 실제로 로딩된 양은 기대한 것보다 적다. 수지로부터 절단한 후에 중량계 HPLC를 이용한 FmocLeuOH 분석에 따르면, 제 1 배취는 1.07mmol/g의 계산된 로딩량을 보유한다. 이는 시작 2-CTC 수지상의 12% LOD를 고려하면, 계산된 로딩이 (500 g) 0.647mmole/g이기 때문에, 거의 불가능하다. 실제 로딩은 로딩된 총 1.577moles 대하여 0.647mmole/g에 근접한다.
1.7㎏ 2-CTC에서 만든 FmocLeu-O-수지(2.154 ㎏) 제 2 배취는 0.68 mmole/g의 계산된 로딩을 보유하고, 로딩으로 인한 중량 증가는 0.66mmole/g로 나타났다.
7 용량의 5/2 DMF/DCM에 녹인 0.8eq FmocGlnOH 및 1eq DIEA을 이용하여, 3.65㎏ 2-CTC 수지로 시작하는 단일 배취에서 총 3.856㎏ FmocGlnO-수지를 만들었다. 중량계 HPLC 검사를 이용하여 계산된 치환은 총 2.12moles의 FmocGlnO-수지에 대하여 0.55 mmol/g이다. 시작 2-CTC 수지의 12% LOD를 고려하면, 계산된 로딩은 총 2.0moles FmocGlnO-수지에 대하여 0.52 mmol/g이다.
일반적으로, 중량 증가에 의한 로딩양은 로딩된 AA 또는 제거된 풀벤에 대한 중량계 HLPC 분석에 기초하여 계산된 중량보다 크거나 또는 동일하다. 시작 2-CTC는 1% LOD보다는 적어야 하고, 분리된 FmocAAO수지는 소량의 NMP, 염 또는 잔류 FmocAAOH를 함유해야 한다.
11.1.1. Fmoc-AA(Boc)-2-클로로트리틸 수지를 대규모로 준비하는 적절한 방법.
FmocTrp(Boc)OH 및 FmocLeuOH
공기 감응성 2-클로로트리틸클로라이드 수지(1eq, 3.7㎏, 5.18mole)를 SPPS 체임버에 넣고, 5 용량의 DCM로 씻는다. 용매를 빼내고, FmocTrp(Boc)OH 또는 FmocLeu(Boc)OH(1.5eq), DIEA(1.7eq)/DCM(5 vol) 용액을 첨가한다(note 1). 슬러리는 2시간 동안 교반시킨다. 용매를 제거하고, 수지상에 있는 잔류 활성 부위는 30분간 9:1 MeOH:DIEA(5 vol)을 이용하여 말단 캡핑한다. 용매를 빼내고, 수지는 5 용량의 DCM로 6회 세척한다. 수지를 일정한 중량으로 건조시킨 후, 샘플링하여, 로딩에 대해 분석한다(note 2). FmocLeuOH 로딩의 경우에도 동일한 과정을 이용한다.
FocGluOH
질소대기하에서 공기-감응성 2-CTC(3.65㎏, 1.4 mmole/g) 수지를 40ℓSPPS 체임버에 넣고, DCM(5 vol)으로 씻어낸다. 20ℓ반응기에는 FmocGlnOH(1.506㎏, 0.8eq), DMF(5 vol), DIEA(1.0eq)를 넣는다. SPPS 체임버를 배수시키고, DMF 용액을 첨가한다. 반응기를 DCM(2 vol)로 헹구고, 헹굼액을 SPPS 체임버에 첨가한다. 수지는 2시간 동안 질소대기하에서 교반시키고, 배수시킨다. 수지상에 남아있는 활성 부위는 30분간 9:1 DIEA(5 vol)을 이용하여 캡을 씌운다. 수지를 배수시키고, DCM (6×5 vol)으로 씻은 후에, 건조시켜 일정한 중량(3.856㎏)이 되도록 한다. 수지를 샘플링하고, 로딩 수준에 대해 검사한다(note 2).
Note:
1. 2-클로로트리틸클로라이드 수지는 습기에 매우 민감하다. 물로 덮으면, HCl이 발생된다. 용매가 건조되는 동안에, DCE 및 DCM간에 거의 차이가 없다.
2. 수지로부터 Fmoc 아미노산을 잘라내고, 정량적인 wt/wt HPLC 분석을 이용한 기준에 대해 검사하여, 수지 로딩을 결정한다.
Phenomenox Jupiter C18, 300A, Sm
1㎖/min, 260nm
A: 0.1% 수용성 TFA
B: 65%B 아세토니트릴 등용매의 0.1% TFA
보유 시간: 대략 8분
수지를 건조시키기 전에 수지로부터 NMP를 완전하게 제거하기 위해 사용된 세척 횟수가 충분하지 못할 경우에, 수지의 중량 증가에 의한 로딩 측정은 정확하지 않을 수 있다. 계산은 다음과 같이 실시한다:
(Fmoc-AA-OH-레신 중량 - 시작 2-CTC의 중량)/Fmoc-AA-OH-레신 중량(로딩된 AA MW - HCl MW)
DCM에서 장시간 동안(수일) 본 발명의 펩티드 단편을 보관하는 경우에, 수지로부터 실제 잘려나온다는 것을 관찰하였다. 예를 들면, FmocAA17-26OH를 만드는 과정동안에, 부분적으로 만들어진 단편을 DCM에서 주말동안 보관한다. 합성을 완료하고, 수지로부터 제거한 후에, FmocAA17-26OH는 수득율이 8%정도 되었다. 주말동안 보관하는 동안에 DCM에 있는 잔류 HCl에 의해 수지로부터 부분적으로 만들어진 단편이 서서히 잘려나온다고 추측할 수 있다.
FmocAA17-26O-수지, AcAA1-16O-수지, FmocAA27-35O-수지 샘플을 DCM 및 IPA상에 1주일간 실온에 방치한다. 각 상층액을 HPLC로 분석하였다. 비록 정량적인 결과를 얻지는 않았지만, DCM에서는 모든 단편이 수지로부터 상당한 수준으로 잘려나온 것에 비해, IPA에서는 관찰되지 않았다. 부분적으로 만들어진 단편을 수일간(주말동안) 보관해야 할 경우에, 질소 대기하에서 NMP로 포화시켜 둔다.
FmocLeuO-수지, FmocGlnO-수지, FmocTrp(Boc)O-수지, FmocAA17-26O-수지, AcAA1-16O-수지, FrmoAA27-35O-수지를 마지막으로 세척할 때, DCM을 IPA로 대체시킨다. IPA로 포화된 FmocLeuO-수지, FmocGlnO-수지, FmocTrp(Boc)O-수지를 40℃에서 건조시킨다. FmocAA17-26O-수지, AcAA1-16O-수지, FrmoAA27-35O-수지는 4℃에서 건조된 로딩된 수지로부터 만든다. 합성이 완료된 때에, 수지에 결합된 단편은 DOM과 이후 IPA를 이용하여 깨끗하게 씻어낸다. IPA 포화된 수지에 결합된 단편을 나누고, 실온 및 40℃에서 건조시킨다. 수지로부터 단편을 잘라내고, HPLC를 이용하여 분석한다. 단편 순도에서는 차이가 없었다. IPA 포화된, 수지에 결합된 단편을 40℃에서 건조시킬 경우에도, 분리된 단편의 양 또는 질은 별다른 영향을 받지 않는다.
NMP/DCM에 반대되는 DMF에서 단편의 SPPS를 검사하였다(1g 수지를 이중 용매 시스템에서 5㎖로 팽창시킨다). 용매로 DMF를 이용하고, 결합 시약으로 TBTU vs HBTU를 이용하여, 단편 FmocAA27-35OH를 합성하였다. FmocAA27-35OH는 수득율 77%, 순도 89.5A%로 분리되었다.
단편 FmocAA17-36NH2및 AcAA1-36NH2에 대한 작업 프로토콜에서 결합안된 단편을 제거한다. 고형상 합성동안 결손 부위에서 이들 단편을 아세틸화(말단 캡핑)를 하면, 용액상 결합에서 결손 단편은 결합하지 않게 된다. FmocAA17-36NH2 및 AcAA1-36NH2 합성 동안에 결합안된 단편은 IPA 및 ACN 작업을 통하여 제거해야 한다.
11.2. 단편 Ac-AA(1-16)-OH(단편 3c)의 대량 제조
단편 AcAA1-16OH의 SPPS에 의해 대규모 제조과정을 2회 실시하면, 3.53㎏ FmocGlnOH-수지로부터 총 7.941㎏ 수지에 결합된 단편을 얻는다. 2회 실시동안에 시작 FmocGln-수지에 대한 로딩 값은 0.55mmol/g(중량계 HPLC 검사)인데, 이는 출발 2-CTC상에서 12% LOD를 고려하여 중량 증가에 의해 얻은 0.52mmol/g보다는 다소 많은 것이다. 원하는 것보다 낮은 수지 로딩을 보유하는 경우에는 SPPS동안에 각 아미노산을 6% 초과 이용한다.
SPPS는 수지상의 첫 2.5eq FmocGln(trt)OH 와 단편상의 연소된 1.7eq 아미노산 각각(0.55mmol/g 로딩에 대해)을 이용하였다. 결합 반응은 8 용량의 3:1 NMP:DCM에서 실시하고, 32개 결합 반응(아세틸 반응 포함)중 2개는 2시간내에 완료된다. 5 용량의 NMP로 모든 세척을 실시한다.
수지에 결합된 단편은 세척할 때마다 5분간 0~5℃에서, 3.4 용량(건조된 AcAA1-16O-수지 중량에 대해)의 1% TFA/DCM를 이용하여, 5~6회 실시한다. 각 세척액은 1.36 용량의 0.33M aq NaHCO3상에 수득하여, TFA를 중화시킨다. 삼중 상 세척 액을 복합시키고, 물(2vol)을 첨가한다. 증류를 이용하여, DCM를 제거하녕, 수용성 중탄산나트륨에 여과가능한 침전물이 남게된다. 증류과정 동안에, 다중 상 슬러리는 점성이 있어, 크림형으로 되고, 최종 DCM이 제거되면 여과가능한 슬러리가 된다. 슬러리는 0-5℃로 냉각시키고, pH는 0.1N HCl을 이용하여 3.0으로 조정한다. 슬러리를 0~5℃에서 1-2시간 동안 교반시키고, 여과시켜, 수거한 후에, 세척 및 건조시킨다. 나머지 과정에서, 고체를 수득하고, 반응기로 다시 넣고, 1~2시간 동안 물로 분쇄시키고, 수득한 후 건조시킨다.
수지로부터 AcAA1-16OH를 절단은 4회에 걸쳐 1% TFA/DCM를 이용하여 실시한다. 3.53㎏ FmocGlnO-수지로부터 총 4.814㎏ AcAA1-16OH가 얻어진다(순도는 93-96A%). 출발 2-CTC(이론상 5.83㎏)의 12% LOD를 고려한 중량 증가로 계산된 0.52 mmol/g 로딩에 기초한 전반적인 수득율은 83%이다.
AcAA1-16OH 나트륨염은 DMF 및 NMP에 불용성이고 따라서, 카르복시 말단에 프로톤을 제공하기 위해서는 pH를 반드시 조절해야 한다. 물로 세척하면, 생성물에서 트리플로오르아세테이트 나트륨염을 제거할 수 있다. 매우 소량(wt/wt)의 트리플로오르아세테이트 나트륨염도 HAA17-36NH2를 이용한 용액-상 결합을 방해할 수 있다.
이 단편은 실온에서 건조시켜야 한다. 젖은 AcAA1-16OH를 40℃에서 건조시키는 경우의 안정성 연구에서, 3일동안 약 4% 분해되는 것으로 밝혀졌. 흥미로운 것은, 24시간 동안 80℃에서 건조된 고체가 안정하다는 것이다.
