KR100507731B1 - 종양 세포 증식 저해물질로써 렙틴 - Google Patents
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Abstract
암 분야에 렙틴 또는 렙틴-관련 분자를 이용하는 것을 설명한다.
Description
본 발명은 지방세포에 의해 생산되어, 다양한 세포 및 조직에 영향을 주는 사이토킨인 렙틴에 관련된 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 암 분야에 렙틴을 새로 응용하는 분야에 관계한다.
체중을 조절하는 지방세포에서 유도된 사이토킨인 렙틴(Leptin)은 뮤린 ob 유전자(Zhang et al., 1994)의 위치 클로닝으로 확인되었고, 이들은 음식 섭취 및 발열반응에 모두 영향을 주는 것으로 보인다(Campfield et al., 1995; Collins et al., 1996, Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995; Weigle et al., 1995). 맥락막 망상조직에는 고친화성의 렙틴-결합 부위가 위치하고; 이 망상조직으로부터 cDNA가 발현되어 렙틴 수용체(OB-R)를 제공한다(Tartaglia et al., 1995). 공지된 렙틴 활성은 해마에 있는 이 수용체에 의해 중개된다. 렙틴 수용체는 신장, 폐, 간에서도 추가로 발현된다(Cioffi et al., 1996; Lee et al., 1996; Tartaglia et alk, 1995). 또한, 이들 세포질 도메인과 상이한 렙틴-수용체-절단 변이체도 생쥐에서 조직-특이적인 방식으로 발현된다(Lee et al., 1996). 따라서, 음식 섭취 및 체온을 조절하는데 추가하여, 렙틴은 또 다른 생리학적 기능을 발휘할 것이다.
비록 렙틴이 지방세포에서 생산되기는 하지만, 혈청에서 과도한 렙틴 수준과 과다 지방과의 상관관계에 대한 최근 연구에 따르면, 렙틴이 음식 섭취 및 체줄을 감소시킨다는 것과는 대조를 이룬다(Considine et al., 1996; Frederich et al, 1995; Lonnqvist et al, 1995; Maffei et al., 1995). 이와 같은 상관관계 및 비만 및 인슐린 저항성에 대한 잘 확립된 연계에 따르면(Felber and Goly, 1995), 렙틴은 인슐린-조절된 반응을 조절할 수 있다는 것이다. 또한, 최근 보고에 따르면, 렙틴은 인슐린-수용체 기질(IRS-1)의 기저 및 인슐린-유도된 티로신-포스포릴화반응을 상당히 감소시킨다는 것이다. IRS-1 포스포릴화반응에 렙틴의 효과는 특이적이다. 그 이유는 인슐린 수용체(IR) β-사슬의 티로신-포스포릴화반응이 감소되지 않았기 때문이다(Cohen et al., 1996).
IR 카이나제에 의한 IRS-1의 티로신-포스포릴화반응은 인슐린 수용체 시그날 카스캐이드 반응의 주요 단계로써 이는 공지의 많은 인슐린 활성을 유도한다(Araki et al., 1994; Cheatham and kahn, 1995; Myers et al., 1994; Myers et al., 1994; Myers and White, 1993; Rose et al., 1994; Tamemoto et al., 1994; White and Kahn, 1994). IRS-1의 하류 시그날 발생과정은 몇 가지 연합 단백질에 의해 중개되는데, 이중 하나는 생장-인자 수용체-연합된 결합 단백질-2(GRB2)(Cheatham and Kahn, 1995)이 된다.
인슐린 수용체(IR)는 대사 수용체로써, 포도당 항상성에서 인슐린의 효과를 중개한다. 이와 같이, 지방 조직, 산, 근육과 같은 최종적으로 분화된 조직에서 발현된다. 그러나, 최근 많은 연구 결과에 따르면, IR이 종양 세포에서 발현되었을 때, in vivo ?? in vitro에서 IR은 강력한 유사분열 촉진 수용체라는 것이다. 예를 들면, 인슐린 치료에 대한 반응으로 IR의 티로신-포스포릴화반응에 의해 결정하였을 때, 몇 가지 유방 암 세포주에서 기능을 하는 IRs가 확인되었다. 또한, IR은[3H]티미딘 결합에 의해 측정하였을 때 이들 세포에서 유사분열 반응을 중개하였다(Milazzo et al., 1997; Millazzo et al., 1992).
지금까지, 일반적으로 종양학 분야에서 렙틴을 이용한 적이 없었고, 특히, 렙틴은 세포의 증식을 저해하는데 특히, 암 세포의 증식을 저해하는데 유용할 것이라고 설명한 선행기술은 없었다.
