KR100618746B1 - 피테이스를 함유하는 효소 배합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피테이스(phytase), 및 a) 크실리톨 또는 리비톨과 같은 C₅ 당류, b) 600 내지 4000 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, c) 말론산, 글루타르산 및 숙신산의 디소듐 염, d) 카복시메틸셀룰로스, 및 e) 소듐 알지네이트로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 안정화제를 함유하는 안정화된 효소 배합물에 관한 것이다.

또한, 피테이스는 a) 글루타르알데하이드와 화학 반응시키는 방법 또는 b) 피테이스 탄수화물 잔기를 소듐 퍼요오데이트로 산화시킨 후 아디프산 디하이드라자이드를 첨가하는 방법에 의해 화학적으로 가교결합되어 안정화될 수 있다.

Description

피테이스를 함유하는 효소 배합물{Phytase formulation}

도 1은 실시예 1에 기술한 바와 같은 표준 분석 조건하에서 측정된 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 피테이스(phytase), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus tereus) CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 피테이스 및 콘센서스(consensus) 피테이스의 활성에 대한 온도의 영향을 비교한 것이다.

도 2는 65℃에서 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 비활성에 대한 상이한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 영향을 도시한 것이다.

도 3a, 3b, 3c 및 3d는 아스퍼질러스 나이거 피테이스, 콘센서스 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스 및 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스의 열 안정성에 대한 상이한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 50% 용액의 영향을 도시한 것이다. 비활성은 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스 및 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스의 경우 60℃, 아스퍼질러스 나이거 피테이스의 경우 65℃, 및 콘센서스 피테이스의 경우 75℃에서 측정하였다.

도 4는 65℃에서 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 비활성에 대한 상이한 종류의 폴리올 25% 및 50% 용액의 영향을 도시한 것이다.

도 5a, 5b, 5c 및 5d는 첨가제로서 50% 크실리톨의 존재하에 아스퍼질러스 나이거 피테이스(도 5a), 콘센서스 피테이스(도 5b), 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스(도 5c) 및 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스(도 5d)의 활성에 대한 온도의 영향을 도시한 것이다.

도 6은 25% 농도의 디소듐 말로네이트, 디소듐 숙시네이트 및 디소듐 글루타레이트의 존재하에 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 7은 5, 10 및 25%의 디소듐 말로네이트의 존재하에 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 8은 5, 10 및 25%의 소듐 아세테이트의 존재하에 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 9a, 9b, 9c, 9d 및 9e는 25%의 디소듐 말로네이트의 존재하에 아스퍼질러스 나이거 피테이스(도 9a), 콘센서스 피테이스(도 9b), 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스(도 9c), 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스(도 9d) 및 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스(도 9e)의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 10a, 10b, 10c, 10d 및 10e는 25%의 디소듐 숙시네이트의 존재하에 아스퍼질러스 나이거 피테이스(도 10a), 콘센서스 피테이스(도 10b), 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스(도 10c), 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스(도 10d) 및 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스(도 10e)의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 11a는 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 샘플을 상이한 농도의 소듐 퍼 요오데이트와 함께 항온반응시킨 후의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다.

도 11b는 도 11a에서 각각 상이하게 산화된 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 샘플을 아디프산 디하이드라자이드와 가교결합시킨 후의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다.

도 12는 퍼요오데이트/아디프산 디하이드라자이드와 가교결합되기 전후의 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 및 콘센서스 피테이스의 활성의 온도 의존성을 도시한 것이다.

도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f는 콘센서스 피테이스 서열을 도시한 것이다. 문자는 한문자 암호의 아미노산 잔기를 표현한다. 하기 서열을 사용하여 배열하였다: 아스퍼질러스 테레우스 9A-1의 phyA(미첼(Mitchell, D. B.) 등의 문헌[1997]; 아미노산(aa) 27로부터), 아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46의 phyA(반 룬(van Loon, A. P. G. M.) 등의 문헌[1998]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 나이거 변종 아와모리(Aspergillus niger var. awamori)의 phyA(피딩톤(Piddington, C. S.) 등의 문헌[1993]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 나이거 T213의 phyA(비스(Wyss, M.) 등의 문헌[1998]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 나이거 균주 NRRL3135의 phyA(반 하팅스벨트(van Hartingsveldt, W.) 등의 문헌[1993]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073의 phyA(파사몬테스(Pasamontes, L.) 등의 문헌[1993]; aa 25로부터), 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32722의 phyA(반 룬 등의 문헌[1998]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 58128의 phyA(반 룬 등의 문헌[1998]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 26906의 phyA(반 룬 등의 문헌[1998]; aa 27로부터), 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32239의 phyA(반 룬 등의 문헌[1998]; aa 30으로부터), 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans)의 phyA(파사몬테스 등의 문헌[1997a]; aa 25로부터), 탈라로마이세스 써모필러스(Talaromyces thermophilus)의 phyA(파사몬테스 등의 문헌[1997a]; aa 24로부터), 및 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila)의 phyA(미첼 등의 문헌[1997]; aa 19로부터). 배열은 파일업(PILEUP) 프로그램을 사용하여 계산하였다. 갭(gap)의 위치는 수동으로 다듬었다. 배열에서 각 위치의 대문자 표기된 아미노산 잔기는 콘센서스 잔기를 이루는 아미노산 군에 속한다. 최종적으로 구성된 콘센서스 피테이스(Fcp)의 아미노산 서열은 계산된 콘센서스 서열 아래에 굵은 활자로 도시된다. 계산된 콘센서스 서열의 갭은 하기 실시예 3에 언급된 이론에 따라 수동으로 채워넣었다.

도 14a, 14b 및 14c는 콘센서스 피테이스-1 유전자(fcp)의 DNA 서열(서열번호:1) 및 이 유전자를 구성하는데 사용된 프라이머의 DNA 서열을 도시한 것이다. 계산된 아미노산 서열(도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f)은 백트랜슬레이트(BACKTRANSLATE) 프로그램(드베류(Devereux, J.) 등의 문헌[1984] 참조) 및 높은 비율로 발현되는 효모 유전자의 코돈(codon) 사용빈도표(GCG 프로그램 팩키지(package), 9.0)를 사용하여 DNA 서열로 전환시켰다. 아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46 피테이스의 신호 펩타이드를 N-말단에 융합시켰다. 굵은 활자로 표시된 염기는 유전자를 제조하는데 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 각 올리고뉴클레오티드의 명칭은 서열의 위 또는 아래에 표기된다. 밑줄 친 염기는 fcp 유전자의 개시 코돈 및 종결 코돈을 나타낸다. 이탤릭체로 표기된 2군데의 염기는 도입된 EcoRI 부위를 나타낸다.

도 15a, 15b 및 15c는 5개의 담자균류 피테이스의 배열 및 콘센서스 서열(서열번호:3)을 도시한 것이다. 문자는 한문자 암호의 아미노산 잔기를 표현한다. 팍실러스 인볼루투스(Paxillus involutus)의 피테이스인 phyA1(aa 21, 국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호) 및 phyA2(aa 21, 국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호), 트라메테스 푸베센스(Trametes pubescens)의 피테이스(aa 24, 국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호), 아그로사이베 페디아데스(Agrocybe pediades)의 피테이스(aa 21, 국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호), 및 페니오포라 리시(Peniophora lycii)의 피테이스(aa 21, 국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호)의 아미노산 서열(괄호안에 언급된 아미노산 잔기로부터 출발함)을 "바시디오(Basidio)"라고 불리는 상응하는 콘센서스 서열을 배열하고 계산하는데 사용하였다(하기 실시예 4). 배열은 파일업 프로그램으로 수행하였다. 갭의 위치는 수동으로 다듬었다. 콘센서스 서열은 프리티(PRETTY) 프로그램으로 계산하였다. 콘센서스 서열을 계산하기 위해, 0.5의 선택 가중치를 2개의 팍실러스 인볼루투스 피테이스에 각각 할당하고, 모든 다른 유전자에는 1.0의 선택 가중치를 할당하였다. 바시디오 서열에서 프로그램이 콘센서스 잔기를 결정하지 못하는 위치는 줄표(-)로 나타낸다. 배열에서 각 위치의 대문자로 표기된 아미노산 잔기는 콘센서스 잔기를 이루는 아미노산 군에 속한다.

도 16a, 16b, 16c, 16d, 16e, 16f 및 16g는 콘센서스 피테이스-10의 아미노 산 서열을 도시한 것이다. 써모마이세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa)의 피테이스 서열(베르카(Berka, R. M.) 등의 문헌[1998] 참조) 및 5개의 담자균류 피테이스로부터의 콘센서스 서열을 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f의 배열에 추가하여, 개선된 콘센서스 서열을 프리티 프로그램으로 계산하였다. 또한, 아스퍼질러스 나이거 T213의 아미노산 서열을 삭제하고 대신 남은 아스퍼질러스 나이거 피테이스 서열에 0.5의 선택 가중치를 추가로 할당하였다. 추가의 정보는 실시예 14를 참조한다.

도 17a, 17b 및 17c는 콘센서스 피테이스-10의 DNA 및 아미노산 서열(서열번호:4 및 서열번호:5)을 도시한 것이다. 아미노산 서열은 한문자 암호를 사용하여 상응하는 DNA 서열의 위에 표기된다. 유전자를 조립하는데 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 굵은 활자로 나타낸다. 콘센서스 피테이스-1의 올리고뉴클레오티드 및 아미노산과 비교하여 바뀐 올리고뉴클레오티드 및 아미노산은 밑줄을 그어 나타내고, 이들의 상응하는 트리플렛(triplet) DNA는 작은 경우에 강조된다. fcp10 유전자는 하기 올리고뉴클레오티드로부터 조립되었다: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10, CP-5.10, CP-6, CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10, CP-11.10, CP-12.10, CP-13.10, CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10, CP-20.10, CP-21.10, CP-22.10. 새로 합성된 올리고뉴클레오티드에는 숫자 10을 추가하여 표시한다. 이 피테이스는 하기 32개의 아미노산 치환을 포함한다: Y54F, E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q, I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A, T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D, R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A, Q415E, A437G, A463E. 굵은 활자로 강조된 돌연변이는 콘센서스 피테이스-1에서 단일 돌연변이로 시험된 것과 같은 안정화 효과를 콘센서스 피테이스-1에 대해 나타내었다.

도 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f 및 18g는 콘센서스 피테이스-11을 설계하기 위한 배열(서열번호:6)을 도시한 것이다. 콘센서스 피테이스-10을 설계할 때와는 반대로, 콘센서스 피테이스-11의 아미노산 서열을 설계하기 위해서 모든 담자균류의 피테이스를 각 담자균류의 서열에 대해 0.2의 선택 가중치를 할당하여 각각 독립 서열로 사용하였다. 또한 아스퍼질러스 나이거 T213의 아미노산 서열도 이 배열에 사용하였다.

도 19a, 19b 및 19c는 콘센서스 피테이스-1-써모(thermo)[8]-Q50T-K91A의 DNA 및 아미노산 서열(서열번호:7 및 서열번호:8)을 도시한 것이다. 아미노산 서열은 한문자 암호를 사용하여 상응하는 DNA 서열 위에 표기된다. 대체된 아미노산 잔기는 밑줄을 그어 나타낸다. 유전자의 종결 코돈은 별표(^*)로 표시된다.

도 20a, 20b 및 20c는 콘센서스 피테이스-10-써모[3]-Q50T-K91A의 DNA 및 아미노산 서열(서열번호:9 및 서열번호:10)을 도시한 것이다. 아미노산 서열은 한문자 암호를 사용하여 상응하는 DNA 서열 위에 표기된다. 대체된 아미노산 잔기는 밑줄을 그어 나타낸다. 유전자의 종결 코돈은 별표(^*)로 표시된다.

도 21a, 21b 및 21c는 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 피테이스 a-돌연변이주의 DNA 및 아미노산 서열(서열번호:11 및 서열번호:12)을 도시한 것이다. 아미노산 서열은 한문자 암호를 사용하여 상응하는 DNA 서열 위에 표기된다. 대체된 아미노산 잔기는 밑줄을 그어 나타낸다. 유전자의 종결 코돈은 별표(^*)로 표시된다.

도 22a, 22b, 22c, 22d 및 22e는 콘센서스 피테이스-7의 DNA 및 아미노산 서열(서열번호:13 및 서열번호:14)을 도시한 것이다. 아미노산은 한문자 암호를 사용하여 상응하는 DNA 서열 위에 표기된다. 유전자를 조립하는데 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 굵은 활자로 나타낸다. 치환된 올리고뉴클레오티드 및 아미노산은 밑줄을 그어 나타내고, 그의 상응하는 트리플렛 DNA는 작은 경우에 강조된다. fcp7 유전자는 하기 올리고뉴클레오티드로부터 조립되었다: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7, CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7, CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7, CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21, CP-22. 새로 합성된 올리고뉴클레오티드에는 숫자 7을 추가하여 표시한다. 피테이스는 원 콘센서스 피테이스와 비교하여 하기 24개의 아미노산 치환을 포함한다: S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A, G205S, H212P, G224A, D226T, E255T, D256E, V258T, P265S, P292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A 및 A405S.

도 23a 및 23b는 콘센서스 피테이스-1 및 콘센서스 피테이스-10의 시차주사 열량계(DSC) 분석 결과를 도시한 것이다. 단백질 샘플을 약 50 내지 60㎎/㎖로 농축하고 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내에서 대량으로 투석하였다. 10℃/분의 일 정한 가열 속도를 적용하여 온도를 95℃까지 올렸다. 콘센서스 피테이스-10의 DSC 분석 결과 85.4℃의 융점을 수득하였고(도 23a의 그래프), 이것은 콘센서스 피테이스-1의 융점(78.1℃, 도 23b의 그래프)보다 7.3℃ 더 높은 값이다.

도 24a 및 24b는 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T 및 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A의 시차주사 열량계(DSC) 분석 결과를 도시한 것이다. 단백질 샘플을 약 50 내지 60㎎/㎖로 농축하고 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내에서 대량으로 투석하였다. 10℃/분의 일정한 가열 속도를 적용하여 온도를 95℃까지 올렸다. 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T의 DSC 분석 결과 88.6℃의 융점을 수득한 반면(도 24a의 그래프), 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A의 융점은 89.3℃(도 24b의 그래프)로 밝혀졌다.

도 25는 콘센서스 피테이스-1, 콘센서스 피테이스-10 및 콘센서스-10-써모-Q50T 사이의 최적 온도를 비교한 것이다. 최적 온도를 결정하기 위해, 피테이스 표준 분석법을 37 내지 86℃의 일련의 온도에서 수행하였다. 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 희석된 상청액을 사용하여 최적 온도를 결정하였다. 상청액의 다른 성분은 최적 온도를 결정하는데 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다: △, 콘센서스 피테이스-1; ◇-콘센서스 피테이스-10; ■, 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T.

도 26a 및 26b는 콘센서스 피테이스-10, 그의 변형체인 써모-Q50T 및 써모-Q50T-K91A의 pH-의존성 활성 프로파일(profile) 및 기질 특이성을 도시한 그래프이다. 피테이스 활성은 상이한 pH의 적절한 완충액(하기 실시예 11 참조)에서 표준 분석법을 사용하여 결정하였다. 도 26a의 그래프는 콘센서스 피테이스-10(□), 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T(●), 및 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A(△)의 pH-의존성 활성 프로파일을 도시한 것이다. 도 26b의 그래프는 표준 분석법에서 피테이트를 지시된 화합물로 대체시켜 시험하였을 때의 상응하는 기질 특이성을 도시한 것이다: 흰색 막대, 콘센서스 피테이스-10; 회색 막대, 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T; 흑색 막대, 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A. 숫자는 하기 화합물에 대응된다: 1, 피테이트; 2, p-니트로페닐 포스페이트; 3, 페닐 포스페이트; 4, 프럭토스-1,6-비스포스페이트; 5, 프럭토스-6-포스페이트; 6, 글루코스-6-포스페이트; 7, 리보스-5-포스페이트; 8, DL-글리세롤-3-포스페이트; 9, 글리세롤-2-포스페이트; 10, 3-포스포글리세레이트; 11, 포스포에놀피루베이트; 12, AMP; 13, ADP; 14, ATP.

도 27a 및 27b는 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T 및 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T-K91A의 pH-의존성 활성 프로파일 및 기질 특이성을 도시한 그래프이다. 피테이스 활성은 상이한 pH의 적절한 완충액(하기 실시예 11 참조)에서 표준 분석법을 사용하여 결정하였다. 도 27a의 그래프는 Q50T-변종(■) 및 Q50T-K91A-변종(●)의 pH-의존성 활성 프로파일을 도시한 것이다. 도 27b의 그래프는 표준 분석법에서 피테이트를 지시된 화합물로 대체시켜 시험하였을 때의 상응하는 기질 특이성을 도시한 것이다: 흰색 막대, 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T; 흑색 막대, 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T-K91A. 기질은 도 26a 및 26b에 설명한 바와 같다.

도 28a 및 28b는 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T 및 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T-K91A의 시차주사 열량계(DSC) 분석 결과를 도시한 그래프이다. 단백질 샘플을 약 50 내지 60㎎/㎖로 농축하고 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내에서 대량으로 투석하였다. 10℃/분의 일정한 가열 속도를 적용하여 온도를 95℃까지 올렸다. 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T의 DSC 분석 결과 84.7℃의 융점을 수득한 반면(도 28a의 그래프), 콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T-K91A의 융점은 85.7℃(도 28b의 그래프)로 밝혀졌다.

