KR100496249B1 - 돼지의호흡기및생식기질환치료용폴리뉴클레오티드백신제제 - Google Patents

돼지의호흡기및생식기질환치료용폴리뉴클레오티드백신제제 Download PDF

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Abstract

숙주세포 생체내에서 발현되도록 하나의 돼지 병원체 결합가를 가진 유전자를 내포하는 플라스미드를 각기 함유하는 3 개 이상의 폴리뉴클레오티드 백신 결합가로 이루어진, 특히, 돼지의 생식기 및/또는 호흡기 병변에 대한 돼지 백신제제.
상기 결합가들이 아우제스키병 바이러스, 돼지 플루 바이러스, 돼지 미스테리 질병 바이러스, 파르보바이러스증 바이러스, 통상적인 돼지 콜레라 바이러스 및 악티노바실루스증을 나타내는 박테리아로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 플라스미드는, 각 결합가에 대해서, 아우제스키병 바이러스에 대한 gB 및 gD, 돼지 플루 바이러스에 대한 HA, NP 및 N, 미스테리병 바이러스에 대한 E, ORF3, M, 파르보바이러스증 바이러스에 대해 VP2, 페스티바이러스증에 대한 E1, E2, 및 악티노바실루스증에 대한 apxI, apxII 및 apxIII 로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 하나 이상 함유한다.

Description

돼지의 호흡기 및 생식기 질환 치료용 폴리뉴클레오티드 백신 제제{POLYNUCLEOTIDE VACCINE FORMULA FOR TREATING PORCINE RESPIRATORY AND REPRODUCTIVE DISEASES}
본 발명은 생식기 및 호흡기 병변에 대해 돼지에게 예방 접종할 수 있는 백신 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이에 해당하는 예방 접종법에 관한 것이다.
지난 수십년 동안, 돼지를 생육하는 방법이 완전히 변화하였다. 갇힌 공간안에서 집중적인 사육이 일반화되면서 필연적으로 호흡기 병변의 상당한 진전이 수반되었다.
돼지 호흡기 병변의 증후 범위는 일반적으로 돼지 호흡기 질환의 복합증으로 분류되어 바이러스 뿐 아니라 박테리아 및 마이코플라스마를 포함하는 매우 다양한 병원체들을 포함한다.
호흡기 질환을 유발하는 주요 병원체로는 악티노바실러스 플루로뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumoniae), 미스테리 질병 바이러스로 또한 불리는 불임성 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRS), 아우제스키병 바이러스 (PRV) 및 돼지 플루 (유행성 감기) 바이러스가 있다.
기타 바이러스들은 유산, 태아의 미이라화 및 불임을 유발하는 생식기 질환을 일으킨다. 주요 바이러스는 PRRS, 파르보바이러스 및 통상적인 돼지 콜레라 바이러스 (HCV) 이다. 이차적으로는, 돼지 플루 바이러스 PRV 및 A. 플루로뉴모니아 (A. pleuropneumoniae) 가 또한 상기 질환을 유발할 수 있다. A. 플루로뉴모니아, HCV 및 PRV 는 사망을 일으킬 수도 있다.
또한, 미생물간의 상호작용은 돼지 호흡기 복합증에 있어서 매우 중요하다. 실제로, 대부분의 박테리아성 병원균은 어린 동물에 있어서 비인두 영역 및 편도에서 흔히 볼 수 있는 숙주이다. 암퇘지로부터 유래된 상기 병원체들을, 콜로스트랄 면역 (cholostral immunity) 이 효과를 나타내지 전인, 갓 태어난 후 몇 시간 동안 어린 돼지들이 흡입하게 된다. 숙주의 호흡기 방어 기작이 악티노바실러스 플루로뉴모니아와 같은 선구 병원체 또는 바이러스에 의해서 손상되었을 때 상부 기도에 살고있는 유기체들이 하부 기도를 침범할 수도 있다. 특히 호흡기 상피세포 및 폐포 대식세포의 섬모를 손상시킬 수 있는 강력한 세포독소를 생성하는 악티노바실러스 플루로뉴모니아와 같은 선구 병원체의 경우에 있어서 폐로의 침범은 매우 빠를 수 있다.
인플루엔자와 같은 주요 바이러스성 감염, 및 호흡기성 코로나바이러스 및 아우제스키병 바이러스 감염으로, 호흡기 친화성을 가진 박테리아 및 마이코플라즈마 외에도, 호흡기 복합증에 대한 병원성 역할을 할 수 있다.
마지막으로, 일부 병원체들은 호흡기 및 생식기에 대한 영향을 모두 가진다. 또한, 생식의 병리학적 측면에서 상호작용을 일으킬 수도 있다.
그러므로, 돼지의 생식기 및 호흡기 병변을 유발하는 주요 병원체에 대한 효과적인 예방법을 개발하기 위한 노력이 필요한 것으로 보여진다.
지금까지 개발된 관련된 것들은 불활성 백신 또는 생백신, 경우에 따라서는 상기 백신의 혼합물로부터 제조되었다. 그들의 개발은 결합가 사이의 화합성 및 안정성의 문제들을 안고 있다. 사용된 상이한 항원의 관점에서 보나 제제 그 자체의 관점에서 보나, 특히 불활성 백신과 생백신 모두가 결합하는 경우에 상이한 백신 결합가 사이에 화합성을 모두 가질 수 있도록 하는 것이 실제로 필요하다. 상기 결합된 백신의 보전의 문제 및 또한 보조제의 존재하에서 특히 그들의 안정성 문제가 또한 존재한다. 이러한 백신들은 일반적으로 매우 비싸다.