11.2.1. 단편 Ac-AA(1-16)-OH(단편 3c)를 대량 준비하는데 적합한 방법
40ℓ펩티드 체임버에 수지-결합된 FmocGlnOH(1.53㎏, 0.55mmol/g, 0.84mole)를 첨가한다. 수지는 15분간 교반시키면서 질소하에서 DCM(5 vol)로 상태조절하고, 이후 건조시킨다. 20% 피페리딘/NMP 용액(5 vol)을 첨가한 후에, 현탁액은 질소하에서 20분간 교반시킨다. 용액을 빼내고, 과정을 반복한다. 수지는 5 용량의 NMP을 이용하여 5회 세척하여, 클로라닐 검사(note 1)에서 측정된 것과 같은 디벤조풀벤 및 피페리딘을 제거한다.
수지를 세척시켜, 피페리딘을 제거하는 동안에, 서열상의 다음 아미노산(1.5eq), HOBT(1.5eq), DIEA(1.5eq)은 NMP(6-7 vol)에서 복합시켜, 0℃로 냉각시킨다. 냉각 용액에 HBTU(1.5eq)을 첨가하고, 용액을 10-15분간 교반시켜, HBTU를 용해시킨다. 활성화된 아미노산을 포함하는 냉각된 용액을 수지에 첨가하고, 이어서, DCM 수지(2.5 vol)에 첨가한다(note 2). 질소 배기하에 2시간 동안 현탁액을 교반시키고, 그 다음 정성 닌하이드린 검사를 위해 수지 샘플을 떼낸다(note 3). 닌하이드린 검사가 음성인 경우에, 용기를 배수시키고, 5 용량의 NMP로 3회 세척하는데(note 4), 서열상의 다음 아미노산에도 이 과정을 반복시킨다. 검사 결과가 양성인 경우에, 추가 한 시간 동안 현탁액을 교반시키고, 다시 검사한다. 닌하이드린이 음성인 경우에, 그 다음 과정으로 진행한다. 닌하이드린이 양성인 경우에는 1eq 아미노산 및 시약으로 다시 결합시킨다. 1시간후에도 닌하이드린이 양성으로 나오는 경우에는 1시간 동안 무수 아세트산 Seq, 피리딘 Seq로 말단 캡핑한다.
단편 합성이 완료된 경우에, 상기에서 설명한 것과 같이 마지막 아미노산으로부터 Fmoc를 제거하고, 수지는 20-30분간 또는 닌하이드린 검사 결과가 음성이 나올 때까지 무수 아세트산, 피리딘(각 5eq)/3:1 NMP:DCM 용액(10 vol)에서 교반시킨다. 수지를 배수시키고, 5 용량의 NMP로 2회, 5 용량의 DCM로 5회 세척한 후에, 건조시키면, 3.49㎏의 AcAA1-16O-수지를 얻을 수 있다.
40ℓSPPS 체임버에 건조된 수지-결합된 AcAA1-16(3.49 ㎏)을 넣는다. 수지-결합된 펩티드는 6 X 3.4 용량의 1% TFA/DCM를 이용하여 수지로부터 제거한다. 각 절단세척액을 1.35 용량의 0.33M 수용성 중탄산나트륨상에 수득한다. 이중 상 분취물을 복합시키고, 2 용량의 물로 희석시킨다. 이중 상 혼합물은 감압하에서(15Hg, 20℃) 농축시켜, DCM를 제거한다. 교반을 유지시킬 필요가 있는 증류동안에 물(2 용량)을 첨가한다. DCM가 제거될 때(수 시간), 현탁액은 0℃로 냉각시키고, pH는 1N 수용성 HCl을 이용하여 3으로 조정한다. 축축한 고체는 반응 용기에 다시 넣고 물로 분쇄시켜(7 용량), 잔류한 TFA 및 트리플로오르아세테이트를 제거한다. 진공 여과를 이용하여 고체를 수득하고, 일정한 중량(1.12 ㎏, 95A%)으로 건조시킨다. 0.52mmol/g 로딩을 기초로 한 경우에 AcAA1-16OH 수득율은 86%이다(note 7).
Note:
1. 톨루엔에 녹인 클로라닐의 포화된 용액 한 방울과 유출액 한 방울을 1㎖의 아세톤에 첨가한다. 남색 또는 보라색은 피페리딘 존재에 대한 양성 표시다. 베드높이가 올라감에 따라, 피페리딘을 씻어내기 위해 더 많은 부피의 NMP가 필요 하게 된다.
2. DCM은 수지의 적절한 팽창을 위해 첨가한다.
3. 정성 닌하이드린 검사. 수지 샘플 2-20mg을 뽑아내고, 메탄올로 깨끗하게 씻었다. 에탄올에 녹인 76% 페놀 3방울, 피리딘에 녹인 0.2 mM KCN 용액 4방울, 에탄올에 녹인 닌하이드린 0.28 M 용액 3방울을 샘플에 첨가한다. 용액은 에탄올로 0.5-1㎖로 희석하고, 5-10분동안 75 ℃로 열 블럭하에 둔다. 남색 또는 보라색은 자유 아민 존재에 대한 양성 표시이다. 무색 또는 희미한 남색은 음성 결과다(Protocol for Quantitative Ninhydrin Test References: Sarin, V. K., Kent, S. B. H., Tam, J. P., & Merrifield, R. B. (1981) Analytical Biochem. iii, 147-157).
4. 하룻밤동안 수지를 저장하는 경우, NMP 5 용량으로 5번 세척하고, 배수하고, 질소하에 저장한다. DCM하에서 저장하지 않는다. 이것은 수지으로부터 펩티드를 절단하여, 상당한 질량 손실을 야기할 수 있다. 각 분취물은 254nm에서 TLC 시각화로 산물함량을 검사한다. 대부분의 산물은 첫 5번의 세척으로 제거된다.
6. DCM이 제거되면, 반응물은 마시맬로 크림의 경도를 취하게 된다. 증류가 지속됨에 따라, 현탁액은 점진적으로 고체 슬러리로 쪼개진다. 산물 기름-방출을 피하기 위하여, DCM은 천천히 제거해야 한다.
7. Vydac C8, 5μ, 300A
1 ㎖/min, 30℃, 230nm
A 1000:1 물/TFA
B 800:200:1 IPA:ACN:TFA
60-95%B/30 min
보유 시간: 13.1분
11.3 FmocAA(17-26)-OH 단편(단편 10b)의 대규모 준비
전체 5.3㎏의 FmocAA17-26O-수지는 2개의 동등크기로 2.4 ㎏ FmocLeuO-수지으로부터 만들었다. 5.3㎏ FmocLeuO-수지는 4개의 동등크기로 수지로부터 절단하여, 3.184 ㎏ FmocAA17-26OH(평균 94.4A% 순도와 90% 수득율)을 얻었다.
로딩 인자에 상대적인 각 1.5 당량의 아미노산을 이용하여 실행된 반응으로, 각 결합주기에서 65% 초과된 아미노산이 사용되게 된다. 모든 결합반응은 2시간이내에 종결되었다(음성 닌하이드린 검사).
Fmoc 보호기는 20분동안 NMP(5 용량)에 녹인 20% 피페리딘으로 반복하여 제거한다. 피페리딘은 5 ×5 용량 NMP 세척액으로 수지로부터 씻어냈다. 결합 반응은 8 용량의 3:1 NMP:DCM으로 실행시켰다. 결합 용액은 배수하고, 고체는 3개의 5용량 NMP 세척액으로 깨끗하게 하였다. 서열의 다음 아미노산에서 상기 주기를 반복하였다. 단편 완성후, 수지 베드는 2 ×5 용량의 NMP와 5 ×5 용량의 DCM으로 씻고, 일정중량으로 건조시켰다.
DCM용매의 몇몇 1% TFA를 사용하여, 수지로부터 단편을 제거한다. DCM에 녹인 1% TFA 용액의 냉각은 불필요한데, 그 이유는 1% TFA/DCM (1%/day)에서 이 단편의 안정성이 AcAA1-16OH보다 훨씬 크기 때문이다. 산성 DCM 세척액을 함유한 산물을 수득할 때, 이들은 피리딘으로 중화시킨다. 모아진 세척액은 희석하여 DCM을 제거하고, 에탄올을 첨가하여, 용액상태를 유지시키고 희석동안 남아있는 DCM을 방출시킨다. DCM을 제거한 후(제거된 증류물의 온도 증가로 결정), 물을 첨가하여 단편을 침전시킨다. 고체는 진공여과하여 수득하였다(60분 이하). 여전히 축축한 고체는 반응기로 환원시키고, 60분동안 0-5℃에서 80/20 에탄올/물(5 vol)로 분쇄하였다. 침전된 FmocAA17-26OH는 진공여과하여 수득하고, 최소량의 80/20 에탄올/물을 가하여 건조시켰다(진공, 가열없슴, 10일).
11.3.1 FmocAA(17-26)-OH 단편(단편 10b)의 대규모 준비를 위한 적절한 방법
40ℓ SPPS 체임버는 FmocLeuO-수지(1.2 ㎏, 0.776 mole)과 DCM(5 vol)으로 채워, 수지를 팽창시켰다. DCM은 건조 출발수지의 완전한 팽창을 위해 필요하다. 현탁액은 20-30분동안 교반하고, 배수한다. NMP 용액에 녹인 20% 피페리딘(5 vol)을 첨가하고, 용액은 20분동안 교반한다. 용매는 배수하고, 수지 배드는 5 ×5 용량의 NMP로 세척하여 피페리딘을 제거한다(note 1).
탈보호하는 동안, 기계적으로 교반한 20 ℓ밑 둥근 플라스크는 서열상의 다음 아미노산(1.95 eq), HOBT(1.95 eq), DIEA (1.95 eq), NMP(6 vol)로 채웠다. 용액은 고체가 분해될 때까지 교반하고, 이후, 0-5 ℃로 냉각하고, HBTU (1.95 eq)를 첨가한다. 용액은 HBTU가 분해되거나 또는 피페리딘이 없는 경우 수지가 분해될 때까지(어떤 것이든 먼저 일어나는 것) 교반하고, 이후 수지에 첨가한다. 반응물은 DCM(2 vol)으로 씻고, SPPS 반응기로 옮긴다. 아미노산과 시약의 화학량은 1.5 당량이 된다.
수지는 부드럽게 교반한 결합 용액에서 현탁시킨다. 2시간 후, 수지 샘플은 SPPS 체임버로부터 떼어내고, 정성 닌하이드린 검사를 실시한다(note 2). 닌하이드린 검사가 음성인 경우, 용기는 배수하고, 3번 5 용량의 NMP로 씻고, 서열상의 다음 아미노산에서 상기 주기를 반복한다(DCM 팽창은 로딩된 첫 아미노산에만 적용한다).
검사가 양성인 경우, 현탁액은 추가로 1시간동안 교반하고, 재검사한다. 닌하이드린이 음성인 경우, 다음 주기로 진행시킨다. 닌하이드린이 양성인 경우, 1 당량의 아미노산 및 시약과 재결합시킨다. 닌하이드린이 1시간후에 양성으로 나타나는 경우, 1시간동안 NMP(10 vol)에 녹인 5 eq 아세트산 무수물과 5 eq 피리딘으로 말단 캡핑한다.
단편 합성 종결후, 수지는 배수하고, 2 ×5 용량의 NMP와 5 ×5 용량의 DCM으로 씻고, 건조시켜 2.67 ㎏의 FmocAA17-26O-수지를 만들었다.
FmocAA17-26OH은 각 5분동안 DCM에 녹인 5-6 ×1.7 용량의 1% TFA를 이용하여, 수지(1.33 ㎏)로부터 절단한다. 1% TFA/DCM 세척액은 피리딘(세척액에서 TFA와 1:1 부피)을 함유한 플라스크에서 수거한다. 세척액을 함유한 산물은 모으고(대략 14ℓ), DCM은 최소 포트부피(대략 원 부피의 1/3)로 증류한다. 진공 조절하여, 15-20℃의 포트(pot)온도를 유지한다. 에탄올(6.5 vol)을 첨가하고, 증류는 DCM이 제거될 때까지 지속한다. 다시 한번, 진공 조절하여 15-20℃의 포트온도를 유지한다. 최종 포트부피는 대략 8-10 용량이 된다. 용액은 5-10℃로 냉각하고, 물(6.5 vol)을 30분동안 첨가하여 FmocAA17-26OH를 침전시킨다. 고체는 진공여과 하여 수득하고, 물(2-3 vol)로 씻는다. 잔류한 피리딘 및/또는 염을 제거하기 위하여, 여전히 축축한 고체는 반응기로 환원하고, 80/20 에탄올/물(5 vol)(미리 0℃로 냉각)을 첨가한다. 현탁액은 0℃에서 60분동안 교반하고, 고체는 진공여과하여 수득하고, 80/20 에탄올/물 최소량으로 씻고, 일정중량으로 건조시켜 0.806㎏ FmocAA17-26OH(90.6% 수득율, 96A% 순도)를 얻었다(note 4).