도 29는 콘센서스 피테이스-1, 콘센서스 피테이스-1-써모[3] 및 콘센서스 피테이스-1-써모[8] 사이의 최적 온도를 비교한 것이다. 최적 온도를 결정하기 위해, 피테이스 표준 분석법을 37 내지 86℃의 일련의 온도에서 수행하였다. 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 상청액으로부터 정제된 단백질을 사용하여 최적 온도를 결정하였다: ○, 콘센서스 피테이스-1; □, 콘센서스 피테이스-1-써모[3]; ▲, 콘센서스 피테이스-1-써모[8].

도 30a 및 30b는 콘센서스 피테이스-1, 콘센서스 피테이스-7 및 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스의 pH-의존성 활성 프로파일 및 기질 특이성을 비교한 그래프이다. 피테이스 활성은 상이한 pH의 적절한 완충액(하기 실시예 11 참조)에서 표준 분석법을 사용하여 결정하였다. 도 30a의 그래프는 콘센서스 피테이스-1(■), 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135의 피테이스(○), 및 콘센서스 피테이스-7(▲)의 활성 프로파일에 대한 pH의 영향을 도시한 것이다. 도 30b의 그래프는 표준 분석법에서 피테이트를 지시된 화합물로 대체시켜 시험하였을 때의 상응하는 기질 특 이성을 도시한 것이다: 흑색 막대, 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스; 회색 막대, 콘센서스 피테이스-1; 줄친 막대, 콘센서스 피테이스-7. 기질은 도 26a 및 26b에 설명된 바와 같다.

도 31a 및 31b는 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073의 피테이스, 및 F55Y, V100I, F114Y, A243L, S265P, N294D의 아미노산 치환을 포함하는 그의 안정화된 α-돌연변이주 피테이스의 시차주사 열량계(DSC) 분석 결과를 도시한 그래프이다. 단백질 샘플을 약 50 내지 60㎎/㎖로 농축하고 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내에서 대량으로 투석하였다. 10℃/분의 일정한 가열 속도를 적용하여 온도를 95℃까지 올렸다. 아스퍼질러스 푸미가투스 13073 피테이스의 DSC 분석 결과 62.5℃의 융점을 수득한 반면(도 31a의 그래프), 그의 α-돌연변이주의 융점은 67.0℃(도 31b의 그래프)로 밝혀졌다.

도 32는 야생형 아스퍼질러스 푸미가투스 13073, 그의 아스퍼질러스 푸미가투스 α-돌연변이주, 및 추가의 안정화된 α-돌연변이주(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)의 최적 온도를 비교한 그래프이다. 최적 온도를 결정하기 위해, 피테이스 표준 분석법을 37 내지 75℃의 일련의 온도에서 수행하였다. 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 희석된 상청액을 사용하여 최적 온도를 결정하였다. 상청액의 다른 성분은 최적 온도를 결정하는데 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다: ○, 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073의 피테이스; ▲, 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 α-돌연변이주의 피테이스; □, 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 α-돌연변이주-(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T의 피테이스; ■, 아스 퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 α-돌연변이주-(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T-K68A의 피테이스. Q27T 및 K68A는 콘센서스 피테이스-1 Q50T 및 콘센서스 피테이스-1 K91A에 각각 상응한다.

도 33은 "바시디오" 콘센서스 서열로부터 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A로 전달된 다수의 활성 부위 잔기를 포함하는 콘센서스 피테이스 12(콘스피(consphy)12)의 아미노산 서열(서열번호:15)을 도시한 것이다.

본 발명은 안정화제를 첨가하거나 가교결합함으로써 안정성, 바람직하게는 열 안정성이 증가된, 액체 피테이스 배합물 및 무수 피테이스 배합물에 관한 것이다.

다량의 포스페이트가 피테이트 인의 형태로 사료에 존재하지만, 돼지 및 가금류와 같은 단일 위장을 갖는 동물은 이러한 형태의 포스페이트를 이용할 수 없다. 피트산의 알칼리 염 또는 알칼리 토류 염은 천연에서 주로 곡류에 존재한다. 단일 위장을 갖는 동물은 이러한 형태의 포스페이트를 이용할 수 없으므로, 포스페이트를 동물 사료에 첨가하는 것이 통상적으로 실시되어 왔다.

다른 한편으로, 피테이스라고 지칭되는 효소(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트 포스포하이드롤레이스)가 식물 및 일부 미생물에서 생산되는 것으로 알려져 있다. 피테이스는 발효에 의해서 생산될 수 있으므로, 피트산(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)으로부터 무기 포스페이트를 생성시켜 식물성 재료의 영양가를 증가시키기 위해 피테이스를 동물 사료 첨가제로 사용하는 것이 당해 분야에 알려져 있다. 단일 위장을 갖는 동물은 피테이트에서 피테이스에 의해 생성된 포스페이트를 이용할 수 있으므로, 동물 사료에 피테이스를 첨가하는 것에 의한 환경의 인 오염 정도를 감소시킬 수 있다.

사료에 적용하는데 있어서, 일시적인 고온(80℃ 이하 내지 120℃) 및 높은 전단력에 의해 단백질 구조가 영향을 받아 원치않는 활성의 손실이 초래될 수도 있는 배합물 처리 방법(예를 들어, 분무 건조 또는 과립화) 및 사료 처리 방법(예를 들어, 펠렛화(pelleting), 압출 또는 팽창) 중에 발생할 수 있는 문제점을 해결하기 위해, 안정한, 바람직하게는 열에 안정한 피테이스가 일반적으로 주목되고 있다.

지스트-브로캐이드즈(Gist-Brocades)의 국제 특허 공개공보 제 WO 93/16175 호에는 피테이스의 안정화된 액체 배합물이 기술되어 있다. 여기에는 안정화제로서 우레아 및 수용성 폴리올(폴리올 중에서 6000 Da의 분자량을 갖는 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜이 소개되어 있다)을 사용하는 것이 제시되어 있다.

본 발명의 목적은 다양한 조건하에서 활성을 유지하는 능력으로 정의되는 피테이스의 안정성, 특히 열 안정성을 향상시키는 것이다.

이러한 안정성 양태는 효소의 생산(발효, 다운스트림(downstream) 공정, 배합물의 열 처리 및 사료의 열 처리), 유통(수송 및 저장) 및 최종 적용으로 이루어진 피테이스의 전체 활성주기와 관련되어 있다. 피테이스와 같이 상업적 가치가 있는 효소는 펠렛화, 압출 및 팽창과 같은 다양한 사료 처리 과정중에 발생하는 고온(80℃ 이하 내지 120℃)에 견딜 수 있고, 장기간의 저장 안정성을 갖는 것이 중요하다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "안정성"이란 용어는, 활성, 특이성, 저장 안정성, 기계적 안정성, 미생물에 대한 안정성, 독성, 화학적 조성 및 물리적 변수(예를 들어, 밀도, 점도, 흡습성, 색채, 냄새 및 분진)와 같은 양태를 포함하는 산업용 효소의 모든 사항에 관련된다. 본 발명의 바람직한 양태는 펠렛화, 압출 및 팽창과 같은 배합물 및 사료 처리 과정중의 열 불활성화에 대한 피테이스의 안정성에 관한 것이다.

피테이스를 다양한 분야에 사용하는데 있어서 주요한 문제점은 이 효소가 사료 처리 과정중의 불활성화를 견디어내는 열 안정성(80 내지 120℃)이 필요하다는 것이다. 현재 시판중인 산업용 피테이스는 모두 아스퍼질러스 나이거로부터 유래한 것으로 열 불활성화에 대한 고유 내성이 낮다. 분자 생물학적 접근 이외에 다른 접근으로서 본 발명은 상이한 첨가제를 첨가하여, 또 다른 양태에서는 효소 단량체를 화학적으로 가교결합시켜 올리고머(oligomer)를 형성함으로써 단백질의 안 정성, 바람직하게는 열 안정성을 향상시킨다.

본 발명에 따르는 실험은 또한 아스퍼질러스 피테이스에 비해 더 높은 고유 안정성을 갖는 이론적인 분자 생물학적 접근에 따라 개발된 피테이스인 이른바 콘센서스 피테이스로 수행하였다(유럽 특허 공개공보 제 897 985 호 참조). 본 발명의 실시에서는, 실시예 3 내지 실시예 13에서 구체적으로 기술된 콘센서스 피테이스가 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 효소의 안정성, 바람직하게는 열 안정성을 위한 안정화제로 작용하는 상이한 첨가제를 사용하는 것을 개시한다.

본 발명에 바람직하게 사용될 수 있는 비-배합된 피테이스의 비활성에 대한 온도의 영향에 대해서는, 최대 활성에 따라 3개의 상이한 군으로 나눌 수 있다. 최대 활성은 하기의 온도에서 나타난다: 아스퍼질러스 푸미가투스 및 아스퍼질러스 나이거의 피테이스 경우 55℃, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 및 아스퍼질러스 니둘란스의 피테이스 경우 45℃, 및 콘센서스 피테이스의 경우 65℃. 결정된 최대 활성을 나타내는 온도보다 10 내지 15℃가 더 높은 온도(이 온도에서, 비-배합된 피테이스는 완전히 불활성화된다)를 피테이스의 열 안정성에 대한 안정화제의 영향을 조사하기 위한 스크리닝(screening) 지점으로 선택하였다(즉, 아스퍼질러스 니둘란스 및 아스퍼질러스 테레우스 CBS의 피테이스의 경우 60℃, 아스퍼질러스 나이거 및 아스퍼질러스 푸미가투스의 피테이스의 경우 65℃, 및 콘센서스 피테이스의 경우 75℃).

본 발명은 피테이스, 및 a) 5개의 탄소 원자를 포함하는 폴리올, 바람직하게 는 C₅ 당류, 더욱 바람직하게는 크실리톨 또는 리비톨, b) 600 내지 4000 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜, c) 말론산, 글루타르산 및 숙신산의 디소듐 염, d) 카복시메틸셀룰로스, e) 소듐 알지네이트로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 안정화제를 포함하는 안정화된, 바람직하게는 열 안정화된 효소 배합물을 제공한다.

본 발명은 또한 a) 글루타르알데하이드와 화학 반응시키는 방법 또는 b) 소듐 퍼요오데이트로 산화시킨 후 아디프산 디하이드라자이드를 첨가하는 방법에 의해 가교결합된 피테이스를 포함하는 안정화된, 바람직하게는 열 안정화된 효소 배합물을 제공한다.

미생물과는 다른 출처로부터 수득된 기타 피테이스를 사용할 수도 있지만, 미생물에서 생산된 피테이스를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는, 바람직하게는 진균류, 더욱 바람직하게는 아스퍼질러스 푸미가투스, 아시퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 테레우스 및 아스퍼질러스 나이거로 구성된 군에서 선택된 진균류에서 생산된 피테이스가 사용된다. 본 발명에 바람직하게 사용되는 또 다른 피테이스는 소위 콘센서스 피테이스이다. 그러나, 진균류로부터 수득된 유전자를 세균(예를 들어, 이 콜라이(E. coli)), 효모 또는 또 다른 진균류와 같은 숙주 유기체에 옮기는 유전 공학적 방법에 의해 이러한 피테이스를 생산할 수 있고, 이에 대한 자세한 설명은 유럽 특허 공개공보 제 684 313 호 및 유럽 특허 공개공보 제 897 010 호를 참조한다.

효소 배합물이란 용어는 피테이스 효소를 상업화할 수 있는 모든 액체 및 무 수 배합물을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 배합물에서 피테이스의 출처는 발효액으로부터 수득되는 다소 정제되지 않은 액체 제조물이다. 액체 피테이스 배합물을 제조할 때, 선택한 안정화제를 첨가하거나 피테이스를 가교결합시킨다. 안정화된, 바람직하게는 열 안정화된 무수 배합물을 수득하기 위해서, 피테이스는 a) 선택한 안정화제의 존재하에 분무 건조 또는 과립화되거나, b) 화학적으로 가교결합된다.

바람직한 한 양태에서, 액체 효소 배합물은 안정화제로서 최종 배합물내 10 내지 50%(중량/중량)의 농도로 존재하는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

바람직한 효소 배합물은 1000 내지 3350 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 특히, 약 1450 Da의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 분자량 범위를 다소 벗어난 분자량(각각 600 Da 및 4000 Da)을 갖는 폴리에틸렌 글리콜도 어느 정도 효과를 나타냈지만 덜 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜의 안정화 효과는 분자량에 따라 다른 것으로 나타났다(도 2 및 도 3a, 3b, 3c 및 3d 참조).

본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 안정화제는 크실리톨 또는 리비톨이다. 이 둘은 모두 5개의 탄소 원자 구조를 갖는 당 알콜이다. 크실리톨 및 리비톨은 바람직하게는 최종 액체 배합물내 20 내지 60%(중량/중량)의 농도로 사용된다. 놀랍게도, 예를 들어 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 안정화제로서 첨가되는 크실리톨 및 리비톨은 65℃에서 측정된 비활성을 12.5%의 폴리올 농도에서 11 내지 12U/㎎으로, 및 25%의 폴리올 농도에서 51 내지 90U/㎎으로 증가시켰다(도 4 참조).

본 발명의 또 다른 양태에서 액체 효소 배합물은 안정화제로서 최종 배합물내 10 내지 30%(중량/중량) 범위의 농도로 존재하는, 글루타르산, 숙신산 또는 말론산의 디소듐 염을 포함한다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 25% 농도의 말로네이트, 숙시네이트 및 글루타레이트를 첨가하였을 때 말로네이트의 경우 70℃, 및 숙시네이트 및 글루타레이트의 경우 65℃에서 측정한 결과 상당한 활성의 증가와 함께 아스퍼질러스 푸미가투스의 효소 열 안정성이 크게 향상되었다.

그 이외에, 카복실레이트가 37℃에서 측정된 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 활성을 증가시켰는데, 말로네이트의 경우 피테이스 활성이 약 4배 증가하였고 숙시네이트의 경우 피테이스 활성이 2배 증가하였으나 글루타레이트의 경우는 미소하였다. 상이한 농도의 말로네이트(5, 10 및 25%)에 대한 연구는, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 열 안정성이 말로네이트의 농도에 따라 증가되는 반면, 효소 활성은 적어도 이 범위의 농도에서는 농도에 따라 증가되지 않음을 나타내었다(도 7 참조). 이러한 사실과는 대조적으로, 모노카복실산인 상이한 농도의 소듐 아세테이트(5, 10 및 25%)는 37℃에서 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 비활성을 2배 이하로 증가시켰지만, 효소 단백질의 열 안정성에는 단지 미소한 영향을 미쳤다(도 8 참조). 따라서, 카복실레이트 그룹은 활성을 조절하는 반면 이작용성 디카복실레이트는 아마도 이온 상호작용에 의해 피테이스를 안정화하는 것으로 결론지을 수 있다. 소듐 말로네이트 및 소듐 숙시네이트는 일반적으로 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피 테이스 및 콘센서스 피테이스의 열 안정성을 5 내지 15℃ 증가시켰다. 다른 한편으로 피테이스 활성의 증가는 다소 낮은 비활성을 갖는 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스 및 아스퍼질러스 푸미가투스의 피테이스에서만 나타났고, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피테이스 및 콘센서스 피테이스에서는 나타나지 않았다(도 9a, 9b, 9c, 9d 및 9e, 및 도 10a, 10b, 10c, 10d 및 10e 참조).

본 발명의 또 다른 양태에서, 효소 배합물은 안정화제로서 최종 배합물내 1 내지 20%(중량/중량), 바람직하게는 1 내지 10%(중량/중량)의 농도로 존재하는 카복시메틸셀룰로스 및/또는 소듐 알지네이트와 같은 중합체를 포함한다. 이러한 중합체를 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 제조물에 첨가하였을 때 피테이스의 열 안정성이 5 내지 10%로 크게 증가하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 효소 배합물은 안정화제로서 알지네이트, 바람직하게는 소듐 알지네이트, 가장 바람직하게는 최종 액체 배합물내 1 내지 10%(중량/중량)의 농도로 존재하는 알지네이트를 포함한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 효소 배합물은 가교결합된 피테이스를 포함한다. 이러한 안정화된 피테이스 형태의 제조물에서, 글루타르알데하이드는 효소 단백질을 올리고머화하는 농도로 피테이스에 첨가된다.

또 다른 양태에서, 효소 배합물은 탄수화물 쇄에 의해 가교결합된 피테이스를 포함한다. 가교결합 반응은 처음 단계로 탄수화물 잔기가 퍼요오데이트 산화된 후 생성된 알데하이드 그룹과 아디프산 디하이드라자이드가 반응하는 것을 포함한 다.

사용된 조건에 따라, 가교결합 반응은 다양한 효소 유도체, 즉 a) 아디프산 디하이드라자이드의 단지 1개의 하이드라자이드 그룹과 반응하는 변형된 효소 분자, b) 분자간 가교결합이 존재하거나 존재하지 않는 분자내 가교결합된 효소, 및 c) 분자간 가교결합된, 가용성 올리고머 또는 불용성 중합체를 생성할 수 있다.