특허 출원 WO-A-90 11092, WO-A-92 19183, WO-A-94 21797 및 WO-A-95 20660 은 최근 개발된 폴리뉴클레오티드 백신의 기술을 사용하고 있다. 이러한 백신들이 플라스미드로 삽입된 항원을 숙주세포내에서 발현할 수 있는 플라스미드를 사용한다는 것이 공지되어 있다. 모든 투여 경로가 제안되어있다 (복강내, 정맥내, 근육내, 경피내, 피내, 점막 등). DNA를 골드 입자 표면에 침착시켜 투사하므로써 동물의 피부내로 투과시키는 것 (Tang et al., Nature, 356, 152-154, 1992) 및 피부, 근육, 지방조직 및 유방조직에 동시에 트랜스펙트될 수 있는 액체 제트 주사기 (Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992) 과 같은, 다양한 예방 접종 수단이 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 백신은 또한 나 DNA (naked DNA) 및, 예를 들어, 양이온성 지질 리포솜내에 제형된 DNA 모두를 사용할 수 있다.
문헌 [M-F Le Potier et al., Second International Symposium on the Eradication of Aujeszky's Disease (pseudorabies) Virus August 6th to 8 th 1995 Copenhagen, Denmark] 및 문헌 (M. Monteil et al., Les Journees d'Animation Scientifique du Departement de Pathologie Animale [Scientific meeting orgarnized by the department of animal pathology], INRA-ENV, Ecole Nationale Veterinaire, LYON, 13-14 Dec. 1994) 에서는 강한 프로모터인, 제 2 형 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터의 조절하에서 gD 유전자를 발현시킬 수 있는 플라스미드에 의해서 돼지를 아우제스키병 바이러스에 대해 예방 접종하기 위해 노력해왔었다. 우수한 항체 반응치에도 불구하고, 아무런 방어도 감지될 수 없었다. 현재는, gD 유전자 및 동일한 프로모터가 삽입된 재조합 아데노바이러스를 돼지에 접종한 후, gD 당단백질이 돼지에게서 방어를 유도하기에 충분하다는 것을 증명하는, 방어 영역에 있어서 만족스런 결과들이 기록되고 있다.
선행 기술은 폴리뉴클레오티드 백신접종법에 의해 돼지에게 있어서 방어적인 결과를 나타내지 못한다.
본 발명은 특히 호흡기 병변 및/또는 생식기 병변을 유발하는 수 많은 병원체에 대해 돼지를 예방접종할 수 있도록 하는 다결합가의 백신 제제를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 결합가의 상호 화합성 및 안정성에 필요한 모든 기준들을 나타내면서 상이한 결합가로 결합하는 백신 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동일한 운반체내에 상이한 결합가로 결합할 수 있는 백신 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사용이 용이하고 값싼 백신 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 다결합가 방어를 포함하여, 높은 효능 및 장시간 지속성을 가질 뿐 아니라 양호한 안전성 및 잔류물이 없는 방어를 수득할 수 있는 백신 제제 및 돼지의 백신 접종 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 주제는 그러므로 하나의 돼지 병원체 결합가를 가진 유전자를 내포하여, 숙주세포 생체내에서 발현되는 플라스미드를 각기 함유하는 3 개 이상의 폴리뉴클레오티드 백신 결합가로 이루어진, 특히, 돼지의 생식기 및/또는 호흡기 병변에 대한 백신제제에 관한 것으로써, 상기 결합가들은 아우제스키병 바이러스 (PRV 또는 슈도라비에스 바이러스), 돼지 플루 바이러스 (돼지 인플루엔자 바이러스, SIV), 돼지 미스테리 질병 바이러스 (PRRS 바이러스), 파르보바이러스증 바이러스 (PPV 바이러스), 통상적인 돼지 콜레라 바이러스 (HCV 바이러스) 및 악티노바실루스증을 나타내는 박테리아 (A. pleuropneumoniae) 로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 플라스미드는 각 결합가에 대해서 아우제스키병 바이러스에 대한 gB 및 gD, 돼지 플루 바이러스에 대한 HA, NP 및 N, PRRS 바이러스에 대한 ORF5 (E), ORF3, ORF6 (M), 통상적인 돼지 콜레라 바이러스에 대한 E1, E2, 및 A. 플루로뉴모니아에 대한 apxI, apxII 및 apxIII 로 구성된 군으로부터 선택된 유전자를 하나 이상 함유한다.
본 발명에 있어서 결합가 (Valency) 는 고려되는 병원성 바이러스에 대해 방어를 나타내도록 하는 하나 이상의 항원을 의미하는 것으로, 결합가는 고려되는 병원성 균주중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상 변형된 천연 유전자를 소결합가 (subvalency) 로 함유할 수 있다.
병원체 유전자는 완전한 유전자 뿐 아니라, 방어반응을 유발하는 능력을 보유하는 단편을 포함하여 다양한 뉴클레오티드 서열의 의미하는 것이다. 유전자의 개념은 실시예에서 상세하게 기재된 것과 균등한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로, 다시 말해 동일한 단백질을 코드하는 상이한 서열을 의미하는 것이다. 이는 또한 다른 병원성 균주의 뉴클레오티드 서열도 포함하는데, 이는 하나의 균주 또는 균주군에 특이적인 방어 또는 교차-방어를 나타낸다. 이는 또한 동일한 단백질을 코드하지만 숙주 동물에 의한 생체내 발현이 용이하도록 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백신 제제는 바람직하게는 PRRS 및 A. 플루로뉴모니아 (악티노바실루스증) 결합가로부터 선택된 다른 결합가가 첨가될 수 있는 아우제스키병 및 돼지 플루 결합가로 이루어질 것이다. 파르보바이러스증 및 통상적인 돼지 콜레라 결합가로부터 선택된 다른 결합가들이 경우에 따라 거기에 첨가될 수 있다.
당연히 결합가들의 모든 조합이 가능하다. 그러나, 본 발명의 범위내에서, PRRS 및 A. 플루로뉴모니아와 함께, 아우제스키병 및 돼지 플루 결합가가 바람직한 것으로 보인다.
보다 상세하게 돼지 호흡기 병변에 대해 나타낸 백신 접종의 관점에서 볼 때, 결합가들은 아우제스키병, 돼지 플루, PRRS 및 악티노바실루스증으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
생식기 병변에 대해 구체적으로 나타낸 백신 접종의 관점에서 볼 때, 결합가는 PRRS, 파르보바이러스증, 통상적인 돼지 콜레라 및 아우제스키병으로 선택하는 것이 바람직할 것이다.
아우제스키병 결합가에 관해서는 gB 및 gD 유전자중 어느 하나가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 두 유전자 모두 사용되고, 이러한 경우에 있어서 이들은 상이한 플라스미드에 또는 하나의 동일한 플라스미드내에 배열된다.
돼지 플루 결합가에 관해서는 HA 및 NP 유전자가 바람직하게 사용된다. 상기 두 유전자중 어느 하나 또는 두 유전자 모두가 상이한 플라스미드에 또는 하나의 동일한 플라스미드내에 배열되어 사용될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주, 특히 당 분야에서 발견되는 상이한 균주로부터의 HA 서열이 동일한 백신내에 결합될 것이다. 다른 한편으로는, NP 가 교차-방어를 나타내므로 단일한 바이러스 균주로 부터의 서열이 만족스러울 것이다.
PRSS 결합가에 관해서는 E 및 ORF3 또는 택일적으로 M 유전자가 바람직하게 사용된다. 상기 유전자는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는데; 조합하는 경우에 있어서, 상기 유전자들은 별개의 플라스미드 또는 상기 유전자중 2 또는 3 개를 조합한 플라스미드에 배열될 수 있다. 적어도 2 개의 균주, 특히 유러피안 균주 및 아메리칸 균주로부터 유래된 유전자들을 동일한 백신내에서 조합하는 것이 유리할 것이다.
통상적인 돼지 콜레라 결합가에 관해서는, 2 개의 상이한 플라스미드내 또는 선택적으로 하나의 동일한 플라스미드내에서의 E1 및 E2 유전자중 어느 하나 또는 조합된 E1 및 E2 유전자가 사용될 수 있다.
악티노바실루스증 결합가에 관해서는, 상이한 플라스미드내 또는 혼합된 플라스미드내의 상기 언급된 3 개의 유전자중 하나 또는 상기 유전자들중 2 또는 3 개의 조합을 사용하여 A. 플루로뉴모니아의 상이한 혈청형 (serotypes) 에 대해 방어를 나타낼 수 있다. apxI, apxII 및 apxIII 항원에 대해서, 코딩 서열이 특히 실시예에서와 같이 비독성화된 항원을 수득할 수 있도록 변형되는 것을 고려할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 제제는 특히 근육내 경로를 통한 백신 접종에 대해 일반적으로 0.1 내지 10 ml, 특히 1 내지 5 ml 부피의 투여형태로 제공될 수 있다.
투여량은 일반적으로 플라스미드 형태에 대해 일반적으로 10 ng 내지 1 mg, 바람직하게는 100 ng 내지 50 μg 및 바람직하게는 1 μg 내지 250 μg 일 것이다.
일반적으로 생리식염수 (0.9% NaCl), 초정제수, TE 완충액 등인 백신 접종 매개액중에 단순히 존재하는 나 플라스미드 (naked plasmid)를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 선행 기술에 기재된 모든 폴리뉴클레오티드 백신 형태가 물론 사용될 수 있다.
각 플라스미드는 숙주 세포로 조절하에서 삽입된 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 함유한다. 이는 일반적으로 강한 진핵세포 프로모터 및 특히 사람 또는 쥐 기원의, 또는 경우에 따라 래트, 돼지 및 기니아 피그와 같은 또다른 기원의 사이토메갈로바이러스 어얼리(early) CMV-IE 프로모터일 것이다.
보다 일반적으로, 프로모터는 바이러스 기원 또는 세포 기원중 어느 하나일 수 있다. 바이러스성 프로모터로는, SV40 바이러스 어얼리 또는 레이트 프로모터 또는 로우스 사코마 바이러스 LTR 프로모터를 들 수 있다. 또한, 유전자가 유래된 바이러스로 부터의 프로모터, 예를 들어 유전자 자체의 프로모터일 수 있다.
세포성 프로모터로는 세포골격 유전자의 프로모터, 예를 들어 데스민 프로모터 (Bolmont et al., Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 1990, 22, 117-122; 및 Zhenlin et al., Gene, 1989, 78, 243-254), 또는 이와는 달리 액틴 프로모터를 들 수 있다.
수개의 유전자가 동일한 플라스미드내에 존재하는 경우, 이들은 동일한 전사 단위체로 또는 2 개의 상이한 단위체로 나타날 수 있다.
본 발명에 따른 상이한 백신 결합가의 조합은 각각의 결합가에 대한 항원들을 발현하는 폴리뉴클레오티드 플라스미드를 혼합하므로써 이루어지는 것이 바람직할 수 있으나, 수개 결합가의 항원이 동일한 플라스미드에 의해 발현되도록 하는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 주제는 또한 PRV, PRRS, PPV, HCV 및 A. 플루로뉴모니아로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스중 하나로부터 유래된 하나 이상의 유전자를 코드하는 하나 이상의 플라스미드로 이루어진 단일 결합가의 백신 제제에 관한 것으로, 상기 유전자들은 상기 기재된 것들이다. 그들의 단일 결합가 특성외에, 상기 제제는 유전자의 선택, 그들의 조합, 플라스미드의 조성, 투여 부피, 투여량 등에 관련하여 상기 서술된 특징들을 포함할 수 있다.
단일 결합가 백신 제제는 (i) 상기 기재된 바와 같은 다결합가 백신 제제의 제조에 사용될 수 있고, (ii) 실제 병변에 대해 개별적으로 사용될 수 있고, (iii) 또다른 병변에 대한 형태의 백신과 조합되어 (생 또는 불활성화된 전체, 재조합, 서브유니트) 사용될 수 있고, 또는 (iv) 하기 기재된 바와 같은 백신의 부스터(booster)로서 사용될 수 있다.
본 발명의 주제는 또한 사실상 특히, 생전백신, 불활성화된 전백신, 서브유니트 백신, 재조합 백신으로 구성된 군으로부터 선택된, 선행기술에서의 형태인 일차 통상적인 백신으로 일차 백신접종하여 돼지를 예방접종하고자 하는 백신의 제조를 위해 본 발명에 따른 하나 이상의 플라스미드의 용도에 관한 것으로, 상기 일차 백신 (단일결합가 또는 다결합가) 은 교차-방어를 나타내는 항원(들) 또는 플라스미드에 의해 코드되는 항원(들)을 갖는다 (즉, 발현할 수 있다). 대단하게도, 폴리뉴클레오티드 백신은 면역 반응의 증폭 및 장시간-지속 면역성의 획득을 초래하는 잠재적인 부스터 효과를 갖는다.
일반적으로, 일차-예방접종 백신은 각종 가축용 백신 생산업체가 생산한 시판되는 백신들로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 주제는 또한 상기 기재된 바와 같은 일차-예방접종 백신 및 부스터를 위한 본 발명의 백신 제제가 함께 들어있는 예방접종 키트에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같은 일차 예방접종을 위한 추가자극으로써의 상기 제제의 용도를 고지하고 있는 전단(leaflet)이 동반된 본 발명에 따른 백신 제제에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 또한 상기 기재된 바와 같이 유효 투여량의 백신 제제를 투여하는 것을 특징으로 하는 돼지 생식기 병변 및/또는 호흡기 병변에 대해 돼지를 예방접종하는 방법에 관한 것이다. 상기 예방접종 방법은 백신 제제를 1 회 이상 투여하는 것으로 이루어지며, 이는 상기 투여를 단시간에 걸쳐 연속적으로 투여 및/또는 긴 간격을 두고 지속적으로 투여하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 백신 제제는, 폴리뉴클레오티드 백신 접종을 위한 선행기술에서 제안된 상이한 투여 경로에 의해서 및 공지된 투여 방법에 의해서 상기 예방접종 방법의 내용으로 투여될 수 있다. 예방접종은 특히 액체 제트, 바람직하게는 멀티플 제트, 주사기 및 피그제트 기구 (상품명: Pigjet apparatus; the company Endoscoptic, Laons, France 제조) 과 같은 특히 여러개의 구멍 또는 노즐, 특히 5 또는 6 개의 구멍 또는 노즐로 이루어진 주사 헤드를 이용한 주사기를 이용하여 피부내 투여 경로로 사용될 수 있다.
상기 기구에 의한 투여 부피는 바람직하게는 0.1 내지 0.9 ml, 특히 0.2 내지 0.6 ml 및 유리하게는 0.4 내지 0.5 ml 로 감소될 것이고, 투여 부피는 1 회 또는 수회, 바람직하게는 2 회 투여될 수 있다.
본 발명의 주제는 또하나 상기 기재된 바와 같은 일차 예방접종 및 본 발명에 따른 백신 제제를 이용하여 추가자극시키는 것으로 구성된 예방접종 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 우선, 특히 불활성화된, 생, 감쇠된 또는 재조합 형태의 통상적인 백신 또는 이와는 달리 서브유니트 백신을 동물에 투여하므로써 일차 예방접종을 하고, 바람직하게는 2 ∼ 6 주후, 본 발명에 따른 다결합가 또는 단일결합가의 백신을 투여한다.
본 발명은 또한 상기 설명으로부터 명백한 바와 같이, 백신 제제의 제조 방법, 즉 결합가 제제 및 그의 혼합물의 제법에 관한 것이다.
이제 수반되는 도면을 참고로 하여 본 발명의 구현예에 의해서 본 발명이 보다 상세하게 설명될 것이다.
도면의 설명
도 1 : 플라스미드 pVR102
도 2 : PRV gB 유전자 (NIA3 균주) 의 서열
도 3 : 플라스미드 pAB090 의 구조
도 4 : PRV gD 유전자 (NIA3 균주) 의 서열
도 5 : 플라스미드 pPB098 의 구조
도 6 : 돼지 플루 HA 유전자 (H1N1 균주) 의 서열
도 7 : 플라스미드 pPB143 의 구조
도 8 : 돼지 플루 NP 유전자 (H1N1 균주) 의 서열
도 9 : 플라스미드 pPB42 의 구조
도 10 : 돼지 플루 HA 유전자 (H3N2 균주) 의 서열
도 11 : 플라스미드 pPB144 의 구조
도 12 : 돼지 플루 NP 유전자 (H3N2 균주) 의 서열
도 13 : 플라스미드 pPB132 의 구조
도 14 : 플라스미드 pAB025
도 15 : 플라스미드 pAB001
도 16 : 플라스미드 pAB091
도 17 : 플라스미드 pAB092
도 18 : 플라스미드 pAB004
도 19 : 플라스미드 pAB069
도 20 : 플라스미드 pAB061
도 21 : 플라스미드 pPB162
도 22 : 플라스미드 pPB163
도 23 : 플라스미드 pPB174'
도 24 : 플라스미드 pPB189
도 25 : 플라스미드 pPB190
서열표
서열번호 1 : PRV gB 유전자 (NIA3 균주) 의 서열
서열번호 2 : 올리고뉴클레오티드 AB166
서열번호 3 : 올리고뉴클레오티드 AB167
서열번호 4 : 올리고뉴클레오티드 AB168
서열번호 5 : 올리고뉴클레오티드 AB169
서열번호 6 : PRV gD 유전자 (NIA3 균주) 의 서열
서열번호 7 : 올리고뉴클레오티드 PB101
서열번호 8 : 올리고뉴클레오티드 PB102
서열번호 9 : 올리고뉴클레오티드 PB107
서열번호 10 : 올리고뉴클레오티드 PB108
서열번호 11 : 돼지 플루 HA 유전자 (H1N1 균주) 의 서열
서열번호 12 : 올리고뉴클레오티드 PB097
서열번호 13 : 올리고뉴클레오티드 PB098
서열번호 14 : 돼지 플루 NP 유전자 (H1N1 균주) 의 서열
서열번호 15 : 올리고뉴클레오티드 PB095
서열번호 16 : 올리고뉴클레오티드 PB096
서열번호 17 : 돼지 플루 HA 유전자 (H3N2 균주) 의 서열
서열번호 18 : 돼지 플루 NP 유전자 (H3N2 균주) 의 서열
서열번호 19 : 올리고뉴클레오티드 AB055
서열번호 20 : 올리고뉴클레오티드 AB056
서열번호 21 : 올리고뉴클레오티드 AB001
서열번호 22 : 올리고뉴클레오티드 AB002
서열번호 23 : 올리고뉴클레오티드 AB170
서열번호 24 : 올리고뉴클레오티드 AB171
서열번호 25 : 올리고뉴클레오티드 AB172
서열번호 26 : 올리고뉴클레오티드 AB173
서열번호 27 : 올리고뉴클레오티드 AB007
서열번호 28 : 올리고뉴클레오티드 AB010
서열번호 29 : 올리고뉴클레오티드 AB126
서열번호 30 : 올리고뉴클레오티드 AB127
서열번호 31 : 올리고뉴클레오티드 AB118
서열번호 32 : 올리고뉴클레오티드 AB119
서열번호 33 : 올리고뉴클레오티드 PB174
서열번호 34 : 올리고뉴클레오티드 PB189
서열번호 35 : 올리고뉴클레오티드 PB190
서열번호 36 : 올리고뉴클레오티드 PB175
서열번호 37 : 올리고뉴클레오티드 PB176
서열번호 38 : 올리고뉴클레오티드 PB191
서열번호 39 : 올리고뉴클레오티드 PB192
서열번호 40 : 올리고뉴클레오티드 PB177
서열번호 41 : 올리고뉴클레오티드 PB278
서열번호 42 : 올리고뉴클레오티드 PB279
서열번호 43 : 올리고뉴클레오티드 PB280
서열번호 44 : 올리고뉴클레오티드 PB307
서열번호 45 : 올리고뉴클레오티드 PB303
서열번호 46 : 올리고뉴클레오티드 PB306
서열번호 47 : 올리고뉴클레오티드 PB304
서열번호 48 : 올리고뉴클레오티드 PB305
실시예 1 : 바이러스의 배양
바이러스를 세포변성효과가 수득될 때 까지 적절한 세포 시스템상에서 배양한다. 각 바이러스에 대해 사용된 세포 시스템은 당 분야의 숙련자에게 이미 공지되어있다. 간단하게 말하자면, 이글 최소 필수 배지 (MEM 배지) 또는 다른 적절한 배지에서 배양된, 사용된 바이러스에 민감성인 세포를 감염다중성을 이용하여 연구된 바이러스 균주와 함께 접종한다. 감염된 세포를 이어서 완전한 세포변성효과의 발현에 필요한 시간동안 (평균 36 시간) 37 ℃에서 배양시킨다.
실시예 2 : 박테리아의 배양 및 박테리아성 DNA 의 추출
악티노바실러스 플루로뉴모니아 균주를 문헌 [A. Rycroft et al., J. Gen. Microbiol., 1991, 137, 561-568]에 기재된 바와 같이 배양시킨다. 고분자량 DNA (염색체 DNA)를 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 표준 방법으로 제조한다.
실시예 3 : 바이러스성 게놈 DNA 의 추출
배양후, 상청액 및 용균된 세포를 수합하여 전체 바이러스 현탁액을 +4℃에서 1000 g 로 10 분간 원심분리시켜 세포 파편들을 제거한다. 바이러스 입자들을 이어서 +4℃에서 400,000 g 로 1 시간동안 초원심분리하여 수합한다. 펠렛을 최소부피의 완충액 (10 mM 트리스, 1 mM EDTA; pH 8.0) 으로 취합한다. 상기 농축된 바이러스 현탁액을 소듐 도데실 술페이트 (SDS) (최종 0.5%) 의 존재하에서 프로테이나제 K (최종 100 μg/ml) 로 37 ℃에서 2 시간동안 처리한다. 바이러스 DNA를 이어서 페놀/클로로포름 혼합액으로 추출한 다음 2 배 부피의 무수 에탄올로 침전시킨다. -20℃ 에서 하룻밤 방치한 후, DNA를 +4℃에서 10,000 g 로 15 분간 원심분리시킨다. DNA 펠렛을 건조시킨 다음 최소 부피의 멸균 초정수로 취합한다. 이를 이어서 제한효소로 절단할 수 있다.
실시예 4 : 바이러스 게놈 RNA 의 단리
RNA 바이러스는 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 따라서 정제된다. 각 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 문헌 [P. Chromczynski 및 N. Sacchi; Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159] 에 기재된 "구아니듐 티오시아네이트/페놀-클로로포름" 추출법을 이용하여 단리시킨다.
실시예 5 : 분자생물학적 방법
모든 플라스미드의 구축은 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 기본적인 분자생물학적 방법을 이용하여 수행된다. 본 발명에서 사용되는 모든 제한효소 단편들을f "젠클린 (Geneclean)" 키트 (BIO 101 Inc. La Jolla, CA)를 이용하여 단리한다.
실시예 6 : RT-PCR 방법
특정 올리고뉴클레오티드 (증폭된 단편들의 클로닝이 용이하도록 5' 말단에 제한효소 위치를 함유)를 증폭되는 유전자의 코딩 영역을 완전히 포함하도록 합성한다 (실시예 참고). 역전사효소 (RT) 반응 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 기본적인 방법에 따라 수행된다. 각 RT-PCR 반응을 한쌍의 특이적 앰플라이머로 수행하고, 주형으로서 추출된 바이러스 게놈 RNA를 사용한다. 증폭된 상보적 DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25:24:1) 로 추출한 다음 제한효소로 절단한다.
실시예 7 : 플라스미드 pVR1012
플라스미드 pVR1012 (도 1)를 시판되는 것 [Vical Inc., San Diego, CA, USA] 으로부터 수득한다. 그의 구축방법은 문헌 [J. Hartikka et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217] 에 기재되어있다.
실시예 8 : 플라스미드 pAB090 (PRV gB 유전자) 의 구축
플라스미드 pPR2.15 (M. Riviere et al., J. Virol., 1992, 66, 3424-3434)를 ApaI 및 NaeI 으로 절단하여 아우제스키병 바이러스 (NIA3 균주) gB 당단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 2665 bp 의 ApaI-NaeI 단편 (단편 A)을 방출시킨다 (도 2, 서열번호 1).
하기 2 개의 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키므로써 :
AB166 (33머) (서열번호 2)
AB167 (33머) (서열번호 3)
개시 ATG 코돈으로부터 ApaI 위치까지의 gD 유전자 서열을 함유하는 33 bp 단편을 5' 말단에 PstI 위치를 만들면서 재구축한다 (단편 B).
하기 2 개의 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키므로써 :
AB168 (45머) (서열번호 4)
AB169 (49머) (서열번호 5)
NaeI 위치로부터 TAG 정지코돈까지의 gD 유전자 서열을 함유하는 45 bp 단편을 3' 말단에 BamHI 위치를 만들면서 재구축한다 (단편 C).
단편 A, B 및 C를 미리 PstI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시키므로써 플라스미드 pAB090 (7603 bp)를 수득한다 (도 3).
실시예 9 : 플라스미드 pPB098 (PRV gD 유전자) 의 구축
플라스미드 pPR29 (M. Riviere et al., J. Virol., 1992, 66, 3424-3434)를 SalI 및 BglII 로 절단하여 아우제스키병 바이러스 (NIA3 균주) gD 당단백질을 코드하는 유전자의 3' 말단부분을 함유하는 711 bp 의 SalI-BglII 단편 (단편 A)를 유리시킨다 (도 4, 서열번호 6).
플라스미드 pPR29를 Eco47III 및 SalI 으로 절단하여 아우제스키병 바이러스 (NIA3 균주) gD 당단백질을 코드하는 유전자의 5' 말단부분을 함유하는 498 bp 의 Eco47III-SalI 단편 (단편 A)을 유리시킨다.
하기 2 개의 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키므로써 :
PB101 (15머) (서열번호 7)
PB102 (19머) (서열번호 8)
개시 ATG 코돈으로부터 Eco47III 위치까지의 gD 유전자의 5' 서열을 함유하는 15 bp 단편을 5' 말단에 PstI 위치를 만들면서 재구축한다 (단편 C).
정제후, 단편 A, B 및 C를 미리 PstI 및 BglII 로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7) 에 결찰시키므로써 플라스미드 pPB098 (6076 bp)를 수득한다 (도 5).
실시예 10 : 플라스미드 pPB143 (돼지 플루 HA 유전자, H1N1 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따른 RT-PCR 반응을, 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 플루 바이러스 (SIV, H1N1 "SW" 균주) 게놈 RNA에 대해 하기 올리고뉴클레오티드을 가지고 수행하여 :
PB107 (32머) (서열번호 9)
PB108 (33머) (서열번호 10)
1803 bp 의 PCR 단편의 형태인 SIV H1N1 으로부터 유래된 HA 단백질을 코드하는 유전자를 단리한다 (도 6, 서열번호 11). 정제후, 상기 단편을 벡터 PCRII-디렉트 (Invitrogen Reference K2000-01) 에 결찰시켜 벡터 pPB137 (5755 bp)을 수득한다. 벡터 pPB137을 EcoRV 및 NotI 으로 절단하여 HA 유전자를 함유하는 1820 bp EcoRV-NotI 단편을 유리시킨다. 상기 단편을 이어서 미리 EcoRV 및 NotI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜 플라스미드 pPB143 (6726 bp)를 수득한다 (도 7).
실시예 11 : 플라스미드 pPB142 (돼지 플루 NP 유전자, H1N1 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 플루 바이러스 (SIV H1N1 "SW" 균주) 게놈 RNA, 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB097 (36머) (서열번호 12)
PB098 (33머) (서열번호 13)
SalI-NotI 단편의 형태인 SIV H1N1 으로부터 유래된 NP 단백질을 코드하는 유전자 (도 8, 서열번호 14)를 단리한다. 정제후, 1566 bp 의 RT-PCR 생성물을 벡터 PCRII-디렉트 (Invitrogen Reference K2000-01) 에 결찰시켜 벡터 pPB127 (5519 bp)을 수득한다.
벡터 pPB127을 SalI 및 NotI 으로 절단하여 NP 유전자를 함유하는 1560 bp 의 SalI-NotI 단편을 유리시킨다. 상기 단편을 이어서 미리 SalI 및 NotI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pPB142 (6451 bp)를 수득한다 (도 9).
실시예 12 : 플라스미드 pPB144 (돼지 플루 HA 유전자, H3N2 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 플루 바이러스 (균주 SIV H3N2 Cotes du Nord 1987) 게놈 RNA, 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB095 (31머) (서열번호 15)
PB096 (36머) (서열번호 16)
PstI-NotI 단편의 형태인 SIV H3N2 으로부터 유래된 HA 단백질을 코드하는 유전자 (도 10, 서열번호 17)를 단리한다. 정제후, 1765 bp 의 RT-PCR 생성물을 벡터 PCRII-디렉트 (Invitrogen Reference K2000-01) 에 결찰시켜 벡터 pPB120 (5716 bp)을 수득한다.
벡터 pPB120을 NotI 으로 절단하여 HA 유전자를 함유하는 1797 bp 의 NotI-NotI 단편을 유리시킨다. 상기 단편을 이어서 미리 NotI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 프로모터에 대해 정방향으로 H3N2 HA 유전자를 함유하는 플라스미드 pPB144 (6712 bp)를 수득한다 (도 11).
실시예 13 : 플라스미드 pPB132 (돼지 플루 NP 유전자, H3N2 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 플루 바이러스 (균주 SIV H3N2 Cotes du Nord 1987) 게놈 RNA, 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB097 (36머) (서열번호 12)
PB098 (33머) (서열번호 13)
SalI-NotI 단편의 형태인 SIV H3N2 으로부터 유래된 NP 단백질을 코드하는 유전자 (도 12, 서열번호 18)를 단리한다. 정제후, 1564 bp 의 RT-PCR 생성물을 벡터 PCRII-디렉트 (Invitrogen Reference K2000-01) 에 결찰시켜 벡터 pPB123 (5485 bp)을 수득한다.
벡터 pPB123을 SalI 및 NotI 으로 절단하여 NP 유전자를 함유하는 1558 bp 의 SalI-NotI 단편을 유리시킨다. 상기 단편을 이어서 미리 SalI 및 NotI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pPB132 (6449 bp)를 수득한다 (도 13).
실시예 14 : 플라스미드 pAB025 (PRRSV ORF5 유전자, 렐리스태드 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 PRRSV 바이러스 (렐리스태드 균주) 게놈 RNA (J. Meulenberg et al., Virology, 1993, 19, 62-72), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여:
AB055 (34머) (서열번호 19)
AB056 (33머) (서열번호 20)
랠리스태드 균주, PRRS 바이러스로부터 유래된 엔벨로프 당단백질 E (gp25)를 코드하는 "ORF5" 유전자를 단리한다. 정제후, 630 bp 의 RT-PCR 생성물을 SalI 및 BamHI 으로 절단하여 617 bp 의 SalI-BamHI 단편을 단리시킨다. 상기 단편을 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB025 (5486 bp)를 수득한다 (도 14).
실시예 15 : 플라스미드 pAB001 (PRRSV ORF5 유전자, USA 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 PRRSV 바이러스 (ATCC VR2332 균주) 게놈 RNA (M. Murtaugh et al., Arch Virol., 1995, 140, 1451-1460), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
AB001 (30머) (서열번호 21)
AB002 (30머) (서열번호 22)
ATCC-VR2332 균주, PRRS 바이러스로부터 유래된 엔벨로프 당단백질 E ("gp25")를 코드하는 유전자를 단리한다. 정제후, 620 bp 의 RT-PCR 생성물을 PstI 및 BamHI 으로 절단하여 606 bp 의 PstI-BamHI 단편을 단리시킨다. 상기 단편을 미리 PstI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB001 (5463 bp)를 수득한다 (도 15).
실시예 16 : 플라스미드 pAB091 (PRRSV ORF3 유전자, 렐리스태드 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 PRRSV 바이러스 (렐리스태드 균주) 게놈 RNA (J. Meulenberg et al., Virology, 1993, 19, 62-72), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여:
AB170 (32머) (서열번호 23)
AB171 (30머) (서열번호 24)
랠리스태드 균주, PRRS 바이러스로부터 유래된 엔벨로프 당단백질 "gp45"를 코드하는 "ORF3" 유전자를 단리한다. 정제후, 818 bp 의 RT-PCR 생성물을 PstI 및 BamHI 으로 절단하여 802 bp 의 PstI-BamHI 단편을 단리시킨다. 상기 단편을 미리 PstI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB091 (5660 bp)를 수득한다 (도 16).
실시예 17 : 플라스미드 pAB092 (PRRSV ORF3 유전자, USA 균주) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 PRRSV 바이러스 (ATCC-VR2332 균주) 게놈 RNA (M. Murtaugh et al., Arch Virol., 1995, 140, 1451-1460), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
AB172 (32머) (서열번호 25)
AB173 (32머) (서열번호 26)
ATCC-VR2332 균주, PRRS 바이러스로부터 유래된 엔벨로프 당단백질 "gp45"를 코드하는 "ORF3" 유전자를 단리한다. 정제후, 785 bp 의 RT-PCR 생성물을 PstI 및 BamHI 으로 절단하여 769 bp 의 PstI-BamHI 단편을 단리시킨다. 상기 단편을 미리 PstI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB092 (5672 bp)를 수득한다 (도 17).
실시예 18 : 플라스미드 pAB004 (돼지 파르보바이러스 VP2 유전자) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 파르보바이러스 (NADL2 균주) 게놈 RNA (J. Vasudevacharya et al., Virology., 1990, 178, 611-616), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
AB007 (33머) (서열번호 27)
AB010 (33머) (서열번호 28)
돼지 파르보바이러스 VP2 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 1757 bp 단편을 증폭시킨다. 정제후, RT-PCR 생성물을 PstI 및 BamHI 으로 절단하여 1740 bp 의 PstI-BamHI 단편을 수득한다. 상기 단편을 미리 PstI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB004 (6601 bp)를 수득한다 (도 18).