Note:
1. 톨루엔에 녹인 클로라닐의 포화된 용액 한 방울과 유출액 한 방울을 1㎖의 아세톤에 첨가한다. 남색 또는 보라색은 피페리딘 존재에 대한 양성 표시다.
2. 정성 닌하이드린 검사는 결합효율의 모니터에 적당하다. 수지 샘플 2-20mg을 뽑아내고, 메탄올로 깨끗하게 씻는다. 에탄올에 녹인 76% 페놀 3방울, 피리딘에 녹인 0.2 mM KCN 용액 4방울, 에탄올에 녹인 닌하이드린 0.28M 용액 3방울을 샘플에 첨가한다. 용액은 에탄올로 0.5-1㎖로 희석하고, 5-10분동안 75℃로 열 블럭하에 둔다. 남색 또는 보라색은 자유 아민 존재에 대한 양성 표시이다. 무색 또는 희미한 남색은 음성 결과다.
3. DCM의 진공증류동안 선단온도는 10-15℃이었다. 선단온도는 DCM이 제거되는 경우, 35℃로 상승하였다.
4. Vydac C8, 5μ, 300A
1 ㎖/min, 30℃, 262nm
A 물/0.1% TFA
B ACN/0.1% TFA
80-99%B/20 min
보유 시간: 15.2분
11.4 FmocAA(27-35)-OH 단편(단편 16b)의 대규모 준비
전체 4.694㎏의 FmocAA27-35OH는 4.45㎏ FmocTrp(Boc)O-수지로부터 합성하였다. 고형상 합성은 2개 배취로 실행하고, 수지로부터의 절단은 4개 배취로 실행하였다. 한 배취에서 생성된 FmocAA27-35OH는 다른 배취에서 생성된 물질보다 5% 이상 덜 순수하였다. 이것은 FmocAA17-36NH2로 진행되는 과정에서 제거되는 5A% 미확인 불순물에 기인하였다. 수지에 로딩된 전체 FmocTrp(Boc)OH 양은 2.5몰이었다. 고형상 합성은 예상한대로 진행되었는데, 수지는 63% 용량으로 로딩되었다. 모든 결합은 첫 2시간 점검시점에서 완결되었다. 반응 및 SPPS와 절단을 위해 사용된 헹굼 부피는 FmocAA17-26OH 합성에서 이용된 것과 동일하였다. 수지로부터의 절단은 전술하였다. 여과는 빠르게 이루어졌다(15분). 90/10 에탄올/물 분쇄후 고체 건조에는 3일이 걸렸다(진공, 열 가하지 않음). 단편은 40℃로 건조시켜 안정화시킨다.
11.4.1 Ac-AA(27-35)-OH 단편(단편 16b)의 대규모 준비의 적절한 방법
FmocTrp(Boc)-수지(1 eq, 2.2 ㎏, 1.23몰)을 함유한 SPPS 체임버를 DCM(5 vol)으로 채웠다. 현탁액은 15분동안 교반하고 배수한다. NMP(5 vol)에 녹인 20% 피페리딘을 첨가하고, 현탁액은 10-15동안 교반하여 Fmoc 보호기를 제거한다. 이 과정은 반복하고, 수지는 클로라닐 검사가 음성이 될 때까지, 5-7 ×NMP(5 vol)로 씻는다(note 1).
다음 아미노산(1.5 eq), HOBT (1.5 eq), DIEA (1.7 eq)는 NMP(6 vol)에서 모으고, 이후, 0-5℃로 냉각한다(note 2). HBTU를 첨가하고, 용액은 10-15분동안 교반하여 녹였다. 활성화된 아미노산 용액을 수지에 첨가한다. DCM (2 vol)을 이용하여 반응물을 씻고, 이후 이를 수지에 첨가한다(note 3). 현탁액은 질소대기하에서 1-2시간동안 교반한다. 결합종결은 정성 닌하이드린 검사로 모니터한다(note 4). 닌하이드린 검사가 음성인 경우, 용기는 배수하고, 3번 5vol NMP로 씻고, 서열상의 다음 아미노산에 주기를 반복한다(DCM 팽창은 로딩된 첫 아미노산에만 적용한다).
검사가 양성인 경우, 현탁액은 추가로 1시간동안 교반하고, 재검사한다. 닌하이드린이 음성인 경우, 다음 주기로 진행시킨다. 닌하이드린이 양성인 경우, 1 당량의 아미노산 및 시약과 재결합시킨다. 닌하이드린이 계속 양성을 나타내는 경우, 1eq 아미노산과 시약과 재결합시킨다. 닌하이드린이 1시간후에 양성으로 나타나는 경우, 1시간동안 NMP(10 vol)에 녹인 5 eq 아세트산 무수물과 5 eq 피리딘으로 말단 캡핑한다.
단편 합성 종결후, 수지는 배수하고, 2 ×5 용량의 NMP와 5 ×5 용량의 DCM으로 씻고, 건조시켜 4.11 ㎏의 FmocAA27-350-수지를 얻었다.
단편은 각 5분동안 DCM에 녹인 6 ×1.7 용량의 1% TFA를 이용하여, 수지(2.05㎏)로부터 절단한다. 1% TFA/DCM 세척액은 피리딘(세척액에서 TFA와 1:1 부피)을 함유한 플라스크에서 수거한다. 세척액을 함유한 산물은 모으고, DCM은 원 부피의 1/2로 증류하여(진공 조절하여 포트온도를 15℃로 유지) 제거한다. 에탄올(5 vol)을 점진적으로 도입하고, 증류(진공 조절하여 포트온도를 15℃로 유지)는 DCM이 제거될 때까지 지속한다(증류물의 온도로 측정, note5). 포트부피는 대략 6-7 용량이 된다. 흐린 용액은 10-15℃로 냉각하고, 빠르게 교반하면서 30분동안 물(3.5 vol)을 첨가하여 FmocAA27-350H를 침전시킨다. 고체는 진공여과(15분)하여 수득하고, 물(1 vol)로 씻는다. 잔류한 피리딘을 제거하기 위하여, 여전히 축축한 고체는 반응기로 환원하고, 미리 0-5℃로 냉각한 90/10 에탄올/물(10 vol)을 첨가한다. 슬러리는 0-5℃에서 60분동안 교반하고, 고체는 진공여과하여 수득하고, 90/10 에탄올/물(0.5 vol)로 씻고, 일정중량으로 건조시켜 1.19㎏ FmocAA27-35OH(89% 수득율, 89.2A% 순도)를 만들었다(note 6).
이 프로토콜은 15 용량의 9:1 아세토니트릴/물로 고체를 분쇄하고, 12시간 교반하고, 수거하고, 건조하여 재현할 수 있다.
Note:
1. 톨루엔에 녹인 클로라닐의 포화된 용액 한 방울과 유출액 한 방울을 1㎖의 아세톤에 첨가한다. 남색 또는 보라색은 피페리딘 존재에 대한 양성 표시다.
2. 실온에서 HBTU이외의 시약을 첨가하여 분해를 촉진한다. HBTU를 냉각 용액에 첨가하여 라세미화반응을 최소화시킨다.
3. 활성화는 NMP에서 실시하는데, 그 이유는 HBTU는 DCM에 녹지 않기 때문이다. DCM을 사용하여 반응물을 씻고, 이를 수지에 첨가하여 적당한 수지 팽창을 유지한다.
4. 정성 닌하이드린 검사는 결합효율의 모니터에 적당하다. 수지 샘플 2-20mg을 뽑아내고, 메탄올로 깨끗하게 씻는다. 에탄올에 녹인 76% 페놀 3방울, 피리딘에 녹인 0.2 mM KCN 용액 4방울, 에탄올에 녹인 닌하이드린 0.28M 용액 3방울을 샘플에 첨가한다. 용액은 에탄올로 0.5-1 ㎖로 희석하고, 5-10분동안 75℃로 열 블럭하에 둔다. 남색 또는 보라색은 자유 아민 존재에 대한 양성 표시이다. 무색 또는 희미한 남색은 음성 결과다.
5. DCM의 진공증류동안 선단온도는 10-15℃이었다. 선단온도는 DCM이 제거되는 경우, 35℃으로 상승하였다.
6. Vydac C8, 5μ, 300A
1 ㎖/min, 30℃, 262nm
A 물/0.1% TFA
B ACN/0.1% TFA
80-99%B/20 min
보유 시간: 15.3분
11.5 FmocAA(27-35)-OH와 HPheNH 2 의 고형상 결합에 의한 FmocAA(27-36)-OH 단편의 대규모 준비
전체 5.226㎏ FmocAA27-36NH2는 4.676㎏ FmocAA27-35OH로부터 4회에 걸쳐 만들었다. 잔류한 결합 시약 또는 용매으로, 100%이상 수득율이 얻어진다. 이들은 다음 단계에서 제거된다.
물 드롭아우트후 반응기 벽에 붙어있는 고체는 이 단계에서 상당한 골칫거리였다. 진공여과로 정제안된 고체를 분리하는 데에는 30분이 걸렸다. 실행을 위한 평균건조시간(진공, 가열없슴)은 8일이었다. 고체는 오븐에 넣기 전에, 필터위에서 압축하여 과도한 물을 제거해야 한다. 단편은 40℃로 건조시켜 안정화시키고, 진공오븐은 가열한다.
이용 검사는 0.5 내지 1g 크기로 실행하는데, 출발물질을 일괄/다량 이용하여 품질과 동일성을 확보하였다. 박막 크로마토그래피(TCL)와 HPLC를 이용하여 출발물질의 산물로의 전환을 모니터한다. FmocAA27-35OH 단편을 찾기 위한 일차 불순물은 트리플루오르아세트산(또는 이의 염)이다. FmocAA27-35OH에 존재하는 트리플루오르아세트산 활성화 및 이와 페닐알라닌 아마이드와의 반응은 빠르게 진행된다. 소량의 페닐알라닌 아마이드를 사용하여 존재하는 임의의 트리플루오르아세트산을 소모시킬 수 있다. 구매한 페닐알라닌 아마이드에는 심각한 품질 문제가 존재한다. 이것은 대부분 HCl 염으로 판매된다. 페닐알라닌 아마이드의 몇몇 HCl 염은 불순물(5-15A%)을 만드는데, 이것은 HPLC에서 출발물질과 함께 용리된다. 불순물은 출발물질과 산물로부터 TLC로 분리할 수 있다. 불순물은 페닐알라닌 아마이드의 HCl 염에 존재하는 염화암모늄에서 생성된 FmocAA27-35NH2이다.
11.5.1 FmocAA(27-35)-OH와 HPheNH 2 의 용액상 결합에 의한 FmocAA(27-36)-OH 단편의 대규모 준비
기계적 교반기가 장착된 40ℓ 재킷 반응기는 FmocAA27-35OH(1 eq, 1.185 ㎏), HOAT (1.1 eq), HCl. HPheNH2(1.15 eq), DMF(12.5 vol)로 채운다. DIEA (2.1 eq)를 첨가하고, 용액은 0-5℃로 냉각하고, HBTU(1.2 eq)를 첨가한다. 반응혼합물은 0-5℃로 15분동안 교반하고, 이후 실온까지 가열하고, 추가로 70분동안 교반한다(note 1, 기준 과정동안 HPLC 사용). HPLC로 반응종결을 확인한 후, 물(12.5 vol)을 15-30분동안 첨가하여 펩티드를 침전시킨다. 슬러리는 실온에서 15분동안 교반한다. 고체는 진공여과하여 수득하고, 물(3 vol)로 씻고, 건조하여 FmocAA27-36NH2(1.357 ㎏, 107% 수득율, 87.1A% HPLC 순도)를 얻는다(note 2).