대부분의 경우, 가교결합 반응은 몇 가지 형태의 혼합물을 생성한다. 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)에서 발현되는 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 및 콘센서스 피테이스는 가교결합시 올리고머 형태로 형성된다. 가교결합도는 효소의 산화되는 정도를 변화시킴으로써 효과적으로 조절할 수 있다. 5㎎/㎖의 피테이스 용액에 50mM 소듐 퍼요오데이트의 농도를 적용하였을 때, 피테이스의 최적의 열 안정성이 나타났다. 상기 피테이스 둘 모두에서 열 안정성이 10 내지 15℃ 증가하였다(도 12 참조). 산화된 피테이스는 아디프산 디하이드라자이드를 첨가하지 않아도 상당량의 이량체, 삼량체 및 사량체를 형성하였다(도 11a 참조).

본 발명의 또 다른 양태는 무수/고체 피테이스 배합물을 생산할 때 첨가제로서 상기 안정화제를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 1 내지 20%(중량/중량)의 크실리톨/리비톨, 1 내지 20%(중량/중량)의 폴리에틸렌 글리콜(바람직하게는 1000 내지 3350 Da의 분자량을 가짐), 1 내지 20%(중량/중량)의 디카복실레이트(예를 들어, 말로네이트, 숙시네이트 및 글루타레이트), 및/또는 1 내지 10%(중량/중량)의 중합체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 및/또는 알지네이트, 바람직하게는 소듐 알지네이트)의 안정화제는 100 내지 200㎖의 피테이스 액체(가교결합되거나 가교결합되지 않은)에 용해되어 첨가되거나, 고체 화합물로서 표준 과립 혼합물(결합제로서 리그닌설포나트, 담체로서 실리카 및 석고를 포함함)에 첨가된다. 이러한 배합물은 45℃에서 15분간 유동층 건조기에서 과립물을 건조하는 단계를 포함하는 고-전단력 과립화 방법 후 측정된 피테이스 활성을 크게 회복시킬 수 있다(20% 이하). 또한, 안정화제를 포함하는 이러한 과립물은 사료와 혼합되었을 때, 이러한 첨가제가 없는 과립물에 비해 사료 처리(예를 들어, 85℃에서의 펠렛화 공정) 후 효소 활성을 크게 회복시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 단일 위장을 갖는 동물을 위한 사료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 방법에 의해 사료는 첨부된 특허청구범위에서 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 열 안정화된 무수 또는 액체 효소 배합물로 보충된다. 피테이스가 보충된 사료는 압출, 팽창 및 펠렛화와 같은 몇 가지 사료 제조 방법에 적용될 수 있는데, 이 경우 일시적인 고온이 발생할 수 있어서 열 안정성이 요구된다.

본 발명의 안정화된 효소 배합물은, 예를 들어 사료 펠렛에 사용될 수 있다. 열 안정화된 액체 효소 배합물을 수도물로 희석하여 바람직한 피테이스 활성(100 내지 200 유니트(unit) 피테이스/g 용액)을 갖는 용액을 수득할 수 있다. 사료 펠렛을 기계적 혼합기에 옮기고 희석된 효소 배합물을 사료 펠렛상에 분무하면서 교반하여, 예를 들어 500 유니트 피테이스/㎏ 사료 펠렛의 피테이스 활성이 첨가된 균일한 생성물을 수득할 수 있다. 또는 무수 또는 액체 효소 배합물을 매쉬(mash) 사료와 직접 혼합한 후, 펠렛화, 압출 또는 팽창과 같은 방법을 이 혼합물에 적용할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 사료를 동물에게 먹여서 추가의 인을 사료에 첨가할 필요없이 단일 위장을 갖는 동물에게 섭취 요구량의 인을 제공할 수 있는 방법에 관한 것이다.

실시예 1

a) 재료

피트산(도데카소듐 염), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리올, 소듐 디카복실레이트, 소듐 퍼요오데이트, 아디프산 디하이드라자이드 및 기타 첨가제는 상업적인 공급업체로부터 구입하였다. 모든 다른 화학물질은 분석용 등급 이상을 사용하였다. 5㎖들이 하이트랩(HiTrap) 탈염 칼럼은 파마샤(Pharmacia)로부터 구입하였다. SDS-PAGE 겔(4 내지 12%의 NuPAGE Bis-Tris Pre-Cast) 및 완충액은 노벡스(NOVEX)로부터 구입하였다.

b) 피테이스의 발현 및 정제

아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스 및 콘센서스 피테이스를 한세눌라 폴리모파에서 대량 발현시켰다. 아스퍼질러스 나이거 피테이스 및 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스는 아스퍼질러스 나이거에서 대량 발현시켰다. 이들 피테이스의 클로닝(cloning), 정제 및 특징 분석은 파사몬테스 등의 문헌[Appl. Environ. Microbiol. 63, 1696-1700, 1997]에 전술된 바에 따랐다. 콘센서스 피테이스의 구성, 클로닝 및 정제는 유럽 특허 공개공보 제 897 985 호에 따라 수행하였다. 비-배합된 콘센서스 피테이스는 70℃ 이하의 증가된 열 안정성을 가졌고, 아미노산 치환에 의해(50번 위치에서 Q를 L로) 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스에 비해 3배 높은 활성을 가졌다.

c) 피테이스 활성 분석

열 안정성을 측정하기 위해, 정제된 효소를 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)(첨가제(%)(중량/중량)의 존재 또는 부재하에)내 0.05U/㎖(37℃에서 측정된 활성)로 희석시켜 상이한 온도에서 피트산으로 효소 활성을 측정하였다. 단백질 용액의 분취량(250㎕)을 목적하는 온도에서 5분간 초기 항온반응시킨 후, 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 1% 피트산을 함유하는 동일한 부피의 용액(동일한 온도에서 10분간 10㎖의 분취량으로서 초기 항온반응시킨 것)에 첨가하였다. 목적하는 온도(예를 들어, 첨가제의 영향을 스크리닝하기 위해 60 또는 65℃)에서 15분간 샘플을 항온반응시킨 후, 0.5㎖의 15% 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 유리된 무기 포스페이트를 표준 방법을 사용하여 측정하였다.

d) 열 안정화 첨가제의 평가

일반적으로 폴리올은 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 25 또는 50%(중량/중량)의 농도로 용해되어 있다. PEG는, 25%의 농도로 사용되는 4000, 8000 및 10000의 분자량을 갖는 PEG를 제외하고는, 50%의 농도로 용해되어 있다. PEG 및 다른 폴리올을 스크리닝하기 위해, 초기 항온반응 온도 및 반응 온도를 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스 및 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스의 경우 60℃, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 및 아스퍼질러스 나이거 피테이스의 경우 65℃, 및 콘센서스 피테이스의 경우 75℃로 선택하였다.

디소듐 말로네이트, 디소듐 숙시네이트 및 디소듐 글루타레이트는 5, 10 및 25%의 농도로 용해되었고, 피테이스 활성은 37, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 및 85℃의 온도에서 효소에 첨가제와 기질(상기 참조)을 초기 항온반응시킨 후 측정하였다. 동일한 방식으로, 25% 크실리톨 및 25% 리비톨의 존재하에 각각 다른 종의 피테이스 활성에 대한 온도의 영향을 시험하였다. 첨가제의 농도가 기질을 첨가한 후 반으로 감소되었음을 주지하여야 한다.

e) 탄수화물 쇄의 가교결합 반응

피테이스 탄수화물 쇄의 가교결합 반응은 세시(Cesi) 등의 문헌[Studies in Organic Chemistry 47: Stability and Stabilization of Enzymes, Proceedings of an International Symposium held in Maastricht, The Netherlands, 1992, Elsevier Science Publications B. V., Amsterdam, The Netherlands]에서 인버테이스에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. 피테이스 샘플(5㎎ 단백질/㎖)은 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 상이한 농도(0, 5, 10, 20, 30, 40 및 50mM)의 소듐 퍼요오데이트의 존재하에 30℃에서 2시간 동안 항온반응시키고 4℃에서 하룻밤 동안 놓아두었다. 각 샘플을 악타익스플로어(AktaExplorer) 시스템(파마샤 제품)에 연결된 5㎖들이 하이트랩 탈염 칼럼(파마샤 제품)상에서, 용리 완충액으로 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)를 사용하여 탈염시켰다. 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 용해된 100㎕의 0.5M 아디프산 디하이드라자이드를 900㎕의 탈염된 산화 생성물에 첨가하여 가교결합 반응을 수행하였다. 피테이스 활성 측정 및 이 샘플의 겔 전기영동은 모두 산화 단계 및 가교결합 단계 후에 수행하였다.

f) 열 안정화된 피테이스의 고-전단력 과립화

100 내지 250㎖의 피테이스 용액(총 2500 내지 5000 유니트의 가교결합되거나 가교결합되지 않은 피테이스)을 5 내지 10% 칼슘 리그노설포네이트(노르웨이 소재의 보레가드(Borregard)), 5 내지 20% 실리카(독일 소재의 데구사(Degussa), 시퍼나트(Sipernat) 50S), 0 내지 20%의 열 안정화제 및 석고의 무수 혼합물 1㎏에 첨가하였다. 고-전단력 과립화 반응 동안에, 바람직한 특성의 과립물이 형성될 때까지 물을 첨가하였다. 과립물을 유동층 건조기에서 45℃에서 15분간 건조시킨 후, 천연 야자 지방질(스위스 바젤 소재의 플로린(Florin) 제품, 팜(Palm) 46)로 피복시켰다.

g) 열 안정화된 무수 및 액체 피테이스 배합물의 펠렛화 안정성

피테이스의 열 안정화된 무수 또는 액체 배합물(전술한 바와 같이)을 사료와 혼합한 후, 85℃에서 증기 콘디쇼닝(conditioning)하에 펠렛화하였다. 피테이스의 펠렛화 안정성은 펠렛화 전의 매쉬 상태에서 그리고 생성된 펠렛에서 모두 피테이스 활성을 측정하여 결정하였다.

실시예 2

실시예 1에 기술한 바와 같이 상이한 진균류 피테이스 활성에 대한 온도의 영향을 조사한 결과, 각각의 피테이스에 대해 다음과 같은 온도에서 최대 활성이 나타났다: 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 및 아스퍼질러스 나이거 피테이스의 경우 55℃, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스 및 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스의 경우 45℃, 및 콘센서스 피테이스의 경우 65℃. 결정된 최대 온도보다 10 내지 15℃ 높은 온도를, 피테이스의 열 안정성에 대한 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜, 디카복실레이트, 카복시메틸셀룰로스 및 소듐 알지네이트의 영향에 대해 연구하기 위한 스크리닝 지점으로 선택하였다.

a) 상이한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜의 첨가

50% 및 25%의 폴리에틸렌 글리콜(반응 기간 동안 25% 및 12.5%의 최종 농도)을 첨가하여 65℃에서 측정된 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 비활성을 분자량에 따라 증가시켰는데, 최대 비활성은 PEG 1450(비활성 80U/(㎎ 단백질))에서 관찰되었고 PEG 1000(50U/(㎎ 단백질)) 및 PEG 3350(42U/(㎎ 단백질))에서도 또한 상당한 활성이 관찰되었다. 이 실험의 결과를 도 2에 요약하였다.

600, 1000, 1450, 3350 및 4000 Da의 분자량을 갖는 PEG는 시험된 다른 피테이스에 대해 유사한 영향을 나타내었다. 이 실험의 결과를 도 3a, 3b, 3c 및 3d에 도시하였다.

b) 폴리올의 첨가

폴리올, 즉 25% 및 50% 농도의 리비톨(C₅ 당류), 크실리톨(C₅ 당류) 및 소르비톨(C₆ 당류)은 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 열 안정성을 크게 향상시켰다. 이것은 도 4에 도시되어 있다.

에리트리톨, 만니톨, 만노헵툴로스 및 만노헵토스는 0.2M 소듐 아세테이트(pH 5.0)내에서 50%(중량/중량)의 농도로 용해되지 않고, 단지 25% 농도 로만 용해된다. 65℃에서 측정된 비활성은 25%의 리비톨, 크실리톨 및 소르비톨의 존재하에 각각 11, 21 및 11U/(㎎ 단백질)이었고, 50%의 리비톨, 크실리톨 및 소르비톨 용액의 존재하에 각각 51, 90 및 74U/(㎎ 단백질)이었다.

글리세롤(C₃ 당류), 에리트리톨(C₄ 당류), 만노헵토스(C₇ 당류) 및 만노헵툴로스(C₇ 당류)와 같은 6개 이상 또는 5개 미만의 탄소 원자를 포함하는 폴리올은 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 열 안정성에 대해 좋지않은 영향을 나타내었다.

50% 농도의 크실리톨은 또한 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피테이스 및 콘센서스 피테이스의 최적 온도를 10 내지 15℃ 증가시켰다. 이 결과를 도 5a, 5b, 5c 및 5d에 도시하였다.

c) 디카복실산의 첨가

25% 농도(활성 분석에서 12.5%의 최종 농도)의 말로네이트, 숙시네이트 및 글루타레이트는 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 열 안정성을 크게 증가시켰고, 말로네이트의 경우 70℃, 및 숙시네이트 및 글루타레이트의 경우 65℃에서 상당한 활성이 검출되었다. 이 결과를 도 6에 도시하였다.

또한, 디카복실레이트는 37℃에서 측정된 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 활성을 증가시켰는데, 말로네이트의 경우 피테이스 활성을 약 4배 증가시켰고, 숙시네이트의 경우 2배 증가시켰으나 글루타레이트의 경우는 미소하였다. 상이한 농도의 말로네이트(5, 10 및 25%)에 대한 연구에서는, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테 이스의 열 안정성이 말로네이트 농도에 따라 증가되는 반면, 효소 활성은 적어도 이 농도 범위에서는 증가되지 않음을 나타내었다. 이것은 도 7에 도시되어 있다.

이러한 사실과는 반대로, 상이한 농도의 소듐 아세테이트(5, 10 및 25%), 즉 모노카복실산은 37℃에서 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스의 비활성을 2배 증가시켰지만, 이 단백질의 열 안정성에는 단지 미소한 영향만을 미쳤다. 이것은 도 8에서 알 수 있다.

디소듐 말로네이트 및 디소듐 숙시네이트는 일반적으로 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피테이스 및 콘센서스 피테이스의 열 안정성을 5 내지 15℃ 증가시켰다. 다른 한편으로, 피테이스 활성의 증가는 다소 낮은 비활성을 갖는 아스퍼질러스 니둘란스 피테이스 및 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스에서만 나타났지만, 아스퍼질러스 테레우스 CBS 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피테이스 및 콘센서스 피테이스에서는 나타나지 않았다. 이것은 도 9a, 9b, 9c, 9d 및 9e, 및 도 10a, 10b, 10c, 10d 및 10e에 도시되어 있다.

d) 가교결합의 영향

이전의 실험에서, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 단량체는 글루타르알데하이드와 항온반응시켜 가교결합시켰다. 생성된 열 안정화(60℃에서 측정됨)는 1시간의 반응 시간 후 최대에 이르렀지만, 활성의 손실이 나타났다(37℃에서 측정됨). 추가의 실험에서, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 단량체를 그의 탄화수소 쇄를 통해 가교결합시켰다. 이러한 유형의 가교결합은 단지 최소한의 비활성 손실(<10%)을 나타냈고 15mM보다 높은 농도의 소듐 퍼요오데이트에서 올리고머 형태가 형성되었다. 이것은 도 11a 및 11b에서 알 수 있다.

열 안정화의 정도는 퍼요오데이트의 농도에 따라 다르고 75℃ 이하에서 높은 비활성이 관찰되는 50mM의 퍼요오데이트에서 최대에 이르렀다(도 12 참조). 열 안정성에 대한 피테이스 올리고머화의 큰 영향은 또한 탄화수소 쇄를 통해 가교결합된 콘센서스 피테이스에서도 관찰되었다. 이것은 도 12에서 알 수 있다.

본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 낮은 M_r의 첨가제에 의한 열 안정화 영향(산업용 효소의 안정화의 경우 매우 바람직하다) 및 화학적 변형에 의한 열 안정화 영향(이 접근이 통상적으로 기술적 및 환경적 이유로 덜 바람직하게 생각되지만)에 초점을 두었다.

섬유상 진균류(아스퍼질러스 나이거) 또는 섬유상 효모(한세눌라 폴리모파)에서 발현되는 다양한 범위의 피테이스에서 C₅ 당류가 열 안정화 작용을 하는 것을 발견하였다. 열 안정성에서의 증가는 상이한 피테이스 사이에서 어느 정도 다양하였지만, 약 10℃였다. PEG의 영향은 분자량에 따라 달랐다. 모든 피테이스에서 최적의 열 안정화는 1000 내지 3350 Da의 분자량을 갖는 PEG에서 수득되었다.

소듐 아세테이트, 모노카복실산 및 표준 피테이스 활성 분석법의 주성분은 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스 활성에 대해서는 농도에 따른 증가를 나타내었지만 피테이스의 열 안정성에는 영향을 미치지는 않았다. 따라서 카복실레이트 그룹은 활성을 변형시키는 작용을 하는 반면, 이작용성 디카복실레이트는 이온 상호작용에 의해 피테이스를 안정화하는 것으로 생각된다.

