KR100535213B1

KR100535213B1 - 수용성 생리활성물질을 함유하는 나노 액정 캐리어, 그제법 및 그를 함유한 조성물

Info

Publication number: KR100535213B1
Application number: KR10-2003-0047088A
Authority: KR
Inventors: 진병석; 최문재; 한용문
Original assignee: 네비온 주식회사; 진병석
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2005-12-08
Also published as: KR20050007050A

Abstract

본 발명은 (a) HPC(hydrogenated phosphatidyl choline) 또는 HPC-지질 혼합물을 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 용매에 용해시켜 지질 용액을 수득한 다음, 냉각시켜 유방성(lyotropic) 액정을 형성하는 단계; (b) 수용성 생리활성물질의 수용액을 상기 유방성 액정에 첨가한 후 혼합 및 수화과정을 거쳐 수화 액정상(hydrated liquid crystal phase)을 형성하는 단계; (c) 상기 수화 액정상을 상기 수화 액정의 녹는점보다 낮은 온도에서 교반시키면서 완충 용액 또는 정제수를 첨가하여 상기 수화 액정상을 분산시키는 단계; 및 (d) 상기 분산된 수화 액정상을 초음파 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 생리활성물질이 엔캡슐레이션되어 있는 나노 액정 캐리어의 제조방법 및 그 나노 액정 캐리어에 관한 것이다. 또한, 상기 나노 액정 캐리어를 0.1 ~ 99 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 경피투과용 조성물에 관한 것이다.

Description

수용성 생리활성물질을 함유하는 나노 액정 캐리어, 그 제법 및 그를 함유한 조성물{Nano liquid crystal carrier comprising a water-soluble physiological active compound, method for producing the same and composition containing the same}

발명의 분야

본 발명은 수용성 생리활성물질의 경피투과를 증진시키기 위한 신규한 나노 액정 캐리어 및 그 제조방법 및 그 나노 액정 캐리어를 함유하는 경피투과용 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

피부를 통한 흡수경로로서는 각질층을 통한 흡수가 가장 중요한 흡수 경로이나, 각질층은 각질세포 간격이 비극성 지질들로 이루어져 있기 때문에 극성 물질은 거의 흡수가 되지 않고 친지성(lipophilic) 물질만 흡수가 될 수 있다. 따라서 수용성 생리활성물질은 피부흡수가 용이하지 않으므로 수용성 생리활성성분의 경피투과를 촉진시킬 수 있는 방법이 필요하다.

액정은 분자간의 규칙적인 배향에 의하여 액상보다 상대적으로 적은 분자 운동성을 가지며, 이로 인해 점도 및 유동성 면에서는 액체처럼 행동하나, 빛의 산란과 반사 같은 물성에 있어서는 결정성의 물성을 나타내는 등 독특한 성질을 가지고 있다. 이와 같은 상대적으로 적은 분자간 분자 운동성으로 인하여, 액정은 화장품, 의약품 등의 분야에서 불안정한 물질의 안정성을 향상시키는 특성을 나타낸다.

세틸 알콜, 스테아릴 알콜, 옥틸 도데칸올, 비이온 계면활성제로 이루어진 액정은 이미 수년전부터 알려져 왔으나, 상기와 같은 조성의 액정은 단지 제품의 점도를 향상시키기 위하여 사용되었을 뿐이었다.

최근 세라마이드, 세토스테아릴 알콜, 콜레스테롤, 비이온계면활성제 등의 조성에 의하여 액정을 형성하는 방법이 알려졌다. 이 같은 조성으로 형성된 액정은 피부의 생체 세포막 간지질의 구성 형태와 유사한 구조를 가짐으로써, 피부의 간지질과 유사한 보습막을 형성하여 피부에 효과적으로 보습 및 보호기능을 제공할 뿐만 아니라, 사용된 피부유용성 물질의 안정도를 향상시켜 제품의 안정도 향상에 기여하였다. 그러나, 상기 액정 조성물은 비이온 계면활성제 등과 같이 피부에 자극이 되는 성분을 함유하고 있어 피부 트러블을 일으키기 쉽다.

미국특허 제6.224,853호에는 라놀린 유도체를 주축으로 하는 피부유용물질을 포함한 액정 조성물이 개시되어 있으나, 상기에서 사용된 라놀린 유도체는 피부의 알러지 등을 유발할 가능성이 있는 원료이고 변취 등 화장품에 사용하기에 부적합하여 사용이 어려운 단점이 있었다.

상기와 같이 종래의 액정 캐리어들은 피부에 자극을 주는 성분(예, 계면활성제)을 함유하여 피부자극성면에서 불리한 단점이 있었다. 또한 종래에 공지된 액정 캐리어들에서는 생리활성물질의 봉입율이 낮다는 단점이 있어서 원하는 효과를 거두기 힘들었다. 그리고, 종래의 액정 캐리어들의 경우 복잡한 제조과정과 고가의 제조단가로 인해 실용성이 떨어지는 문제점이 있었다.