반응물은 15 용량의 9:1 아세토니트릴/물로 고체를 분쇄하고, 12시간 교반하여, 수거하고, 건조하여 재가공한다.
Note:
기준 과정, TLC:
88/12 디클로로메탄/메탄올
UV, 요오드 검출
Rf : FmocAA27-35OH, 0.49
Rf : FmocAA27-36NH2, 0.63
Vydac C8, 5 m, 300A
30 ℃, 1 ㎖/ min, 262 nm
A 물/0.1% TFA
B ACN/0.15 TFA
80-99%B/20분
보유 시간: FmocAA27-35OH, 15.8
보유 시간: FmocAA27-36NH2, 17.12
분리된 고체를 반응기로 환원하여 물로 분쇄하지 않는 경우, 이론치보다 높은 수득율이 얻어진다.
11.6 FmocAA(27-36)-OH로부터 HAA(27-36)-OH 단편의 대규모 준비
전체 3.897㎏ HAA27-36NH2는 5.221㎏ FmocAA27-36NH2로부터 4회에 걸쳐 만들었는데, 평균 2단계 수득율은 86.4%이었다. 작업동안 관찰된 수득율 범위는 74-97%이었는데, 이것은 한번의 작업에서 다음 작업으로의 이전을 의미한다.
이런 단계에서 일련의 산물 분리는 매우 효과적이다. 정확한 양의 DCM이 MTBE에 남아있고, 고체가 빠른 여과와 건조를 유도하는 물리적 성질을 보유한 경우, 산물의 순도는 향상된다. 이런 산물 분리 과정은 단락 11.6.2에서 제시한 새로운 단계로 통합한다.
DCM은 FmocAA27-36NH2의 탈보호동안 사용되는 용매다. 탈보호의 완결시, 유기용액은 2번 물로 씻고, 대부분의 과도한 피페리딘을 제거한다. MTBE를 첨가하여 단편을 침전시킨다. 계속 증류하여 남아있는 DCM 대부분을 제거하고, 단편의 침전을 완결시킨다. 침전물에서 질량 감소를 피하기 위해서는 DCM 대부분을 제거해야 한다. 또한, MTBE에 약간의 DCM을 남겨두어, 산물 소거를 확보하는 것이 중요하다. 디벤조풀벤, 피페리딘/풀벤 부산물, 잔류한 피페리딘은 MTBE에 녹는다. HAA27-36NH2는 수거하고, 건조시킨다. 필요한 경우, MTBE로 이차 분쇄하여 잔류한 디벤조풀벤, 좀더 중요하게는 HAA27-36NH2에 존재하는 피페리딘/풀벤 부산물을 제거한다. 헥산으로 분쇄하는 경우, 디벤조풀벤은 제거할 수 있지만, 피페리딘/풀벤 부산물은 제거할 수 없다. MTBE로부터 분리한 고체의 건조 시간은 1일이다.
DCM/MTBE에서 HAA27-36NH2와 관련 불순물의 높은 용해성으로 인해, 용매 교환의 종결시점을 정확하게 측정할 수 있는 분석방법이 바람직하였다. MTBE에서 DCM를 분석하기 위해 GC 방법이 개발되었다. 증류는 MTBE상의 DCM 함량이 6%미만일 때, 종결된다.
11.6.1 FmocAA(27-36)-OH로부터 HAA(27-36)-OH 단편의 대규모 준비
기계적 교반기가 장착된 40ℓ 유리 재킷 반응기는 FmocAA27-36NH2 (1 eq., 1.356 ㎏), DCM (5 vol), 피페리딘(0.2 vol)으로 채운다. 용액은 실온에서 1.5시간동안 교반한다(note 1). 유기용액은 물(2 ×5 vol)로 씻는다. 유기층 부피는 증류(25 mmHg, 고체 용해를 예방하기 위해 45℃이하의 재킷 온도)하여 원부피의 1/3로 줄인다. 상당한 침전이 이루어지도록 계속 농축하고, 포트부피가 대략 5 용량이 될 때까지, MTBE(5 vol)를 반응용기에 점진적으로 도입한다. DCM 함량이 6%미만일 때, 용매 교환은 중단한다. 슬러리는 0-5℃로 냉각하고, 60분동안 교반하고, 이후, 진공여과(신속)로 수득한다. 고체는 MTBE(2 ×0.5 vol)로 씻고, 일정 중량으로 건조하여 1.022㎏ HAA27-36NH2(수득율 89.2%(2단계), 91.1A% 순도)를 얻는 다(note 1).
반응물은 23℃에서 13시간동안 MTBE(12.5 vol)로 분쇄하고, 진공여과하여 수거하고, 건조하여 재가공한다
Note:
IPC 및 HPLC 순도 측정:
Vydac C8, 5 m, 300A
30 ℃, 1 ㎖/ min, 262 nm
A 물/0.1% TFA
B ACN/0.15 TFA
80-99%B/20분
보유 시간: FmocAA27-36NH2, 16.5분, HAA27-36NH2, 8.4분
11.6.2 FmocAA(27-36)-OH와 HPheNH 2 의 용액상 결합에 의한 HAA(27-36)-OH 단편의 향상된 준비
FmocAA27-35OH에서 HAA27-36NH2를 포함하는 단락 11.5 내지 단락 11.6.1을 통합한 새로운 과정이 개발되었다. 이 새로운 과정에는 FmocAA27-36NH2를 분리하는 문제와 긴 건조시간이 필요없다. 상세한 설명은 하기에 제공한다. 새로운 과정에는 긴 건조시간 및 합성루트 단계가 필요하지 않다.
자석 교반막대와 질소 입구가 장착된 100㎖ 밑 둥근 플라스크에 FmocAA27- 35OH (5.0 g, I eq), HOAT (0.459, 1.2 eq), Phe-NH2(0.389, 1.2 eq)를 첨가한다. 10 용량의 NMP(50 ㎖)와 DIEA(0.45 g, 1.5 eq)를 플라스크에 첨가하고, 고체가 녹을 때까지 질소대기하에서 교반한다. 용액은 0 내지 5℃로 냉각하고, 이후, HBTU(1.04 g, 1.2 eq)를 첨가한다. 30분동안 0 내지 5℃ 질소대기하에서 교반한다. 반응혼합물은 20℃로 가열하고, 교반을 지속한다. HBTU를 첨가한 후, 기준 과정(IPC)을 실시한다(note 1).
기준 과정(IPC)에서 반응이 종결된 후, 피페리딘(1.379, 7 eq)을 반응혼합물에 첨가하고, 1.5시간동안 질소대기하에서 교반한다(note 1). Fmoc 제거가 완결되지 않은 경우, 추가로 30분동안 교반하고, IPC를 실행시킨다.
완결되면, 반응혼합물은 35℃ 온도를 초과하지 않는 비율로, 5% 수용성 아세트산에 첨가한다(30 vol). 1 내지 2시간동안 생성된 슬러리를 교반하고, 진공여과하여 수거한다(note 2). 고체는 10 용량(50 ㎖)의 물로 씻는다.
축축한 고체는 반응기로 환원하고, 20 용량의 물(100 ㎖)을 첨가하고, 1 내지 2시간동안 실온에서 교반한다. 진공여과하여 고체를 수거하고, 10 용량의 물(50 ㎖)로 씻고, 건조시킨다(note 3).
건조된(note 4) 고체는 2 내지 5시간동안 실온에서, MTBE(20 vol)로 분쇄하여, 디벤조풀벤과 디벤조풀벤 피페리딘 부산물을 제거한다. 진공여과하여 고체를 수득하고, 일정 중량으로 건조하여 4.55g(94.3%) HAA27-36NH2를 얻었다(85-90A% 순도)(note 1).
Fmoc 부산물(디벤조풀벤과 이의 피페리딘 부산물)은 일반적으로 이 프로토콜동안 제거되지만, 재가공이 필요한 경우, 2 내지 3시간동안 20℃로 10용량의 MTBE에서 고체를 교반하고, 수거하고, 건조시킨다.
Note:
1. 기준 과정(IPC), 역상 HPLC:
컬럼: Vydac C8, 300A, 5μ, 30 ℃
유속: 1 ㎖/min
검출: 262nm UV
이동상: A. 물/0.1 % TFA
B. 아세토니트릴/0.1% TFA
방법: 20분동안 80 내지 99%B
보유 시간: FmocAA27-36NH2 (16.5 분), HAA27-36NH2(8.4 분)
2. 전체 여과 시간은 10분이다.
3. 축축한 여과물 덩어리는 기름유출 또는 고체의 고무질 형성을 피하기 위해, 물 세척용 반응기로 환원시킨다.
4. 정제안된 산물은 완전히 건조시키고, MTBE 분쇄하여 디벤조풀벤 부산물을 완전하게 제거한다.
11.7 FmocAA(17-26)-OH와 HAA(27-36)-OH의 용액상 합성융합에 의한 FmocAA(17-36)-OH 단편의 대규모 준비
전체 5.115㎏ FmocAA17-36NH2는 2.993㎏ HAA27-36NH2와 3.176㎏ FmocAA17-26OH로부터 4회에 걸쳐 만들었다. 평균 수득율은 84.3%이었다. 반응혼합물로부터 물 드롭아우트후 정제안된 고체를 여과하는 데에는 평균 40-50분이 걸렸다.
이용 검사는 1-2g 크기로 실행하여, 결합반응을 실시하기 전에 사용하는 단편과 HBTU를 검사한다. 출발물질과 시약의 화학량은 이용 검사로부터 결정한다. 출발 물질의 용해성 또한, 이용 검사에서 측정한다. 흐린 용액은 FmocAA17-26OH에서 염의 존재를 암시하는데, 이런 경우 단편을 물로 씻는다. 반응혼합물의 모든 성분은 HBTU 첨가이전 용액상태로 만들어, 출발물질이 최소한의 라세미화반응과 부산물형성을 보이는 산물로 전환되도록 하여야 한다.
물 드롭아우트로부터 분리된 정제 안된 FmocAA17-36NH2의 순도는 IPA로부터의 침전에 의해 상당히 향상되었다. FmocAA17-36NH2는 IPA에 부분적으로 녹는다. 미리 60-70℃로 가열한 15용량의 95/5 IPA/물로 FmocAA17-36NH2를 분쇄하고, 이후, 여러 시간동안 실온에서 냉각하면서 교반하면, 단편의 순도가 향상된다. 출발물질 및 FmocAA17-26OH의 피페리딘 아마이드와 HAA27-36NH2의 에나민 요소 부산물은 95% IPA에 녹는다. 연장된 기간동안 실온에서 95% IPA로 정제안된 FmocAA17-36NH2를 분쇄하는 것은 불순물 제거에 그다지 효과적이지 못하다. 60-70℃에서 안정성 연구를 완결하였다. 52℃이상으로 가열하지 않아도, 분리된 산물의 품질은 별다른 영향을 받지 않는 것으로 보인다.
11.7.1 FmocAA(17-26)-OH와 HAA(27-36)-OH의 용액상 합성융합에 의한 FmocAA(17-36)-OH 단편의 향상된 대규모 준비를 위한 적절한 방법
기계적 교반기가 장착된 40ℓ 재킷 반응기는 FmocAA17-260OH(1 eq, 0.770 ㎏), HOAT (1.5 eq), HAA27-36NH2 (1 eq., 0.720 ㎏), DMF(FmocAA17-26OH에 상대적인 12.5 용량)으로 채운다. EtPr2N(1.5 eq.)을 첨가하고, 현탁액은 고체가 녹을 때까지(시각적으로), 실온에서 교반한다. 용액은 질소대기하에서 0-5℃로 냉각하고, HBTU(1-1.05 eq)를 첨가한다. 반응혼합물은 HBTU가 녹을 때까지(시각적으로, 대략 15분), 0-5℃에서 교반한다. 반응혼합물은 25℃로 가열하고, 2시간동안 교반한다(note 1). DMF 용액은 0-5℃로 냉각하고, 냉각수(12.5 vol)는 25℃를 초과하지 않는 비율로 첨가한다. 생성된 슬러리는 1-24시간동안 교반하고, 고체는 진공여과하여 수득하고, 물(3 ×4 vol)로 씻는다. 고체는 16-24시간동안 여과지에서 이론 중량의 2배정도로 건조시킨다. 40ℓ 반응기는 95/5 이소프로판올/물(25 vol)로 채우고, 45℃로 가열하였다. 반-건조 FmocAA17-36NH2는 빠르게 교반하면서, IPA 용액에 첨가한다. 현탁액은 52℃로 가열하고, 이후, 실온으로 냉각하면서 12-16시간동안 교반하고, 최소량의 IPA로 씻고, 건조시켜 1.261㎏ FmocAA17-36NH2(수득율 85%, 90.SA% HPLC 순도)를 얻는다(note 1). 반응물은 95/5 IPA/물 분쇄를 반복하여 재가공한다.