실시예 3

콘센서스 피테이스-1의 아미노산 서열의 설계

아미노산 서열의 배열

시퀀스 어날리시스 팩키지 릴리스(Sequence Analysis Package Release) 9.0(드베류 등의 문헌[1984] 참조)의 파일업 프로그램과 표준 변수(갭 생성 패널티(penalty) 12, 갭 연장 패널티 4)를 사용하여 배열을 계산하였다. 갭의 위치는 텍스트(text) 편집기를 사용하여 다듬었다. 하기 표 1은 신호 서열 없이 표 1에 나타난 바와 같은 아미노산(aa)으로부터 출발하도록 배열시키기 위해 사용된 서열(도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f 참조)을 나타낸다.

[표 1]

콘센서스 피테이스-1을 설계하는데 사용된 피테이스 아미노산 서열의 기원 및 선택 가중치

기원	출발 위치	선택 가중치	참고 문헌
아스퍼질러스 테레우스 9A-1의phyA	aa 27	0.5	미첼 등의 문헌[1997]
아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46의phyA	aa 27	0.5	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 나이거 변종 아와모리의phyA	aa 27	0.33	피딩톤 등의 문헌[1993]
아스퍼질러스 나이거 T213의phyA	aa 27	0.33	비스 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 나이거 균주 NRRL3135의phyA	aa 27	0.33	반 하팅스벨트 등의 문헌[1993]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073의phyA	aa 26	0.2	파사몬테스 등의 문헌[1997]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32722의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 58128의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 26906의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32239의phyA	aa 30	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
에머리셀라 니둘란스의phyA	aa 25	1.0	파사몬테스 등의 문헌[1997a]
탈라로마이세스 써모필러스 ATCC 20186의phyA	aa 24	1.0	파사몬테스 등의 문헌[1997a]
마이셀리오프토라 써모필라의phyA	aa 19	1.0	미첼 등의 문헌[1997]

콘센서스 피테이스-1의 아미노산 서열 계산

다듬어진 배열을 입력값으로 사용하여, 콘센서스 서열을 시퀀스 어날리시스 팩키지 릴리스 9.0(드베류 등의 문헌[1984] 참조)의 프리티 프로그램으로 계산하였다. 프리티는 열에 맞춰 나란히 서열을 인쇄하고 배열로부터 콘센서스 서열을 나타낼 수 있다. 배열된 피테이스의 아미노산 서열 사이의 유사성에 따라 선택 가중치를 모든 서열에 할당하였다. 하나의 서열 서브그룹(subgroup)(동일한 종이지만, 상이한 균주인)의 모든 피테이스, 예를 들어 서로 다른 아스퍼질러스 푸미가투스 균주의 모든 피테이스의 아미노산 서열이 선택에 미치는 중요도를 합하여 선택 가중치를 1로 설정하는 것은, 각 서열이 균주 서열수의 역수에 해당하는 선택 가중치에 기여함을 의미한다(표 1 참조). 이러한 방식으로, 예를 들어 서로 다른 아스퍼질러스 푸미가투스 균주의 피테이스간의 매우 유사한 아미노산 서열이 계산된 콘센서스 서열의 대부분을 차지하는 것을 방지할 수 있다.

프리티 프로그램은 하기 변수를 갖고 시작되었다: 콘센서스가 없다고 판단되는, 선택된 회수로 정의되는 선택수의 임계치를 2.0으로 설정하였다. 아미노산 잔기가 잔기의 목적하는 군에 선택되지 않을 수 있는, 스코어링 매트릭스(scoring matrix) 수치 미만인지를 결정하는 임계치를 2로 설정하였다. 프리티는 펩타이드에 대한 프리티펩.씨엠피(PrettyPep.Cmp) 콘센서스 스코어링 매트릭스를 사용하였다.

프로그램으로 콘센서스 잔기를 결정할 수 없는 배열의 위치(위치 46, 66, 82, 138, 162, 236, 276, 279, 280, 308; 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f)는 하기 규칙에 따라 수동으로 채워넣었다. 가장 많이 나타나는 잔기가 존재하면, 이 잔기를 선택하였다(138, 236, 280). 유사하거나 계통발생적으로 상동성인 잔기의 우세한 그룹이 존재하면, 가장 많이 나타나는 잔기를 선택하거나, 이것이 가능하지 않으면, 이 그룹의 잔기를 선택하였다(46, 66, 82, 162, 276, 308). 우세한 잔기나 우세한 그룹이 없는 경우, 존재하는 잔기 중 하나를 단백질 안정성에 대한 통상적인 그의 영향을 고려하여 선택하였다(279). 8개의 다른 위치(132, 170, 204, 211, 275, 317, 384, 447; 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f)는 프로그램에 의해 선택된 아미노산 잔기로 채우지 않고, 일반적으로 프로그램에 의해 선택된 잔기와 동일한 빈도로 나타나는 아미노산으로 채워넣었다. 대부분의 경우, 이러한 수정에 의해 3개의 아스퍼질러스 나이거 서열(선택 가중치 합계: 0.99) 중에서 다소 경시할 수 있는 것을 제거하였다.

콘센서스 피테이스-1 아미노산 서열의 DNA 서열로의 전환

아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46 피테이스의 처음 26개의 아미노산 잔기를 신호 펩타이드로 사용하고, 따라서 모든 콘센서스 피테이스의 N-말단에 융합시켰다. 이러한 서열의 신장을 위해, 상응하는 DNA 서열을 계산하는 특수한 방법을 사용하였다. 퍼비스(Purvis, I. J.) 등(1987)은 유전자에 희귀 코돈(rare codon)을 혼입시키는 것이 단백질의 폴딩(folding) 효율성에 영향을 미친다고 보고하였다. 따라서, 콘센서스 피테이스에 사용되고 단백질 분비에 매우 중요하며 사카로마이세스 세레비지애의 코돈 사용 단위로 전환되는, 아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46의 신호 서열에서 한군데 이상 분포하는 희귀 코돈을 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시키기 위해 제조된 새로운 신호 서열내로 옮겼다. 단백질의 나머지 부분을 위해, GCG 프로그램 팩키지로부터 수득되는, 높은 비율로 발현되는 사카로마이세스 세레비지애 유전자의 코돈 사용빈도표를 사용하여 계산된 아미노산 서열을 DNA 서열로 전환시켰다.

생성된 fcp 유전자의 서열을 도 14a, 14b 및 14c에 도시하였다.

콘센서스 피테이스-1 유전자의 구성 및 클로닝

콘센서스 피테이스-1(fcp)의 계산된 DNA 서열을 선택적으로 센스(sense) 및 안티-센스(anti-sense) 스트랜드(strand)의 서열을 사용하여 85bp의 올리고뉴클레오티드로 분할하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 반대 스트랜드의 전방 올리고뉴클레오티드 및 후방 올리고뉴클레오티드와 20bp가 겹친다. 스위스 발가히 소재의 마이크로신트(Microsynth)에서 구입하고 PAGE-정제된 형태로 수득되는 모든 프라이머(primer)의 위치는 도 14a, 14b 및 14c에 지시되어 있다.

PCR 반응

3가지 PCR 반응에서, 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전체 유전자를 구성하였다. PCR 반응을 위해, 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(독일 만하임 소재의 뵈링거 만하임)으로부터 구입한 하이 파이델리티 키트(High Fidelity Kit) 및 AMS 바이오테크놀로지(유럽) 리미티드(AMS Biotechnology(Europe) Ltd.)(스위스의 루가노 소재)에서 프로토콜(Protokol^TM)의 상표명으로 시판중인 써모 사이클러(thermo cycler)를 사용하였다.

올리고뉴클레오티드 CP-1 내지 CP-10(믹스(Mix) 1, 도 14a, 14b 및 14c)은 각 올리고뉴클레오티드를 0.2 pMol/㎕의 농도로 혼합하였다. 두 번째 올리고머 혼합물(믹스 2)을 CP-9 내지 CP-22로 제조하였다(0.2 pMol/㎕의 각 올리고뉴클레오티드). 또한, 하기와 같은 4개의 짧은 프라이머(서열번호:16 내지 서열번호:18 및 서열번호:20 참조)를 PCR 반응에 사용하였다:

PCR 반응물 a: 10㎕의 믹스 1(2.0pmol의 각 올리고뉴클레오티드), 2㎕의 뉴클레오티드(10mM의 각 뉴클레오티드), 2㎕의 프라이머 CP-a(10 pmol/㎕), 2㎕의 프라이머 CP-c(10 pmol/㎕), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 b: 10㎕의 믹스 2(2.0pmol의 각 올리고뉴클레오티드), 2㎕의 뉴클레오티드(10mM의 각 뉴클레오티드), 2㎕의 프라이머 CP-b(10 pmol/㎕), 2㎕의 프라이머 CP-e(10 pmol/㎕), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물(2.6U) 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 a 및 b의 반응 조건: 단계 1, 2분-45℃; 단계 2, 30초-72℃; 단계 3, 30초-94℃; 단계 4, 30초-52℃; 단계 5, 1분-72℃.

단계 3 내지 단계 5를 40회 반복하였다.

PCR 생성물(670bp 및 905bp)을 아가로스(agarose) 겔 전기영동(0.9% 아가로스) 및 이어서 겔 추출법으로 정제하였다(퀴아엑스 II 겔 익스트렉션 키트(QIAEX II Gel Extraction Kit), 독일 힐든 소재의 퀴아진(Qiagen) 제품). 정제된 DNA 단편을 PCR 반응물 c에 사용하였다.

PCR 반응물 c: 6㎕의 PCR 반응물 a의 생성물(약 50ng), 6㎕의 PCR 반응물 b의 생성물(약 50ng), 2㎕의 프라이머 CP-a(10 pmol/㎕), 2㎕의 프라이머 CP-e(10 pmol/㎕), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물(2.6U) 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 c의 반응 조건: 단계 1, 2분-94℃; 단계 2, 30초-94℃; 단계 3, 30초-55℃; 단계 4, 1분-72℃.

단계 2 내지 단계 4는 31회 반복하였다.

생성된 PCR 생성물(1.4kb)을 전술한 바와 같이 정제하고, EcoRI로 분해한 다음 EcoRI-분해되고 탈인산화된 pBsk(-)-벡터(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트래타진(Stratagene) 제품)에 연결시켰다. 1㎕의 연결 혼합물을 사용하여 이 콜라이 XL-1 컴피턴트(competent) 세포(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트래타진 제품)를 형질전환시켰다. 모든 표준 절차는 샘브루크(Sambrook, J.) 등의 문헌[1987]에 기술된 바와 같이 행하였다. 구성된 콘센서스 피테이스 유전자의 DNA 서열(fcp, 도 14a, 14b 및 14c)은 당해 분야에 공지된 바와 같이 서열을 분석하여 조절하였다.

실시예 4

개선된 콘센서스 피테이스(콘센서스 피테이스-10) 아미노산 서열의 설계

콘센서스 피테이스-10의 서열을 설계하기 위해 사용할 배열을 표준 변수(갭 생성 페널티 12, 갭 연장 페널티 4)와 함께 시퀀스 어날리시스 팩키지 릴리스 9.0(드베류 등의 문헌[1984] 참조)으로부터 파일업 프로그램을 사용하여 계산하였다. 갭의 위치는 텍스트 편집기를 사용하여 다듬었다.

하기 표 2의 아미노산(aa)으로부터 출발하는 하기 서열을 사용하여 담자균류 피테이스를 배열하였다.

[표 2]

상응하는 콘센서스 아미노산 서열(바시디오)을 계산하기 위해 사용된 5개의 담자균류 피테이스의 기원 및 선택 가중치

기원	출발 위치	선택 가중치	참고 문헌
팍실러스 인볼루투스 NN005693의phyA1	aa 21	0.5	국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호
팍실러스 인볼루투스 NN005693의phyA2	aa 21	0.5	국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호
트라메테스 푸베센스 NN9343의phyA	aa 24	1.0	국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호
아그로사이베 페디아데스 NN009289의phyA	aa 19	1.0	국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호
페니오포라 리시 NN006113의phyA	aa 21	1.0	국제 특허 공개공보 제 WO 98/28409 호

배열은 도 3a, 3b, 3c 및 3d에 도시되어 있다.

하기 표 3에서, 최종 배열을 형성하기 위해 사용된 유전자를 나열하였다. 배열에 사용된 서열의 첫 번째 아미노산(aa)을 유기체 기원 뒤에 나타내었다.

[표 3]

콘센서스 피테이스-10을 설계하는데 사용된 피테이스 서열의 기원 및 선택 가중치

기원	출발 위치	선택 가중치	참고 문헌
아스퍼질러스 테레우스 9A-1의phyA	aa 27	0.5	미첼 등의 문헌[1997]
아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46의phyA	aa 27	0.5	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 나이거 변종 아와모리의phyA	aa 27	0.5	피딩톤 등의 문헌[1993]
아스퍼질러스 나이거 균주 NRRL3135의phyA	aa 27	0.5	반 하팅스벨트 등의 문헌[1993]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073의phyA	aa 26	0.2	파사몬테스 등의 문헌[1997]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32722의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스러질러스 푸미가투스 ATCC 58128의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 26906의phyA	aa 26	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 32239의phyA	aa 30	0.2	반 룬 등의 문헌[1998]
에머리셀라 니둘란스의phyA	aa 25	1.0	파사몬테스 등의 문헌[1997a]
탈라로마이세스 써모필러스 ATCC 20186의phyA	aa 24	1.0	파사몬테스 등의 문헌[1997a]
마이셀리오프토라 써모필라의phyA	aa 19	1.0	미첼 등의 문헌[1997]
써모마이세스 라누기노사의phyA	aa 36	1.0	베카 등의 문헌[1998]
5개의 담자균류 피테이스의 콘센서스 서열		1.0	바시디오, 도 15

상응하는 배열은 도 6에 도시되어 있다.

콘센서스-10의 아미노산 서열 계산

배열을 개선시키기 위해, 바시디오라고 불리는, 정의되지 않은 서열 위치를 여전히 포함하고 있는 4개의 상이한 담자균류의 5개의 피테이스로부터 수득한 근원 콘센서스 서열(도 15a, 15b 및 15c 참조), 근원 콘센서스 피테이스를 계산하기 위해 사용된 거의 모든 피테이스 서열, 및 자낭균류인 써모마이세스 라누기노사의 1개의 새로운 피테이스 서열을 추가하여 더 긴 배열을 만들었다. 담자균류 피테이스 서열의 콘센서스 서열을 사용하는 것은 5개의 아미노산 서열 사이의 상이성에 주목하지 않고, 자낭균류 피테이스와 담자균류 피테이스 사이의 공통 아미노산과 상이한 아미노산 잔기에 주목하기 위함이다.

본 발명자들은 선택수를 2.0으로 설정하고 임계치를 3으로 설정하였다. 사용된 선택 가중치는 표 3에 나타내었다. 배열 및 상응하는 콘센서스 서열은 도 16a, 16b, 16c, 16d, 16e, 16f 및 16g에 도시되어 있다. 새로운 콘센서스 피테이스 서열은 원 콘센서스 피테이스에 비해 32개의 상이한 아미노산을 가졌다. 프리티 프로그램이 콘센서스 아미노산 잔기를 계산하지 못하는 위치는 실시예 3에 기술된 규칙에 따라 채워넣었다. 프로그램에 의해 선택된 잔기는 대체하지 않았다.

또한, 모든 담자균류 피테이스를 단일 아미노산 서열로 포함시켰지만 배열에서 선택 가중치는 0.2를 할당하였다. 상응하는 배열은 도 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f 및 18g에 도시되어 있다. 계산된 콘센서스 아미노산 서열(콘센서스 피테이스-11)은 콘센서스 피테이스-10의 서열과 다음의 차이를 갖는다. 하기 X란 문자는 프로그램이 콘센서스 아미노산을 계산할 수 없는 잔기 위치를 의미하고, 괄호안의 아미노산은 콘센서스 피테이스-10에 최종적으로 포함되는 아미노산에 상응한다. 도 17a, 17b 및 17c에서와 같이 번호를 매기면 다음과 같다: D35X, X(K)69K, X(E)100E, A101R, Q134N, X(K)153N, X(H)190H, X(A)204S, X(E)220D, E222T, V227A, X(R)271R, H287A, X(D)288D, X(K)379K, X(I)389I, E390X, X(E)415E, X(A)416A, X(R)446L, E463A.

또한 본 발명자들은 개선된 콘센서스 서열 10 및 11에 의해 제시된 단일 아미노산 치환을 근원 콘센서스 피테이스의 안정성에 대한 이들의 영향으로 조사하였다. 이러한 접근은 실시예 5에 기술되어 있다.

콘센서스 피테이스-10 아미노산 서열의 DNA 서열로의 전환

아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46 피테이스의 처음 26개의 아미노산 잔기를 단일 펩타이드로 사용하여 콘센서스 피테이스-10의 N-말단에 융합시켰다. 사용된 절차는 실시예 3에 추가로 기술되어 있다.

생성된 fcp10 유전자의 서열은 도 17a, 17b 및 17c에 도시되어 있다.

콘센서스 피테이스-10 유전자( fcp10 )의 구성 및 클로닝

fcp10의 계산된 DNA 서열을 선택적으로 센스 및 안티-센스 스트랜드의 서열을 사용하여 85bp의 올리고뉴클레오티드로 분할하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 반대 스트랜드의 전방 올리고뉴클레오티드 및 후방 올리고뉴클레오티드와 20bp가 겹친다. 스위스 발가히 소재의 마이크로신트에서 구입하고 PAGE-정제 형태로 수득되는 모든 프라이머의 위치는 도 17a, 17b 및 17c에 지시되어 있다.