발명의 요약
본 발명은 암 세포의 증식을 저해하는 저해물질로써 렙틴을 이용하는 것과 같은 세포 증식 저해물질로써 렙틴을 이용하는 것을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 종양을 치료하기 위해 다른 치료제와 복합하여, 또는 단독으로 렙틴을 이용하는 것을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 종양을 치료하는데 있어서, 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체를 이용하는 것을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 종양을 치료하는데 있어서, 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음에서 명백하게 알 수 있는 것과 같다.
본 발명은 세포 증식 저해물질로써 렙틴을 이용하는 것이다. 다양한 악성 종양을 치료하기 위해, 렙틴을 단독으로 또는 다른 치료제 또는 다른 방식과 복합하여 이용하여도 유용하다. 본 발명의 적절한 구체예에서는 사람 유방 암종 세포 증식을 저해하는데 렙틴을 이용한다. 인슐린 및 IGF-I와 같은 다양한 생장 인자 존재하에서 다양한 종류의 종양 세포 증식이 증가된다. 인슐린 및 IGF-I가 세포에서 생장 자극 효과는 어느 정도 IRS-1/GRB2 경로를 통하여 조절된다(Myers et al, 1993). 이 경로가 렙틴에 의해 방해를 받는다. IRS-1는 IL-4 및 IL-9를 포함한 추가 생장 인자 및 사이토킨의 수용체 카이나제의 기질이다(Pernis et al., 1995; Yin et al., 1995; Yin et al., 1994). 따라서, 렙틴은 전술한 생장 인자 및 사이토킨 일부 또는 전부의 유사분열 반응을 저해할 뿐만 아니라 다른 생장 인자의 반응도 저해하여, 다양한 종양 세포의 증식을 저해한다. 여기에서 제공되는 실시예에는 IGF-I-유도된 증식 저해 및 사람 유방 암 세포 주 T-47D 및 MCF7의 인슐린-유도된 증식 저해가 포함된다. 본 발명은 또한, 다양한 악성 종양을 치료하기 위해 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체의 이용 및 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체를 포함하는 제약학적 조성물을 이용한다.
좀더 구체적으로는, 본 발명은 종양 세포 증식 저해물질로써 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체에서 선택된 활성 물질을 이용하는 것이다.
본 발명의 구체예에는
(i) 포유류에서 악성 종양을 치료하기 위해 세포 증식의 저해물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(ii) 생장 인자-의존성 종양의 저해물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(iii) 사람 유방 암종 세포 증식의 저해물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(iv) 사람 유방 암종을 치료하기 위해 상기 활성 물질을 이용하고;
(v) 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)/생장 인자 수용체-연합된 결합 단백질-2(GRB2) 경로에 의해 부분적으로 중개되는 종양 세포에서 인슐린 및 IGF-I의 생장 자극 효과 저해 물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(vi) 종양 치료를 위해, IRS-1의 기질인 IL-4 및 IL-9를 포함하는 한 가지 이상의 수용체 카이나제, 생장 인자 및 사이토킨에 대해 종양 세포에서 유사뷴열 반응 저해물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(vii) 사람 유방 암을 치료하기 위해 기저 IGF-I-유도된 그리고 인슐린-유도된 종양 세포 증식 저해물질로써 상기 활성 물질을 이용하고;
(viii) 활성 성분은 렙틴인 활성 성분을 이용하고, 렙틴은 상기 언급된 저해물질 또는 상기 언급된 치료에 이용된다.
유사하게, 본 발명은 또한, 종양 세포 증식을 저해하는 약물을 준비하는데 렙틴, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질, 활성 단편 또는 임의 분취물, 활성 유사체 또는 이들의 임의 유도체에서 선택된 활성 물질을 이용한다.
본 발명의 구체예에서는
(i) 포유류에서 악성 종양을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(ii) 생장 인자-의존성 종양의 저해하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(iii) 사람 유방 암종 세포 증식의 저해하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(iv) 사람 유방 암종을 치료하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(v) 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)/생장 인자 수용체-연합된 결합 단백질-2(GRB2) 경로에 의해 부분적으로 중개되는 종양 세포에서 인슐린 및 IGF-I의 생장 자극 효과 저해하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(vi) 종양 치료를 위해, IRS-1의 기질인 IL-4 및 IL-9를 포함하는 한 가지 이상의 수용체 카이나제, 생장 인자 및 사이토킨에 대해 종양 세포에서 유사뷴열 반응 저해하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(vii) 사람 유방 암을 치료하기 위해 기저 IGF-I-유도된 그리고 인슐린-유도된 종양 세포 증식 저해하기 위한 약물을 제조하는데 활성 물질을 이용하고;
(viii) 활성 성분은 렙틴인 활성 성분을 이용하고, 렙틴은 상기 언급된 저해물질 또는 상기 언급된 치료에 이용된다.
유사하게, 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포 증식을 저해하기 위해, 상기에서 언급한 것과 같은 활성 성분, 제약학적 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제로 구성된 제약학적 조성물을 제공한다.
(i) 포유류에서 악성 종양을 치료하기 위한 제약학적 조성물;
(ii) 생장 인자-의존성 종양의 저해하기 위한 제약학적 조성물;
(iii) 사람 유방 암종 세포 증식의 저해하여 사람 유방 암종을 치료하기 위한 제약학적 조성물;
(iv) 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)/생장 인자 수용체-연합된 결합 단백질-2(GRB2) 경로에 의해 부분적으로 중개되는 종양 세포에서 인슐린 및 IGF-I의 생장 자극 효과 저해하기 위한 제약학적 조성물;
(v) IRS-1의 기질인 IL-4 및 IL-9를 포함하는 한 가지 이상의 수용체 카이나제, 생장 인자 및 사이토킨에 대해 종양 세포에서 유사뷴열 반응 저해하여, 종양을 치료하는 제약학적 조성물;
(vi) 사람 유방 암을 치료하기 위해 기저 IGF-I-유도된 그리고 인슐린-유도된 종양 세포 증식 저해하기 위한 제약학적 조성물;
(vii) 활성 성분은 렙틴인 제약학적 조성물.
본 발명은 또한, 포류유에서 종양 세포 증식을 저해하거나 또는 포유류에서 종양을 치료하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 약형으로 된 상기에서 언급된 본 발명에 따른 제약학적 조성물을 환자에게 투여하고, 투여 경로는 환자를 검사하여 전문의의 처방에 따르는 것이다.
본 발명의 다른 측면 및 구체예는 다음에서 제시하였고, 본 발명의 상세한 설명으로부터 명백하게 인지할 수 있을 것이다.
도 1은 인슐린에서 T-47D 세포 증식 의존성을 나타낸 것으로, MTT 착색으로 측정한 것이다.
도 2는 IGF-I에서 T-47D 세포 증식 의존성을 나타낸 것으로, MTT 착색으로 측정한 것이다.
도 3은 10% 태아 소 혈청(FBS)에서 뮤린 렙틴에 의한 인슐린-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 MTT 착색으로 측정한 것이다.
도 4는 2% 태아 소 혈청(FBS)에서 뮤린 렙틴에 의한 인슐린-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 결정 바이올렛 착색으로 측정한 것이다.
도 5는 10% 태아 소 혈청(FBS)에서 뮤린 렙틴에 의한 IGF-I-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 MTT 착색으로 측정한 것이다.
도 6은 2% 태아 소 혈청(FBS)에서 뮤린 렙틴에 의한 IGF-I-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 결정 바이올렛 착색으로 측정한 것이다.
도 7은 2% 태아 소 혈청(FBS)에서 사람 렙틴에 의한 IGF-I-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 결정 바이올렛 착색으로 측정한 것이다.
도 8은 무-혈청에서 뮤린 렙틴에 의한 인슐린-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 결정 바이올렛 착색으로 측정한 것이다.
도 9는 무-혈청에서 뮤린 렙틴에 의한 IGF-I-유도된 T-47D 세포 증식 저해를 나타낸 것으로 결정 바이올렛 착색으로 측정한 것이다.
본 발명은 종양 증식 저해물질로써 렙틴을 이용하는 것에 관계한다. 일반적으로, 다양한 종양으로부터 유도된 사람 기원의 세포주는 약 10% 용적의 태아 소 혈청이 보충된 생장 배지 존재하에 배양물에서 생장할 수 있다. 이와 같은 조건에서 세포 생장은 "기저 세포 증식"이라고 정의한다. 상기 혈청이 보충된 배양 배지에 인슐린, 상피 생장 인자 또는 인슐린 유사 생장 인자(IGF-I)와 같은 다양한 생장 인자가 첨가되었을 경우에 많은 종양 세포 주 생장이 상당히 강화된다. 생장 배지에 약 3 내지 600nanomolar 농도의 렙틴이 포함되면, 기저 세포 증식 및 생장인자-유도된 세포 증식이 모두 감소된다.
아래에서 제공되는 세포 배양 실험의 결과에서는 렙틴이 다양한 종양의 생장을 저해하는데 유용하다는 것을 보여준다. 따라서, 렙틴은 다양한 악성 종양을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 렙틴은 유방 암 세포 증식을 저해하는데 유용하다. 렙틴을 사람 관 유방 암 T-47D 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD; Strain No. ATCC HTB 133) 배양물에 첨가하였을 때, 증식 정도가 감소되었다. 유사하게, 렙틴을 사람 유방 아데노육종 NCF7 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD; strain No. ATCC HTB 22) 배양물에 첨가하였을 경우에, 증식 정도가 감소되었다. 렙틴은 기저, IGF-I-유도된 그리고 인슐린-유도된 T-47D 및 MCF7 세포 증식을 모두 저해하였다. 따라서, 렙틴은 유방 암종을 치료하는데 특히 유용할 것이다.
세포에서 인슐린 및 IFG-I의 생장 촉진 효과는 IRS-1의 티로신 포스포릴화 및 연속하여 IRS-1 및 GRB2의 연합에 부분적으로 중개되어, 유사분열 반응으로 이어진다. 렙틴의 항-유사분열 효과는 기저 인슐린-유도된 그리고, IGF-I에 의해 유도된 IRS-1의 티로신 포스포릴화 반응을 감소시켜, GRB2가 IRS-1에 결합되는 것을 줄이는 능력에 기인한 것이다. 또한, IRS-1은 다른 생장 인자 및 IL-4, IL-9를 포함하는 사이토킨의 수용체 카이나제 기질이다(Pernis et al., 1995; Yin et al., 1995; Yin et al., 1994). 따라서, 렙틴은 전술한 생장인자 및 사이토킨 일부 또는 전부의 유사분열 반응을 저해할 뿐만아니라 다른 미토겐을 저해하여, 다양한 종양 세포의 증식을 저해할 수 있다.
본 발명은 또한 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질 또는 이의 활성 단편 또는 분취물 및 이들의 염을 포함하는 렙틴 유도체 및 유사체에 관계하고, 다양한 종양을 치료하기 위해 렙틴 융합 단백질, 렙틴 뮤테인, 렙틴 수용체 길항물질 또는 이의 활성 단편 또는 분취물 및 이들의 염을 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.
여기에서 언급된 바와 같이, "뮤테인"이란 렙틴의 유사체로써, 한 개 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 결손되거나 또는 한 개 이상의 아미노산이 렙틴 고유 서열에 첨가되어, 야생형의 렙틴 또는 이의 활성 단편의 활성과 비교하였을 때, 생성된 생성물의 활성이 큰 변화가 없는 것을 말하는 것이다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 또는 부위-직접적은 돌연변이 기술 또는 임의 다른 적절한 기술을 이용하여 만들 수 있다.
임의 이와 같은 뮤테인은 렙틴 또는 이의 활성 단편과 실제 유사하기 위해 렙틴의 것과 충분히 이중 나선을 이룰 수 있는 아미노산 서열을 가진다. 따라서, 임의 주어진 뮤테인이 실제 렙틴과 동일한 활성을 가지는 지는 뮤테인을 가지고 통상적인 실험을 통하여 확인할 수 있는데, 예를 들면, 간단한 세포 증식 검사를 하는데, 세포 증식을 방해하는 뮤테인은 렙틴의 활성을 충분하게 보유하고 있어, 렙틴의 상기 용도중 하나를 가지고, 실제 동일한 활성을 가진다.
적절한 구체예에서, 이와 같은 뮤테인은 렙틴 서열의 적어도 40% 상동성 또는 유사성을 가진다. 좀더 적절하게는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 가장 적합하게는 적어도 90% 상동성을 가진다.
본 발명에 따라 이용되는 렙틴, 이의 활성 단편 또는 이의 분취물 또는 이를 인코드하는 핵산의 뮤테인에는 여기에서 제시하는 기술을 기초로 하여 불필요한 실험을 하지 않고도 당업자가 일상적으로 얻을 수 있는 치환 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 상응하는 것이다. 단백질 화학 및 구조에 대해 좀더 상세한 설명을 하고 있는 문헌으로는 Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York 1978; and Creighton, T.E. Proteins; Structure and Molecular Proterties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983을 참고호 한다. 코돈 선호와 같은 뉴클레오티드 서열 치환에 대해서는 Ausubel et al, supra, et §§ A.1.1-A.24, and Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y. §§6.4 and 6.4(1987, 1992), at Appendices C and D의 것을 참고로 한다.
본 발명에 따른 뮤테인에 적절한 변화는 "보존성(conservative)" 치환으로 공지된 것이다. 렙틴 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 활성 단편 또는 이의 분취물의 보존성 아미노산 치환은 집단간에 분자의 생물학적 기능을 보존할 수 있는 충분하게 유사한 생리화학적 성질을 가지는 집단의 유사한 아미노산이 포함된다(Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864(1974)). 아미노산의 삽입 및 결손은 이들의 기능에는 변화를 주지않고 상기 정의한 서열에서 이루어지는데, 특히, 삽입 또는 결손은 30개 이하의 아미노산, 적절하게는 10개 이하의 아미노산만이 관여하고, 기능상 모양, 가령 시스테인 잔기에 중요한 아미노산을 제거하거나 치환시키지 않아야 한다(Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 191, pp. 223-230(1973)). 이와 같은 결손 및 삽입에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위에 속한다.
적절하게는 유사한 아미노산 집단은 표 1에 나타내었다. 좀더 적절하게는 유사한 아미노산 집단은 표 2에 나타내었다. 가장 적절한 아미노산 집단은 표 3에 나타내었다.
본 발명에서 이용할 수 있는 렙틴 또는 이의 활성 단편의 뮤테인을 얻는데 이용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환 예는 US patents RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 and 4,737,462, to Mark et al; 5,116,943 to Koths et al., 4,965,195 to Namen et al; 4,879,111 to Chong et al; and 5,017,691 to Lee et al;에서 제시하고 있는 임의 공지된 방법을 포함하고; 리신 치환된 단백질은 US patent No. 4,904,584(Shaw et al)에서 제시하고 있다.
또 다른 본 발명의 구체예에서, 본 발명에서 이용할 수 있는 렙틴의 임의 뮤테인 또는 이의 활성 단편은 필수적으로 렙틴의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. "필수적으로 상응하는"은 천연 단백질의 기본 특징에 영향을 주지않고, 특히 세포 증식을 저해하는데 영향을 주지 않으면서 천연 단백질의 서열에 약간 변화된 서열을 가지는 단백질로 이해하면 된다. "필수적으로 상응하는"에 일반적으로 해당되는 변화 형태에는 렙틴을 인코드하는 DNA의 통상적인 돌연변이 기술로 만들어지는 것으로, 약간의 변화가 이루어지고, 이는 상기에서 언급된 원하는 활성에 대해 스크리닝하면 된다.
본 발명에 따른 뮤테인에는 스트린젼트("stringent") 조건하에 본 발명에 따른 렙틴을 인코드하는 DNA 또는 RNA에 하이브리드할 수 있는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 인코드된 단백질을 포함한다. 이와 같은 핵산은 본 발명에 따른 렙틴의 기능적인 활성을 인코드하는제에 대해 결정하기 위해 연구할 수 있을 거이다. "스트린젼트 조건"은 당업자에게 공지된 하이브리드 반응 및 연속하는 세척 조건을 말하는 것으로, 통상적으로 "stringent"라고 말한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, NY, §§6.3 and 6.4(1987, 1992) and Sambrook et al, supra.). 스트린젼트 조건을 예로 들자면, 하이브리드의 계산된 Tm이하의 온도인 12-20℃에서 세척하는 것을 포함하는데, 예로 들면, 2 x SSC, 0.5% SDS에서 5분; 2 x SSC, 0.1% SDS에서 15분; 0.1 x SSC, 0.5% SDS에서 37℃, 30-60분 그 다음 0.1 x SSC, 0.5% SDS에서 68℃, 30-60분간 등이 되나 이에 한정하는 것은 아니다. 당업자는 스트린젼트 조건은 DNA 서열 길이, 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이(10-40염기) 또는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에 따라 또한 달라진다. 혼합형 프로브를 이용하는 경우에, SSC대신에 염화 테트라메틸 암모니움(TMAC)을 이용하는 것이 적절하다(Ausubel, supra).
"렙틴 융합 단백질" 또는 간단히 "융합 단백질"은 렙틴 또는 이의 활성 단편이 예를 들면, 체액에서 잔류시간이 증가시키는 또 다른 단백질과 융합된 것으로 구성된 폴리펩티드를 말하는 것으로, 렙틴 또는 이의 활성 단편은 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 이와 유사한 것과 융합될 수 있다.
여기에서 "염"은 카르복실기염 및 렙틴, 이의 활성 단편, 뮤테인 또는 이의 렙틴 융합 단백질 아미노기 산첨가 염을 모두 포함한다. 당 기술에 공지의 수단을 이용하여 카르복시기 염이 만들어 질 수 있는데, 예를 들면, 나트륨, 칼슘, 암모니움, 철 또는 아연 염과 같은 무기염과 트리에탄올아민, 아르기난 또는 리신, 피페리딘, 프로카인등과 같은 아민등으로 만들어진 유기 염기등이 포함된다. 산 첨가염에는 예를 들면, 염산 또는 황산과 같은 미네랄 산 염 또는 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산이 포함되고, 이와 같은 염은 렙틴 또는 이의 활성 분취물과 실제 유사한 활성을 가진다.
여기에서 이용된 "기능적으로 유도체"는 당 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 잔기 또는 N- 또는 C- 말단기에서 측쇄로써 발생되는 기능기로부터 준비할 수 있는 렙틴 또는 이의 활성 단편 또는 분취물, 뮤테인 및 렙틴 융합 단백질을 포함하고, 본 발명에서는 렙틴과 유사한 활성을 가지는 단백질의 활성을 파괴하지 않고, 이를 포함하는 조성물에 독성을 제공하지 않는 제약학적으로 수용가능한 것이면 된다. 예를 들면, 이와 같은 유도체에는 항원부위를 차단할 수 있고, 체액에서 렙틴 또는 이의 활성 분취물이 더 잔류할 수 있도록 하는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 포함된다. 다른 유도체에는 카르복실 기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1차 또는 2차 아민과 반응하는 카르복실기의 아미드, 아실 부분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 기)과 형성된 아미노산 잔기의 자유 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 부분과 형성된 자유 하이드록실 기(가령, 세릴 EH는 트레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
여기에서 사용된 것과 같은 렙틴, 렙틴 뮤테인, 렙틴 융합 단백질의 "활성 분취물 또는 단편"은 본 발명에서 렙틴의 폴리펩티드 사슬의 전구물질 또는 임의 다편 또는 렙틴 단독 또는 다른 분자와 연합된 또는 당, 인산 잔기 또는 유도체의 다른 응집체에 결합된 렙틴의 임의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는데, 단 이들 분취물은 렙틴과 실제 유사한 활성을 가져야 한다.
본 발명은 또한, 렙틴 수용체의 천연 및 합성 길항물질을 이용하는 것에 관계하는데, 이는 세포 증식을 저해하기 위해 이들의 능력이 실제 렙틴과 유사한 것들이다. 이와 같은 길항물질은 펩티드 라이브러리, 펩티드 유사체 라이브러리 또는 유기 분자의 무작위 라이브러리에서 선택할 수 있다. 이때 선택하는 방법은 당분야에 공지된 수단을 이용하는데, 렙틴 수용체에 결합하는 선택된 길항물질의 능력으로 선택하는 것이 기본이다. 예를 들면, 무작위 펩티드 라이브러리는 담체 단백질에 융합된 무작위 펩티드를 인코드하는 DNA을 가지는 원핵 발현 플라스미드로 만든다. 또 한가지 예로는 파아지 이스플레이 시스템엔데, 이는 발현 시스템이 무작위 펩티드를 인코드하는 DNA를 포함하는 파아지로, 외부 파아지 단백질중 한 개에 결합된다. 융합된 길항물질 또는 항물질을 인코드하는 파아지는 렙틴 수용체로 피복된 표면에서 가려내어 파아지 라이브러리에서 분리한다. 결합된 파아지를 분리하고, 그 다음 박테리아에서 증폭시킨다. 몇 회 패닝-증폭과정을 실시하여, 렙틴 수용체에 높은 친화성을 가지는 융합된 펩티드를 발현시키는 파아지를 얻을 수 있다. 그 다음 분리된 파아지는 증폭시키고, 펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 결정한다. 또는, 무작위 펩티드 라이브러리 또는 다른 분자 라이브러리는 당분야에 공지의 수단을 이용하여 고분자 비드상에서 고형상 합성에 의해 준비할 수 있다. 렙틴 수용체에 친화성을 가지는 펩티드 또는 다른 분자를 가지는 비드는 라이브러리로부터 형광으로 라벨한 렙틴 수용체와 같은 라벨된 렙틴 수용체에 결합시켜 선택한다. 양성 비드를 찍어내고, 비드상에 펩티드 구조 또는 다른 분자가 존재하는 지를 결정한다. 비드가 펩티드를 가지고 있는 경우에, 펩티드 서열은 단백질 합성 분석으로 결정한다. 비드가 무작위 유기 분자 라이브러리를 나타내는 경우에, 분자는 비드에서 떼어내고, 이 구조는 당 분야에 공지된 방법 즉, 질량 스펙트로스코피, 핵 자기 공명등의 방법을 이용하여 결정한다. 렙틴 수용체에 친화력으로 확인된 펩티드는 추가로 전술한 방식으로 세포 증식을 저해하는 능력이 있는 지에 대해 테스트를 한다.
따라서, 렙틴, 이의 활성 단편, 렙틴 뮤테인, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 수용체 길항물질 또는 이의 활성 단편 또는 분취물 및 이들의 염을 포함하는 렙틴 유도체 및 유사체는 다양한 종양의 치료, 특히 생장인자 의존성 종양, 좀더 구체적으로는 유방 암종을 치료하는데 이용된다.
본 발명은 또한 렙틴, 이의 활성 단편, 렙틴 뮤테인, 렙틴 융합 단백질, 렙틴 수용체 길항물질 또는 이의 활성 단편 또는 분취물 및 이들의 염을 포함하는 렙틴 유도체 및 유사체 및 제약학적 수용 가능한 담체를 이용하는 것에 관계한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 생리학적으로 수용가능한 담체, 안정화제 또는 부형제와 렙틴 또는 이의 유도체 렙틴 수용체 길항물질과 혼합하고, 약량 바이알에 동결시켜 약형으로 제조할 수 있다. 투여 방법은 유사한 물질을 투여하기 위한 임의 수용된 방법이 될 수 있는데, 이는 치료를 할 조건에 달라 달라지지만, 정맥, 근육내, 피하내 또는 국소 주사 또는 국소 응용 및 연속적으로 주입하는 등이 될 수 있다. 투여되는 활성 화합물의 양은 투여 경로, 치료할 질병, 환자의 상태에 따라 달라진다. 예를 들면, 국소 주입은 정맥으로 주입하는 경우보다 체중을 기준으로 휠씬 적은 양의 단백질을 이용한다. 주사할 렙틴의 일반적인 활성 양은 체중 ㎏당 0.1-1000㎍, 적절하게는 1 내지 10㎍/㎏이 된다. 렙틴 유도체의 활성 양 및 렙틴 수용체 길항물질의 활성 양은 기본적으로 몰량 기준으로 렙틴의 경우와 동일하다.
렙틴은 암 환자에게 단독으로 또는 다른 치료제와 복합하여 또는 다른 치료 방식과 복합하여 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 국한시키지는 않는다.
실시예 1; MTT 착색으로 세포 증식 측정
시약
MTT 원액; 인산 완충된 염에 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 5 mg/ml, 사용할 때 까지 -20℃에 보관.
용매; 농축 HCl(450㎕)/2-프로판올(10㎖)
과정
다양한 생장 자극 물질 및 생장 저해물질 존재 하에 96웰 플레이트에서 세포를 생장시킨다. 원하는 시간에 MTT 원액(10㎕)을 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 2.5-3 시간동안 배양한다. 가는 바늘을 이용하여 진공으로 상청액을 뽑아낸다. 용매(100㎕)를 첨가하고, 630㎚에서 570nM 필터를 이용하여 미량플레이트 펀독기에서 흡수도를 읽는다.
실시예 2; 결정 바이올렛 착색으로 세포 증식을 측정
과정
다양한 생장 자극 물질 및 생장 저해물질 존재 하에 96웰 플레이트에서 세포를 생장시킨다. 원하는 시간에 12.5% 글루타알데히드(40㎕)를 각 웰에 첨가한다. 실온에서 30분간 배양한다. 미량플레이트는 물로 씻어내고, 건조시키고, 수용성 결정 바이올렛(0.1%, 0.1㎖)을 각 웰에 첨가한다. 또한, 미량플레이트는 30분간 추가로 배양하고 물로 세척하고, 630㎚에서 배경을 빼고, 540nm에서 판독한다.
실시예 3; 인슐린-의존성 T-47D 세포 증식의 결정
사람 T-47D 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD; strain No. ATCC HTB 133)를 96웰 플레이트에 3x105 세포/㎖ DMEM, 10% 소 혈청(FBS)에서 0.1㎖을 각 웰에 첨가한다. 사람 인슐린은 농도를 증가시키면서 다른 웰에 첨가하고, 플레이트는 72시간동안 배양하고, 그 다음 세포 수는 MTT 착색에 의해 결정한다(도 1). 결과는 평균 8 레플리케이트가 된다. 도 1에서 보여주는 세포 증식 정도를 기초로, 추가 연구에서 50nM 인슐린 농도를 이용한다.
실시예 4; IGF-I 의존성 T-47D 세포 증식의 결정
사람 T-47D 세포를 96웰 플레이트에 3x105 세포/㎖ DMEM, 10% 소 혈청(FBS)에서 0.1㎖을 각 웰에 첨가한다. 사람 IGF-I은 농도를 증가시키면서 다른 웰에 첨가하고, 플레이트는 3일간 배양하고, 그 다음 세포 수는 MTT 착색에 의해 결정한다(도 2). 결과는 평균 8 레플리케이트가 된다. 도 1에서 보여주는 세포 증식 정도를 기초로, 추가 연구에서 50ng/㎖ IGF-I 농도를 이용한다.
실시예 5; 렙틴에 의한 인슐린-유도된 T-47D 세포 증식의 저해
10%FBS가 보충된 DMEM에서 T-47D 세포(3x105 cells/㎖)를 96 웰 플레이트(웰당 0.1㎖)로 접종한다. 세포는 뮤린 렙틴 유무 하에 인슐린(50nM)으로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 MTT로 착색시킨다. 데이터는 평균±표준 편차(SE, n=8)로 나타내었다. 결과를 보면, 렙틴이 인슐린-유도성 세포 증식을 상당히 저해시킨 것을 알 수 있다(도 3).
10%FBS 보충된 DMEM에서 T-47D 세포(3x105 cells/㎖)를 96웰 플레이트(웰당 0.1㎖)에 접종시킨다. 하루가 지난 후에, 배지는 2% FBS가 보충된 DMEM으로 대체하고, 하루가 지난 후에, 세포는 렙틴/DMEM, 2% FBS 유무하에서 인슐린(50nM)으로 처리한다. 그 다음 세포는 결정 바이올렛으로 착색시킨다. 데이터는 평균 ±SE(n=8)로 나타낸다. 결과를 보면, 렙틴은 인슐린-유도된 세포 증식을 상당히 저해시키는 것으로 나타났다.