Note:
1. 기준 과정과 순도, HPLC
Vydac, C8, 5 μ, 300A
1 ㎖/min, 262nm, 30 ℃
A 물/0.1% TFA
B 80/20 IPA/ACN/0.1% TFA
60-95%B/20분
보유 시간: HAA27-36NH2, 6.73분
FmocAA17-26OH, 10.67분
FmocAA17-36NH2, 20.2분
2. FmocAA17-36NH2는 이런 온도와 부피에서는 완전히 분해되지 않는다. 고체를 수거하기 전에, 교반을 중단하고, 고체가 가라앉도록 한다. 여과물 샘플을 이전하고, HPLC로 분석한다. 여과물이 충분한 양의 FmocAA17-36NH2를 함유한 경우, 고체를 수거하기 전에 0℃로 냉각한다.
11.8 FmocAA(17-36)-OH로부터 HAA(17-36)-OH 단편의 대규모 준비
전체 4.965㎏ HAA17-36NH2는 5.112㎏ FmocAA17-36NH2로부터 4회에 걸쳐 만들었다. 분리된 수득량과 HPLC 결과는 디벤조풀벤과 용매의 존재를 암시한다. 존재하는 디벤조풀벤은 탄산칼륨으로 제거되기 때문에 이후의 결합반응을 방해하지 않아, 디벤조풀벤의 피페리딘은 화학적으로 문제가 되지 않는다.
이런 과정과 관련된 몇 가지 문제점이 있다. 반응은 12용량의 DMF에서 실행 한다. Fmoc기를 제거하는 염기는 1용량의 1.1M 탄산칼슘이 되는데, 이것은 디벤조풀벤과 제거하기 어려운 염기 부산물을 형성하지 않는다. 탈보호는 실온에서 약 90분동안 진행된다.
미리 0℃로 냉각한 1:1 포화된 수용성 염화나트륨:물 용액을 첨가하여, 단편과 디벤조풀벤을 동시에 침전시킨다. 여기에서, 미세한 우유빛 고체가 만들어지는데, 이것을 여과하는 데에는 여러 시간(5-8)이 걸린다. 분리된 축축한 고체는 완전히 건조시켜, 디벤조풀벤 불순물을 제거한다(1% LOD 이하). 건조에는 10일이 소요된다(지공, 가열없슴). 건조된 고체는 반응기에 환원하고, 실온에서 18시간동안 3:1 헵탄:MTBE (20 vol)로 분쇄하여 디벤조풀벤을 제거한다. 분쇄시간이 짧으면 이것이 완전히 제거되지 않고, 고체에 물이 남아있으면 제거되지 않는다. 디벤조풀벤이 계속 남아있는 경우, 3:1 헵탄:MTBE (20 vol) 재가공을 실시할 수 있다.
이런 문제를 해결하기 위하여, 다음의 새로운 과정이 개발되었다. 기계적 교반기, 온도 조절기, 환류 응축기가 장착된 100㎖ 밑 둥근 플라스크에 FmocAA17-36NH2(2.0 g, 1 eq.)와 헵탄(8 vol)을 첨가한다. 2용량의 MTBE(4 ㎖)를 첨가하고, 슬러리를 45-50℃로 가열한다(note 1). 피페리딘(1 0 eq.)을 첨가한다. 24-36시간동안 45-50℃로 질소대기하에서 교반한다(note 2). 45-50℃에서 반응혼합물을 열 여과하고, 이후, 5 용량(10 ㎖)의 60:40 헵탄:MTBE로 덩어리를 씻는다.
Note:
1. MTBE가 반응기를 벗어나게 되면, 헵탄::MTBE비율이 변화되고, 반응은 느 려지게 된다. 반응온도가 50℃이상이 되면, 반응 고체는 고무질을 형성한다. Fmoc는 5시간정도 지나면 거의 제거된다.
2. 반응 완결은 RP-HPLC로 모니터한다:
컬럼: Vydac C8, 300A, 5, 30℃
유속: 1 ㎖/min
검출: 262 nm UV
이동상: A. 물/0.1% TFA
B. 80:20 IPA:CAN 0.1% TFA
방법: 30분동안 60 내지 95%B
열 여과는 디벤조풀벤의 피페리딘 부산물의 제거를 보조한다.
11.8.1 FmocAA(17-36)-OH로부터 HAA(17-36)-OH 단편의 대규모 준비
기계적 교반기가 장착된 40ℓ재킷 반응기는 실온에서 FmocAA17-36NH2 (1 eq, 1.26 ㎏)와 DMF(12 vol)으로 채운다. 1.11M 수용성 탄산칼륨 용액(1 vol, 5 eq)을 동시에 첨가한다(note 1). 반응혼합물은 실온에서 3.5시간 교반한다(note 2). 반응혼합물은 10℃를 초과하지 않는 비율로, 미리 10℃로 냉각한 포화된 수용성 염화나트륨/물의 1:1 용액에 천천히 첨가한다. 고체는 여과물 덩어리로부터 물을 압축하기 위한 라버댐을 이용하여 진공여과로 수거한다(note 3). 젖은 덩어리는 반응 용기로 환원하고, -2시간동안 물(10 vol)로 분쇄하여(교반하여) 잔류한 비유기염을 제거한다. 고체는 진공여과하여 수거하고, 라버댐으로 압착하고, 이후, 진공오븐 으로 옮겨 일정중량으로 건조시킨다. 건조된 고체(note 4)는 최소 14시간동안 실온에서 3:1 헵탄:MTBE(20 vol)으로 분쇄하여(교반하여) 디벤조풀벤을 제거한다. 고체는 진공여과로 수득하고, 헵탄(2 vol)으로 씻고, 건조시켜 1.20㎏ HAA17-36NH2(수득율 99.5%, 순도 75A%)를 얻는다. HAA17-36NH2는 5A% 디벤조풀벤을 함유한다. 헵탄:MTBE 분쇄를 반복하여 반응을 재현한다.
Note:
1. 수용성 탄산칼륨을 첨가하는 경우, 용액은 흐려지지만, 계속 교반하면 투명해진다. 4-5℃의 열방출점이 나타난다.
2. IPC에 사용된 HPLC와 순도.
Vydac C8, 260 nm
1 ㎖/min, 262 nm, 30 ℃
A 물/0.1% TFA
B 80:20 IPA/아세토니트릴/0.1 % TFA
60-95%B/30 분
3. 산물은 미세한 입자크기로 침전되고, 이로 인해 여과속도가 느려짐.
4. 헵탄이 디벤질풀벤을 효과적으로 제거하기 위해서는 물질에 물이 존재하지 않아야 한다.
11.9 AcAA(1-16)-OH과 FmocAA(17-36)-OH로부터 용액상 합성에 의한 AcAA(1-36)-OH의 대규모 준비
AcAA1-16OH는 HOAT와 DIEA로 DMF에 녹이고, 0℃로 냉각하고, HBTU를 첨가하였다. 이것은 15분동안 또는 HBTU가 녹을 때까지 교반하고, 이후, HAA17-36NH2를 첨가하였다. HAA17-36NH2의 부재하에서 AcAA1-16OH의 선-활성화는 후기에는 불필요한 예방조치다. 또한, HAA17-36NH2를 활성화된 AcAA1-16OH를 함유한 0℃ DMF 용액에 분해시키는 것은 큰 규모에서는 속도가 느려진다는 것이 밝혀졌다.
전체 6.972㎏ AcAA1-36NH2는 3.92㎏ AcAA1-16OH와 4.96㎏ HAA17-36NH2로부터 4회에 걸쳐 만들었는데, 평균 수득율은 80.1%이었다. 이 단계에서 2회 평균 수득율은 87%이었고, 다른 2회 평균 수득율은 73%이었다.
이용 검사는 1-2g 크기로 실행하여, 결합반응을 실시하기 전에 사용하는 단편과 HBTU를 검사한다. 출발물질과 시약의 화학량은 이용 검사로부터 결정한다. 출발물질의 용해성 또한, 이용 검사에서 측정한다. 흐린 용액은 AcAA1-16OH에서 염의 존재를 암시하는데, 이런 경우 단편을 물 세척한다. 반응혼합물의 모든 성분은 HBTU 첨가이전 용액상태로 만들어, 출발물질이 최소한의 라세미화반응과 부산물형성을 보이는 산물로 전환되도록 하여야 한다.
단편 AcAA1-16OH와 HAA17-36NH2, 시약 HOAT, DIEA는 DMF에 녹이고, 0℃로 냉각하고, HBTU를 첨가한다. 한 실행과정에서, HAA17-36NH2에서 HCl를 포획하기 위하여 추가로 1당량의 DIEA가 필요하였다. 정제안된 산물은 반응혼합물로부터 물 드롭아우트를 이용해 분리한다(여과 시간, 10분). 여전히 축축한 고체는 55℃로 선- 가열한 아세토니트릴을 함유한 반응기에 환원시키고, 이후, 빠르게 교반하면서 3시간동안 35℃, 그 다음, 하룻밤동안 20℃로 냉각하였다. 슬러리는 0-5℃로 냉각하고, 추가로 1-2시간 교반하고, 고체는 여과하여 수득한다. 이런 과정동안, AcAA1-36NH2는 55℃에서 거의 용해된다. 용액이 냉각됨에 따라, AcAA1-36NH2는 용액에서 침전된다(기름). 용액이 냉각됨에 따라, 기름은 고체화되고, 결국 미세한 흰색 고체로 변환된다. 이런 변환과정동안, 반응기 벽과 교반 샤프트에 상당한 고체가 침전되게 된다. 슬러리를 20℃에서 하룻밤동안 교반하면, 이들 대부분은 떨어져나간다. 고체를 수득한 후, 반응기는 반응기 벽과 샤프트에 붙어있는 고체를 덮을 수 있을 만큼 충분한 물을 채워넣는다. 슬러리는 모든 남아있는 고체가 벽과 샤프트에서 떨어질 때까지 교반하고(대략 1시간), 이후, 여과물 덩어리에 세척액으로 사용한다. 아세토니트릴로 세척하여, 20개 아미노산이하의 임의 절두된 단편과 반응안된 출발물질을 제거한다.
11.9.1 AcAA(1-16)-OH과 FmocAA(17-36)-OH로부터 용액상 합성에 의한 AcAA(1-36)-OH 단편의 적절한 대규모 준비
40ℓ반응기는 AcAA1-16OH(938 g, 1 eq), HAA17-36NH2(1.19 ㎏, 1 eq), HOAT (1 eq), DMF(19 vol, AcAA1-16OH와 상대적), DIEA(1 eq)로 채운다. 슬러리는 고체가 분해될 때까지 교반하고, 이후 0-5℃로 냉각하고, HBTU(1.03 eq.)를 첨가한다. 용액은 0-5℃에서 15분동안 또는 고체가 녹을 때까지 교반하고, 20℃로 가열하고, 2시간동안 교반한다. 반응혼합물은 IPC용 샘플을 만든다(note 1). 반응인 완결된 것으로 판단되면, 물(19 vol)은 35℃를 초과하지 않는 비율로 첨가한다.
슬러리는 1-24시간동안 교반하고, 이후, 고체는 진공여과로 수득하고(10분), 물(2 ×3 vol.)로 씻는다. 여과물 덩어리는 압착하여, 가능한한 많은 물을 제거한다. 한편, 반응기는 95% 아세토니트릴/물(AcAA1-16OH에 상대적인 30 용량)로 채우고, 교반하면서 55℃로 가열한다.