PCR 반응

3가지 PCR 반응에서, 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 전체 유전자를 구성하였다. PCR 반응을 위해, 뵈링거 만하임(독일 만하임 소재의 뵈링거 만하임)으로부터 구입한 하이 파이델리티 키트 및 AMS 바이오테크놀로지(유럽) 리미티드(스위스의 루가노 소재)에서 프로토콜의 상표명으로 시판중인 써모 사이클러를 사용하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 0.2 pMol/㎖의 농도로 사용하였다.

믹스 1.10: CP-1, CP-2, CP-3.10, CP-4.10, CP-5.10, CP-6, CP-7.10, CP-8.10, CP-9.10, CP-10.10

믹스 2.10: CP-9.10, CP-11.10, CP-12.10, CP-13.10, CP-14.10, CP-15.10, CP-16.10, CP-17.10, CP-18.10, CP-19.10, CP-20.10, CP-21.10, CP-22.10

새로 합성된 올리고뉴클레오티드는 숫자 10으로 표시하였다. 피테이스는 원 콘센서스 피테이스에 비해 하기 32개의 아미노산 치환을 포함하는데, 이것은 도 17a, 17b 및 17c에서 밑줄을 그어 표시하였다: Y54F, E58A, D69K, D70G, A94K, N134Q, I158V, S187A, Q188N, D197N, S204A, T214L, D220E, L234V, A238P, D246H, T251N, Y259N, E267D, E277Q, A283D, R291I, A320V, R329H, S364T, I366V, A379K, S396A, G404A, Q415E, A437G, A463E.

하기와 같은 4개의 짧은 PCR 프라이머(서열번호:16, 서열번호:17, 서열번호:19 및 서열번호:20 참조)를 올리고뉴클레오티드를 조합하는데 사용하였다:

PCR 반응물 a: 10㎕의 믹스 1.10(2.0pmol의 각 올리고뉴클레오티드), 2㎕의 뉴클레오티드(10mM의 각 뉴클레오티드), 2㎕의 프라이머 CP-a(10 pmol/㎖), 2㎕의 프라이 머 CP-c.10(10 pmol/㎖), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 b: 10㎕의 믹스 2.10(2.0pmol의 각 올리고뉴클레오티드), 2㎕의 뉴클레오티드(10mM의 각 뉴클레오티드), 2㎕의 프라이머 CP-b(10 pmol/㎖), 2㎕의 프라이머 CP-e(10 pmol/㎖), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물(2.6U) 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 a 및 b의 반응 조건: 단계 1, 2분-45℃; 단계 2, 30초-72℃; 단계 3, 30초-94℃; 단계 4, 30초-52℃; 단계 5, 1분-72℃.

단계 3 내지 단계 5를 40회 반복하였다.

PCR 생성물(670bp 및 905bp)을 아가로스 겔 전기영동(0.9% 아가로스) 및 이어서 겔 추출법으로 정제하였다(퀴아엑스 II 겔 익스트렉션 키트, 독일 힐든 소재의 퀴아진 제품). 정제된 DNA 단편을 PCR 반응물 c에 사용하였다.

PCR 반응물 c: 6㎕의 PCR 반응물 a의 생성물(약 50ng), 6㎕의 PCR 반응물 b의 생성물(약 50ng), 2㎕의 프라이머 CP-a(10 pmol/㎎), 2㎕의 프라이머 CP-e(10 pmol/㎎), 10.0㎕의 PCR 완충액, 0.75㎕의 중합효소 혼합물(2.6U) 및 73.25㎕의 H₂O.

PCR 반응물 c의 반응 조건: 단계 1, 2분-94℃; 단계 2, 30초-94℃; 단계 3, 30초-55℃; 단계 4, 1분-72℃.

단계 2 내지 단계 4는 31회 반복하였다.

생성된 PCR 생성물(1.4kb)을 전술한 바와 같이 정제하고, EcoRI로 분해한 다음 EcoRI-분해되고 탈인산화된 pBsk(-)-벡터(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트래타진 제품)에 연결시켰다. 1㎕의 연결 혼합물을 사용하여 이 콜라이 XL-1 컴피턴트 세포(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트래타진 제품)를 형질전환시켰다. 모든 표준 절차는 샘브루크 등의 문헌[1987]에 기술된 바와 같이 행하였다. 구성된 콘센서스 피테이스 유전자의 DNA 서열(fcp10)은 당해 분야에 공지된 바와 같이 서열을 분석하여 조절하였다.

실시예 5

콘센서스 피테이스-10 및 콘센서스 피테이스-11의 아미노산 서열에 의해 제시된 단일 돌연변이를 도입시킴에 의한 콘센서스 피테이스-1의 열 안정성의 증가

상동 유전자의 열 안정성을 증가시키기 위해, 목표 단백질과 계산된 콘센서스 서열 사이의 각각 상이한 아미노산 잔기가 안정성에 미치는 영향을 시험하여, 모든 안정화된 돌연변이를 목표 단백질내에 조합시킬 수 있다. 본 발명자들은 목표 단백질로서 콘센서스 피테이스를 사용하고, 콘센서스 피테이스 10 및/또는 콘센서스 피테이스 11과는 달리, 단일 돌연변이로서 34개의 아미노산 잔기를 사용하여 이들이 단백질 안정성에 미치는 영향을 시험하였다.

아스퍼질러스 나이거, 사카로마이세스 세레비지애, 또는 한세눌라 폴리모파에서 발현하는 돌연변이 단백질을 구성하기 위해, 콘센서스 피테이스 유전자를 포함하는 상응하는 발현 플라스미드를 부위지향성 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)(실시예 8 내지 실시예 10 참조) 방법의 주형으로 사용하였다. 돌연 변이는 스트래타진(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)의 "퀵 익스체인지(quick exchange^TM) 부위지향성 돌연변이 유발 키트"를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하고 상응하는 프라이머를 사용하여 도입시켰다. 제조된 모든 돌연변이 및 그의 상응하는 프라이머를 하기 표 4a 내지 표 4e에 요약하였다. 바람직한 돌연변이를 포함하는 플라스미드는 당해 분야에 공지된 바와 같은 DNA 서열 분석법으로 확인하였다.

[표 4a]

콘센서스 피테이스의 부위지향성 돌연변이 유발 방법에 사용된 프라이머(서열번호:24 내지 서열번호:59; 치환된 염기는 굵은 활자로 강조된다. 제한 부위의 도입은 서열 위에 표시된다. 괄호 안에 표기된 제한 부위는 돌연변이를 도입시킬 때 파괴된다)

[표 4b]

[표 4c]

[표 4d]

[표 4e]

사카로마이세스 세레비지애에서 발현되고 정제된 피테이스(하기 실시예 9)의 최적 온도는 하기 실시예 11에서 기술된 바와 같이 결정하였다. 하기 표 5는 콘센서스 피테이스 안정성에 대한 도입된 각 돌연변이의 영향을 나타낸 것이다.

[표 5]

콘센서스 피테이스-1에서 개별적인 아미노산 치환이 안정성에 미치는 영향(+ 및 -는 각각 1℃ 이하에서의 단백질 안정성에 대한 바람직한 영향 및 바람직하지 않은 영향을 의미하고, ++ 및 --는 각각 1 내지 3℃에서의 단백질 안정성에 대한 바람직한 영향 및 바람직하지 않은 영향을 의미하며, 숫자 10 및 11은 아미노산이 치환된 콘센서스 피테이스 서열을 가리킨다)

안정함		무영향		불안정함
돌연변이	영향	돌연변이	영향	돌연변이	영향
E58A(10)	+	D69A	±	Y54F(10)	-
D69K(11)	+	D70G(10)	±	V73I	-
D197N(10)	+	N134Q(10)	±	A94K(10)	-
T214L(10)	++	G186H	±	A101R(11)	-
E222T(11)	++	S187A(10)	±	K153N(11)	-
E267D(10)	+	T214V	±	I158V(10)	--
R291I*	+	T251N(10)	±	G203A	--
R329H(10)	+	Y259N(10)	±	G205S	-
S364T(10)	++	A283D(10)	±	A217V	-
A379K(11)	+	A320V(10)	±	V227A(11)	--
G404A(10)	++	K445T	±	L234V(10)	-
		A463E(10)	±	A238P(10)	--
				E277Q(10)	-
				H287A(11)	-
				Q292A(10)	-
				I366V(10)	-
				S396A(10)	--
				Q415E(11)	-
				A437G(10)	--
				E451R	--
*: 이 아미노산 치환은 또 다른 돌연변이에서 발견되었다.

본 발명자들은 본 실시예에서 전술한 프라이머 및 기법을 사용하여 콘센서스 피테이스에서 수득된 8개의 바람직한 돌연변이(E58A, D197N, E267D, R291I, R329H, S364T, A379K, G404A)를 조합하였다. 또한 피테이스의 촉매적 특성에 주요 영향을 미치는 돌연변이 Q50T 및 K91A를 도입시켰다(유럽 특허 공개공보 제 897 985 호 및 실시예 11 참조). 생성된 피테이스 유전자(콘센서스 피테이스-써모[8]-Q50T-K91A)의 DNA 및 아미노산 서열은 도 19a, 19b 및 19c에 도시되어 있다. 이러한 방식으로, 콘센서스 피테이스의 최적 온도 및 융점을 7℃ 증가시켰다(도 27a 및 27b, 도 28a 및 28b, 및 도 29 참조).

상기 표 5의 결과를 사용하여, 본 발명자들은 또한 콘센서스 피테이스의 안정성에 매우 불량한 영향을 미치는 것으로 나타난 돌연변이를 역으로 돌연변이시킨 역 돌연변이 K94A, V158I 및 A396S에 의해 콘센서스 피테이스-10의 열 안정성을 향상시켰다. 생성된 단백질은 피테이스-10-써모[3]이다. 또한, 본 발명자들은 주로 콘센서스 피테이스의 촉매적 특성에 영향을 미치는 Q50T 및 K91A 돌연변이를 도입시켰다(유럽 특허 공개공보 제 897 985 호, 실시예 11, 도 16a, 16b, 16c, 16d, 16e, 16f 및 16g, 및 도 27a 및 27b 참조). 생성된 DNA 및 아미노산 서열은 도 20a, 20b 및 20c에 도시되어 있다. 최적화된 피테이스는 콘센서스 피테이스-10보다 4℃ 더 높은 최적 온도 및 융점을 나타내었다(도 24a 및 24b, 및 도 25 참조). 또한, 피테이스는 피테이트를 기질로 하였을 때, pH 5.5에서 250U/㎎의 매우 증가된 비활성을 가졌다(도 26a 및 26b 참조).

실시예 6

아미노산 잔기를 상응하는 콘센서스 피테이스-1 및 콘센서스 피테이스-10 잔기로 치환시킴에 의한 아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 피테이스의 안정화

아스퍼질러스 푸미가투스 13073이 유일하거나 거의 유일한 피테이스인 배열에서, 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f의 배열과 비교하여 상응하는 콘센서스 피테이스 아미노산 잔기를 포함하지 않는 6개의 전형적인 위치의 비-콘센서스 아미노산 잔기를 콘센서스 잔기로 대체시켰다. 우선, Q27T 치환 및 아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46 피테이스의 신호 서열을 포함하여 다음의 아미노산을 아스퍼질러스 푸미가투스 13073 피테이스에서 치환시켰다(도 21a, 21b 및 21c 참조): F55(28)Y, V100(73)I, F114(87)Y, A243(220)L, S265(242)P, N294(282)D.

괄호안의 숫자는 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f에서 매긴 번호를 부여한 것이다.

다음으로, 콘센서스 피테이스-10 서열에서 발견되고 콘센서스 피테이스-1에서 단일 돌연변이로서 시험된(표 5) 7개의 안정화 작용성 아미노산 치환 중 4개(E59A, R329H, S364T, G404A)를 추가로 아스퍼질러스 푸미가투스 a-돌연변이주내로 도입시켰다. 또한, 피테이스의 단백질 분해효소 감수성을 감소시키는 것으로 나타난, 아미노산 치환 S126N을 도입시켰다.

돌연변이는 실시예 5에 기술된 바와 같이 도입시켰고(하기 표 6 참조), 실시예 8 내지 실시예 10에서 기술된 바와 같이 발현시켰다. 생성된 아스퍼질러스 푸미가투스 13073 피테이스 변종을 a-돌연변이주 및 α-돌연변이주-E59A-S126N-R329H-S364T-G404A로 명명하였다.

아스퍼질러스 푸미가투스 13073 α-돌연변이주 피테이스의 최적 온도(60℃, 도 32) 및 융점(67.0℃, 도 31a 및 31b)은 야생형 균주 피테이스의 수치(최적 온도: 55℃, T_m: 60℃)에 비해 5℃ 증가하였다. 5개의 추가의 아미노산 치환은 최적 온도를 3℃ 증가시켰다(도 32).

[표 6]

아스퍼질러스 푸미가투스 ATCC 13073 피테이스의 안정화를 위한 돌연변이 유발 프라이머(서열번호:60 내지 서열번호:69)

실시예 7

아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스의 활성 부위 아미노산 잔기의 콘센서스 피테이스-1으로의 도입

본 발명자들은 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스의 결정 구조를 사용하여 모든 활성 부위 아미노산 잔기를 정의하였다(참고 문헌의 실시예 및 유럽 특허 제 897 010 호 참조). 도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e 및 13f의 배열을 사용하여, 본 발명자들은 하기 활성 부위 잔기 및 추가로 콘센서스 피테이스와 동일하지 않은 인접 잔기를 아스퍼질러스 나이거 피테이스의 잔기로 대체시켰다: S89D, S92G, A94K, D164S, P201S, G203A, G205S, H212P, G224A, D226T, E255T, D256E, V258T, P265S, Q292H, G300K, Y305H, A314T, S364G, M365I, A397S, S398A, G404A 및 A405S.

콘센서스 피테이스-7의 새로운 단백질 서열을 실시예 3에 기술된 바와 같은 DNA 서열로 역해독하였다(도 22a, 22b, 22c, 22d 및 22e). 상응하는 유전자(fcp7)는 하기 올리고뉴클레오티드 믹스를 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다:

믹스 1.7: CP-1, CP-2, CP-3, CP-4.7, CP-5.7, CP-6, CP-7, CP-8.7, CP-9, CP-10.7

믹스 2.7: CP-9, CP-10.7, CP-11.7, CP-12.7, CP-13.7, CP-14.7, CP-15.7, CP-16, CP-17.7, CP-18.7, CP-19.7, CP-20, CP-21, CP-22

올리고뉴클레오티드의 DNA 서열은 도 15a, 15b 및 15c에 지시되어 있다. 새로 합성된 올리고뉴클레오티드에는 숫자 7로 추가로 표시하였다. 실시예 3에 기술 된 바와 동일한 PCR 프라이머를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 조합한 후, 유전자를 실시예 8 내지 실시예 10에 기술된 바와 같은 발현 벡터내로 클로닝하였다.

한세눌라 폴리모파에서 발현되고 정제된 후 결정된 pH-프로파일은 pH 4.5 내지 pH 5.0에서 최적을 나타내어 산성 범위의 pH-스펙트럼(spectrum)으로 이동하였다(도 30a 및 30b 참조). 효소는 pH 2.5 내지 pH 6.0에서 최대 활성의 60% 이상이 나타나는 넓은 최적 pH 범위를 가졌다. pH 5.0 이하에서, 프로파일은 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스의 프로파일과 비슷하였다. 그러나, pH 5.0 미만에서는 활성이 손실되어 pH 4.0에서는 전형적으로 낮은 아스퍼질러스 나이거 피테이스의 프로파일을 가졌다.

실시예 8

한세눌라 폴리모파에서 콘센서스 피테이스 유전자의 발현

한세눌라 폴리모파 RB11(젤리센(Gellissen, G.) 등의 문헌[1994] 참조)을 형질전환시키는데 사용된 피테이스 발현 벡터는 pBsk^- fcp 또는 그의 변종의 EcoRI 단편을 한세눌라 폴리모파 발현 벡터 pEPMT121의 다중 클로닝 부위로 삽입시켜 구성하였는데, pEPMT121 벡터는 사카로마이세스 세레비지애의 ura3 선택 표지, 한세눌라 폴리모파의 포르메이트 탈수소효소(FMD) 프로모터(promoter) 요소 및 한세눌라 폴리모파 메탄올 산화효소(MOX) 종결유전자 요소를 기본으로 포함한다. fcp 유전자의 5' 말단은 FMD 프로모터에 융합되고, 3' 말단은 MOX 종결유전자에 융합된다(젤리센 등의 문헌[1996]; 유럽 특허 제 0299 108 B 호 참조). 생성된 발현 벡터는 pFPMTfcp, pFPMTfcp10, pFPMTfcp7로 명명하였다.