실시예 6; 렙틴에 의해 IGF-I 유도된 T-47D 세포 증식 측정
10%FBS가 보충된 DMEM에서 T-47D 세포(3x105 cells/㎖)를 96 웰 플레이트(웰당 0.1㎖)로 접종한다. 세포는 뮤린 렙틴 유무 하에 IGF-I(50ng/㎖)로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 MTT로 착색시킨다. 데이터는 평균±표준 편차(SE, n=8)로 나타내었다. 결과를 보면, 렙틴이 인슐린-유도성 세포 증식을 상당히 저해시킨 것을 알 수 있다(도 5).
10%FBS 보충된 DMEM에서 T-47D 세포(3x105 cells/㎖)를 96웰 플레이트(웰당 0.1㎖)에 접종시킨다. 하루가 지난 후에, 배지는 2% FBS가 보충된 DMEM으로 대체하고, 하루가 지난 후에, 세포는 뮤린 렙틴/DMEM, 2% FBS 유무하에서 IGF-I(50ng/㎖)으로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 결정 바이올렛으로 착색시킨다. 데이터는 평균 ±SE(n=8)로 나타낸다. 결과를 보면, 렙틴은 IGF-I-유도된 세포 증식을 상당히 저해시키는 것으로 나타났다(도 6).
10%FBS 보충된 DMEM에서 T-47D 세포(3x105 cells/㎖)를 96웰 플레이트(웰당 0.1㎖)에 접종시킨다. 하루가 지난 후에, 배지는 2% FBS가 보충된 DMEM으로 대체하고, 하루가 지난 후에, 세포는 사람 렙틴/DMEM, 2% FBS 유무하에서 IGF-I(50ng/㎖)으로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 결정 바이올렛으로 착색시킨다. 데이터는 평균 ±SE(n=8)로 나타낸다. 결과를 보면, 렙틴은 IGF-I-유도된 세포 증식을 상당히 저해시키는 것으로 나타났다(도 7).
실시예 8; 렙틴에 의해 인슐린 유도된 MCF7 세포 증식 측정
6%FBS가 보충된 MCF7 세포(3x105 cells/㎖, American Type Culture Collection, Rockville, MD, strain No. ATCC HTB 22)를 96 웰 플레이트(웰당 0.1㎖)로 접종한다. 하루가 지난 후에, 배지는 무-혈청 DMEM으로 대체시키고, 하루가 지난 후에, 세포는 무혈청 배지에서 뮤린 렙틴 유무하에 인슐린(50nM)로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 MTT로 착색시킨다. 데이터는 평균±표준 편차(SE, n=8)로 나타내었다. 결과를 보면, 렙틴이 인슐린-유도성 세포 증식을 상당히 저해시킨 것을 알 수 있다(도 8).
실시예 9; 렙틴에 의해 IGF-I-유도된 MCF7 세포 증식 측정
6%FBS가 보충된 MCF7 세포(3x105 cells/㎖, American Type Culture Collection, Rockville, MD, strain No. ATCC HTB 22)를 96 웰 플레이트(웰당 0.1㎖)로 접종한다. 하루가 지난 후에, 배지는 무-혈청 DMEM으로 대체시키고, 하루가 지난 후에, 세포는 무혈청 배지에서 뮤린 렙틴 유무하에 IGF-I(50ng/㎖)로 처리한다. 플레이트는 48시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양시킨다. 그 다음 세포는 MTT로 착색시킨다. 데이터는 평균±표준 편차(SE, n=8)로 나타내었다. 결과를 보면, 렙틴이 인슐린-유도성 세포 증식을 상당히 저해시킨 것을 알 수 있다(도 9).
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- 렙틴, 렙틴 염 또는 이의 혼합물을 활성 물질로 하고, 포유류에서 악성 종양 치료용 약학 조성물
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- 제 19 항에 있어서, 약학 조성물은 생장-인자 의존성 종양을 저해하기 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 악성 종양은 사람 유방 암종인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 19 항에 있어서, 약학 조성물은 IRS-1/GRB2 경로에 의해 중개되는 종양 세포에서 인슐린의 생장 자극 효과를 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 19 항 또는 제 21 항에 있어서, 약학 조성물은 IRS-1를 기질로 하는 IGF-1, IL-4, IL-9로 구성된 사이토킨 및 생장 인자, 수용체 카이나제에 대한 종양 세포의 유사분열 반응을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 19 항 또는 제 21항에 있어서, 약학 조성물은 기저 및 인슐린 유도된 종양 세포 증식을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 활성 성분은 렙틴인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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