축축한 고체는 조금씩 반응기에 첨가하여, 덩어리가 되지 않도록 한다. 슬러리는 교반하면서, 3시간이상 35℃로, 이후, 하룻밤동안 20℃로 냉각한다. 0-5℃로 냉각하고, 2시간동안 교반하고, 교반을 중단하고, 용액의 샘플을 만든다.
진공여과하여 고체를 수득한다. 반응기는 90% 아세토니트릴/물(3.6 vol)로 씻고, 균질화시킨다.
반응기는 반응기 벽 또는 교반 샤프트(대략 30 vol)를 덮을 수 있을 만큼 충분한 양의 물로 채운다. 고체가 더 이상 반응기 벽과 샤프트에 부착되지 않을 때까지, 실온에서 교반한다(대략 1시간). 레스트로 고체를 수거하고, 일정 중량(1.83 ㎏, 86%)으로 건조시킨다.
90/10 아세토니트릴/물을 이용하여, 건조 고체에서 분쇄를 반복한다.
Note:
1. IPC와 순도, HPLC
YMC ODS-A, 150 ×4.6 ㎜, 5 μ, 120A
1 ㎖/min, 260 nm, 30 ℃
A 물/0.1% TFA
B THF/0.1% TFA
60-90%B/30 min, 90-95%B/1 min, 95%B/5 min
AcAA1-16OH 6.37분
HAA17-36NH2 8.91분
AcAA1-36NH2 18.07분
물 첨가동안 온도가 35℃를 초과하는 경우, 침전된 고체가 녹아, 반응기 벽에 덩어리 침전이 생기게 된다.
11.10. AcAA(1-36)-OH의 측쇄에 보호기 제거
이 실험의 목적은 온도를 20℃ 이하로 유지시키기 위한 침전물에서 MTBE의 추가 비율을 변화시키고, 정제안된 T-20 고체를 분리하고, 카르복실기를 제거(디카르복실화 용액 제거)하는 것이다.
HPLC 컬럼에 로딩하기 전에 ACN/물에서 침전으로 고체형의 정제안된 T-20을 분리하였다. 중량계 HPLC 검사를 이용하여 고체에서 T20 함량 비율을 측정하였다.
90/5/5 TFA/물/디티오트레톨로부터 측쇄가 보호된 기를 제거한 후에, 용액은 0℃로 냉각시키고, MTBE(AcAA1-36NH2에 대해 45 vol.)를 첨가한다. 이것은 T-20의 침전을 완료시키는데 필요한 MTBE 최소량이 된다. 혼합할 때, 발열 반응이 일어나고, 처음 5 용량을 서서히 첨가하여, 온도를 20℃이하로 유지시켜야 한다(약 60분). 더 많은 MTBE를 첨가하면, 추가 비율이 증가된다. 침전 과정동안에 온도를 20℃이하로 유지시키면, 용액으로부터 침전될 때, 고체가 엉기는 것을 막아준 다.
현행 절단/정제 프로토콜에는 크로마토그래피 정제과정과 수반되는 단계에서 탈보호과정이 포함된다. 탈보호 칵테일로부터 분리된 TFA 염형태의 정제안된 T-20을 pH 5에서 아세토니트릴/물에 용해시키고, 여과시킨 후 15시간 방치하여, 트립토판 인돌의 데카르복실화를 유도한다. 데카르복실화 반응이 완료된 후에, 용액을 희석하여, 컬럼에 로딩될 정제 기구로 옮긴다. 희석하는 동안에, 용액이 탁해지고, 탁해진 용액을 컬럼에 제공한다. 컬럼의 머리부분에 고체를 얹게되어, 정제가 실시되는 동안에 컬럼이 점진적으로 침식하게 된다. 몇 시간 동안 pH 5의 아세토니트릴/물에서 T-20이 데카르복실화되면 상당한 불용성의 큰 응집물이 형성된다.
용액에서 데카르복실화 반응을 회피하는 방법이 개발되었다. MTBE 침전물로부터 TFA 염형태로 분리된 정제안된 T-20은 5-7일 이상 실온에서 진공하에 데카르복실화한다. 데카르복실화 반응은 진공상태, 40℃에서 3일안에 완료되었다. 분리된 고체에서 TFA 함량은 9%이다. 물질은 0℃에서 최고 1달간 보관할 수 있는데, 손실율은 1% wt/wt이다.
MTBE로부터 T-20-TFA를 분리시킨 후에, 에탄올/물(1:9)에서 HOAc를 이용하여 염 교환을 실행할 수 있다. 정제안된 T-20 아세테이트 염은 상당히 안정적이고, 바람직하다. 어떤 분리 방법을 사용하여도 대규모로 측쇄의 보호기 제거를 실시할 수 있으며, T-20은 응집의 원인이 되는 것으로 알려진 데카르복실화 반응에 이용되는 아세토니트릴/물/HOAc 조건에 노출되지 않는다.
AcAA(1-35)OH 축쇄의 보호기 제거를 위한 신규한 방법
90/5/5 TFA/물/디티오트레톨 용액(13 vol)을 준비하고, 3분간 질소를 이용하여 정화시킨다. 실온, 질소 대기하에서 AcAA1-36NH2를 90/5/5 TFA/물/디티오트레톨(13 vol)에 나누어 첨가시킨다. 용액은 4시간 동안 실온에서 교반시키고, 0℃로 냉각시킨 다음, T-20을 침전시키기 위해, 0-5℃로 냉각된 MTBE(45 vol)를 초기 20℃ 이하로 유지시키면서, 느린 속도로 한 방울씩 첨가한다(대략 첨가 시간은 1-2시간 정도). 진공 여과를 이용하여 고체를 수득한다(note 1). 반응기, 라인, 여과물 덩어리는 바로 3 ×5 용량의 MTBE로 씻어낸다. 고체를 제거하고, t = 0 IPC에 대해 샘플링하고, 진공하에서 5일간 또는 HPLC에서 변화가 나타나지 않을 때까지 건조시킨다.
note:
1. 보호기를 제거하는 용액이 흡습성이기 때문에, 여과동안에 고체에 공기가 빨려나오지 않도록 한다. TFA 용액이 씻겨나가기 전에 고체를 통하여 공기를 빨아들일 경우에, 점착성 또는 지성 고체가 형성된다.
2. HPLC 방법 TM2-0003-01(TFA 방법)을 이용한다. 아세테이트 암모늄 방법(TM2-0006-01)은 다양하게 카르복실화된 중간 생성물을 분리시키지 못한다.
AcAA(1-36)OH의 측쇄에 보호기를 제거하는 방법
12회로 총 7.226㎏의 AcAA1-36NH2에서 보호기를 제거시킨다. 6.972㎏ 정도의 AcAA1-36NH2가 만들어졌는데, 이는 중간 생성물이 흡습성이 있다는 것을 암시한다. MTBE를 제거한 것으로부터 분리된 고체를 10 용량의 1:1 ACN/물에 용해시키 고, 여과시키고, 중탄산나트륨을 이용하여 pH를 3.5로 조절한다. 아세트산(1.5 volume %)을 첨가시키고(pH 4.5 내지 5), 용액은 15시간동안 실온에서 교반하여, 데카르복실화 반응을 유도한다. 용액을 25 용량의 물로 희석시키면, 총 40 용량의 85/15 물/ACN 용액이 만들어진다. 모든 경우에서 용액은 탁하고, 일부의 경우에는 미세한 고체(응집된 T-20)를 함유한다. IPC용 샘플을 취하고, 용액은 정제 기구로 옮긴다. 각 과정에서의 정제안된 T-20의 수득율은 wt/wt HPLC 검사를 이용하여 계산한다.
AcAA1-36NH2의 보호기 제거 과정은 90/5/5 TFA/물/DTT상에서 실온, 4-5시간동안에 완료된다. 8시간 경에는 눈에 띄는 분해(2%)가 일어난다. 5℃ 동일한 칵테일에서 8시간내 보호기 제거 반응이 완결되지 않았지만, 23시간에는 완결되었다. 실온에서 5시간 실시한 경우와 5℃에서 23시간 실시한 경우에 얻은 정제안된 T-20의 순도에는 차이가 없었다. 분리 용량(약 55 vol)이 반응(보호기 제거반응) 용량(13 vol)보다 훨씬 크기 때문에, 20ℓ병에든 TFA 용액에 AcAA1-36NH2를 용해시키고, 40ℓ반응기로 용액을 옮겨야 한다.
정제안된, 카르복실화된 T-20(TFA염형태)을 보호기 제거용 칵테일로부터 분리하기 위해서, MTBE로 침전시킨다. 펩티드를 침전시키는데 필요한 MTBE 양은 보호기제거 칵테일 양의 3-4배가 된다. 절단 칵테일 용량의 2배 정도의 MTBE를 이용하면, 펩티드만 남게된다. 칵테일을 MTBE에 첨가시키면, 여과하기 힘든 미세한 침전물이 만들어지지만, 절단 칵테일에 MTBE를 첨가시키면 용이하게 여과할 수 있는 고체를 얻을 수 있다. MTBE를 TFA 용액에 첨가시키는 동안에 온도는 5℃에서 40~45℃로 상승된다. 온도의 상승은 분리된 정제안된 T-20의 순도에는 영향을 주지 않는다(187/117,119). MTBE를 첨가하는 동안에 일부 고체가 엉긴다. 엉김을 풀기 위해 1-2시간동안 슬러리를 교반시킨다. MTBE를 첨가시키는 동안에 온도를 20℃로 유지시키면, 여과가 잘되는 좀더 균질한 고체를 얻을 수 있다(196/31). MTBE 첨가 속도는 앞으로 조절될 수 있을 것이다. 정제안된 T-20은 질소 대기하에서 여과시켜 수득한다. TFA를 씻어내기 전에 여과동안 수분에 노출될 경우, 고체는 점성을 띄게 된다. TFA를 씻어낸 후에, 고체는 대기중에서 안정적이다.
실행 방법
90/5/5 TFA/물/디티오트레톨 용액(13 vol)을 20ℓ병에서 만들어 3분간 질소 공기를 공급한다. AcAA1-36NH2(650g)를 나누어 첨가하여 응집되는 것을 막는다. 고체가 용액상에 있게 되면, 용액을 70ℓ반응기로 옮긴다. 병과 라인을 최소량의 90/5/5 TFA/물/디티오트레톨로 씻어낸다. 용액은 4시간 동안 질소대기하에, 실온에서 교반시키고, 0-5℃로 냉각시킨다. MTBE(45 vol)를 내부 온도가 30℃이하로 유지되는 속도로 첨가시킨다. 고체는 질소 기류하에서 진공 여과를 통하여 수득한다. 반응기, 라인, 고체는 2×2 용량의 MTBE로 씻어내고, 일정한 중량으로 건조시킨다(594 g, 70A%).
고체(594 g)를 50% ACN/물(AcAA1-36NH2 충전량에 대한 8배 용량)에 용해시키고, 여과시킨다. 용기 및 라인은 50% ACN/물(2 vol)로 씻어낸다. 용액의 pH는 중 탄산나트륨으로 3.5-4.0으로 조절한 다음, 아세트산(0.18 vol)을 첨가하여, pH 4.9로 만든다. 15시간 동안 실온에서 용액을 교반시킨 다음(IPC, note 1), pH는 1M 탄산칼륨을 이용하여 9-9.5로 조절한다. 용액에 물(25 vol)을 첨가하여, 85/15 물/ACN으로 희석시킨다. 생성된 탁한 용액을 샘플링하여, wt/wt HPLC 분석하고, 정제 기구로 옮긴다.
note:
방법 TM2-0003-01.
방법 TM2-0006-01.
11.11. HAA(1-36)-OH의 정제
정제, 냉동건조 및 포장은 3단계로 분류하였다:
%wt/wt = 100 - 불순물% - 아세테이트% - 물% - TFA%. 배취에서 아세테이트 함량은 6-8%이다.