본 발명자들은 위와 같은 기존의 액정 캐리어들이 갖고 있는 문제점들을 해결하고자 부단히 노력한 결과, 본 발명의 액정 캐리어를 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 경피투과가 용이하지 않은 수용성 생리활성물질의 피부 흡수를 높이기 위한 나노 액정 캐리어 및 그 제조방법을 제공하는데 있다

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 나노 캐리어를 함유하는 경피투과용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 수용성 생리활성물질의 봉입율이 높고 제조방법이 간단하며 제조단가가 낮은 나노 액정 캐리어 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 생체 친화적인 재료만으로 구성된 나노 액정 캐리어 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 수용성 생리활성물질의 경피투과를 증진시키기 위한 신규한 나노 액정 캐리어 및 그 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 신규한 나노 액정 캐리어를 함유하는 경피투과용 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 (a) HPC(hydrogenated phosphatidyl choline) 또는 HPC-지질 혼합물을 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 용매에 용해시켜 지질용액을 수득한 다음, 냉각시켜 유방성(lyotropic) 액정을 형성하는 단계; (b) 수용성 생리활성물질의 수용액을 상기 유방성 액정에 첨가한 후 혼합 및 수화과정을 거쳐 수화 액정상(hydrated liquid crystal phase)을 형성하는 단계; (c) 상기 수화 액정상을 상기 수화 액정의 녹는점보다 낮은 온도에서 교반시키면서 완충용액 또는 정제수를 첨가하여 상기 수화 액정상을 분산시키는 단계; 및 (d) 상기 분산된 수화 액정상을 초음파처리하는 단계를 포함하는 나노 액정 캐리어의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 수용성 생리활성물질이 대략 10 ~ 90 중량%로 엔캡슐레이션되어 있는 나노 액정 캐리어에 관한 것이다. 그리고, 상기 방법에 의해 제조된 나노 액정 캐리어를 대략 0.1 ~ 99 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 경피투과용 조성물에 관한 것이다. 상기 경피투과용 조성물의 예로서는 의약품용 또는 화장품용 경피투과용 조성물을 들 수 있다.

본 발명에서 사용된 HPC는 지방산의 불포화기를 수소첨가반응을 통해 완전 포화시킨 인지질로서, 불포화지방산이 포함된 레시틴에 비해 산화안정성이 좋고, 탈색 및 탈취효과도 있어 장기 안정성이 요구되는 화장품 또는 의약품 원료에 적합하다.

상기 HPC-지질 혼합물은 HPC와 다른 지질과의 혼합물로서, 상기 다른 지질은 화장품 재료로 또는 의약품 재료로 사용가능한 지질을 의미한다. 상기 다른 지질의 예로서는 스테아린산(stearic acid), 올레인산(oleic acid)와 같은 지방산, 콜레스테롤, 포스파티딜세린, 리소 레시틴, 세틸 포스페이트, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 파이토스핑고신 등을 들 수 있으며, 상기 나열된 물질에 한정되는 것은 아니다.

상기 수용성 생리활성물질의 예로서는, 인삼 다당체, 비타민 C, 비타민 C 유도체, 알부틴, 감초, 기타 수용성 천연추출물, 수용성 경피투과용 의약품 등 화장품 원료로서 또는 의약품 원료로서 생리활성효과가 있는 모든 수용성 물질이 가능하며, 상기 나열된 물질에 한정되는 것은 아니다.

상기 수용성 생리활성물질 수용액의 용매의 예로서는, 물, 완충용액 등을 들 수 있으며, 화장품 재료로서 또는 의약품 재료로서 사용가능한 용매를 의미한다.

상기 (c) 단계의 완충용액은 화장품 원료로 또는 의약품 원료로 사용될 수 있는 완충용액을 의미하며, 예를들면 PBS (phosphate buffered saline) 용액 등이고, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 (d) 단계의 초음파처리는 액정 캐리어 크기를 균일하고 작게 만들어 나노 액정 캐리어로 만드는 과정이다.

또한 상기 방법에 의해 제조된 나노 액정 캐리어에는 수용성 생리활성물질이 대략 10 ~ 90 중량%로 엔캡슐레이션되어 있는데, 너무 낮게 엔캡슐레이션되면 생리활성효과가 감소하고, 너무 높은 엔캡슐레이션 효율은 실제적으로 일어나기 힘들다. 또한, 본 발명에서는 상기 방법에 의해 제조된 나노 액정 캐리어를 대략 0.1 ~ 99 중량%로 함유하는 경피투과용 조성물을 제공하는데, 나노 액정 캐리어의 함유율이 너무 낮으면 효과가 감소하고, 너무 높은 함유율은 실제적으로 일어나기 힘들다.

본 발명의 하기에서 사용되는 "에토좀(Ethosome)"이란 용어는 에탄올을 용매로 하여 제조된 나노 액정을 의미하고, "PGsome"은 프로필렌 글리콜(propylene glycol: PG)을 용매로 하여 제조된 나노 액정을 의미하며, "BGsome"은 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-butylene glycol: BG)을 용매로 하여 제조된 나노 액정을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 에토좀 제조

본실시예에서는 수용성 활성성분으로서 생리활성성분 대신 마커(marker)인 칼세인을 사용하였다.

