NO322304B1 - Anvendelse av leptin for fremstilling av et medikament for inhibering av human brystkarcinomcelleproliferering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av leptin for fremstilling av et medikament for inhibering av human brystkarcinomcelleproliferering. Leptin er et cytokin produsert av adipocytter og som virker inn på forskjellige celler og vev.

Leptin og adipocyttavledet cytokin som regulerer kroppsvekt, ble identifisert ved posi-sjonskloning av det murine øfc-genet (Zhang et al., 1994) og ble vist å virke inn på både matinntak og termogenese (Campfield et al., 1995; Collins et al., 1996; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995; Weigle et al., 1995). Høyaffinitetslipidbindingsseter ble lokalisert i koroid pleksus; som uttrykker kloning av cDNA fra dette vevet til-veiebragt av leptinreseptoren (OB-R) (Tartaglia et al., 1995). De kjente aktivitetene til leptin er mediert gjennom dens reseptor i hypotalamus. Leptinreseptorene blir uttrykt, i ytterligere organer, spesielt nyre, lunge og lever (Cioffi et al., 1996: Lee et al., 1996;

Tartaglia et al., 1995). Ytterligere blir et forskjellig reportoar av leptinreseptorsplei-singsvarianter, som er forskjellige i deres cytoplasmatiske domene, uttrykt på en vevs-spesifikk måte i musen (Lee et al., 1996). Derfor, i tillegg til kontroll av matinntak og kroppsvarme, kan leptin utvise andre fysiologiske funksjoner.

Skjønt leptin blir produsert av adipocytter, var det nylige funn av en korrelasjon mellom for mye fett og høye nivåer av leptin i serum i kontrast med den forestilling at leptin reduserer matinntak og kroppsvekt (Considine et al., 1996; Frederich et al., 1995; Lonnqvist et al., 1995; Maffei et al., 1995). Denne korrelasjonen og den veletablerte koblingen mellom fedme og insulinresistens (Felber og Golay, 1995) foreslår at leptin kan modulere insulinregulerte responser. Det ble nylig rapportert at leptin reduserte signifikant basal- og insulinindusert tyrosin-fosforylering av insulinreseptorsubstrat-1 (IRS-1). Denne effekten av leptin på IRS-1 fosforylering var spesifikk, siden tyrosin-fosforylering av insulinreseptoren (IR) B-kjeden ikke ble redusert (Cohen et al., 1996).

Tyrosin-fosforylering av IRS-1 av IR-kinase er et nøkkeltrinn i insulinreseptorsignalise-ringskaskaden, som fører til mange av de kjente insulinaktiviteten (Araki et al., 1994;

Cheatham og Kahn, 1995; Myers et al., 1994; Myers et al., 1994; Myers og White, 1993; Rose et al., 1994; Tamemoto et al., 1994; White og Kahn, 1994). Nedstrøms sig-nalisering av IRS-1 er mediert ved flere assosierte proteiner, en som er vekstfaktorresep-torassosiert bindingsprotein-2 (GRB2) (Cheatham og Kahn, 1995).

Insulinreseptoren (IR) blir betraktet som en metabolsk reseptor, som medierer effektene av insulin på glukosehomeostase. Som sådan blir den uttrykt på terminaldifferensierte vev slik som adipose vev, lever og muskel. Imidlertid, har mange studier vist at IR er en potent mitogen reseptor in vitro og in vivo når den blir uttrykt i tumorceller. For eksempel, ble fuksjonelle IR identifisert i flere brystcancercellelinjer, som bestemt ved tyrosin-fosforylering av IR i respons på insulinbehandling. Videre, medierer IR en mitogen respons i disse cellene, som beskrevet ved [<3>H]tymidininkorporering (Milazzo et al., 1997; Millazzo et al., 1992).

Så langt har det ikke blitt beskrevet anvendelsen av leptin i området onkologi, generelt;

og spesielt, har leptin ikke blitt beskrevet som å være nyttig for å inhibere proliferering av celler, spesielt proliferering av cancerceller.

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er anvendelse av et aktivt middel valgt fra gruppen bestående av leptin, leptinfusjonsproteiner, leptinmuteinér, aktive fragmenter eller fraksjoner av en enkelt derav som har minst 80 % sekvensidentitet med leptin og som har en lignende biologisk aktivitet som vill-leptin eller salter av en enkelt derav, og blandinger av en enkelt derav, for fremstilling av et medikament for inhibering av human brystkarcinomcelleproliferering.

Et annet mål for oppfinnelsen er anvendelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av humane brystkarcinomer.

Et ytterligere mål for oppfinnelsen er anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2 for fremstilling av et medikament for behandling av brystcarcinomer, hvori den vekststimulatoriske effekten av insulin på brystcarcinomceller, som er mediert, i det minste delvis, av insulin reseptor substrat-1 (IRS- 1/vekst-faktor reseptor-assosiert bindingsprotein-2(GRB2)reaksjonsvei er inhibert.

Et ytterligere mål for den foreliggende oppfinnelse er anvendelse ifølge krav 1 eller krav 3 for fremstilling av et medikament for behandling av brystcarcinomer, hvori den mitogene responsen i brystcarcinomcellene til én eller flere reseptorkinaser, vekstfaktorer og cytokiner er inhibert, hvori nevnte reseptor kinaser, vekstfaktorer og cytokiner har IRS-1 som et substrat, hvori nevnte reseptor kinaser, vekstfaktorer og cytokiner er fra gruppen bestående av IGF-1, IL-4 og IL-9.