구성된 플라스미드는 이 콜라이에서 복제시켰다. 플라스미드 DNA는 당해 분야에서 사용하는 절차의 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 젤리센 등의 문헌[1996]에 기술된 바와 같은 컴피턴트 세포의 제조 및 효모의 형질전환에 대한 절차를 사용하여 발현 플라스미드로 한세눌라 폴리모파 균주 RP11의 오로티딘-5'-포스페이트 탈탄산효소(ura3) 결손주를 형질전환시켰다. 각 형질전환 혼합물을 2% 글루코스 및 1.8% 한천을 함유하는 YNB(0.14%(중량/부피)의 디프코(Difco) YNB 및 0.5%의 황산암모늄)상에 평판도말하고 37℃에서 배양하였다. 4 내지 5일 후에, 개별적인 형질전환체 콜로니(colony)를 취하여 37℃에서 2일간 전술한 액체 배지에서 생육시켰다. 이어서, 이 배양액의 분취물을 사용하여 2% 글루코스를 함유한 YNB-배지가 담긴 새로운 바이얼(vial)에 접종하였다. 선택 배지에서 추가로 7회 계대배양한 후, 발현 벡터를 다량체 형태의 효모 게놈(genome)내로 혼입시켰다. 그다음, 유사분열시 안정한 형질전환체를 3㎖의 비-선택적 액체배지(YPD, 2% 글루코스, 10g 효모 추출물, 및 20g 펩톤)에서 2단계 추가 배양하여 수득하였다. 유전적으로 상동인 재조합 균주를 수득하기 위해, 마지막 단계의 안정화 배양액의 분취물을 선택 평판배지상에 평판도말하였다. 단일 콜로니를 분리하여 fmd 프로모터를 억제하기 위해 글루코스 대신 2% 글리세롤을 함유하는 YNB에서 피테이스 발현을 분석하였다. 콘센서스 피테이스의 정제는 하기 실시예 9에 기술된 바와 같이 행하였다.

실시예 9

사카로마이세스 세레비지애에서 콘센서스 피테이스 유전자의 발현 및 배양 상청액 으로부터 피테이스의 정제

콘센서스 피테이스 유전자를 상응하는 블루스크립트(Bluescript) 플라스미드(pBsk^- fcp, pBsk^- fcp10, pBsk^- fcp7)로부터 분리하고, 사카로마이세스 세레비지애 발현 벡터 pYES2(미국 캘리포니아주 산 디에고 소재의 인비트로진(Invitrogen) 제품)의 발현 카세트(cassette)내 EcoRI 부위와 연결하거나 제인스(Janes, M.) 등의 문헌[1990]에 기술된 바와 같이 약화된 GAPFL(글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소) 프로모터와 pho5 종결유전자 사이에 서브클로닝(subcloning)하였다. 유전자의 정확한 배향은 PCR로 조사하였다. 사카로마이세스 세레비지애 균주, 예를 들어 INVSc1(미국 캘리포니아주 산 디에고 소재의 인비트로진 제품)의 형질전환은 힌넨(Hinnen, A.) 등의 문헌[1978]에 따라 행하였다. GAPFL 프로모터의 조절하에 피테이스 유전자를 포함한 단일 콜로니를 취하여 5㎖ 선택 배지(SD-우라실, 쉐르만(Sherman, J. P.) 등의 문헌[1986] 참조)에서 30℃에서 1일간 격렬히 쉐이킹(shaking)(250rpm)하면서 배양하였다. 그다음 초기배양액을 500㎖ YPD 배지(쉐르만 등의 문헌[1986] 참조)에 첨가하고 동일한 조건하에 생육시켰다. gal1 프로모터의 도입은 제조사의 지시에 따라 행하였다. 4일간 배양한 후, 세포 배양액을 원심분리하여(7000rpm, GS3 회전자, 15분, 5℃) 세포를 제거하고 상청액을 아미콘(Amicon) 8400 용기(PM30 막) 및 울트라프리(ultrafree)-15 원심분리용 여과 장치(미국 매사츄세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore), 바이오맥스(Biomax)-30K)에서 한외여과하여 농축하였다. 농축액(10㎖)을 40㎖들이 세파덱스(Sephadex) G25 수퍼파인(Superfine) 칼럼(독일 프라이부르크 소재의 파마샤 바이오테크(Biotech) 제품)상에서 용리 완충액으로 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)를 사용하여 탈염시켰다. 탈염된 샘플을 2M (NH₄)₂SO₄에 옮기고 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 2M 내지 0M의 (NH₄)₂SO₄의 선형 구배로 용리되는 1㎖들이 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(Butyl Sepharose 4 Fast Flow) 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼(독일 프라이부르크 소재의 파마샤 바이오테크 제품)에 직접 주입하였다. 피테이스는 누출점에서 용리되고, 농축되며, 120㎖들이 세파크릴(Sephacryl) S-300 겔 투과 크로마토그래피 칼럼(독일 프라이부르크 소재의 파마샤 바이오테크 제품)상에 주입하였다. 콘센서스 피테이스 및 콘센서스 피테이스-7은 동일한 대칭 피크(peak)로서 용리되었고, SDS-PAGE에서 순도 약 95%로 나타났다.

실시예 10

아스퍼질러스 나이거에서 콘센서스 피테이스 유전자의 발현

유전자의 개시 코돈의 Bsp HI-부위 업스트림(upstream) 및 종결 코돈의 EcoRV-부위 다운스트림을 도입하기 위해 Bluescript 플라스미드, pBsk^- fcp, pBsk ^- fcp10 및 pBsk^- fcp7을 주형으로 사용하였다. 익스팬드(Expand^TM) 하이 파이델리티 PCR 키트(독일 만하임 소재의 뵈링거 만하임 제품)를 하기 프라이머(서열번호:21 내지 서열번호:23 참조)와 함께 사용하였다:

제조사에 의해 기술된 바에 따라 반응시켰다. PCR-증폭된 fcp 유전자는 개시 코돈에 프라이머 Asp-1에 의해 도입된 새로운 Bsp HI 부위를 가지고, 이는 두 번째 아미노산 잔기인 글리신이 세린으로 대체되는 결과를 가져온다. 이어서, DNA 단편을 BspHI 및 EcoRV로 분해하고, 아스퍼질러스 나이거의 글루코아밀레이스 프로모터(glaA)의 NcoI 부위 다운스트림과 아스퍼질러스 니둘란스 트립토판 C 종결유전자(trpC)의 EcoRV 부위 업스트림에 연결시켰다(뮬라니(Mullaney, E. J.) 등의 문헌[1985] 참조). 이 클로닝 단계 후, PCR에 의해 도입될 수 있는 오류를 검출하기 위해 유전자의 서열을 분석하였다. 유럽 특허 제 684 313 호의 실시예 9에 기술된 바와 같이 pGLAC 벡터에 기본적으로 상응하는 생성된 발현 플라스미드는 선택 표지로서 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)의 오로티딘-5'-포스페이트 탈탄산효소 유전자(pyr4)를 포함하였다. 아스퍼질러스 나이거의 형질전환 및 콘센서스 피테이스 유전자의 발현은 유럽 특허 제 684 313 호에 기술된 바와 같이 행하였다. 콘센서스 피테이스는 실시예 9에 기술된 바와 같이 정제하였다.

실시예 11

피테이스 활성 및 최적 온도의 결정

피테이스 활성은 기본적으로 미첼 등의 문헌[1997]에 기술된 바와 같이 결정하였다. 활성은 200mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)내 0.5% 피트산(약 5mM)을 함유한 분석 혼합물에서 측정하였다. 15분간 37℃에서 항온반응시킨 후, 동일 부피의 15% 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 유리된 포스페이트는 100㎕의 분석 혼합물을 900㎕ H₂O, 및 1㎖의 0.6M H₂SO₄, 2% 아스코르브산 및 0.5% 암모늄 몰리브데이트와 혼합하여 정량하였다. 포타슘 포스페이트의 표준 용액을 기준 용액으로 사용하였다. 1 유니트의 효소 활성은 37℃에서 1분간 1μmol의 포스페이트를 유리하는 효소의 양으로 정의하였다. 단백질 농도는 페이스(Pace, N. C.) 등의 문헌[1995]에 따라 계산된 280㎚에서의 효소 흡광계수를 사용하여 결정하였다: 콘센서스 피테이스, 1.101; 콘센서스 피테이스 7, 1.068; 콘센서스 피테이스 10, 1.039.

최적 pH 곡선의 경우, 정제된 효소를 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)에 희석시켰다. 희석된 단백질의 분취물을 동일 부피의 일련의 상이한 완충액내 1% 피트산(약 10mM)과 혼합하여 항온반응을 시작하였다: 0.4M 글리신/HCl, pH 2.5; 0.4M 아세테이트/NaOH, pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5; 0.4M 이미다졸/HCl, pH 6.0, 6.5; 0.4M Tris/HCl, pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0. 대조군 실험은 pH가 혼합 단계에 의해서만 약간 영향을 받음을 나타내었다. 항온반응은 전술한 바와 같이 37℃ 에서 15분간 행하였다.

피테이스의 기질 특이성을 측정하기 위해, 분석 혼합물내 피트산을 5mM 농도의 각 포스페이트 화합물로 대체시켰다. 활성 시험은 전술한 바와 같이 행하였다.

최적 온도를 측정하기 위해, 효소(100㎕) 및 기질 용액(100㎕)을 상기 온도에서 5분간 초기 항온반응시켰다. 반응은 효소에 기질 용액을 첨가하여 시작되었다. 15분간 항온반응시킨 후에, 트리클로로아세트산으로 반응을 종결시키고 유리된 포스페이트의 양을 결정하였다.

원 콘센서스 피테이스의 최적 pH는 약 pH 6.0 내지 pH 6.5(70U/㎎)이었다. Q50T 돌연변이를 도입하여, 최적 pH를 pH 6.0(130U/㎎)으로 이동시켰다. K91A를 도입한 후, 최적 pH는 pH 2.5 내지 pH 6.0의 더 높은 비활성을 나타내는 산성 pH-범위로 1 pH 단위 이동되었다. 이것은 안정화된 돌연변이주와 콘센서스 피테이스-10에서도 나타났다(도 26a 및 26b, 및 도 27a 및 27b 참조).

콘센서스 피테이스에 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135의 촉매적 특성을 부여하기 위해 구성된 콘센서스 피테이스-7은 pH 4.5 내지 pH 5.0의 최적 pH를 나타내어 산성 범위의 pH-스펙트럼으로 이동되는 pH-프로파일을 가졌다(도 31a 및 31b 참조). 효소는 pH 2.5 내지 pH 6.0에서 증가된 최대 활성의 60% 이상이 나타나는 넓은 최적 pH 범위를 가졌다. 기질 스펙트럼은 또한 콘센서스 피테이스-1의 기질 스펙트럼보다 아스퍼질러스 나이거 NRRL3135 피테이스의 기질 스펙트럼에 더욱 가까웠다.

콘센서스 피테이스-1의 최적 온도(71℃)는 콘센서스 서열을 계산하기 위해 사용된 야생형 피테이스의 최적 온도(45 내지 55℃, 하기 표 7 참조)보다 16 내지 26℃ 더 높았다. 개선된 콘센서스 피테이스-10은 그의 최적 온도를 80℃까지 추가로 증가시켰다(도 33 참조). 콘센서스 피테이스-1-써모[8]의 최적 온도는 대량생산된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 상청액을 사용하여 동일한 범위(78℃)에서 발견되었다. 82℃에 이르는 가장 높은 최적 온도는 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A에서 측정되었다.

[표 7]

콘센서스 피테이스, 아스퍼질러스 푸미가투스 피테이스, 아스퍼질러스 나이거 피테이스, 에머리셀라 니둘란스 피테이스 및 마이셀리오프토라 써모필라 피테이스의 최적 온도 및 T_m-값(최적 온도의 측정은 실시예 11에 기술된 바와 같이 행하였다. T_m-값은 실시예 12에서 기술된 바와 같이 시차주사 열량계로 측정하였다)

피테이스	최적 온도(℃)	Tm(℃)
콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A	82	89.3
콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T	82	88.6
콘센서스 피테이스-10	80	85.4
콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T	78	84.7
콘센서스 피테이스-1-써모[8]-Q50T-K91A	78	85.7
콘센서스 피테이스-1	71	78.1
아스퍼질러스 나이거 NRRL 3135	55	63.3
아스퍼질러스 푸미가투스 13073	55	62.5
아스퍼질러스 푸미가투스 13073 α-변이주	60	67.0
아스퍼질러스 푸미가투스 13073 α-변이주 (최적화된 것)	63	-
아스퍼질러스 테레우스 9A-1	49	57.5
아스퍼질러스 테레우스 cbs116.46	45	58.5
에머리셀라 니둘란스	45	55.7
마이셀리오프토라 써모필라	55	측정되지 않음
탈라로마이세스 써모필러스	45	측정되지 않음

실시예 12

시차주사 열량계(DSC)에 의한 융점의 결정

피테이스의 언폴딩(unfolding) 온도를 결정하기 위해, 시차주사 열량계를 브루거(Brugger, R.) 등의 문헌[1997]에서 이미 공지된 바와 같이 적용하였다. 50 내지 60㎎/㎖의 피테이스 균질 용액을 시험에 사용하였다. 10℃/분의 일정한 가열 속도를 적용하여 90℃ 이하 내지 95℃로 올렸다.

결정된 융점은 수득된 최적 온도 결과를 반영한다(표 7). 설계된 가장 안정한 콘센서스 피테이스는 선택된 조건하에 89.3℃의 융점을 나타내는 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A이다. 이것은 사용된 야생형 피테이스의 융점보다 26 내지 33.6℃ 더 높다.

실시예 13

담자균류 피테이스 활성 부위의 콘센서스 피테이스-10-써모-Q50T-K91A로의 전달

이전에 기술된 바와 같이(실시예 5), 담자균류 피테이스 활성 부위로부터 유도된 돌연변이주를 콘센서스 피테이스-10에 도입시켰다. 하기 a) 내지 e)의 5개의 구성물을 제조하였다:

a) 이 구성물은 콘센서스 피테이스 12로 명명되고, 바시디오 콘센서스 서열의 선택된 수의 활성 부위 잔기를 포함하며, 그의 아미노산 서열(콘스피12)은 도 33에 도시되어 있다(처음 26개의 아미노산은 신호 펩타이드를 형성하고, 수정된 위치는 밑줄을 그었다);

b) 돌연변이의 클러스터(cluster)(클러스터 II)를 콘센서스-10 서열로 옮겼다, 즉 S80Q, Y86F, S90G, K91A, S92A, K93T, A94R, Y95I;

c) 유사하게, 돌연변이의 또 다른 클러스터(클러스터 III)를 옮겼다, 즉 T129V, E133A, Q143N, M136S, V137S, N138Q, S139A;

d) 유사하게, 돌연변이의 다른 한 클러스터(클러스터 IV)를 옮겼다, 즉 A168D, E171T, K172N, F173W;

e) 최종적으로, 돌연변이의 또 다른 한 클러스터(클러스터 V)를 옮겼다, 즉 Q297G, S298D, G300D, Y305T.

이들 구성물을 실시예 8 내지 실시예 10에 기술된 바와 같이 발현시켰다.

<참고 문헌>

아카누마(Akanuma, S.) 야마기시(Yamagishi, A.), 다나카(Tanaka, N.) 및 오시마(Oshima, T.)의 문헌[Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution, Prot. Sci., 7, 698-705, 1998].

아레이스(Arase, A.), 요모(Yomo, T.), 우라베(Urabe, I.), 하타(Hata, Y.), 가쓰베(Katsube, Y.) 및 오카다(Okada, H.)의 문헌[Stabilization of xylanase by random mutagenesis, FEBS Lett., 316, 123-127, 1993].

베르카, 레이(Rey, M. W.), 브라운(Brown, K. M.), 바이운(Byun, T.) 및 클로츠(Klotz, A. V.)의 문헌[Molecular characterization and expression of a phytase gene from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosa, Appl. Environ. Microbiol., 64, 4423-4427, 1998].

블라버(Blaber, M.), 린드스트롬(Lindstrom, J. D.), 가스너(Gassner, N.), 크슈(Xu, J.), 헤인즈(Heinz, D. W.) 및 매튜스(matthews, B. W.)의 문헌[Energetic cost and structural consequences of burying a hydroxyl group within the core of a protein determined from Ala/Ser and Val/Thr substitutions in T4 lysozyme, Biochemistry, 32, 11363-11373, 1993].

브루거, 마스카렐로(mascarello, F.), 오젬(Augem, S.), 반 룬 및 비스의 문헌[Thermal denaturation of phytases and pH 2.5 acid phosphatase studied by differential scanning calorimetry. In The Biochemistry of phytate and phytase(eds. Rasmussen, S. K.; Raboy, V.; Dalboge, H. and Loewus, F.); Kluwer Academic Publishers, 1997].

코스그로브(Cosgrove, D. J.)의 문헌[Inositol phosphates-their chemistry, biochemistry and physiology: studies in organic chemistry, chapter 4, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New York, 1980].

드베류, 해베를리(Haeberli, P.) 및 스미시즈(Smithies, O.)의 문헌[A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX, Nucleic Acids Res., 12, 387-395, 1984].

젤리센, 홀렌베르크(Hollenberg, C. P.) 및 자노윅즈(Janowicz, Z. A.)의 문헌[Gene expression in methylotrophic yeasts. In: Smith, A.(ed.) Gene expression in recombinant microorganism, Dekker, New York, 395-439, 1994].

젤리센, 피온텍(Piontek, M.), 다흘렘즈(Dahlems, U.), 젠젤류스키(Jenzelewski, V.), 가바간(Gavagan, J. E.), 디코시모(DiCosimo, R.), 안톤(Anton, D. I.) 및 자노윅즈의 문헌[Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst: coexpression of the spinach glycolate oxidase(GO) and the S. cerevisiae catalase T(CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol., 46, 46-54, 1996].

거버(Gerber, P.) 및 뮬러(Muller, K.)의 문헌[Moloc molecular modeling software, J. Comput. Aided Mol. Des., 9, 251-268, 1995].

힌넨, 힉스(Hicks, J. B.) 및 핀크(Finck, G. R.)의 문헌[Transformation of yeast, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 75, 1929-1933, 1978].

이마나카(Imanaka, T.), 시바자키(Shibazaki, M.) 및 다카기(Takagi, M.)의 문헌[A new way of enhancing the thermostability of proteases, Nature, 324, 695-697, 1986].

제인스, 메이학크(Meyhack, B.), 짐머만(Zimmermann, W.) 및 힌넨의 문헌[The influence of GAP promoter variants on hirudine production, average plasmid copy number and cell growth in Saccharomyces cerevisiae, Curr. Genet., 18, 97-103, 1990].

카푸사스(Karpusas, M.), 바세(Baase, W. A.), 마쓰므라(Matsumura, M.) 및 매튜스의 문헌[Hydrophobic packing in T4 lysozyme probed by cavity-filling mutants, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 86, 8237-8241, 1989].

마가리트(Margarit, I.), 캄파놀리(Campagnoli, S.), 프리제리오(Frigerio, F.), 그랜디(Grandi, G.), 필리피스(Fillipis, V. D.) 및 폰타나(Fontana, A.)의 문헌[Cumulative stabilizing effects of glycine to alanine substitutions in Bacillus subtilis neutral protease, Prot. Eng., 5, 543-550, 1992].

매튜스의 문헌[Genetic and structural analysis of the protein stability problem, Biochemistry, 26, 6885-6888, 1987a].

매튜스의 문헌[Structural and genetic analysis of protein stability, Annu. Rev. Biochem., 62, 139-160, 1993].

매튜스, 니콜손(Nicholson, H.) 및 벡크텔(Becktel, W.)의 문헌[Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 84, 6663-6667, 1987].

미첼, 보젤(Vogel, K.), 웨이만(Weimann, B. J.), 파사몬테스 및 반 룬의 문헌[The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila, Microbiology, 143, 245-252, 1997].

뮬라니, 해머(Hamer, J. E.), 로버티(Roberti, K. A.), 옐톤(Yelton, M. M.) 및 팀버레이크(Timberlake, W. E.)의 문헌[Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans, Mol. Gen. Genet., 199, 37-46, 1985].

무노즈(Munoz, V.) 및 세라노(Serrano, L.)의 문헌[Helix design, prediction and stability, Curr. Opin. Biotechnol., 6, 382-386, 1995].

페이스, 바이도스(Vajdos, F.), 피(Fee, L.), 그림즐리(Grimsley, G.) 및 그레이(Gray, T.)의 문헌[How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Proc. Sci., 4, 2411-2423, 1995].

판톨리아노(Pantoliano, M. W.), 랜드너(Landner, R. C.), 브라이언(Brian, P. N.), 롤렌스(Rollence, M. L.), 우드(Wood, J. F.) 및 폴로스(Poulos, T. L.)의 문헌[Protein engineering of subtilisin BPN: enhanced stabilization through the introduction of two cysteines to form a disulfide bond, Biochemistry, 26, 2077-2082, 1987].

파사몬테스, 하이커(Haiker, M.), 헨리퀘즈-후에카스(Henriquez-Huecas, M.), 미첼 및 반 룬의 문헌[Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus, Biochem. Biophys. Acta., 1353, 217-223, 1997a].

파사몬테스, 하이커, 비스, 테시어(Tessier, M.) 및 반 룬의 문헌[Cloning, purification and characterization of a heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus, Appl. Environ. Microbiol., 63, 1696-1700, 1997].

피딩톤, 휴스톤(Houston, C. S.), 팔로헤이모(Paloheimo, M.), 칸트렐(Cantrell, M.), 미에티넨-오이노넨(Miettinen-Oinonen, A.), 네발라이넨(Nevalainen, H.) 및 람보섹(Rambosek, J.)의 문헌[The cloning and sequencing of the genes encoding phytase(phy) and pH 2.5-optimum acid phosphatase(aph) from Aspergillus niger var. awamori, Gene, 133, 55-62, 1993].

퍼비스, 베타니(Bettany, A. J. E.), 산티아고(Santiago, T. C.), 코긴스(Coggins, J. R.), 둔칸(Duncan, K.), 이손(Eason, R.) 및 브라운의 문헌[The efficiency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translation in vivo, J. Mol. Biol., 193, 413-417, 1987].

리스(Risse, B.), 스템퍼(Stempfer, G.), 루돌프(Rudolph, R.), 슈마커(Schumacher, G.) 및 재닉케(Jaenicke, R.)의 문헌[Characterization of the stability effect of point mutations of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum: protection of the native state by modulating coenzyme binding and subunit interaction, Proc. Sci., 1, 1710-1718, 1992].

샘브루크, 프릿츠(Fritsch, E. F.) 및 마니아티스(Maniatis, T.)의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989].

사우어(Sauer, R.), 헤이르(Hehir, K.), 스티어만(Stearman, R.), 웨이스(Weiss, M.), 제이틀러-닐슨(Jeitler-Nilsson, A.), 서차넥크(Suchanek, E.) 및 파보(Pabo, C.)의 문헌[An engineered intersubunit disulfide enhances the stability and DNA binding of the N-terminal domain of l-repressor, Biochemistry, 25, 5992-5999, 1986].

세라노, 데이(Day, A. G.) 및 페르쉬트(Fersht, A. R.)의 문헌[Step-wise mutation of barnase to binase. A procedure for engineering increased stability of proteins and an experimental analysis of the evolution of protein stability, J. Mol. Biol., 233, 305-312, 1993].

쉐르만, 핀크 및 힉스의 문헌[Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor University, 1986].

스테이프(Steipe, B.), 쉴러(Schiller, B.), 플루엑툰(Plueckthun, A.) 및 스테인바흐(Steinbach, S.)의 문헌[Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain, J. Mol. Biol., 240, 188-192, 1994].

반 덴 베르크(van den Burg, B.), 브리엔드(Vriend, G.), 벨트만(Veltman, O. R.), 베네마(Venema, G.) 및 에이신크(Eijsink, V. G. H.)의 문헌[Engineering an enzyme to resist boiling, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95, 2056-2060, 1998].

반 에텐(van Etten, R. L.)의 문헌[Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase, Ann. NY Acad. Sci., 390, 27-50, 1982].

반 하팅스벨트, 반 제이질(van Zeijl, C. M. F.), 하트벨트(Harteveld, G. M.), 고우카(Gouka, R. J.), 수이커부이크(Suykerbuyk, M. E. G.), 루이텐(Luiten, R. G. M.), 반 파리돈(van Paridon, P. A.), 셀텐(Selten. G. C. M.), 빈스트라(Veenstra, A. E.), 반 고르콤(van Gorcom, R. F. M.) 및 반 덴 혼델(van den Hondel, C. A. M. J. J.)의 문헌[Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene(phyA) of Aspergillus niger, Gene, 127, 87-94, 1993].

반 룬, 시모에즈-눈스(Simoes-Nunes, C.), 비스, 톰스키(Tomschy, A.), 허그(Hug, D.), 보젤 및 파사몬테스의 문헌[A heat resistant phytase of Aspergillus fumigatus with superior performance in animal experiments. Phytase optimization and natural variability. In the Biochemistry of phytate and phytases, Kluwer Academic Press, 1998].

비스, 파사몬테스, 레마이(Remy, R.), 쾨흘러(Kohler, J.), 쿠스즈니르(Kusznir, E.), 가디언트(Gadient, M.), 뮬러(Muller, F.) 및 반 룬의 문헌[Comparison of the thermostability properties of three acid phosphatases from molds: Aspergillus fumigatus phytase, A. niger phytase, and A. niger pH 2.5 acid phosphatase, Appl. Environ. Microbiol., 64, 4446-4451, 1998].