HPC(또는 HPC-지질 혼합물) 1g에 에탄올 1ml을 넣고 60℃에서 용해시켰다. 투명한 상태의 지질용액을 상온에서 냉각시켜 유방성 액정(lyotropic liquid crystal)을 수득하였다. 상기 액정을 다시 60℃에서 용융시키고, 여기에 칼세인 수용액 1ml를 첨가하여 5분 이상 골고루 혼합시키면서 지질 용액상에 수화시켰다. 이를 다시 상온에서 냉각시켜 수화 액정상(hydrated liquid crystal phase)을 수득하였다.

상온에서는 수화 액정의 점도가 너무 높아 교반이 잘 이루어지지 않기 때문에 바람직하게는, 수화 액정의 녹는점(약 55℃)보다 낮은 약 40℃에서 상기 수득된 수화 액정상을 1시간동안 교반시키면서 여기에 PBS 용액(또는 정제수) 38ml 를 서서히 첨가하여 상기 수화 액정상을 분산시켰다.

최종적으로, 상기 분산된 수화 액정상을 초음파로 처리하여 에토좀 (Ethosome)을 제조하였다. 초음파 기기는 VC 505 모델 프로브 타입(probe type )(Sonics & Materials Inc.)을 사용하였고, 초음파 처리는 5분동안(펄스: 5초 켜짐, 1초 꺼짐) 진행하였다. 초음파 처리중 용액의 온도가 과도하게 상승하는 것을 방지하기 위해 용액 주위를 얼음물로 차갑게 유지시켰다. 에토좀 제조과정을 도 1에 요약하여 나타내었다.

에토좀 제조시, 전체 용액 40ml을 기준으로 HPC 또는 HPC-지질 혼합물의 비율은 약 2.5(w/v)% 였다. 바람직하게는, 칼세인 수용액은 포화 용액으로 만들어 사용하였는데, 칼세인은 PBS 1ml에 5mg까지 용해되었다. 칼세인은 용액의 pH에 따라 형광농도가 달라지기 때문에 PBS 완충용액(pH 7.4)을 사용하였다.

실시예 2: PGsome 및 BGsome 제조

본 실시예에서는 수용성 활성성분으로서 생리활성성분 대신 마커인 칼세인을 사용하였다.

HPC(또는 HPC-지질 혼합물) 1g에 프로필렌 글리콜(PG) 2 ml을 넣고 60℃에서 용해시켰다. 60℃에서 에탄올 1ml은 HPC(또는 HPC-지질 혼합물) 1g을 용해시킬 수 있었지만, 프로필렌 글리콜은 에탄올에 비해 지질 용해도가 떨어져 최소 2ml가 필요하였다. 투명한 상태의 지질 용액을 상온에서 냉각시켜 유방성 액정을 수득하였다.

상기 액정을 다시 60℃에서 용융시키고, 여기에 칼세인 수용액 1ml 을 첨가하여 5분 이상 골고루 혼합시키면서 지질 용액상에 수화시켰다. 이를 다시 상온에서 냉각시켜 수화 액정상을 수득하였다.

상기 수득된 수화 액정상을 수화 액정의 녹는점(55℃)보다 낮은 약 40℃에서 1시간동안 교반시키면서 여기에 PBS 용액(또는 정제수) 37ml를 서서히 첨가하여 상기 수화 액정상을 분산시켰다. 그 후에는 에토좀 제조와 동일한 방법으로 초음파 처리과정을 거쳐 PGsome을 수득하였다(도 1). 칼세인 수용액은 포화 용액으로 만들어 사용하였고, 또한 칼세인은 용액의 pH에 따라 형광농도가 달라지기 때문에 PBS 완충용액(pH 7.4)을 사용하였다.

도 2a는 본 실시예에서 제조한 PGsome의 편광현미경 사진이고, 도 2b는 본 실시예에서 제조한 PGsome의 SEM (scanning electron micrography) 사진이다.

BGsome은 프로필렌 글리콜 대신 1,3-부틸렌 글리콜을 용매로 사용하여 PGsome과 동일한 방법으로 제조하였다(도 1).

비교실시예 : 리포좀 제조(기계적 방법)

HPC(또는 HPC에 콜레스테롤을 10 또는 20 중량% 섞은 지질 혼합물) 1g을 둥근바닥 플라스크에 넣고 클로로포름 15ml 에 용해시켰다. 플라스크 벽면에 얇은 지질막(lipid film)이 형성될 때까지 항온조 온도를 50℃로 유지한 상태에서 회전증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 플라스크를 다시 진공오븐에 넣고 건조시켜 잔여 용매가 완전히 제거된 상태의 지질막을 얻었다.

PBS로 제조한 칼세인 수용액 40ml를 플라스크에 넣고 항온조 온도를 60℃로 유지한 후 회전증발기를 이용하여 벽면에 묻어있는 지질막을 수화(hydration)시켰다. 이를 다시 초음파처리하여 리포좀을 완성하였다. 칼세인 수용액은 에토좀 제조할 때와 동일한 포화용액을 사용하였다. 초음파 처리과정도 에토좀 제조시와 동일하게 진행하였다.

제조된 리포좀 입자의 크기는 레이저 광산란 측정장치(Nicomp 380 모델, PSS)를 사용하여 측정하였다. 지질 성분 및 조성에 관계없이 리포좀 모두 1㎛ 이상의 평균입자크기(수평균)를 나타냈다. 또한 칼세인 수용액을 엔캡슐레이션 (encapsulation)한 리포좀의 엔캡슐레이션 효율을 구해본 결과, HPC 리포좀일 경우 5% 미만이고, HPC 에 콜레스테롤이 혼합될수록 엔캡슐레이션 효율이 더욱 감소하였다.

실시예 3: 나노 액정 캐리어 분석

1. 입자크기

가. 에토좀

하기 표 1은 지질성분 구성에 따른 에토좀의 평균입자크기(수평균입자크기) 및 유화상태를 비교한 것이다. 입자 크기는 레이저 광산란 측정장치(Nicomp 380 모델, PSS)를 사용하여 측정하였다. 일반 리포좀은 수평균 입자크기가 모두 1㎛ 이상이었던 것에 반해, 본 발명의 에토좀은 모든 구성에서 1㎛ 이하의 크기를 나타냈다.

지질 구성에 따른 에토좀의 평균입자 크기 및 유화상태

지질구성	수평균입자크기(nm)	유화 상태
HPC	652	균일상 유지
HPC/콜레스테롤(Ch) 10	384	침전물 형성
HPC/콜레스테롤(Ch) 20	281	침전물 형성
HPC/ 포스파티딜 세린(PS) 10	186	균일상 유지
HPC/스테아린산(SA) 10	238	겔(Gel)화
HPC/올레인산(OA) 10	470	겔(Gel)화
HPC/리소 레시틴(LL) 10	91	균일상 유지
HPC/세틸 포스페이트(CP)	36	균일상 유지
HPC/SA 10/Ch 10	358	침전물 형성
HPC/LL 10/Ch 10	453	침전물 형성
HPC/CP 10/Ch 10	487	침전물 형성

HPC 단독으로 만든 경우보다 다른 지질과 혼합하였을 때 비교적 더 작은 크기의 에토좀을 얻을 수 있었고, 콜레스테롤(Ch)의 혼합비율이 높을수록 에토좀 입자 크기가 작아졌다.

스테아린산(SA), 올레인산(OA)과 같은 지방산을 혼합한 경우에는 겔(gel)화가 일어나서 에토좀 용액의 점도가 상승했다.

상기 표 1의 결과에서 가장 눈에 띄는 것은 리소 레시틴(lyso lecithin: LL)이나 세틸 포스페이트(cetyl phosphate: CP)를 혼합한 경우로서, 이 경우 입자크기가 획기적으로 작아져 100nm 이하의 에토좀 입자가 형성되었다. 이 경우 액정을 모으기 위한 하기의 원심분리단계에서도 에토좀 입자가 침전분리되지 않는 등 안정한 유화상태를 유지하였다.

HPC에 스테아린산, 리소레시틴 또는 세틸 포스페이트 외에 콜레스테롤을 첨가하여 3 성분의 지질 혼합물로 에토좀을 만든 경우, 입자 크기는 다시 커지고 에토좀 입자는 용액 밑으로 침전되었다.

나. PGsome, BGsome

지질을 용해시키는 용매로서 에탄올 대신 프로필렌 글리콜(PG) 또는 1,3-부틸렌 글리콜(BG)을 이용하여 나노 액정 캐리어를 만든 후 입자크기를 비교하였다(표 2).

지질 구성에 따른 PGsome, BGsome의 평균입자 크기 및 유화상태

캐리어	지질 구성	수평균입자크기(nm)	유화상태
PGsome	HPC	89	균일상 유지
	HPC/Ch 10	62	침전물 형성
	HPC/LL 10	45	균일상 유지
	HPC/CP 10	47	균일상 유지
BGsome	HPC	83	균일상 유지
	HPC/Ch 10	76	침전물 형성
	HPC/LL 10	51	균일상 유지
	HPC/CP 10	30	균일상 유지

에탄올을 사용한 경우보다 PG 또는 BG 를 각각 사용하여 만든 PGsome 또는 BGsome의 입자가 더욱 작게 형성되었고, 특히 HPC를 단독으로 사용한 경우에 에탄올로 용해시켜 만들었을 때보다 PG 또는 BG로 용해시켜 만들었을 때 액정의 수평균 입자크기가 100nm 이하로 현저하게 작아졌다.

HPC/LL 10 또는 HPC/CP 10의 조성으로 만든 경우, 용매의 종류에 관계없이 수십 nm 크기의 균일한 액정입자가 형성되었고, 균일하면서도 안정한 유화상태가 지속되었다. 또한 HPC/CP 10으로 제조한 PGsome 및 BGsome은 블루 에멀젼 상태를 유지하였다.

다. 용매함량에 따른 입자크기 비교

지질에 대한 용매의 비율을 달리하여 만든 캐리어의 입자크기 변화를 하기 표 3에 기재하였다. 캐리어를 제조할 때 60℃에서 지질 1g을 용해시킬 수 있는 에탄올의 최소부피는 1ml 이고 PG의 최소부피는 2ml 인데, 에탄올 용매함량을 각각 1, 2, 4ml 로 변화시키고 PG 용매함량을 2, 4 ml 로 변화시켜 비교하였다(표 3).

용매함량이 증가할수록 에토좀에서는 입자가 커지는 경향을 나타냈으나, PGsome에서는 입자가 작아지는 경향을 나타냈다. 용매 때문에 액정에 수화되는 수용성 성분의 생리활성 효능이 저하될 가능성도 있으므로 용매는 가능한 한 지질을 녹일 수 있는 최소부피를 사용하여 캐리어를 만드는 것이 바람직하다.

용매함량 변화에 따른 평균입자 크기 변화

캐리어	지질(HPC/Ch10) 1g당 용매함량	수평균입자크기(nm)
에토좀	1 ml	384
	2 ml	466
	4 ml	592
PGsome	2 ml	62
PGsome	4 ml	43

상기 가 - 다의 실험결과를 보면 알 수 있듯이, 일반적인 방법으로 만든 리포좀의 경우 1㎛ 이상의 수평균입자크기를 나타냈지만, 에토좀, PGsome 및 BGsome 의 경우에는 30 - 600 nm 의 입자크기를 나타냈다.

2. 엔캡슐레이션 효율(Encapsulation Efficiency)

피부 흡수가 용이하지 않은 수용성 생리활성물질이 오랫동안 그 효능을 유지하고 경피투과율이 높기 위해서는 수용성 생리활성물질이 나노 액정 캐리어 내에 엔캡슐레이션되는 효율이 높아야 한다. 본 실시예에서는 수용성 생리활성물질 대신 칼세인을 마커로 사용하여 에토좀, PGsome 및 BGsome 내에 엔캡슐레이션시킨 후 각각의 엔캡슐레이션 효율을 측정하였다. 측정방법은 다음과 같다.

실시예 1 과 2 에서 제조한 에토좀, PGsome 및 BGsome 용액을 저온에서 여러번 원심분리(12,000 rpm)시켜 상등액과, 침전된 에토좀, PGsome 및 BGsome 입자를 각각 분리하였다. 분리된 상등액의 부피와 칼세인 농도로부터 캐리어 내로 엔캡슐레이션 되지 못한 칼세인의 양을 계산하였다. 캐리어 내에 엔캡슐레이션된 칼세인의 양은 침전물로 모아진 에토좀, PGsome 및 BGsome 입자를 PBS에 희석시킨 후, 트리톤-X 100(Triton-X 100)을 넣어 캐리어를 완전히 파괴시킨 후 방출되어 나온 칼세인의 농도를 측정하여 구하였다.

엔캡슐레이션 효율은 캐리어 제조시 첨가된 전체 칼세인 질량 중 캐리어내로 엔캡슐레이션된 칼세인의 질량으로 정의하였다. 칼세인의 농도는 형광 스펙트로포토미터(Fluorescence spectrophotometer; Varian Cary Eclipse model)에서 칼세인의 최대 흡광파장을 493.93nm 에서 고정시킨 후, 520nm 근방의 방출피크의 광도를 측정해서 구하였다.

캐리어의 종류와 지질구성에 따른 캐리어의 엔캡슐레이션 효율 차이를 표 4에 나타내었다.

캐리어 종류	지질 구성	엔캡슐레이션 효율
에토좀	HPC	42±%
	HPC/Ch 10	34±%
	HPC/Ch 20	22±%
PGsome	HPC	30±%
BGsome	HPC	29±%

HPC 로 에토좀을 만든 경우, 40% 가 넘는 엔캡슐레이션 효율이 나타났다. 5% 미만의 엔캡슐레이션 효율을 나타내는 일반 리포좀에 비하여, 본 발명의 나노 액정 캐리어는 엔캡슐레이션 효율이 상당히 개선되었다. HPC에 소수성이 강한 콜레스테롤이 첨가될수록 엔캡슐레이션 효율은 다소 감소하였다.

본 발명의 나노 액정 캐리어가 일반 리포좀에 비해 엔캡슐레이션 효율이 현저하게 높은 이유는 하기 2 가지로 볼 수 있다. 하나는 제조과정상의 특성으로, 일반 리포좀은 지질 필름에 칼세인 수용액으로 단 한차례 수화시켜서 제조되지만, 본 발명의 나노 액정 캐리어는 칼세인 수용액으로 수화 액정을 만든 후 분산매인 PBS을 투입시켜 액정을 분산시키는 2 단계 과정을 거치기 때문이다. 또 하나의 이유는, 본 발명의 나노 액정 캐리어에서는 수용액과 친화력이 좋은 용매가 지질과 함께 액정을 구성하기 때문으로, 이로 인해 수용성 생리활성물질이 액정에 더 많이 엔캡슐레이션된다.

본 발명의 나노 액정 캐리어에 있어서, 에탄올 첨가량 또는 칼세인(수용성 생리활성물질의 마커) 첨가량의 변화에 따른 엔캡슐레이션 효율을 조사하였다. 도 3은 에토좀에서 에탄올 첨가량에 따른 엔캡슐레이션 효율을 나타낸 것으로, 에탄올 첨가량이 많을수록 엔캡슐레이션 효율이 떨어졌다. 도 4는 칼세인 첨가량에 따른 에토좀의 엔캡슐레이션 효율을 나타낸 것으로, 칼세인 첨가량이 적을수록 엔캡슐레이션 효율이 높아졌다.