Andre formål fra oppfinnelsen vil bli fremsatt her under eller vil lett være tydelig fra følgende beskrivelse.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse ifølge et hvert av kravene 1 til 4, for fremstilling av et medikament for behandling av humane brystcancere, hvori basal og insulinindusert brystcarcinomcelleproliferering er inhibert. . Leptin kan være nyttig, enten alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler eller tilnærminger, for behandling av forskjellige maligniteter. En annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er anvendelse ifølge et hvert av kravene 1 til 5, hvori nevnte aktive middel er leptin.

Prolifereringen av mange typer av tumorceller økes ved tilstedeværelse av forskjellige vekstfaktorer, slik som insulin og IGF-1. Den vekststimulatoriske effekten til insulin og IGF-1 på celler blir mediert, idet minste delvis, via IRS-1/GRB2 reaksjonsvei (Myers et al., 1993). Denne reaksjonsveien blir inhibert av leptin. Videre, er IRS-1 et substrat for reseptorkinaser for ytterligere vekstfaktorer og cytokiner, inklusiv IL-4 og IL-9 (Pernis et al., 1995; Yin et al., 1995; Yin et al., 1994). Derfor, kan leptin inhibere mitogene responser hos noen eller alle av de tidligere nevnte vekstfaktorer og cytokiner, såvel som andre vekstfaktorer, som derved inhiberer prolifereringen av forskjellige tumorceller. Eksempler som tilveiebringes inkluderer inhibering av IGF-1 indusert proliferering og insulinindusert proliferering av human brystcancercellelinjene T-47D og MCF7.

Det er følgelig mulig å danne en farmasøytisk sammensetning som omfatter en aktiv ingrediens, et aktivt middel som vist over og en farmsøytisk akseptabel bærer, fortyn-ningsmiddel eller eksipient, for inhibering av tumorcelleproliferering.

Den farmasøytiske sammensetningen som beskrevet ovenfor an administreres i en egnet doseform og ved en egnet måte for administrering. Slike doseformer og måter for administrering blir vanligvis bestemt av en medisiner etter undersøkelse av pasienten.

Andre aspekter og utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er fremsatt eller vil lett være tydelig fra den følgende detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 viser avhengigheten av T-47D celleproliferering av insulin bestemt ved MTT-farging. Figur 2 viser avhengigheten av T-47D celleproliferering av IGF-1 bestemt ved MTT-farging. Figur 3 viser inhiberingen av insulinindusert T-47D celleproliferering i 10% fetaltbo-vint serum (FBS) ved murin leptin som bestemt ved MTT-farging. Figur 4 viser inhiberingen av insulinindusert T-47D celleproliferering i 2% FBS ved murin leptin som bestemt ved krystallfiolett farging. Figur 5 viser inhibering av IGF-1 indusert T-47D celleproliferering i 10% FBS ved murin leptin som bestemt ved MTT-farging. Figur 6 viser inhibering av IGF-l-indusert T-47D celleproliferering i 2% FBS ved murin leptin som bestemt ved krystallfiolett farging. Figur 7 viser inhibeirng av IGF-l-induset rT-47D celleproliferering i 2% FBS ved human leptin som bestemt ved krystallfiolett farging. Figur 8 viser inhibering av insulinindusert MCF7 celleproliferering i serumfritt ved murin leptin som bestemt ved krystallfiolett farging. Figur 9 viser inhibering av IGF-l-indusert MCF7 celleproliferering i serumfritt ved murin leptin som bestemt ved krystallfiolett farging.

De farmasøytiske sammensetningene kan anvendes som en inhibitor av tumorcelleproliferering. Cellelinjer av human opprinnelse, avledet fra forskjellige tumorer, kan dyrkes i kultur ved tilstedeværelse av vekstmedium supplert med føtalt bovint serum i en konsentrasjon på omtrent 10 volum-%. Celleproliferering under disse betingelsene er definert heretter som "basal celleproliferering". Vekst av mange tumorcellelinjer er signifikant forsterket når forskjellige vekstfaktorer slik som insulin, epidermal vekstfaktor eller insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) blir tilsatt til det ovenfor nevnte serumsup-plerte kulturmediumet. Inklusjon av leptin i vekstmediumet i et område for konsentrasjoner fra 3 til 600 nanomolar reduserer både basal celleproliferering og vekstfaktorav-hengig celleproliferering.

Resultatene av cellekultureksperimentene som er gitt i eksemplene under indikerer at leptin er nyttig for inhibering av vekst av forskjellige tumorer. Derfor kan leptin være nyttig for behandlingen av forskjellige maligniteter.

Når leptin blir tilsatt til kulturene for human duktal brystcarcinoma T-47D-celler, (American Type Culture Collection, Rockville, MD; stamme nr. ATCC HTB 133), blir graden av proliferering redusert. På samme måte, når leptin blir tilsatt til kulturer av humane brystadenocarcinoma MCF7-celler, (American Type Culture Collection, Rockville, MD; stamme nr. ATCC HTB 22), blir deres grad av proliferering redusert. Leptin inhiberer både basal, IGF-1 indusert og insulinindusert proliferering av T-47D og MCF7 celler. Derfor, kan leptin være nyttig spesifikt for behandlingen av brystcarcinomaer.