총 2.08㎏ T-20(net)을 6.97㎏ AcAA1-36NH2로부터 분리하였다. 이는 AcAA1-36NH2로부터 49.3%의 수득율을 나타낸다. 크로마토그래피 정제에서 얻은 평균 수득율은 55%이다. 개별 과정에서의 수득율은 41-55%로 다양하다. 최소 수득율은 컬럼 또는 여러 회 통과하게 되는 펌프의 실패로 인한 것이다. 일반적으로 크로마토그래피 작업을 할 경우에, 수득율은 50-55% 범위가 된다. 분리된 T-20의 순도는 93-95A%이다.
실시 시간을 최소화시키기 위한 목적으로 방법을 비교하기 위해 정제과정동 안에 4개 그라디언트를 검사하였다;
1. 330㎖/min에서, 15-22% ACN/60분, 22-36% ACN/525분
2. 330㎖/min에서, 16-26% ACN/60분, 24-40% ACN/525분
3. 330㎖/min에서, 제 2 Trimeris 그라디언트 15-36% ACN1788분
4. 330㎖/min에서, 고유 Trimeris 그라디언트 20-23% ACN/112분, 23-36% ACN/488분
20(㎝) 컬럼에 Amberchrom 수지로 축으로 압착시킨다(35㎝ 높이). 500-700g AcAA1-36NH2 배취는 용액에서 보호기를 제거시키고, 데카르복실화 반응을 시킨다. 이 규모는 약 400gram 펩티드(대략 75A% T-20)를 포함할 수 있는 컬럼 공급 용액을 만들 수 있는 것이다. 원액은 일반적으로 탁하고, 현탁된 고체를 포함할 수도 있다. 탁한 용액을 15% B를 이용하여 분당 500㎖ 속도로 컬럼에 로딩한다. 과정중 어느 경우에도 컬럼에 로딩하는 동안 압력은 형성되지 않는다. 유속을 330㎖/min으로 감소시키고, 지정한 시간대에 특정한 그라디언트를 실시한다. 분취물을 수득하고, 78% T-20이상을 포함하는 분취물을 모은 다음(100-110ℓ), 물로 희석시켜, 아세토니트릴 함량이 대략 15-20%(약 140ℓ)가 되도록 한다. 컬럼을 씻은 후에, 15% B로 평형을 이루게 한다. T-20을 포함하는 용액을 8 인치 컬럼에 분당 900㎖ 유속으로 다시 로딩한다. %B가 50%로 증가되고, T-20은 컬럼으로부터 약 25ℓ흘러나온다.
용액은 종 모양의 유리 그릇에서 냉동시키고, 동결건조시켜 분말로 만든다. 분리된 T20은 일반적으로 HPLC를 실시하면, 순도가 92-94A%이고, 6-8% 아세테이트 및 3-4% 물을 함유한다.
바람직한 방법
T-20 85/15 물/아세토니트릴(27ℓ), pH 9.2 용액을 8인치 HPLC 컬럼에 분당 500㎖ 속도로 펌프한다. 유속을 30분이상 330㎖/min으로 줄인다(매 5분마다 30-40㎖/min으로 증가). 600분간 20%B에서 36%B로 선형 그라디언트가 진행되었다. 흡수도가 0.2 AUFS이하로 떨어질 때까지 분취물을 수득한다. HPLC를 이용하여 함량에 대해 분취물을 분석하였다(note 1). 컬럼은 10분간 분당 900㎖ 속도로 80%B로 씻어낸 다음, 15%B로 되돌리고, 900㎖/min에서 평형을 이루게 한다. 78A% T-20이상을 포함하는 분취물을 모으고(113ℓ), 완충액(28.2ℓ)으로 희석하여 아세토니트릴 함량이 15-20%이 되도록 한다. 컬럼상에 용액을 900㎖/min 속도로 펌프한다. %B가 50%로 증가되고, T-20은 컬럼으로부터 900㎖/min 속도로 약 25ℓ정도 흘러나온다. T-20의 농도는 약 9-10㎎/㎖이다. 용액을 1ℓ동결건조 그릇으로 옮겨, 냉동, 건조시켜 216.29g T-20(수득율 54.9%, 순도 94.1A%)을 얻는다.
note:
1. 함량 및 순도에 대해 HPLC를 이용하여 분취물을 분석하였다.
YMC ODS-A, 150 ×4.6 ㎜, 5 ㎛, 120A
1㎖/min, 220nm, 30 ℃
A 70/30 50mM NH4OAc @ pH 7(NH4OH을 이용하여 조절) : ACN
B 5:95 50mM NH4OAc @ pH 7(NH4OH을 이용하여 조절) : ACN
0-15%B/50 min., 15-1000%B/2 min. 100%B/3 min.
T-20 보유 시간; 29.0분
11.12. 펩티드의 열 안정성
일련의 실험을 실시하여, 중간 생성물 T-20 단편의 열 안정성의 특징을 조사하였다. T-20 단편을 물로 포화시키고, 여과시키고, 봉해진 용기에 넣고, 온도를 올렸다. 몇 시간후에, 샘플을 얻고, HPLC 방법을 이용하여, 순도의 변화가 있는 지를 분석하였다. 건조된 T-20 단편의 안정성에 대해 열무게 분석(TGA)을 통하여 특징을 조사하였다.
AcAA1-16OH를 제외한 모든 단편은 3일간 40℃로 건조시킨다. 80℃ 24시간후 두 개 단편, 즉, FmocAA27-35OH(3%), FmocAA27-36NH2(1.4%)에서, 얼마간의 분해가 있었다. 초기 단편 AcAA1-16OH의 순도는 97A%이다. 40℃에서 3일 후에, 순도는 93.4A%이고, 건조상태이다. 80℃에서 추가 24시간후에도 순도는 93.9A%로 유지되었다. 축축한 AcAA1-16OH는 실온에서 건조시켜야 한다.
안정성 연구의 요점은 단편을 실온보다는 40℃에서 건조시켜야 할지를 결정하기는 것이다. 연구에 따르면, 단편은 40℃에서 건조시킬 경우에도 안정적인 것으로 나타났다. 이로써, 건조 시간을 상당히 줄일 수 있게 되었다.
분리 및 정제 과정과 유사한 온도 및 다양한 용매하에서, Ac(1-16)-OH, Fmoc(27-35)-OH, Fmoc(17-26)-OH, Fmoc(27-36)-NH2, Fmoc(17-36)-NH2, H(17-36)- NH2, Ac(1-36)-NH2 단편들의 안정성을 검사하도록 고안된 연구가 완료되었다. 모든 단편은 안정하고, 분리 및 정제된 용매계에서의 안정성은 X로 나타내었다.
Figure 112000019955474-pct00007
X = HPLC 함량과 불순물, 시각검사
본 발명은 여기에서 설명하는 특정 구체예 범위로 한정시키지 않으며, 이는 본 발명의 개별적인 특징을 단지 설명하기 위함이고, 이의 기능상의 등가인 방법 및 성분도 본 발명의 범위에 속한다. 여기에서 설명하는 것에 추가하여 본 발명을 다양하게 변형시킨 것도 전술한 명세서 및 수반한 도면 범위에 속하고, 이는 본 발명의 범위에 속한다는 것을 당업자가 인지할 것이다.



SEQUENCE LISTING <110> Trimeris, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PEPTIDE SYNTHESIS <130> P006860 <150> PCT/US99/06230 <154> 1999-03-22 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T-20 (DP 178) peptide <400> 1 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Intermediate peptide fragment <400> 2 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 3 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 4 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 5 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 6 Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 7 Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 8 Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser 1 5 10 15 Leu Trp Asn Trp 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 9 Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser 1 5 10 15 Leu Trp Asn Trp Phe 20 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 10 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 11 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 12 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Asn Trp Phe 20 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 13 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 14 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Phe <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 15 Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 16 Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 17 Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 18 Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Intermediate peptide fragment <400> 19 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 1 5 10 15 Trp Asn Trp

Claims (29)

  1. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-EKNEQELLEL-NH2(서열 :11)를 가지는 측쇄가 보호된 펩티드와 Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(서열 :18)를 가지는 측쇄가 보호된 펩티드를 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 만들고;
    (b) (a)에서 만든 펩티드의 아미노 말단에 보호기를 제거하고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열;4)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (d) (c)에서 얻은 펩티드의 아미노 말단을 변형시켜, 아세틸 변형시키고;
    (e) (d)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  2. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-EKNEQELLEL-NH2(서열 :11)를 가지는 측쇄가 보호된 펩티드와 Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(서열 :18)를 가지는 측쇄가 보호된 펩티드를 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 만들고;
    (b) (a)에서 만든 펩티드의 아미노 말단에 보호기를 제거하고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드와 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열;4)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (d) (c)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  3. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열;4)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (d) (c)에서 얻은 펩티드의 아미노 말단을 아세틸 변형시키고; 그리고
    (e) (c)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  4. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 얻은 펩티드와 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열;4)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (c) (b)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-DKWASLWNW-COOH(서열:17)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 HPheNH2와 반응시켜, Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(서열:18)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (b) (a)에서 수득한 펩티드의 아미노 말단에 보호기를 제거하고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(서열:11)의 측쇄 보호된 펩티드를 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH(서열:15)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 HPheNH2와 반응시켜, Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH2(서열:16)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (b) (a)에서 수득한 펩티드의 아미노 말단에 보호기를 제거하고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-EKNEQEL-COOH(서열:10)의 측쇄 보호된 펩티드를 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  7. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-DKWASLWNWF-NH2(서열:18)로 된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-EKNEQELLEL-COOH(서열:11)의 측쇄 보호된 펩티드를 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  8. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH(서열:19)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 HPheNH2와 반응시켜, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-IEESQNQQ-COOH(서열:7)로 된 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 생성된 측쇄가 보호된 펩티드는 Fmoc-YTSLIHSL-COOH(서열:2)로 된 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 만드는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  10. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-IEESQNQ-COOH(서열:6)의 측쇄가 보호된 펩티드를 HGlnOPNB와 반응시켜, Fmoc-IEESQNQQ-OPNB(서열 7)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (b) (a)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단에 보호기를 제거하고;
    (c) (b)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드를 Ac-YTSLIHSL-COOH(서열:2)로 된 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (d) (c)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 카르복시 말단에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는
    (a) Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(서열:3)의 측쇄가 보호된 펩티드를 HGlnOPNB 와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-OPNB(서열 4)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (c) (a)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 카르복시 말단의 보호기를 제거하여, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  12. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:9)로 된 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH(서열;3)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드의 아미노 말단을 변형시켜, 아세틸 변형시키고;
    (d) (c)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:9)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH2(서열:8)로 된 측쇄가 보호된 펩티드와 HPheNH2와 반응시켜, Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:9)를 얻는 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  14. Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 가지는 펩티드를 합성하는 방법에 있어서,
    (a) Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:14)로 된 측쇄가 보호된 펩티드의 아미노 말단의 보호기를 제거하고;
    (b) (a)에서 얻은 펩티드와 Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH(서열;5)의 측쇄가 보호된 펩티드와 반응시켜, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)의 측쇄가 보호된 펩티드를 얻고;
    (c) (b)에서 얻은 펩티드의 아미노 말단을 변형시켜, 아세틸 변형시키고;
    (d) (c)에서 얻은 측쇄가 보호된 펩티드의 측쇄에 보호기를 제거하여, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)를 얻는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 합성 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:14)로 된 측쇄가 보 호된 펩티드는
    Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-COOH(서열:13)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 HPheNH2와 반응시켜, Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:14)로 된 측쇄가 보호된 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  16. 제 1, 2, 3, 4, 12 또는 14항에 있어서, Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열 :1)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 또는 2항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 5 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 6 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 7 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 8 항에 있어서, Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:12)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 9 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 10 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 11 항에 있어서, Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH(서열:4)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 11 항에 있어서, Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:9)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 11 항에 있어서, Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH2(서열:14)로 된 측쇄가 보호된 펩티드는 약 1㎏ 이상의 양으로 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 다음의 군에서 선택된 구성원으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드 세트.