3. 캐리어 막의 안정성

캐리어 막의 안정성은 캐리어 내에 엔캡슐레이션된 형광물질인 칼세인의 시간 및 온도에 따른 방출율을 측정하여 평가하였다.

칼세인의 농도는 형광 스펙트로포토미터(Varian Cary Eclipse model)에서 칼세인의 최대 흡광파장을 493.93nm 에서 고정시킨 후, 520nm 근방의 방출 피크의 광도를 측정하여 형광광도-농도 간의 정량적 관계로부터 구하였다. 칼세인 방출실험에서 시료는 다음과 같은 방법으로 준비하였다.

칼세인 수용액으로 수화시켜 만든 에토좀 등의 캐리어 용액을 12,000rpm으로 15분동안 원심분리한후 상등액을 걸러내고 아래에 침전된 캐리어 입자를 모았다. 모은 캐리어 입자를 저온의 PBS 용액으로 3번이상 반복세척하여 캐리어 내로 엔캡슐레이션되지 못하고 외부에 남아있던 칼세인을 제거하였다. 세척된 캐리어 2ml를 채취한 후 이를 다시 PBS 용액으로 희석하여 전체 100ml의 캐리어용액을 만들었다.

이렇게 희석된 용액을 다시 10ml 씩 팰컨(falcon)에 담아 일정시간(1일, 7일, 14일, 21일, 30일)동안 저장 보관했다. 그 후 시료를 원심분리하여 얻어진 상등액을 0.45㎛의 마이크로필터로 여과하고, 여과된 용액의 형광광도의 강도를 측정하여 일정시간 경과시 방출되어 나온 칼세인의 형광광도를 측정했다.

그리고 각각의 경우에 동일한 조건으로 만든 다른 시료에 트리톤 X-100을 넣어 캐리어를 완전히 파괴시킨 후 방출되어 나온 칼세인의 형광광도의 강도를 측정하여, 각 조건에서의 방출율을 결정하였다. 각각의 칼세인 방출율은 하기 식에 의해 결정하였다.

칼세인 방출률 % = ( F - F₀ )/( F_T- F₀ )

F₀: 캐리어 용액 내 칼세인의 초기 형광광도

F : 일정 시간 경과 후 방출되어 나온 칼세인의 형광광도

F_T: 트리톤 X-100 처리한 경우의 칼세인의 형광광도

에토좀을 상온에서 30일동안 보관한 경우 지질의 구성에 관계없이 칼세인의 방출이 거의 없었다. 50℃에서 30일동안 보관한 경우에는, 지질의 구성에 따라 최대 20% 정도의 방출율을 나타냈다. 콜레스테롤의 함량이 높을수록 방출율이 적어지면서 캐리어막의 안정성이 상대적으로 높아지는 경향을 보였다.

도 5를 보면, 에토좀, PGsome 및 BGsome 의 칼세인 방출율 차이는 거의 없었다(실험오차 범위내).

본 발명의 캐리어를 다른 성분과 함께 화장품 또는 의약품으로 제형화할 때, 첨가되는 계면활성제에 의한 캐리어막의 파괴 가능성을 고려하여 계면활성제가 있는 조건하에서의 칼세인 방출율을 조사하였다. 실시예 1 및 2 에서 제조한 캐리어 용액에 계면활성제(Tween 60)를 넣고 1시간동안 25℃ 및 50℃에서 각각 보관한 후 원심분리하여 상등액의 형광광도를 측정하였다.

상온에서 실험한 경우에는 계면활성제가 존재하더라도 방출율이 15% 미만으로 비교적 안정한 막을 형성하였다. 그러나 50℃의 고온에서는 방출율이 80 ~ 100 % 정도로 캐리어 막이 거의 다 파괴되어 칼세인이 대부분 방출되었다. 다만 콜레스테롤을 20% 혼합한 경우에는 계면활성제에 의한 캐리어 막의 파괴가 약간 지연되는 경향을 나타냈다.

계면활성제에 대한, 에토좀, PGsome 또는 BGsome 캐리어 막의 안정성을 비교한 결과, 캐리어의 종류에 상관없이 상온에서는 안정성을 보이지만, 고온에서는 상기 3가지 캐리어 막이 거의 다 파괴되었다. 따라서 계면활성제를 사용하여 화장품 또는 의약품으로 제형화할 때는 상온 이상으로 온도가 올라가지 않도록 주의해야 한다.

4. 경피 투과 효과

나노 액정 캐리어의 경피투과 효과를 살피기 위하여 프란쯔(Franz)형 확산장치에 8주된 마우스 피부(mouse skin)를 걸어놓고 투과실험을 실시하였다. 확산장치의 윗부분(donor compartment)에 칼세인 수용액 또는 칼세인을 함유한 여러형태의 캐리어 용액을 투입하고, 24시간 후에 수용체 부분(receptor compartment)에서 피부막을 투과한 칼세인의 양을 측정하였다.

투입한 용액은 1 ml로서 칼세인의 양으로 환산하면 각 경우에 모두 0.125mg 이었고, 마우스 피부는 대략 0.5mm 정도로 일정한 두께의 피부막을 사용하였다. 확산 장치 전체의 온도는 피부 온도와 동일한 37℃를 유지하였고, 경피투과 실험의 결과를 표 5에 종합하여 나타냈다.

캐리어종류	칼세인용액	HPC리포좀	HPC에토좀	HPC/LL 10에토좀	HPC/CP 10에토좀	HPC/LL 10PGsome	HPC/CP 10PGsome
경피투과량(㎍/㎤)	0.23	0.15	0.20	0.30	0.25	0.27	0.24

칼세인 수용액을 기준으로 하였을 때, 리포좀으로 만든 경우에는 피부투과가 오히려 감소하는 결과가 나타났다. 그러나, 에토좀이나 PGsome 의 경우에는 구성성분에 따라 다소 다르긴 하지만, 경피투과 결과가 수용액과 비슷하거나 증가하였다. 또한, HPC 단독보다는 리소 레시틴(LL) 또는 세틸 포스페이트(CP)를 혼합한 나노 액정 캐리어에서 경피투과가 더 증가하였다.

실시예 4: 인삼다당체를 함유한 나노 액정 캐리어 제조 및 특성 평가

칼세인 대신 인삼다당체 수용액을 사용하여 에토좀, PGsome 및 BGsome의 캐리어를 제조하였다. 사용재료 및 제조방법은 실시예 1 내지 3과 동일하고 혼합비율은 다음과 같다.

지질 혼합물 : 2 g

에탄올 : 2 ml

프로필렌글리콜 : 4 ml

1,3-부틸렌 글리콜 : 4 ml

진산용액(3 mg/ml) : 2 ml

에토좀의 경우 정제수 : 156 ml

PGsome 의 경우 정제수 : 154 ml

BGsome 의 경우 정제수 : 154 ml

1. 입자크기

인삼다당체를 함유한 나노 액정 캐리어 입자 크기는 하기 표 6과 같다.

	에토좀	PGsome	BGsome
	수평균입자크기	수평균입자크기	수평균입자크기
HPC	606	390	585
HPC/Ch	239	86	286
HPC/LL	92	73	86
HPC/CP	68	37	42

위의 결과를 살펴보면 HPC에 콜레스테롤(Ch), 리소 레시틴(LL), 세틸 포스페이트(CP) 등을 혼합하여 에토좀, PGsome 및 BGsome을 제조한 결과, 수백 nm 크기의 캐리어를 수득할 수 있었다.

HPC/CP 10으로 제조된 PGsome 및 BGsome은 블루 에멀젼 상태를 유지하였지만, 에토좀 중 HPC 자체와 HPC/Ch는 수백 nm의 현탁 에멀젼을 형성하였다.

2. 효능실험

인삼다당체에 있는 글루코피라노즈 등은 면역증강효과와 함께 알려졌으며 세포증식효과가 있는 것으로 이미 알려져 있다(한국특허출원번호 10-2001-0052636 인삼다당체를 함유하는 화장품조성물). 인삼다당체를 0.0005~5%의 농도로 만들어 실험한 결과, 6~12시간에서는 0.5~5%의 농도에서 최적의 세포증식효과(약 15~25%)를 나타냈고, 24시간에서는 0.0005%와 0.005%에서 최적의 세포증식효과(최대 40%)를 나타냈다.

한편, 인삼다당체 자체와 이를 에토좀(HPC/Ch) 및 PGsome(HPC/Ch)으로 제제화하여 섬유아세포에 대한 세포재생 효과를 비교하였다(도 6). 도 6에서 y축의 세포재생 효과는 인삼 다당체를 에토좀(HPC/ch) 및 PGsome(HPC/ch)으로 제제화한 것의 세포재생 효과에서 인삼다당체 자체의 세포재생 효과를 뺀 값이다.

인삼다당체를 제제화한 에토좀 및 PGsome은 인삼다당체 자체와 비슷한 정도(-7~10%)의 세포재생효과를 보였다. 인삼다당체 자체는 안정성이 떨어지므로, 본 발명의 나노 액정 캐리어를 사용하면 인삼다당체를 안정화시키면서 경피투과시킬 수 있다. 또한 상기 결과로부터, PGsome 또는 에토좀의 농도를 조절함으로써 인삼다당체(수용성 생리활성물질)의 효과를 서방화시킬 수 있음을 알 수 있다.

3. 안정성

가. 제형의 pH는 원액 기준으로 PGsome(HPC/Ch)은 6.62이었고, 에토좀 (HPC/Ch)은 6.52이었다.

나. 온도 안정성

각 제형을 45℃, 37℃, 30℃ 및 냉장의 항온조에 보관한 후, 시간이 경과함에 따른 변색, 분리, 변취 등을 관찰하였다. 각 제형의 보관 안정성에 대한 결과는 표 7 및 표 8과 같았다. 외관상 변색과 변취는 각 온도범위에서 관찰할 수 없었다.

안정도 결과: PGsome

	45℃	37℃	30℃	냉장	비고
1일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
5일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
10일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
20일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
30일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 쉽게 분산됨

안정도 결과: 에토좀

	45℃	37℃	30℃	냉장	비고
1일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
5일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
10일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 분산됨
20일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 쉽게 분산됨
30일 후	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	파우더 분리	변색 없음, 변취 없음,흔들면 쉽게 분산됨

다. 화장품에서의 안정도

PGsome과 에토좀의 가용화 제형에서의 상용성(compatibility) 검사를 위해 두 원료를 각 0.1% 함유한 스킨제형을 제조하여 45℃, 37℃, 30℃ 및 냉장에서의 항온 안정도를 확인하였다. 또한 현탁정도를 확인하였다.

PGsome(pH 4.52)과 에토좀(pH 4.46)의 가용화 안정도를 조사한 결과, 표 9 및 10에 나타낸 바와 같이 상당기간 투명성이 유지되었다.

가용화 안정도 결과(PGsome: pH 4.52)

	45℃	37℃	30℃	냉장
1일 후	투명유지	투명유지	투명유지	투명유지
5일 후	투명유지	투명유지	투명유지	투명유지
10일 후	투명유지	투명유지	투명유지	투명유지
20일 후	투명유지	투명유지	투명유지	투명유지
30일 후	투명유지	투명유지	투명유지	투명유지

가용화 안정도 결과(에토좀: pH 4.46)

또한, PGsome과 에토좀의 유화 제형에서의 상용성을 검사하기 위해, 두 원료를 각각 1.0% 함유한 유화제형(TWEEN-ARL 계면활성제 시스템)을 제조하여 45℃, 37℃, 30℃ 및 냉장에서의 항온 안정도를 조사한 결과, 표 11 및 표 12에 나타난 바와 같이 매우 안정하였다.

유화 안정도 결과 (PGsome: pH 7.08)

	45℃	37℃	30℃	냉장
1일 후	안정	안정	안정	안정
5일 후	안정	안정	안정	안정
10일 후	안정	안정	안정	안정
20일 후	안정	안정	안정	안정
30일 후	안정	안정	안정	안정

유화 안정도 결과(에토좀: pH 7.00)

유화 처방에 있어서의 점도 변화(조건: 30 ℃ 항온조, 2분, 12 rpm, 스핀들 63 단위 cps)를 조사한 결과, 제조 후 1 내지 30일 동안 점도변화가 크지 않았다. 따라서, 일반적인 유화제형에 있어 겔링이나 분리현상에 크게 영향을 미치지 않는 안정한 소재로서 본 발명의 나노 액정 캐리어를 적용할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 나노 액정 캐리어는 종래 기술의 액정에 비해 수용성 생리활성물질의 봉입율이 현저하게 높고, 제조방법이 편리하며 제조단가가 낮으므로 매우 실용적이다. 더구나, 피부에 자극을 주는 성분(예, 계면활성제)이 없이 생체 친화적인 재료만으로 구성된다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 나노 액정 캐리어는 생체 친화적인 재료만으로 구성되었으므로 피부에 흡수된 후에 별도로 제거할 필요가 없다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 에토좀, PGsome 및 BGsome의 제조과정을 도시한 것이다.

도 2a는 PGsome의 편광현미경 사진이고 도 2b는 PGsome의 SEM의 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 에토좀에서 지질에 대한 에탄올 첨가량에 따른 엔캡슐레이션 효율 변화를 도시한 것이다.

도 4는 칼세인 첨가량에 따른 에토좀의 엔캡슐레이션 효율을 도시한 것이다.

도 5는 캐리어의 종류에 따른 칼세인 방출률을 도시한 것이다.

도 6은 인삼 다당체 자체와 인삼다당체가 에토좀(HPC/Ch), PGsome(HPC/Ch)에 엔캡슐레이션 되어 있는 나노 액정 캐리어의 세포재생 효과를 도시한 것이다.

Claims

하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 생리활성물질이 엔캡슐레이션되어 있는 나노 액정 캐리어의 제조방법:

(a) HPC(hydrogenated phosphatidyl choline) 또는 HPC-지질 혼합물을 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 용매에 용해시켜 지질 용액을 수득한 다음, 냉각시켜 유방성(lyotropic) 액정을 형성하는 단계;

(b) 수용성 생리활성물질의 수용액을 상기 유방성 액정에 첨가한 후 혼합 및 수화과정을 거쳐 수화 액정상(hydrated liquid crystal phase)을 형성하는 단계 ;

(c) 상기 수화 액정상을 약 40℃의 온도에서 교반시키면서 완충 용액 또는 정제수를 첨가하여 상기 수화 액정상을 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 분산된 수화 액정상을 초음파 처리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 수용성 생리활성물질이 인삼 다당체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 HPC-지질 혼합물이 HPC와 다른 지질과의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제 3항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 수용성 생리활성물질이 10 ~ 90 중량%로 엔캡슐레이션되어 있는 나노 액정 캐리어.
제4항의 나노 액정 캐리어를 0.1 ~ 99 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 경피투과용 조성물.