Vekststimulatorisk effekt hos insulin og IGF-1 på celler er mediert, i hvertfall delvis, via tyrosinfosforylering av IRS-1 og etterfølgende assosiering av IRS-1 med GRB2, som fører til en mitogen respons. Anti-mitogen effekt av leptin kan resultere fra dets evne til å redusere basal, insulinindusert og IGF-l-indusert tyrosinfosforylering av IRS-1, som fører til redusert binding av GRB2 til IRS-1. Videre, er IRS-1 et substrat av reseptorkinaser fra andre vekstfaktorer og cytokiner, inklusiv IL-4 og IL-9 (Pernis et al., 1995; Yin et al., 1995; Yin et al., 1994). Derfor, kan leptin inhibere mitogene responser av noen eller alle de tidligere nevnte vekstfaktorene og cytokinene, såvel som andre mitogener, for derved å inhibere prolifereringen av forskjellige tumorceller.

Som brukt heri, refererer "muteiner" seg til analoger av leptin, hvori en eller flere av

aminosyreresidiene er erstattet med forskjellige aminosyreresidier, eller er deletert, eller en eller flere aminosyreresidier er tilsatt til originalsekvensen til leptin uten å endre aktiviteten av de resulterende produktene noe særlig, sammenlignet med vildtypeleptin eller dets aktive fragmenter eller fraksjoner. Disse muteinene er fremstilt ved kjent syntese

og/eller ved setedirigert mutageneseteknikker, eller enhver annen kjent teknikk egnet derfor.

Et hvert slikt mutein har fortrinnsvis en sekvens av aminosyrer som er tilstrekkelig duplikative med den fra leptin slik at den har vesentlig lik aktivitet til leptin eller dets

aktive fragmenter eller fraksjoner. Derfor, kan det bli bestemt om enhver gitt mutein har vesentlig samme aktivitet som leptin, ved metoder for rutineekspeirmentering som omfatter å utsette et slikt mutein, f.eks., til en enkel celleprolifereringsanalyse, som et mutein som blokkerer celleproliferering som bibeholder tilstrekkelig aktivitet av leptin og derfor har minst en av de beskrevne anvendeligheter av leptin og som har vesentlig lik aktivitet dertil.

Et slikt mutein har minst 40% identitet eller homologi med sekvensen fra en av leptine-ne. Mer å foretrekke, har den minst 50%, minst 60%, minst 70%, minst 80% eller, mest foretrukket, minst 90% identitet eller homologi dertil.

Muteiner av leptin eller dets aktive fragmenter eller fraksjoner som kan bli anvendt eller nukleinsyrer som koder der for, inkluderer et begrenset sett av vesentlig korresponderende sekvenser som substitusjonspeptider eller polynukleotider som kan rutinemessig erverves av en som kjenner fagfeltet, uten å gjøre unødige eksperimenter, basert på be-skrivelsene og veiledning som er presentert heri. For en detaljert beskrivelse av pro-teinkjemi og struktur, se Schulz, G.E. et alM Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; og Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Pro-perties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, som herved er inkorporert ved refe-ranse. Foren presentasjon av nukleotidsekvenssubstitusjoner, slik somkodonpreferanse, se Ausubel et al., supra, §§ A. 1.1-A. 1.24, og Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biolo<gy>. Interscience N. Y. §§ 6.3 og 6.4 (1987,1992), ved appendiksene C og

D.

Foretrukkede endringer av muteiner er det som er kjent som "konservative" substitusjo-ner. Konservative aminosyresubstitusjoner hos leptinpolypeptider eller proteiner eller dets aktive fragmenter eller fraksjoner kan inkludere synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig fysiokjemiske egenskaper slik at substitusjon mellom med-lemmer av gruppen vil opprettholde den biologiske funksjonen til molekylet, Grantham, Science, bind 185, s. 862-864 (1974). Det er klart at insertsjoner og delesjoner av aminosyrer også kan bli fremstilt i de ovenfor definerte sekvensene uten å endre deres funk-sjon spesielt hvis insersjonen eller delesjonen bare involverer få aminosyrer, f.eks., under 30, og fortrinnsvis under 10, og ikke fjerner eller deplasserer aminosyrene som er kritiske til en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinresidier, Anfinsen, "Principles That Govem The Folding of Protein Chains", Science, bind 181, s. 223-230 (1973). Proteiner og muteiner produsert ved slike delesjoner og/eller insersjoner er innenfor området av foreliggende oppfinnelse.

Fortrinnsvis, er synonyme aminosyregrupper de som er definert i tabell I. Mer foretrukket, er synonyme aminosyregrupper de som er definert i tabell II; og mest foretrukket er synonyme aminosyregrupper de som er definert i tabell HI. Eksempler for produksjon av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan bli brukt for å erverve muteiner fra leptin eller dets aktive fraksjoner for anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer et hvert kjent metodetrinn, slik som presentert i US patentene RE 33,653,4,959,314,4,588,585 og 4,737,462, til Mark et al.; 5,116,943 til Koths et al.; 4,965,195 til Nåmen et al.; 4,879,111 til Chong et al.; og 5,017,691 til Lee et al., og ly-sinsubstituerte proteiner presentert i US patent nr. 4,904,584 (Shaw et al.).

En hver mutein av leptin eller dets aktive fraksjoner har en aminosyresekvens som i alt vesentlig korresponderer med den fra leptin. Betegnelsen "vesentlig korresponderende til" har til hensikt å innbefatte proteiner med små endringer til sekvensen til det naturlige proteinet som ikke affiserer grunnkarakteristikkene til de naturlige proteinene, spesielt når det gjelder dets evne til å inhibere celleproliferering. Typen av endringer som blir generelt tatt i betraktning å falle innenfor "idet vesentlige korresponderende til" språket er de som ville resultere fra konvensjonelle mutageneseteknikker av DNA-kodende leptin, resulterende i få mindre modifiseringer, og screening for ønsket aktivitet på måten som diskutert over.

Muteiner inkluderer proteiner som koder for en nukleinsyre, slik som DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA som koder for leptin i samsvar med foreliggende oppfinnelse, under stringente betingelser. Slik nukleinsyre ville være en god kandidat for å bestemme om den koder et poiypeptid som har bibeholdt funksjonell aktivitet til leptin fra foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen "stringente betingelser" refererer til hybridisering og etterfølgende vaskingsbetingelser som de som kjenner fagfeltet kon-vensjonelt refereres til som "stringente". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bioloev. supra. Interscience. NY. §§6.3 og 6.4 (1987,1992), og Sambrook et al., supra. Uten begrensning, inkluderer eksempler på stringente betingelser vaskebetingel-ser 12-20°C under den beregnede Tm for hybridet som skal studeres i, f.eks. 2 x SSC og 0,5 SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter; 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30-60 minutter og deretter en 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68°C i 30-60 minutter. De som kjenner fagfeltet forstår at de stringente betingelsene også avhenger av lengden av DNA-sekvensene, oligonukleotidprobene (slik som 10-40 baser) eller blandede oli-gonukleotidprober. Hvis blandede prober blir brukt, er det fordelaktige å anvende tetra-metylammoniumklorid (TMAC) isteden for SSC. Se Ausubel. supra.

Betegnelsen "leptinfusjonsproteiner" eller ganske enkelte "fusert protein" refererer seg . til et poiypeptid som omfatter leptin eller dets aktive fraksjoner eller et mutein derav, fusert med et annet protein som, f.eks. har en utvidet oppholdstid i kroppsvæsker. Leptin eller dets aktive fraksjoner kan derfor bli fusert til et annet protein, poiypeptid eller dets like.

Betegnelsen "salter" heri refererer seg til både salter fra karboksylgruppene og til syretilsetningssalter fra aminogruppene fra leptin, dets aktive fraksjoner, muteiner, eller leptinfusjonsproteiner deav. Salter fra en karboksylgruppe kan bli dannet ved midler som er kjent innen fagfeltet og inkluderer organiske salter, f.eks., natrium, kalsium, ammonium, jem- eller sinksalter, og dets like, og salter med organiske baser som de som blir formet, f.eks., aminer, slik som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og dets like. Syretilsetningssalter inkluderer, f.eks., salter med mineralsyrer slik som, f.eks., saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer slik som, f.eks., eddiksyre eller oksalsyre. Selvfølgelig, må et hver av slike salter ha vesentlig lignende aktivitet til leptin eller dets aktive fraksjoner.

"Funksjonelle derivater" som benyttet heri dekker derivater av leptin eller dets aktive fragmenter eller fraksjoner og dets mutiner og leptinfusjonsproteiner, som kan bli fremstilt fra funksjonelle grupper som forekommer som sidekjeder på residiene eller N- eller C-terminale grupper, ved midler som er kjent innen fagfeltet, og er inkludert i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytiske akseptable, dvs., at de ikke ødelegger aktiviteten til proteinet som er idet vesentlige lik aktiviteten til leptin, og ikke gir toksiske egenskaper til sammensetninger som inneholder den. Disse derivater kan, f.eks., inkludere polyetylenglykolsidekjeder som kan maskere antigensetene og utvide forekomsten av leptin eller dets aktive fraksjoner i kroppsvæsker. Andre derivater inkluderer alifatiske estere fra karboksylgruppene, amider fra karboksylgruppene ved reaksjon med ammonium eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater fra frie aminogrupper fra aminosyreresidier dannet med acyldeler (f.eks. alkanoyl eller karboksylaroylgrupper) eller O-acylderivater fra frie hydroksylgrupper (f.eks. den fra seryl eller treonylresidier) dannet med acyldeler.

Som "aktive fragmenter eller fraksjoner<**> av leptin, leptinmuteiner og leptinfusjonsproteiner, dekker foreliggende oppfinnelse et hvert fragment eller forløper av polypeptid-kjeden hos leptin, eller fuserte proteiner som inneholder et hvert slikt fragment fra leptin, alene eller sammen med assosierte molekyler eller residier koblet dertil, f.eks. suk-ker eller fosfatresidier, eller aggregater fra et hvert av de ovenfor nevnte derivater, forut-satt at nevnte fraksjon har vesentlig lik aktivitet som leptin.

Naturlige og syntetiske agonister fra leptinreseptoren, som er i det vesentlige lik leptin i deres evne til å inhibere celleproliferering kan også anvendes. Slike agonister kan bli selektert fra et bibliotek av peptider, et bibliotek av peptidanaloger eller et tilfeldig bibliotek av organiske molekyler. Seleksjonen ble gjort ved midler som er kjent innen fagfeltet, idet vesentlige ved evnen til å selektere agonister til å binde til leptinreseptoren. For eksempel, et bibliotek fra tilfeldige peptider kan bli fremstilt som prokaryote eks-presjonsplasmider som bærer et DNA som koder for et tilfeldig peptid, fusert til et bæ-rerprotein. Et annet eksempel er et fagiremvisningssystem hvori ekspresjonssystemet er en fag som inneholder DNA som koder for et tilfeldig peptid og inkorporert inn i en av de eksterne fagproteinene. Fagene som koder for de fuserte peptidagonistene eller anta-gonistene er isolert fra fagbibliotek ved f.eks. "panning" over overflater dekket med leptinreseptoren. Bundne fag blir isolert og deretter amplifisert i bakterier. Flere runder med "panning** amplifisering er som regel nødvendig for å erverve fag som uttrykker fuserte proteiner som har høy affinitet for leptinreseptoren. Isolerte fag blir deretter amplifisert og sekvensen av DNA som koder for peptidet blir bestemt. Alternativt, blir tilfeldige peptidbiblioteker eller biblioteker fra andre molekyler fremstilt ved fastfasesyn-tese på polymere kuler med metoder som er kjent innen fagfeltet. Kuler som bærer et peptid eller andre molekyler som har affinitet for leptinreseptoren blir selektert fra bibli-oteket, f.eks. ved å binde merket leptinreseptor, f.eks. fiuorescensmerket leptinreseptor. Positive kuler blir deretter plukket og strukturen til peptidet eller andre molekyler som er tilstede på kulen blir bestemt. Hvis kulen bærer et peptid, blir peptidsekvensen bestemt ved proteinsekvensanalyse. Dersom kulen er en representant fra et tilfeldig bibliotek av organiske molekyler, da blir molekylet kuttet fra kulen og dets struktur bestemt ved metoder som er kjent innen fagfeltet, slik som massespektrometri, nukleær magne-tisk resonans og dets like. Kandidatpeptider som blir identifisert ved deres affinitet for leptinreseptoren blir deretter ytterligere selektert for deres evne til å inhibere celleproliferering på den tidligere nevnte måte.

Følgelig, er aktive fraksjoner, leptinmuteiner, leptinfusjonsproteiner, leptinreseptoragonister og deres salter, funksjonelle derivater og aktive fragmenter eller fraksjoner derav indikert for behandlingen av forskjellige maligniteter, fortrinnsvis for vekstfaktorav-hengige tumorer og mer foretrukket for brystkarsinoma.

Farmasøytiske sammensetninger kan bli fremstilt for administrering ved å blande leptin eller dets derivater, eller leptinreseptoragonister med fysiologiske akseptable bærere, og/eller stabilisatorer og/eller eksipienter, og fremstilt i en doseform, f.eks. ved lyofiliser ring i doseringsrør. Metoden for administrering kan være via enhver av de aksepterte måtene for administrering for lignende mider og vil avhenge av tilstanden som skal behandles, f.eks. intravenøst, intramuskulært, subkutant, ved lokal injeksjon eller topisk anvendelse eller kontinuerlig ved infusjon, etc. Mengden av aktiv forbindelse som skal administreres vil avhenge av måten for administrering, sykdommen som skal behandles og tilstanden til pasienten. Lokal injeksjon, f.eks., vil kreve en lavere mengde av proteinet på kroppsvektsbasis enn intravenøs infusjon. Typisk aktive mengder av leptin som skal injiseres er 0,1-1000 ug/kg kroppsvekt og fortrinnsvis 1 til 10 fig/kg. Aktive mengder av leptinderivater og leptinreseptoragonister kan idet vesentlige være de samme som de som leptin når det gjelder den molare basisen.

Leptin kan bli administrert til cancerpasienter, f.eks. ved injeksjon, enten alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler eller i kombinasjon med andre terapeutiske tilnærmingsmåter.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved følgende eksempler:

EKSEMPEL 1: Bestemmelse av celleproliferering ved MTT- farging

Reagenser:

MTT "stock": (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid 5 mg/ml

i fosfatbufret saltvann. Lagret ved -20°C inntil bruk. Oppløsningsmiddel: Konsentrert HC1 (450 ul) i 2-propanol (100 ml).

Prosedyre:

Dyrking av celler i 96 brønners plater ved tilstedeværelse av forskjellige vekststimulan-ter og vekstinhibitorer. Til en ønsket tid tilsett MTT "stock" (10 |xl) til hver brønn. Inkuber 2,5-3 timer ved 37°C. Aspirer supernatanten med vakuum ved å bruke en fin gaugenål. Tilsett løsningsmiddel (100 (il) og les absorbansen med en mikrotiterplateav-leser ved å bruke et 570 nM filter med bakgrunnssubtraksjon ved 630 nm.

EKSEMPEL 2: Bestemmelse av celleproliferering ved krystallfiolettfarging

Prosedyre:

Dyrking av celler i 96 brønners plater med tilstedeværelse av forskjellige vekststimulan-ter og vekstinhibitorer. Ved ønsket tid tilsett 12,5% glutaraldehyd (40 ul) til hver brønn. Inkuber 30 minutter ved romtemperatur. Mikroplaten ble deretter vasket med vann, tør-ket og vandig krystallfiolett (0,1%, 0,1 ml) ble tilsatt hver brønn. Mikroplaten ble ytterligere inkubert i 30 minutter, vasket med vann og lest av ved 540 nm med bakgrunnssubtraksjon på 630 nm.

EKSEMPEL 3: Bestemmelse av insulinavhengig T- 47D celleproliferering

Humane T-47D celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD; stamme nr. ATCC HTB 133), ble sådd på 96 brønners plater ved 3 x 10<5> celler/ml i DMEM og 10% fetalt bovint serum (FBS), 0,1 ml pr. brønn. Human insulin ble tilsatt til forskjellige brønner ved økende konsentrasjoner, platene ble inkubert i 72 timer og antall av celler ble deretter bestemt ved å farge med MTT (figur 1). Resultatene er gjennomsnittet av 8 replika. Basert på graden av celleproliferering som vist i figur 1, ble en konsentrasjon på 55 mM insulin brukt for ytterligere studier.

EKSEMPEL 4: Bestemmelse av IGF- I- avhengjg T- 47D celleproliferering

Humane T-47D celler ble sådd på 96 brønners plater ved 3 x 10s celler/ml i DMEM og 10% FBS, 0,1 ml pr. brønn. Humant IGF-I ble tilsatt til forskjellige brønner ved økende konsentrasjoner, platene ble inkubert i 3 dager og antallet av celler ble deretter bestemt ved MTT-farging (figur 2). Resultatene er gjennomsnittet av 8 replika. Basert på graden av celleproliferering som vist i figur 2, ble en konsentrasjon på SO mg/ml IGF-I brukt for videre studier.

EKSEMPEL 5: Inhiberin<g> av insulinindusert T- 47D celleprolifererin<g> ved leptin T-47D celler (3 x 10s celler/ml) i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd ut på 96

brønners plater (0,1 ml pr. brønn). Cellene ble behandlet med insulin (SO nM), med eller uten indikerte konsentrasjoner av murin leptin. Platene ble inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med MTT. Dataene er gjennomsnitt ± standardfeil (SE, n = 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant insulinindusert celleproliferering (figur 3).

T-47D celler (3 x 10<5> celler/ml) i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd på 96 brøn-ners plater (0,1 ml pr. brønn). Etter en dag ble mediumet erstattet med DMEM supplert med 2% FBS og etter en dag ble cellene behandlet med insulin (50 nM), med eller uten de indikerte konsentrasjonene av murin leptin i DMEM-2% FBS. Platene ble inkubert ved 3TC i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Dataene er gjennomsnitt ± SE, (n 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant insulinindusert celleproliferering (figur 4).

EKSEMPEL 6: Inhiberin<g> av IGF- I- indusert T- 47D celleprolifererin<g> ved leptin T-47D celler (3 x 10<5> celler/ml) i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd ut på 96 brønners plater (0,1 ml pr. brønn). Cellene ble behandlet med IGF-I (50 ng/ml), med eller uten de indikerte konsentrasjonene av murin leptin. Platene ble inkubert ved 37<*>C i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med MTT. Dataene er gjennomsnitt ± standardfeil (SE, n = 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant IGF-I-indusert celleproliferering (figur 5).

T-47D celler (3 x IO<5> celler/ml) i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd ut på 96

brønners plater (0,1 ml pr. brønn). Etter en dag ble mediumet erstattet med DMEM supplert med 2% FBS og etter en dag ble cellene behandlet med IGF-I (50 ng/ml), med eller uten de indikerte konsentrasjonene av murin leptin i DMEM-2% FBS. Platene ble inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Data-

ene er gjennomsnitt ± standardfeil (SE, n 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant IGF-I-indusert celleproliferering (figur 6).

T-47D celler (3 x IO<5> celler/ml) i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd på 96 brøn-ners plater (0,1 ml pr. brønn). Etter en dag ble mediumet erstattet med DMEM supplert med 2% FBS og etter en dag ble cellene behandlet med IGF-I (50 ng/ml), med eller uten de indikerte konsentrasjoner av human leptin i DMEM-2% FBS. Platene ble inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Dataene er gjennomsnitt ± standardfeil (SE, n = 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant IGF-I indusert celleproliferering (figur 7).

EKSEMPEL 8: Inhibering av insulinindusert MCF7 celleprolifering ved leptin

Human brystadenokarcinoma MCF7 celler (3 x IO<4> celler/ml, American Type Culture Collection, Rockville, MD; stamme nr. ATCC HTB 22) supplert med 6% FBS ble sådd på 96 brønners plater (0,1 ml pr. brønn). Etter en dag ble mediumet erstattet med serumfritt DMEM og etter en dag ble cellene behandlet med insulin (50 nM) med eller uten de indikerte konsentrasjonene av murin leptin i et serumfritt medium. Platene ble inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 48 timer. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Dataene er gjennomsnitt + SE (n = 8). Resultatene viste at leptin inhiberte signifikant den insulin-induserte celleprolifereringen (figur 8).

EKSEMPEL 9: Inhiberin<g> av IGF- I- indusert MCF7 celleprolifererine ved leptin Human brystadenokarcinoma MCF7 celler i DMEM supplert med 10% FBS ble sådd på 96 brønners plater (3 x 10<4> celler/ml, 0,1 ml pr. brønn). Etter en dag ble mediumet erstattet med et serumfritt medium. Etter en dag ble cellene behandlet med IGF-I (50 ng/ml) med eller uten de indikerte konsentrasjonene av murin leptin i et serumfritt medium. Platene ble inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 96 timer. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett. Dataene er gjennomsnitt ± SE, (n = 8). Resultatene viser at leptin inhiberte signifikant insulinindusert celleproliferering (figur 9).

REFERANSER

Araki, E., Lipes, M.A., Patti, M.E., Bruning, J.C., Haag, B.r., Johnson, R.S. og Kahn, CR. (1994). Alternative pathway of insulin signalling in mice with targeted disruption of the IRS-1 gene [see comments]. Nature 372, s. 186-90.

Ausubel, F.M. et al., red., Current Prptocols in Molecular Biology.

Campfield, L.A., Smith, F.J., Guisez, Y., Devos, R. og Bura, P. (1995). Recombinant mouse OB protein: Evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 269,546-549.

Cheatham, B., og Kahn, CR. (1995). Insulin action and the insulin signaling network. Endocr Rev. 16, s. 117-42.

Cioffi, J.A., Shafer, A.W., Zupancic, T.J., Smith-Gbur, J., Mikhail, A., Platika, D. og Snodgrass, H.R. (1996). Novel B219/OB receptor isoforms: Possible role of leptin in hematopoiesis and reproduction. Nature Medicin, 2,585-589.

Cohen, B., Novick, D. og Rubinstein, M. (1996). Modulation of insulin activities by leptin. Science 274,1185-1188.

Coilens, S., Kuhn, CM., Petro, A.E., Swick, A.G., Chrunyk, B.A. og Surwit, R.S.

(1996). Role of leptin in fat regulation. Nature 380,677.

Considine, R. V., Sinha, M.K., Heiman, M.L., Kriauciunas, A., Stephens, T.W., Nyce, M.R., Ohannesian, J.P., Marco, CC, Mckee, L.J., Bauer, T.L. og Caro, J.F. (1996). Serum immunoreactive leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med 334,292-295.

Felber, J.P. og Golay, A. (1995). Regulation of nutrient metabolism and energy expendi-ture. Metabolism 44, Suppl 2) s. 4-9.

Frederich, R.C, Hamann, A., Anderson, S., Lollmann, B., Lowell, B.B. og Flier, J.S.

(1995). Leptin levels reflect body lipid content in mice: Evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nature Med 1,1311-1314.

Halaas, J.L., Gajiwala, K.S., Maffei, M., Cohen, S.L., Chait, B.T., Rabinowitz, D., Lallone, R.L., Burley, S.K. og Friedman, J.M. (1995). Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene [see comments], Science 269, s. 543-6.

Lee, G.H., Proenca, R., Montez, J.M., Carroll, K.M., Darvishzadeh, J.G., Lee, J.I. og Friedman, J.M. (1996). Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature 379,632-635.

Lonnqvist, F., Arner, P., Nordfors, L. og Schalling, M. (1995). Overexpression of the obese (ob) gene in adipose tissue of human obese subjects. Nature Med 1,950-953.

Maffei, M., Halaas, J., Ravussin, E., Pratley, R.E., Lee, G.H., Zhang, Y., Fei, H., Kim, S., Lallone, R., Ranganathan, S., Kern, P.A. og Friedman, J.M. (1995). Leptin levels in human and rodent: Measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Med 1,1155-1161.

Milazzo, G., Sciatta, L., Papa, V., Goldfine, I.D., og Vigneri, R. (1997). ASPB-10 insulin induction of increased mitogenic responses and phenotypic changes i human breast epithelial cells: evidence for enhanced interactions with the insulin-like growth factor-1 receptor. Molec. Carcinogenesis 18,19-25.

Millazzo, G., Giorgino, F., Damante, G., Sung, C, Stampfer, M.R., Vigneri, R., Goldfine, I. og Belfiore, A. (1992). Insulin receptor expression in human breast cancer cell lines. Cancer Res. 52, 3924-3930.

Myers, M.G., Jr., Sun, X.J., Cheatham, B., Jachna, B.R., Glasheen, E.M., Backer, J.M. og White, M.F. (1993). IRS-1 is a comrnon element in insulin and insulin-like growth factor-I signaling to the phosphatidylinositol 3'-kinase. Endocrinology 132, s. 1421-30.

Myers, M.G., Jr., Sun, X.J., og White, M.F. (1994). The IRS-1 signaling system. Trends Biochem Sei 19, s. 289-93.

Myers, M.G., Jr., Wang, L.M., Sun, X.J., Zhang, Y., Yenush, L., Schlessinger, J., Pierce, J.H. og White, M.F. (1994). Role of IRS-1-BRB-2 complexes in insulin signaling. Mol Cell Biol 14, s. 3577-87.

Myers, M.G., Jr., og White, M.F. (1993). The new elements of insulin signaling. Insulin receptor substrate-1 and proteins with SH2 domains. Diabetes 42, s. 643-50.

Pelleymounter, M.A., Cullen, M.J., Baker, M.B., Hecht, R., Winters, D., Boone, T. og Collins, F. (1995). Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice [see comments]. Science 269, s. 540-3.

Pernis, A., Witthuhn, B., Keegan, Å.D., Nelms, K., Garfein, E., Hile, J.N., Paul, W.E., Pierce, J.H. og Rothman, P. (1995). Interleukin 4 signals through two related pathways. Proe Nati Acad Sei USA 92, 7971-7975.

Rose, D.W., Saltiel, A.R., Majumdar, M., Decker, S.J. og Olefsky, J.M. (1994). Insulin receptor substrate 1 is required for insulin-mediated mitogenic signal transduction. Proe Nati Acad Sei USA 91, s. 797-801.

Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

Tamemoto, H., Kadowaki, T., Tobe, K., Yagi, T., Sakura, H., Hayakawa, T., Terauchi, Y., Ueki, K., Kaburagi, Y., Satoh, S., og et al., (1994) Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1 [see comments]. Nature 372, s. 182-6.

Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N.H., Culpepper, J., Devos, R., Rich-ards, G.J., Campfield, L.A., Clark, F.T., Deeds, J., Muir, C, Sanker, S., Moriarty, A., Moore, K.J., Smutko, J.S., Mays, G.G., Wolf, E.A., Monroe, CA. og Tepper, R.I.

(1995). Identification and expression cloning pf a leptin receptor, OB-R. Cell 83,1263-1271.

Weigle, D.S., Bukowski, T.R., Foster, D.C, Holdérman, S., Kramer, J.M., Lasser, G., Loftonday, CE., Prunkard, D.E., Raymond, C. og Kuijper, J.L. (1995). Recombinant ob protein reduces feeding and body weight in the ob/ob mouse. J Clin Invest 96,2065-2070.

White, M.F. og Kahn, CR. (1994). The Insulin signaling system. J Biol Chem. 269, s. 1-4.

Yin, T.G., Keller, S.R., Quelle, F.W., Witthuhn, B.A., Tsang, M.L.S., Lienhard, G.E., Me, J.N. og Yang, Y.C. (1995). Interleukin-9 induces tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 via JAK tyrosin kinases. J Biol Chem. 270,20497-20502.

]. Nature 372, s. 182-6.

Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N.H., Culpepper, J., Devos, R., Rich-ards, G.J., Campfield, L.A., Clark, F.T., Deeds, J., Muir, C, Sanker, S., Moriarty, A., Moore, K.J., Smutko, J.S., Mays, G.G., Wolf, E.A., Monroe, CA. og Tepper, R.I.

(1995). Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 83,1263-1271.

Weigle, D.S., Bukowski, T.R., Foster, D.C., Holderman, S., Kramer, J.M., Lasser, G., Loftonday, CE., Prunkard, D.E., Raymond, C og Kuijper, J.L. (1995). Recombinant ob protein reduces feeding and body weight in the ob/ob mouse. J Clin Invest 96,2065-2070.

White, M.F. og Kahn, CR. (1994). The Insulin signaling system. J Biol Chem. 269, s. 1-4.

Yin, T.G., Keller, S.R., Quelle, F.W., Witthuhn, B.A., Tsang, M.L.S., Lienhard, G.E., Uile, J.N. og Yang, Y.C. (1995). Interleukin-9 induces tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 via JAK tyrosin kinases. J Biol Chem. 270,20497-20502.

Yin, T.G., Tsang, M.L.S. og Yang, Y.C. (1994). JAK1 kinase forms complexes with interleukin-4 receptor and 4PS/insulin receptor substrate-1-like protein and is activated by interleukin-4 and interleukin-9 in T lymphocytes. J Biol Chem 269,26614-26617.

Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M., Barone, M., Leopold, L. og Friedman, J.M. (1994). Posttional cloning of the mouse obese gene and its humane homologue. Nature 372, 425-432.

Claims (6)

1. Anvendelse av et aktivt middel valgt fra gruppen bestående av leptin, leptinfusjonsproteiner, leptinmuteiner, aktive fragmenter eller fraksjoner av en enkelt derav som har minst 80 % sekvensidentitet med leptin og som har en lignende biologisk aktivitet som vill-leptin eller salter av en enkelt derav, og blandinger av en enkelt derav, for fremstilling av et medikament for inhibering av human brystkarcinomcelleproliferering.

2. Anvendelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av humane brystkarcinomer.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2 for fremstilling av et medikament for behandling av brystcarcinomer, hvori den vekststimulatoriske effekten av insulin på brystcarcinomceller, som er mediert, i det minste delvis, av insulin reseptor substrat-1 (IRS- 1/vekst-faktor reseptor-assosiert bindingsprotein-2(GRB2)reaksjonsvei er inhibert.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 3 for fremstilling av et medikament for behandling av brystcarcinomer, hvori den mitogene responsen i brystcarcinomcellene til én eller flere reseptorkinaser, vekstfaktorer og cytokiner er inhibert, hvori nevnte reseptor kinaser, vekstfaktorer og cytokiner har IRS-1 som et substrat, hvori nevnte reseptor kinaser, vekstfaktorer og cytokiner er fra gruppen bestående av IGF-1, IL-4 og IL-9.

5. Anvendelse ifølge et hvert av kravene 1 til 4, for fremstilling av et medikament for behandling av humane brystcancere, hvori basal og insulinindusert brystcarcinomcelleproliferering er inhibert.

6. Anvendelse ifølge et hvert av kravene 1 til 5, hvori nevnte aktive middel er leptin.