    (a)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열:12);
    (b)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNWF(서열:18);
    (c)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNW(서열:17);
    (d)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQ(서열:6),
    EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열:12);
    (e)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQ(서열:6),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNWF(서열:18);
    (f)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQ(서열:6),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNW(서열:17);
    (g)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQELLELDKWASLWNWF(서열:12);
    (h)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNWF(서열:18);
    (i)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQELLEL(서열:11),
    DKWASLWNW(서열:17);
    (j)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNWF(서열:16);
    (k)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNW(서열:15);
    (l)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQ(서열:6),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNWF(서열:16);
    (m)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQ(서열:6),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNW(서열:15);
    (n)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNWF(서열:16);
    (o)YTSLIHSL(서열:2),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQEL(서열:10),
    LELDKWASLWNW(서열:15);
    (p)YTSLIHSLIEESQNQ(서열:3),
    QEKNEQELLELDKWASLWNW(서열:8);
    (p)YTSLIHSLIEESQNQ(서열:3),
    QEKNEQELLELDKWASLWNWF(서열:9);
    (r)YTSLIHSLIEESQNQQEK(서열:5),
    NEQELLELDKWASLWNWF(서열:14);
    (s)YTSLIHSLIEESQNQQEK(서열:5),
    NEQELLELDKWASLWNW(서열:13);
    (t)YTSLIHSLIEESQNQQ(서열:4),
    EKNEQELLELDKWASLWNW(서열:19)
  28. IEESQNQ(서열:6),
    IEESQNQQ(서열:7),
    EKNEQEL(서열:10),
    EKNEQELLEL(서열:11)에서 선택된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  29. Figure 112006024617965-pct00013
    Figure 112006024617965-pct00014
    에서 선택된 것을 특징으로 하는 보호된 펩티드.
KR1020007010534A 1998-03-23 1999-03-22 펩티드 합성 방법 및 그 조성물 KR100633214B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/045,920 1998-03-23
US9/045,920 1998-03-23
US09/045,920 US6281331B1 (en) 1998-03-23 1998-03-23 Methods and compositions for peptide synthesis
US09/071,877 US6015881A (en) 1998-03-23 1998-05-01 Methods and compositions for peptide synthesis
US9/071,877 1998-05-01
US09/071,877 1998-05-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010042131A KR20010042131A (ko) 2001-05-25
KR100633214B1 true KR100633214B1 (ko) 2006-10-11

Family

ID=21940553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007010534A KR100633214B1 (ko) 1998-03-23 1999-03-22 펩티드 합성 방법 및 그 조성물

Country Status (4)

Country Link
US (2) US6281331B1 (ko)
JP (1) JP4755713B2 (ko)
KR (1) KR100633214B1 (ko)
BR (1) BRPI9909018B8 (ko)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001059457A2 (en) 2000-02-10 2001-08-16 Panacos Pharmaceuticals, Inc. Assay for detection of viral fusion inhibitors
US20050065319A1 (en) * 2000-12-19 2005-03-24 Baroudy Bahige M. Combination method for treating viral infections
US7906102B2 (en) 2001-10-03 2011-03-15 Vanderbilt University Ligands to radiation-induced molecules
KR20040058229A (ko) 2001-10-22 2004-07-03 더 스크립스 리서치 인스티튜트 항체 표적화 화합물
KR100451432B1 (ko) * 2002-07-12 2004-10-06 강충경 Ｔ-20 펩타이드의 생물학적 제조방법
CN100357317C (zh) * 2002-07-24 2007-12-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 聚乙二醇化的t20多肽
AU2003250079B2 (en) * 2002-07-24 2006-07-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated T1249 polypeptide
US20040209999A1 (en) * 2002-08-16 2004-10-21 Bohling James Charles Method of manufacturing polypeptides, including T-20 and T-1249, at commercial scale, and polypeptide compositions related thereto
CN1327897C (zh) * 2002-09-24 2007-07-25 重庆前沿生物技术有限公司 Hiv感染的肽衍生物融合抑制剂
US20040076637A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-22 Delmedico Mary Kay HIV-derived HR1 peptides modified to form stable trimers, and their use in therapy to inhibit transmission of human immunodeficiency virus
US7556813B2 (en) * 2002-09-27 2009-07-07 Trimeris, Inc. Antiviral peptide-polymer conjugate comprising a polymer covalently attached to two or more synthetic HIV gp41 HR1 and/or HR2 peptides
US20040063856A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Bohling James Charles Resin for solid phase synthesis
US20040132011A1 (en) * 2002-10-16 2004-07-08 Panacos Pharmaceuticals, Inc. Method for detecting viral inactivating agents
US20040158037A1 (en) * 2003-02-12 2004-08-12 Bohling James Charles Amino acid loaded trityl alcohol resins, method of production of amino acid loaded trityl alcohol resins and biologically active substances and therapeutics produced therewith
AU2004200485A1 (en) * 2003-02-25 2004-09-09 Rohm And Haas Company Method of manufacturing T-20 and T-1249 peptides at commercial scale, and T-20 and T-1249 compositions related thereto
ATE497783T1 (de) 2003-05-06 2011-02-15 Syntonix Pharmaceuticals Inc Gerinnungsfaktor vii-fc chimäre proteine zur behandlung von hämostatischen krankheiten
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CA2522690A1 (en) * 2003-05-06 2004-11-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of drug binding to serum albumin
US20050281829A1 (en) * 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
KR20050024730A (ko) * 2003-09-01 2005-03-11 코바이오텍 (주) Ｔ―２０ 펩타이드 코딩 유전자를 포함하는 재조합대장균의 고농도 세포 배양 방법 및 이로부터 생산된ｔ―２０ 펩타이드의 분리 및 정제 방법
WO2005063799A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Peptide synthesis and deprotection with co-solvent
ES2295961T3 (es) * 2003-12-31 2008-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Proceso para la sintesis peptidica utilizacndo una cantidad reducida de agente de desproteccion.
WO2005063800A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Peptide synthesis using decanting filter
ATE410437T1 (de) * 2003-12-31 2008-10-15 Hoffmann La Roche Verfahren und systeme zur rückgewinnung von peptiden
EP1701970A2 (en) * 2003-12-31 2006-09-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods for recovering cleaved peptide from a support
RU2006128593A (ru) * 2004-01-07 2008-02-20 Тримерис, Инк. (Us) Синтетические пептиды, производные области hr2 белка gp41 вич, и их применение в терапии для ингибирования проникновения вируса иммунодефицита человека
US20050249667A1 (en) * 2004-03-24 2005-11-10 Tuszynski Jack A Process for treating a biological organism
WO2006007368A2 (en) 2004-06-16 2006-01-19 Affinergy, Inc. Biofunctional coatings
ATE480561T1 (de) 2004-10-19 2010-09-15 Lonza Ag Verfahren zur festphasen-peptidsynthese
EP1856142B1 (en) * 2004-12-30 2009-08-12 F. Hoffmann-Roche AG Synthesis of peptide t-1249 using peptide intermediate fragments
WO2006069697A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Colorimetrically assessing peptide characteristics
ES2332418T3 (es) * 2004-12-30 2010-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Sintesis del peptido t-20 empleando fragmentos intermedios del peptido.
CN101133078B (zh) * 2004-12-30 2011-07-27 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 使用肽中间片段合成肽t-20
WO2006069779A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Preparing of peptides with excellent solubility
ATE448240T1 (de) * 2005-04-08 2009-11-15 Lonza Ag Peptidsynthese von alpha-helices auf peg-harz
EP1945262A2 (en) * 2005-10-20 2008-07-23 The Scripps Research Institute Fc labeling for immunostaining and immunotargeting
EP1968995A1 (en) * 2005-12-30 2008-09-17 F. Hoffmann-la Roche AG Methods for the synthesis of arginine-containing peptides
NZ570300A (en) * 2006-02-02 2011-08-26 Trimeris Inc HIV fusion inhibitor peptides with improved biological properties
TW200745163A (en) * 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
WO2007130275A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Mallinckrodt Inc. Composition and method for the release of protected peptides from a resin
AU2007263043B2 (en) * 2006-06-23 2012-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Insulinotropic peptide synthesis
EP2139526A4 (en) * 2007-04-03 2010-07-14 Trimeris Inc NEW FORMULATIONS TO RELEASE ANTIVIRAL PEPTIDE THERAPEUTICS
JP2010531828A (ja) * 2007-06-29 2010-09-30 ロンザ アーゲー プラムリンチドの製造方法
WO2009014177A1 (ja) * 2007-07-25 2009-01-29 Ajinomoto Co., Inc. ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法
EA201070231A1 (ru) * 2007-08-09 2010-10-29 Синтоникс Фармасьютикалз, Инк. Иммуномодулирующие пептиды
KR20100080812A (ko) * 2007-09-25 2010-07-12 트라이머리스, 인코퍼레이티드 치료용 항-ｈｉｖ 펩티드의 합성 방법
DK2205624T3 (da) * 2007-10-27 2017-01-02 Corden Pharma Colorado Inc Insulinotropisk peptidsyntese under anvendelse af faststof- og opløsningsfasekombinationsteknikker
US20110014218A1 (en) * 2008-01-25 2011-01-20 University Of North Carolina At Chapel Hill Ixodes scapularis salivary proteins and methods of use for modulation of the alternative complement pathway
WO2010014909A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US8518927B2 (en) 2009-02-10 2013-08-27 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
WO2011031662A1 (en) 2009-09-08 2011-03-17 Kent Stephen B H Ester insulin
PL219569B1 (pl) 2010-02-19 2015-05-29 Peptaderm Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Cykliczne tetrapeptydy i ich zastosowanie
NZ605400A (en) 2010-07-09 2015-05-29 Biogen Idec Hemophilia Inc Chimeric clotting factors
EP2590997B1 (en) 2010-07-09 2018-04-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized insulinotropic peptides and methods of use
SG11201505926VA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EP3172222A4 (en) 2014-07-24 2018-03-21 Washington University Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof
US20180154007A1 (en) 2015-05-20 2018-06-07 Syracuse University Glycemic Control Using Intrinsic Factor Bound to A Vitamin B12 Conjugate of a Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonist
US10716827B2 (en) 2015-05-20 2020-07-21 Syracuse University Compositions and methods for enhancing peptide stability against protease digestion
KR102550717B1 (ko) * 2017-03-31 2023-06-30 하마리야꾸힝고오교가부시끼가이샤 펩타이드의 제조방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028920A1 (en) * 1993-06-07 1994-12-22 Duke University Synthetic peptide inhibitors of hiv transmission

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987007616A1 (en) * 1986-06-12 1987-12-17 Biogen N.V. Peptides involved in the pathogenesis of hiv infection
US4787222A (en) * 1986-11-24 1988-11-29 Novatek Medical Inc. Combination lock for blood identification system
US5444044A (en) * 1992-03-26 1995-08-22 New York Blood Center Synthetic polypeptides as inhibitors of HIV-1
ATE183515T1 (de) 1992-07-20 1999-09-15 Univ Duke Zusammensetzungen die die hiv replikation inhibieren
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
HUP9900961A3 (en) * 1996-02-09 2001-06-28 Hoffmann La Roche Synthesis of vip analog
JP4602547B2 (ja) * 1998-03-23 2010-12-22 トリメリス，インコーポレーテッド ペプチド合成のための方法および組成物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028920A1 (en) * 1993-06-07 1994-12-22 Duke University Synthetic peptide inhibitors of hiv transmission

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI9909018B1 (pt) 2019-04-09
US6015881A (en) 2000-01-18
US6281331B1 (en) 2001-08-28
JP4755713B2 (ja) 2011-08-24
KR20010042131A (ko) 2001-05-25
BRPI9909018B8 (pt) 2021-05-25
JP2010065044A (ja) 2010-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100633214B1 (ko) 펩티드 합성 방법 및 그 조성물
US11186608B2 (en) Solid phase synthesis of acylated peptides
JP4602547B2 (ja) ペプチド合成のための方法および組成物
EP1372686B1 (en) Methods and compositions for peptide synthesis
JP2019512273A (ja) グルカゴン様ペプチドを製造するための方法
EP1701969B1 (en) Process for peptide synthesis using a reduced amount of deprotection agent
CA2592438C (en) Synthesis of peptide t-20 using peptide intermediate fragments
CA2593864C (en) Synthesis using peptide intermediate fragments iii
MXPA00009211A (en) Methods and compositions for peptide synthesis
CN104045694A (zh) 一种制备艾卡拉肽的方法
WO2000055182A1 (fr) Methode de synthese d&#39;un peptide

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20110812

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee