KR100575897B1

KR100575897B1 - 미생물 총균수의 측정법

Info

Publication number: KR100575897B1
Application number: KR1020030099640A
Authority: KR
Inventors: 이남혁; 조진호; 김윤지; 김영호; 양승용; 김영붕
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2003-12-30
Publication date: 2006-05-03
Also published as: KR20050068350A

Abstract

본 발명은 미생물의 신속한 측정법에 관한 것으로, 미생물의 ATPase 활성 측정법 및 미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약을 개발하고, 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터 소프트웨어를 개발함으로써, 대략 1시간 이내에 10 검체 이상의 미생물 총균수를 현장에서도 즉시 신속하게 측정할 수 있어, 실험실은 물론 원하는 현장에서 각종 식품에 대한 미생물의 검사를 시간과 장소에 구애받지 않고 다목적으로 실시할 수 있다.

미생물, 측정, ATPase, 활성,

Description

미생물 총균수의 측정법{Method of measuring total bacterial counts of Microbiol}

도1은 본 발명에 따른 미생물 ATPase 활성 반응을 위한 반응시약의 안정성을 나타낸 그래프이며,

도2는 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 미생물 총균수의 신속한 측정법에 관한 것으로, 미생물의 ATPase 활성 측정법 및 미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약을 개발하고, 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터 소프트웨어를 개발함으로써, 대략 1시간 이내에 10 검체 이상의 미생물 총균수를 현장에서도 즉시 신속하게 측정할 수 있어, 실험실은 물론 원하는 현장에서 각종 식품에 대한 미생물의 검사를 시간과 장소에 구애받지 않고 다목적으로 실시할 수 있다.

산업이 발달하고 생활이 윤택해지면서 다양한 식문화가 전개되고 있고, 이와 더불어 식품위생의 중요성도 더욱 부각되고 있다.

최근 식품과 관련하여 식중독 사고가 매년 증가하고 있는 실정이나, 이에 대한 대책은 매우 미흡한 점이 사실이다.

이러한 이유는, 사전에 식중독을 유발시키는 요인을 제거하지 못하기 때문인 것으로 사료되며, 특히 미생물에 대해서 신속하게 검사할 수 있는 방법이 거의 없기 때문인 것으로 사료된다.

종래의 미생물 균수의 측정방법은 배지(표준 한천 평판법)를 제조하여 미생물을 접종한 후 3∼4일간 배양하여 미생물 균수를 분석하는 것이 일반적이다.

최근에는 보다 신속한 측정법이 개발되기 시작하였는데, 예컨대, 3M 패트리필름(patrifilm)에 의한 분석법, ATP 생물발광분석법(Bioluminascence assay), DNA 탐침(DNA Probe)를 이용한 PCR법, ELISA 등을 이용한 효소면역학적인 방법 등이 있다.

상기 3M 파트리필름(Patrifilm)에 의한 분석법은, 기존의 배지를 개량하여 측정하기에 편리하도록 제조한 것이다. 이러한 방법은 배지를 만들지 않아도 된다는 장점은 있으나, 배양하는데 많은 시간(2일 이상)이 소요되며, 가격이 대체적으로 고가이다.

또한, ATP 생물발광분석법의 경우, 일반적으로 세포는 대사작용에 이용되는 에너지의 근원인 ATP를 가지고 있으며, 미생물의 수가 많으면 이에 따라 상대적으로 ATP 함량도 증가하므로, ATP 함량을 측정함으로서 미생물의 수를 측정할 수 있는 원리를 이용한 것이다. 이 분석법은 비교적 신속하게 측정할 수 있으나, 반응시약이 고가이어서 대부분 기존의 표준 한천 평판법을 활용하고 있다.

상기 DNA 탐침(Probe)을 이용한 PCR법은, DNA를 시험관내에서 대량으로 신속하게 증폭하는 방법을 이용한 것이다. PCR의 구성요소는 프라이머 세트(Primer set) (1, 2), dNTPs, Taq 폴리머라제(polymerase)로 되어있으며, 측정원리는 프라이머 1(Primer 1) →프라이머 2 →dNTPs →Taq 폴리머라제 변성(polymerase Denaturation) → 어닐링(Annealing) → 증폭(Extension)의 순으로 되어 있다. 그러나 이 측정방법은 균을 동정하는 데에는 신속(24∼30시간)하게 처리할 수는 있으나, 균수를 측정하기에는 어려움이 있다.

또한, ELISA 등을 이용한 효소면역학적인 방법은, 대상균이 가지고 있는 특이적인 항원에 대하여 인위적으로 제조된 항체(균체)를 결합시키고, 이러한 결합체에 효소 표식인자 및 기질을 반응시켜, 측정기구(ELISA) 등을 이용하여 측정하는 검사법이다. 그러나, 이들은 주로 미생물을 동정하는데 이용되고 있으며, 균수를 측정하는데는 부적합하다.

따라서, 본 발명에서는 상기 종래의 문제점을 개선한 것으로, 미생물의 ATPase 활성 측정법 및 미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약을 개발하고, 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터 소프트웨어를 개발함으로써, 대략 1시간 이내에 10 검체 이상의 미생물 총균수를 현장에서도 즉시 신속하게 측정할 수 있어, 실험실은 물론 원하는 현장에서 각종 식품에 대한 미생물의 검사를 시간과 장소에 구애받지 않고 다목적으로 실시할 수 있는 미생물의 신속한 측정법을 제공하고자 한다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 설명한다.

본 발명의 미생물의 신속한 측정법은 하기 3단계의 시험 및 개발을 통하여 완성하였다.

1) 미생물의 ATPase 활성 측정법의 개발

2) 미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약의 개발(ATPase 활성 측정 시약)

3) 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계식 산출 및 상기 관계식으로부터 소프트웨어(Soft Ware)의 개발

여기서, 본 발명의 측정방법은 2가지( I, II )의 시약으로 나뉘어져 있으며, 시약 I(ATPase 활성 측정시약)은 반응(미생물의 ATPase 활성 반응), 시약 II은 발색시키는 작용(발색시약)을 한다. 또한 시약 I은 매우 불안정하여 안정화시켰다.

ATPase 활성은 Ca, Mg, EDTA를 포함하는 ATPase 활성 측정 시약으로 미생물의 균수를 측정할 수 있는 방법을 개발하였으며, 적당량의 샘플을 시약 I(ATPase 활성 측정 시약)에 첨가한 후 5∼20분간 반응시킨다. 그런 다음, 정지시약을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 시약 II(발색시약)을 첨가하여 10∼20분간 발색시켜 400∼660nm에서의 흡광도를 측정하면 완료된다.

또한 흡광도는 보행성 분광광도계(Potable Spectrophotometer: PSP)를 이용하였으며 PSP 내부에 소프트웨어를 장착하여 흡광도를 측정함으로서 자동적으로 미생물 균수를 알 수 있도록 개발하였다.

이하, 실시예를 통하여 좀더 상세히 설명한다.

실시예 1(미생물의 ATPase 활성 측정법 개발)

미생물의 ATPase 활성 측정법은 다음과 같다.

미생물의 채취는 일반적인 방법과 같은 방법으로 채취한다. 즉, 시료 표면의 미생물을 면봉으로 채취하는 방법 또는 시료의 적당량을 분리하여(중량을 정확히 측정) 약 10배량의 살균수에 첨가하여 현탁시킨다.

상기 현탁된 시료를 반응액 I(ATPase 활성 측정 시약)에 첨가하여 5∼20분간 반응시킨 후, 정지액(TCA: 15% Trichloroacetic acid)을 첨가하여 반응을 정지시킨다.

이것을 여과한 후 반응액 II(발색시약)에 첨가하여 약 20분간 반응시킨 다음, 보행성 분광광도계(PSP)로 O.D(흡광도)값을 측정하면, PSP안에 장착되어 있는 소프트웨어에 의해서 자동적으로 총균수가 측정된다. 이 때에 소요되는 시간은 약 45분 정도이며, 연속적으로 측정할 수 있는 형식이므로, 숙련도에 따라서 1시간에 10∼20 샘플을 측정할 수 있다.

상기 본 발명의 미생물의 ATPase 활성 측정법을 요약하면 하기 표1과 같다.

[미생물 채취] ▶ [ATPase 활성 측정 시약] ▶ [정지] ▶ [여과] ▶ [발색시약] (5~20분 소요) (20분 정도 소요) ▶ [O.D 측정] ▶ [총 균수 자동 출력] ※ 총 소요시간 10~20 sample/1시간

실시예 2(미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약 개발)

반응시약은 크게 2가지로 나눌 수 있으며, 그 중 가장 핵심이 되는 반응시약은 ATP(Adenosine triphosphate)를 포함하는 ATPase 활성 측정시약(시약 I)으로써 미생물의 ATPase 활성을 현장에서 측정할 수 있도록 고안된 시약으로, 1~20mM 농도의 ATP, 각각 1~10mM 농도의 칼슘, 마그네슘, EDTA를 포함하는 것으로 고안된 시약이다.

또한, 여기에 상기 반응시약 I(ATPase 활성 측정시약)을 안정화시키기 위하여, 반응시약을 물리적(초고압, 통전가열 및 고압열처리)으로 처리하였다.

도1은 본 발명의 방법으로 처리한 반응 시약 I(ATPase 활성 측정 시약)의 안정성을 나타낸 그래프이다.

도면에서와 같이, 본 발명의 방법으로 처리한 반응시약 I(ATPase 활성 측정 시약)는 약 100일간 실내에서 저장하여도 안정하였다.

실시예 3(표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터 소프트웨어의 개발)

표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터, ATPase 활성이 미생물의 총균수를 측정할 수 있는지에 대한 검증과 양자간의 관계로부터 산출한 관계식을 이용하여 소프트 웨어를 개발하였다.

한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 ATPase 활성에 의한 미생물의 총균수와의 관계는 2단계의 직선관계를 나타내었으며, 10⁵까지는 천천히 10⁵이상에서는 급격히 상승하는 경향을 나타내었다.

따라서 2단계의 직선관계로부터 각각의 관계식을 산출하면, 초기의 1단계에서는 y = 0.0053x + 0.1254의 식이 성립되었으며, 2단계에서는 y = 0.029x - 0.0027의 관계식이 성립되었다.

도2는 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계를 나타내는 그래프이다. 그러므로 상기 식에서 x는 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수이며, y는 x 값과 같은 총균수의 ATPase 활성을 분광광도계(PSP)로 측정한 O.D 값을 나타낸다.

이상의 결과로부터, ATPase 활성 측정법을 이용하면 미생물의 총균수를 측정할 수 있었으며, 각각의 식을 이용하여 소프트웨어를 개발한 결과, ATPase 활성을 PSP로 O.D. 값을 측정하면, 상기 식에 따라 미생물의 총균수를 신속히 측정할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면 ATPase 활성법에 의해 미생물의 총균수를 신속하고 정확하게 측정할 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 미생물의 ATPase 활성 측정법 및 미생물의 ATPase 활성 측정에 필요한 시약을 개발하고, 표준한천평판법에 의한 미생물의 총균수와 미생물의 ATPase 활성과의 관계로부터 소프트웨어를 개발함으로써, 대략 1시간 이내에 10 검체 이상의 미생물 총균수를 현장에서도 즉시 신속하게 측정할 수 있어, 실험실은 물론 원하는 현장에서 각종 식품에 대한 미생물의 검사를 시간과 장소에 구애받지 않고 다목적으로 실시할 수 있어, 관련 분야에의 이용 및 응용이 기대된다 하겠다.

Claims

삭제
미생물을 채취하는 단계,

상기 채취된 미생물을, 1~20mM 농도의 ATP, 각각 1~10mM 농도의 칼슘, 마그네슘, EDTA를 포함한 ATPase 활성 측정시약에 첨가하는 단계;

상기 ATPase 활성 측정시약에 첨가된 미생물을 5∼20분간 반응시킨 후, 정지액(TCA: 15% Trichloroacetic acid)을 첨가하여 ATPase 활성 반응을 정지시키는 단계;

상기 ATPase 활성 반응이 중지된 반응물을 발색시약에 첨가하여 10~20분간 발색시키는 단계; 및

흡광도(O.D) 값을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 측정방법.
제2항에 있어서,

상기 ATPase 활성 측정시약을 초고압, 통전가열 또는 고압열 처리 방법을 통해 안정화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 측정방법.
삭제