본 발명에 의해, 펠렛화, 압출 및 팽창과 같은 다양한 사료 처리 과정중에 발생하는 고온에 견딜 수 있고 장기간의 저장 동안 안정한 피테이스, 바람직하게는 열에 안정한 피테이스를 수득할 수 있고, 이 피테이스로 처리된 사료를 동물에게 먹임으로써 추가의 인을 첨가할 필요없이 단일 위장을 갖는 동물에게 섭취 요구량의 인을 제공할 수 있다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Phytase formulation <130> 2 <150> EP 98111960.5 <151> 1998-06-29 <160> 69 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 1426 <212> DNA <213> Consensus phytase-1 <220> <221> CDS <222> (12)..(1412) <400> 1 tatatgaatt c atg ggc gtg ttc gtc gtg cta ctg tcc att gcc 44 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala 1 5 10 acc ttg ttc ggt tcc aca tcc ggt acc gcc ttg ggt cct cgt ggt aat 92 Thr Leu Phe Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn 15 20 25 tct cac tct tgt gac act gtt gac ggt ggt tac caa tgt ttc cca gaa 140 Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu 30 35 40 att tct cac ttg tgg ggt caa tac tct cca tac ttc tct ttg gaa gac 188 Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Glu Asp 45 50 55 gaa tct gct att tct cca gac gtt cca gac gac tgt aga gtt act ttc 236 Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Asp Asp Cys Arg Val Thr Phe 60 65 70 75 gtt caa gtt ttg tct aga cac ggt gct aga tac cca act tct tct aag 284 Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Lys 80 85 90 tct aag gct tac tct gct ttg att gaa gct att caa aag aac gct act 332 Ser Lys Ala Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr 95 100 105 gct ttc aag ggt aag tac gct ttc ttg aag act tac aac tac act ttg 380 Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu 110 115 120 ggt gct gac gac ttg act cca ttc ggt gaa aac caa atg gtt aac tct 428 Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asn Ser 125 130 135 ggt att aag ttc tac aga aga tac aag gct ttg gct aga aag att gtt 476 Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val 140 145 150 155 cca ttc att aga gct tct ggt tct gac aga gtt att gct tct gct gaa 524 Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu 160 165 170 aag ttc att gaa ggt ttc caa tct gct aag ttg gct gac cca ggt tct 572 Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ser 175 180 185 caa cca cac caa gct tct cca gtt att gac gtt att att cca gaa gga 620 Gln Pro His Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile Ile Pro Glu Gly 190 195 200 tcc ggt tac aac aac act ttg gac cac ggt act tgt act gct ttc gaa 668 Ser Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys Thr Ala Phe Glu 205 210 215 gac tct gaa ttg ggt gac gac gtt gaa gct aac ttc act gct ttg ttc 716 Asp Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Leu Phe 220 225 230 235 gct cca gct att aga gct aga ttg gaa gct gac ttg cca ggt gtt act 764 Ala Pro Ala Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Thr 240 245 250 ttg act gac gaa gac gtt gtt tac ttg atg gac atg tgt cca ttc gaa 812 Leu Thr Asp Glu Asp Val Val Tyr Leu Met Asp Met Cys Pro Phe Glu 255 260 265 act gtt gct aga act tct gac gct act gaa ttg tct cca ttc tgt gct 860 Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser Pro Phe Cys Ala 270 275 280 ttg ttc act cac gac gaa tgg aga caa tac gac tac ttg caa tct ttg 908 Leu Phe Thr His Asp Glu Trp Arg Gln Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu 285 290 295 ggt aag tac tac ggt tac ggt gct ggt aac cca ttg ggt cca gct caa 956 Gly Lys Tyr Tyr 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aac 1292 Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn 415 420 425 gac aga gtt gtt cca ttg cac ggt tgt gct gtt gac aag ttg ggt aga 1340 Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp Lys Leu Gly Arg 430 435 440 tgt aag aga gac gac ttc gtt gaa ggt ttg tct ttc gct aga tct ggt 1388 Cys Lys Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly 445 450 455 ggt aac tgg gct gaa tgt ttc gct taagaatt catata 1426 Gly Asn Trp Ala Glu Cys Phe Ala 460 465 <210> 2 <211> 467 <212> PRT <213> Consensus phytase-1 <400> 2 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala Thr Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn Ser His Ser Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp 35 40 45 Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Glu Asp Glu Ser Ala Ile Ser 50 55 60 Pro Asp Val Pro Asp Asp Cys Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Lys Ser Lys Ala Tyr Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Pro Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala 145 150 155 160 Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ser Gln Pro His Gln Ala 180 185 190 Ser Pro Val Ile Asp Val Ile Ile Pro Glu Gly Ser Gly Tyr Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp His Gly Thr Cys Thr Ala Phe Glu Asp Ser Glu Leu Gly 210 215 220 Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala Ile Arg 225 230 235 240 Ala Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp 245 250 255 Val Val Tyr Leu Met Asp Met Cys Pro Phe Glu Thr Val Ala Arg Thr 260 265 270 Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser Pro Phe Cys Ala Leu Phe Thr His Asp 275 280 285 Glu Trp Arg Gln Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 Tyr Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly 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Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu 30 35 40 att tct cac ttg tgg ggt caa tac tct cca ttc ttc tct ttg gct gac 188 Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asp 45 50 55 gaa tct gct att tct cca gac gtt cca aag ggt tgt aga gtt act ttc 236 Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Lys Gly Cys Arg Val Thr Phe 60 65 70 75 gtt caa gtt ttg tct aga cac ggt gct aga tac cca act tct tct aag 284 Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Lys 80 85 90 tct aag aag tac tct gct ttg att gaa gct att caa aag aac gct act 332 Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr 95 100 105 gct ttc aag ggt aag tac gct ttc ttg aag act tac aac tac act ttg 380 Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu 110 115 120 ggt gct gac gac ttg act cca ttc ggt gaa caa caa atg gtt aac tct 428 Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln Met Val Asn Ser 125 130 135 ggt att aag ttc tac aga aga tac aag gct ttg gct aga aag att gtt 476 Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val 140 145 150 155 cca ttc gtt aga gct tct ggt tct gac aga gtt att gct tct gct gaa 524 Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu 160 165 170 aag ttc att gaa ggt ttc caa tct gct aag ttg gct gac cca ggt gct 572 Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ala 175 180 185 aac cca cac caa gct tct cca gtt att aac gtt att att cca gaa ggt 620 Asn Pro His Gln Ala Ser Pro Val Ile Asn Val Ile Ile Pro Glu Gly 190 195 200 gct ggt tac aac aac act ttg gac cac ggt ttg tgt act gct ttc gaa 668 Ala Gly Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Leu Cys Thr Ala Phe Glu 205 210 215 gaa tct gaa ttg ggt gac gac gtt gaa gct aac ttc act gct gtt ttc 716 Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Val Phe 220 225 230 235 gct cca cct att aga gct aga ttg gaa gct cac ttg cca ggt gtt aac 764 Ala Pro Pro Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu Pro Gly Val Asn 240 245 250 ttg act gac gaa gac gtt gtt aac ttg atg gac atg tgt cca ttc 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tac aac ggt act aag 1148 Thr Met Val Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys 365 370 375 cca ttg tct act act tct gtt gaa tct att gaa gaa act gac ggt tac 1196 Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu Thr Asp Gly Tyr 380 385 390 395 gct gct tct tgg act gtt cca ttc gct gct aga gct tac gtt gaa atg 1244 Ala Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala Tyr Val Glu Met 400 405 410 atg caa tgt gaa gct gaa aag gaa cca ttg gtt aga gtt ttg gtt aac 1292 Met Gln Cys Glu Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn 415 420 425 gac aga gtt gtt cca ttg cac ggt tgt ggt gtt gac aag ttg ggt aga 1340 Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Gly Val Asp Lys Leu Gly Arg 430 435 440 tgt aag aga gac gac ttc gtt gaa ggt ttg tct ttc gct aga tct ggt 1388 Cys Lys Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly 445 450 455 ggt aac tgg gaa gaa tgt ttc gct taagaatt catata 1426 Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala 460 465 <210> 5 <211> 467 <212> PRT <213> Consensus phytase-10 <400> 5 Met Gly Val 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Asp Glu Ser Ala Ile Ser 50 55 60 cca gac gtt cca gac gac tgt aga gtt act ttc gtt caa gtt ttg tct 240 Pro Asp Val Pro Asp Asp Cys Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 aga cac ggt gct aga tac cca act tct tct gcg tct aag gct tac tct 288 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Ala Ser Lys Ala Tyr Ser 85 90 95 gct ttg att gaa gct att caa aag aac gct act gct ttc aag ggt aag 336 Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys 100 105 110 tac gct ttc ttg aag act tac aac tac act ttg ggt gct gac gac ttg 384 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 act cca ttc ggt gaa aac caa atg gtt aac tct ggt att aag ttc tac 432 Thr Pro Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 aga aga tac aag gct ttg gct aga aag att gtt cca ttc att aga gct 480 Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala 145 150 155 160 tct ggt tct gac aga gtt att gct tct gct gaa aag ttc att gaa ggt 528 Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala 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gtt tcc atc 1104 Ala Thr Met Tyr Val Asp Phe Ser His Asp Asn Ser Met Val Ser Ile 355 360 365 ttc ttt gca ttg ggc ctg tac aac ggc act gaa ccc ttg tcc cgg acc 1152 Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Glu Pro Leu Ser Arg Thr 370 375 380 tcg gtg gaa agc gcc aag gaa ttg gat ggg tat tct gca tcc tgg gtg 1200 Ser Val Glu Ser Ala Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Val 385 390 395 400 gtg cct ttc ggc gcg cga gcc tac ttc gag acg atg caa tgc aag tcg 1248 Val Pro Phe Gly Ala Arg Ala Tyr Phe Glu Thr Met Gln Cys Lys Ser 405 410 415 gaa aag gag cct ctt gtt cgc gct ttg att aat gac cgg gtt gtg cca 1296 Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Ala Leu Ile Asn Asp Arg Val Val Pro 420 425 430 ctg cat ggc tgc gat gtg gac aag ctg ggg cga tgc aag ctg aat gac 1344 Leu His Gly Cys Asp Val Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asn Asp 435 440 445 ttt gtc aag gga ttg agt tgg gcc aga tct ggg ggc aac tgg gga gag 1392 Phe Val Lys Gly Leu Ser Trp Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Gly Glu 450 455 460 tgc ttt agt tga 1404 Cys Phe Ser 465 <210> 12 <211> 467 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus ATCC 13073 phytase a-mutant <400> 12 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala Thr Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn His Ser Lys Ser Cys 20 25 30 Asp Thr Val Asp Leu Gly Tyr Gln Cys Ser Pro Ala Thr Ser His Leu 35 40 45 Trp Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Glu Asp Glu Leu Ser Val 50 55 60 Ser Ser Lys Leu Pro Lys Asp Cys Arg Ile Thr Leu Val Gln Val Leu 65 70 75 80 Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Lys Ser Lys Lys Tyr 85 90 95 Lys Lys Leu Ile Thr Ala Ile Gln Ala Asn Ala Thr Asp Phe Lys Gly 100 105 110 Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp 115 120 125 Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe 130 135 140 Tyr Gln Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Ser Val Val Pro Phe Ile Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala Ser Gly Glu Lys Phe Ile Glu 165 170 175 Gly Phe Gln Gln Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ala Thr Asn Arg Ala 180 185 190 Ala Pro Ala Ile Ser Val Ile Ile Pro Glu Ser Glu Thr Phe Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp His Gly Val Cys Thr Lys Phe Glu Ala Ser Gln Leu Gly 210 215 220 Asp Glu Val Ala Ala Asn Phe Thr Ala Leu Phe Ala Pro Asp Ile Arg 225 230 235 240 Ala Arg Leu Glu Lys His Leu Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp 245 250 255 Val Val Ser Leu Met Asp Met Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr 260 265 270 Ser Asp Ala Ser Gln Leu Ser Pro Phe Cys Gln Leu Phe Thr His Asn 275 280 285 Glu Trp Lys Lys Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 Tyr Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Ala Gln Gly Ile Gly Phe Thr 305 310 315 320 Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Ser Pro Val Gln Asp His Thr 325 330 335 Ser Thr Asn Ser Thr Leu Val Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ala Thr Met Tyr Val Asp Phe Ser His Asp Asn Ser Met Val Ser Ile 355 360 365 Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Glu Pro Leu Ser Arg Thr 370 375 380 Ser Val Glu Ser Ala Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Val 385 390 395 400 Val Pro Phe Gly Ala Arg Ala Tyr Phe Glu Thr Met Gln Cys Lys Ser 405 410 415 Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Ala Leu Ile Asn Asp Arg Val Val Pro 420 425 430 Leu His Gly Cys Asp Val Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asn Asp 435 440 445 Phe Val Lys Gly Leu Ser Trp Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Gly Glu 450 455 460 Cys Phe Ser 465 <210> 13 <211> 1426 <212> DNA <213> Consensus phytase-7 <220> <221> CDS <222> (12)..(1412) <400> 13 tatatgaatt c atg ggc gtg ttc gtc gtg cta ctg tcc att gcc 44 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala 1 5 10 acc ttg ttc ggt tcc aca tcc ggt acc gcc ttg ggt cct cgt ggt aat 92 Thr Leu Phe Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn 15 20 25 tct cac tct tgt gac act gtt gac ggt ggt tac caa tgt ttc cca gaa 140 Ser His Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu 30 35 40 att tct cac ttg tgg ggt caa tac tct cca tac ttc tct ttg gaa gac 188 Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Glu Asp 45 50 55 gaa tct gct att tct cca gac gtt cca gac gac tgt aga gtt act ttc 236 Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Asp Asp Cys Arg Val Thr Phe 60 65 70 75 gtt caa gtt ttg tct aga cac ggt gct aga tac cca act gac tct aag 284 Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys 80 85 90 ggt aag aag tac tct gct ttg att gaa gct att caa aag aac gct act 332 Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr 95 100 105 gct ttc aag ggt aag tac gct ttc ttg aag act tac aac tac act ttg 380 Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu 110 115 120 ggt gct gac gac ttg act cca ttc ggt gaa aac caa atg gtt aac tct 428 Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asn Ser 125 130 135 ggt att aag ttc tac aga aga tac aag gct ttg gct aga aag att gtt 476 Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val 140 145 150 155 cca ttc att aga gct tct ggt tct tct aga gtt att gct tct gct gaa 524 Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu 160 165 170 aag ttc att gaa ggt ttc caa tct gct aag ttg gct gac cca ggt tct 572 Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ser 175 180 185 caa cca cac caa gct tct cca gtt att gac gtt att att tct gac gct 620 Gln Pro His Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile Ile Ser Asp Ala 190 195 200 tct tct tac aac aac act ttg gac cca ggt act tgt act gct ttc gaa 668 Ser Ser Tyr Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Ala Phe Glu 205 210 215 gac tct gaa ttg gct gac act gtt gaa gct aac ttc act gct ttg ttc 716 Asp Ser Glu Leu Ala Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Leu Phe 220 225 230 235 gct cca gct att aga gct aga ttg gaa gct gac ttg cca ggt gtt act 764 Ala Pro Ala Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Thr 240 245 250 ttg act gac act gaa gtt act tac ttg atg gac atg tgt tct ttc gaa 812 Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Glu 255 260 265 act gtt gct aga act tct gac gct act gaa ttg tct cca ttc tgt gct 860 Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser Pro Phe Cys Ala 270 275 280 ttg ttc act cac gac gaa tgg aga cac tac gac tac ttg caa tct ttg 908 Leu Phe Thr His Asp Glu Trp Arg His Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu 285 290 295 aag aag tac tac ggt cac ggt gct ggt aac cca ttg ggt cca act caa 956 Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln 300 305 310 315 ggt gtt ggt ttc gct aac gaa ttg att gct aga ttg act aga tct cca 1004 Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Ser Pro 320 325 330 gtt caa gac cac act tct act aac cac act ttg gac tct aac cca gct 1052 Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala 335 340 345 act ttc cca ttg aac gct act ttg tac gct gac ttc tct cac gac aac 1100 Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn 350 355 360 ggt att att tct att ttc ttc gct ttg ggt ttg tac aac ggt act gct 1148 Gly Ile Ile Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Ala 365 370 375 cca ttg tct act act tct gtt gaa tct att gaa gaa act gac ggt tac 1196 Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu Thr Asp Gly Tyr 380 385 390 395 tct tct gct tgg act gtt cca ttc gct tct aga gct tac gtt gaa atg 1244 Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Ala Tyr Val Glu Met 400 405 410 atg caa tgt caa gct gaa aag gaa cca ttg gtt aga gtt ttg gtt aac 1292 Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn 415 420 425 gac aga gtt gtt cca ttg cac ggt tgt gct gtt gac aag ttg ggt aga 1340 Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Ala Val Asp Lys Leu Gly Arg 430 435 440 tgt aag aga gac gac ttc gtt gaa ggt ttg tct ttc gct aga tct ggt 1388 Cys Lys Arg Asp Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly 445 450 455 ggt aac tgg gct gaa tgt ttc gct taagaatt catata 1426 Gly Asn Trp Ala Glu Cys Phe Ala 460 465 <210> 14 <211> 467 <212> PRT <213> Consensus phytase-7 <400> 14 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala Thr Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn Ser His Ser Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp 35 40 45 Gly Gln Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Glu Asp Glu Ser Ala Ile Ser 50 55 60 Pro Asp Val Pro Asp Asp Cys Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Thr Pro Phe Gly Glu Asn Gln Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ser Gln Pro His Gln Ala 180 185 190 Ser Pro Val Ile Asp Val Ile Ile Ser Asp Ala Ser Ser Tyr Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Ala Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala 210 215 220 Asp Thr Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Leu Phe Ala Pro Ala Ile Arg 225 230 235 240 Ala Arg Leu Glu Ala Asp Leu Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Thr Glu 245 250 255 Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Glu Thr Val Ala Arg Thr 260 265 270 Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser Pro Phe Cys Ala Leu Phe Thr His Asp 275 280 285 Glu Trp Arg His Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Phe Ala 305 310 315 320 Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Ser Pro Val Gln Asp His Thr 325 330 335 Ser Thr Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile 355 360 365 Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Pro Leu Ser Thr Thr 370 375 380 Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu Thr Asp Gly Tyr Ser Ser Ala Trp Thr 385 390 395 400 Val Pro Phe Ala Ser Arg Ala Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala 405 410 415 Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro 420 425 430 Leu His Gly Cys Ala Val Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Arg Asp Asp 435 440 445 Phe Val Glu Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Ala Glu 450 455 460 Cys Phe Ala 465 <210> 15 <211> 467 <212> PRT <213> Consensus phytase 12(consphy12) <400> 15 Met Gly Val Phe Val Val Leu Leu Ser Ile Ala Thr Leu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Thr Ser Gly Thr Ala Leu Gly Pro Arg Gly Asn Ser His Ser Cys Asp 20 25 30 Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln Cys Phe Pro Glu Ile Ser Ser Asn Trp 35 40 45 Ser Pro Tyr Ser Pro Tyr Phe Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala Ile Ser 50 55 60 Pro Asp Val Pro Lys Gly Cys Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Gln 65 70 75 80 Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Ala Thr Arg Ile Ser 85 90 95 Ala Leu Ile Glu Ala Ile Gln Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys 100 105 110 Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu 115 120 125 Val Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser Ser Gln Ala Gly Ile Lys Phe Tyr 130 135 140 Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala 145 150 155 160 Ser Gly Ser Asp Arg Val Ile Asp Ser Ala Thr Asn Trp Ile Glu Gly 165 170 175 Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala Asp Pro Gly Ala Asn Pro His Gln Ala 180 185 190 Ser Pro Val Ile Asn Val Ile Ile Pro Glu Gly Ala Gly Tyr Asn Asn 195 200 205 Thr Leu Asp His Gly Leu Cys Thr Ala Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly 210 215 220 Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe Thr Ala Val Phe Ala Pro Pro Ile Arg 225 230 235 240 Ala Arg Leu Glu Ala His Leu Pro Gly Val Asn Leu Thr Asp Glu Asp 245 250 255 Val Val Asn Leu Met Asp Met Cys Pro Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr 260 265 270 Ser Asp Ala Thr Glu Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp 275 280 285 Glu Trp Ile Gln Tyr Asp Tyr Leu Gly Asp Leu Asp Lys Tyr Tyr Gly 290 295 300 Thr Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Val 305 310 315 320 Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr 325 330 335 Ser Thr Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 340 345 350 Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Thr Met Val Ala Ile 355 360 365 Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr 370 375 380 Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Leu 385 390 395 400 Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Glu Ala 405 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Primer for mutation(Q50T) <400> 24 cacttgtggg gtacctactc tccatacttc tc 32 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(Y54F) <400> 25 ggtcaatact ctccattctt ctctttggaa g 31 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(E58A) <400> 26 catacttctc tttggcagac gaatctgc 28 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(D69K) <400> 27 ctccagacgt cccaaaggac tgtagagtta c 31 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(D70G) <400> 28 ctccagacgt cccagacggc tgtagagtta c 31 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Primer for mutation(K91A) <400> 29 gatacccaac ttcttctgcg tctaaggctt actctg 36 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(A94K) <400> 30 cttctaagtc taagaagtac tctgctttg 29 <210> 31 <211> 41 <212> DNA <213> Primer for mutation(A101R) <400> 31 gcttactctg ctttgattga acggattcaa aagaacgcta c 41 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(N134Q) <400> 32 ccattcggtg aacagcaaat ggttaactc 29 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(K153N) <400> 33 gatacaaggc tctcgcgaga aacattgttc 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(I158V) <400> 34 gattgttcca ttcgtgcgcg cttctggttc 30 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(D197N) <400> 35 ctccagttat taacgtgatc attccagaag g 31 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(S187A) <400> 36 ggctgaccca ggggcccaac cacaccaagc 30 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Primer for mutation(T214L) <400> 37 cactttggac catggtcttt gtactgcttt cg 32 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Primer for mutation(E222T) <400> 38 gctttcgaag actctaccct aggtgacgac gttg 34 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(V227A) <400> 39 ggtgacgacg ctgaagctaa cttcac 26 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(L234V) <400> 40 ctaacttcac cgcggtgttc gctccag 27 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Primer for mutation(A238P) <400> 41 gctttgttcg ctccacctat tagagctaga ttgg 34 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(T251N) <400> 42 gccaggtgtt aacttgactg acgaag 26 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(Y259N) <400> 43 gacgaagacg tcgttaactt gatggac 27 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(E267D) <400> 44 gtccattcga cactgtcgct agaacttc 28 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(E277Q) <400> 45 ctgacgctac tcagctgtct ccattc 26 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(A283D) <400> 46 gtctccattc tgtgatttgt tcactcac 28 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(H287A) <400> 47 gctttgttca ccgcggacga atggag 26 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(R291I) <400> 48 cacgacgaat ggatccaata cgactac 27 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(Q292A) <400> 49 gacgaatgga gagcgtacga ctacttg 27 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(A320V) <400> 50 ggtgttggtt tcgttaacga attgattgc 29 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(R329H) <400> 51 gctagattga ctcactctcc agttcaag 28 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Primer for mutation(S364T) <400> 52 ctcacgacaa cactatgata tctattttct tc 32 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(I366V) <400> 53 cgacaactcc atggtttcta ttttcttcgc 30 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(A379K) <400> 54 gtacaacggt accaagccat tgtctac 27 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Primer for mutation(S396A) <400> 55 ctgacggtta cgctgcttct tggac 25 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(G404A) <400> 56 ctgttccatt cgctgctaga gcttac 26 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(Q415E) <400> 57 gatgcaatgt gaagctgaaa aggaacc 27 <210> 58 <211> 26 <212> DNA <213> Primer for mutation(A437G) <400> 58 cacggttgtg gtgtcgacaa gttggg 26 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(A463E) <400> 59 gatctggtgg caattgggag gaatgtttcg 30 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(F55Y) <400> 60 cacgtactcg ccatactttt cgctcgag 28 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <213> Primer for mutation(E58A) <400> 61 ccatactttt cgctcgcgga cgagctgtcc gtg 33 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(V100I) <400> 62 gtataagaag cttattacgg cgatccaggc c 31 <210> 63 <211> 31 <212> DNA <213> Primer for mutation(F114Y) <400> 63 cttcaagggc aagtacgcct ttttgaagac g 31 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(A243L) <400> 64 catccgagct cgcctcgaga agcatcttc 29 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(S265P) <400> 65 ctaatggatg tgtccgtttg atacggtag 29 <210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> Primer for mutation(N294D) <400> 66 gtggaagaag tacgactacc ttcagtc 27 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Primer for mutation(R329H) <400> 67 gcccggttga cgcattcgcc agtgcagg 28 <210> 68 <211> 29 <212> DNA <213> Primer for mutation(S364T) <400> 68 cacacgacaa caccatggtt tccatcttc 29 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Primer for mutation(G404A) <400> 69 gtggtgcctt tcgccgcgcg agcctacttc 30

Claims (22)

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2. 비가교결합된 피테이스 단량체와 비교하여 10 내지 15℃ 향상된 내열성을 갖는 진균류 피테이스 단량체를 함유하고, 이때 상기 피테이스 단량체는 소듐 퍼요오데이트로 산화시킨 후 아디프산 디하이드라자이드를 첨가하는 방법에 의해 가교결합된 것인, 무수 또는 액체의 안정화된 효소 배합물.
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4. 제 2 항에 있어서,

   진균류 피테이스는 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 피테이스, 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 피테이스, 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus) 피테이스 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 피테이스로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 배합물.
5. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,

   배합물이 액체인 것을 특징으로 하는 효소 배합물.
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11. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,

    배합물이 무수 고체인 것을 특징으로 하는 효소 배합물.
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19. 제 2 항 또는 제 4 항에 따른 무수 또는 액체의 안정화된 효소 배합물로 사료를 처리하는 것을 특징으로 하는, 단일 위장을 갖는 동물을 위한 사료 조성물을 제조하는 방법.
20. 제 2 항 또는 제 4 항에 따른 무수 또는 액체의 안정화된 효소 배합물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 단일 위장을 갖는 동물을 위한 사료 조성물.
21. 동물에게 제 20 항에 따른 사료 조성물을 먹이고 추가의 인을 사료에 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는, 단일 위장을 갖는 동물에게 섭취 요구량의 인을 제공하는 방법.
22. 제 2 항 또는 제 4 항에 따른 안정화된 효소 배합물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 무수 또는 액체의 피테이스 배합물을 제조하는 방법.

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