실시예 19 : 플라스미드 pAB069 (돼지 콜레라 HCV E1 유전자) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 콜레라 바이러스 (HCV) (알포르트 균주) 게놈 RNA (G. Meyers et al., Virology., 1989, 171, 18-27), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
AB126 (36머) (서열번호 29)
AB127 (34머) (서열번호 30)
1363 bp RT-PCR 단편의 형태인 HCV 바이러스로부터 유래된 E1 단백질을 코드하는 서열을 단리시킨다. 정제후, 상기 단편을 SalI 및 BamHI 으로 절단하여 1349 bp 의 SalI-BamHI 단편을 수득한다.
상기 단편을 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB069 (6218 bp)를 수득한다 (도 19).
실시예 20 : 플라스미드 pAB061 (돼지 콜레라 HCV E2 유전자) 의 구축
실시예 6 에 기재된 방법에 따라서 RT-PCR 반응을 실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조된 돼지 콜레라 바이러스 (HCV) (알포르트 균주) 게놈 RNA (G. Meyers et al., Virology., 1989, 171, 18-27), 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
AB118 (36머) (서열번호 31)
AB119 (33머) (서열번호 32)
1246 bp RT-PCR 단편의 형태인 HCV 바이러스로부터 유래된 E2 단백질을 코드하는 서열을 단리시킨다. 정제후, 상기 단편을 SalI 및 BamHI 으로 절단하여 1232 bp 의 SalI-BamHI 단편을 수득한다. 상기 단편을 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 결찰시켜, 플라스미드 pAB061 (6101 bp)를 수득한다 (도 20).
실시예 21 : 플라스미드 pBP162 (결실된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxI 유전자) 의 구축
악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxI 유전자를 클로닝하여 아미노산 719 내지 846 사이의 글리신-풍부 아미노산 영역 (칼슘이온 결합 포함)을 결실시킨다.
PCR 반응을 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 1) 게놈 DNA (J. Frey et al., Infect. Immun., 1991, 59, 3026-3032) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB174 (32머) (서열번호 33)
PB189 (29머) (서열번호 34)
SalI-EcoRI 단편의 형태인, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 I 단백질을 코드하는 apxI 유전자의 5' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 2193 bp 의 PCR 생성물을 SalI 및 EcoRI 으로 절단하여 2183 bp 의 SalI-EcoRI 단편을 단리한다 (단편 A).
PCR 반응을 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 1) 게놈 DNA (J. Frey et al., Infect. Immun., 1991, 59, 3026-3032) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB190 (32머) (서열번호 35)
PB175 (31머) (서열번호 36)
EcoRI-BamHI 단편의 형태인, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 I 단백질을 코드하는 apxI 유전자의 3' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 576 bp 의 PCR 생성물을 EcoRI 및 BamHI 으로 절단하여 566 bp 의 EcoRI-BamHI 단편을 단리한다 (단편 B). 단편 A 및 B를 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 함께 결찰시켜, 플라스미드 pPB162 (7961 bp)를 수득한다 (도 21).
실시예 22 : 플라스미드 pBP163 (결실된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxII 유전자) 의 구축
악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxII 유전자를 클로닝하여 아미노산 716 내지 813 사이의 글리신-풍부 아미노산 영역 (칼슘이온 결합 포함)을 결실시킨다.
PCR 반응을 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 9) 게놈 DNA (M. Smits et al., Infection and Immunity, 1991, 59, 4497-4504) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB176 (31머) (서열번호 37)
PB191 (30머) (서열번호 38)
SalI-EcoRI 단편의 형태인, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 II 단백질을 코드하는 apxII 유전자의 5' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 2190 bp 의 PCR 생성물을 SalI 및 EcoRI 으로 절단하여 2180 bp 의 SalI-EcoRI 단편을 단리한다 (단편 A).
PCR 반응을 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 9) 게놈 DNA (M. Smits et al., Infection and Immunity, 1991, 59, 4497-4504) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB192 (29머) (서열번호 39)
PB177 (30머) (서열번호 40)
EcoRI-BamHI 단편의 형태인, 악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 II 단백질을 코드하는 apxII 유전자의 3' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 473 bp 의 PCR 생성물을 EcoRI 및 BamHI 으로 절단하여 463 bp 의 EcoRI-BamHI 단편을 수득한다 (단편 B).
단편 A 및 B를 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 함께 결찰시켜, 플라스미드 pPB163 (7513 bp)를 수득한다 (도 22).
실시예 23 : 플라스미드 pBP174', pBP189 및 pBP190 (결실된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxIII 유전자) 의 구축
AxIII에서 결실의 제 1 예 (플라스미드 pPB174') :
악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxIII 유전자를 클로닝하여 아미노산 733 내지 860 사이의 글리신-풍부 아미노산 영역 (칼슘이온 결합 포함)을 결실시킨다.
PCR 반응을 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, 1992, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB278 (30머) (서열번호 41)
PB279 (28머) (서열번호 42)
SalI-ClaI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 5' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 2216 bp 의 PCR 생성물을 SalI 및 ClaI 으로 절단하여 2205 bp 의 SalI-ClaI 단편을 단리한다 (단편 A).
PCR 반응을 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB280 (33머) (서열번호 43)
PB307 (32머) (서열번호 44)
ClaI-BamHI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 3' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 569 bp 의 PCR 생성물을 ClaI 및 BamHI 으로 절단하여 583 bp 의 ClaI-BamHI 단편을 수득한다 (단편 B).
단편 A 및 B를 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 함께 결찰시켜, 플라스미드 pPB174' (7658 bp)를 수득한다 (도 23).
AxIII에서 결실의 제 2 예 (플라스미드 pPB189) :
악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxIII 유전자를 클로닝하여 아미노산 705 내지 886 사이의 글리신-풍부 아미노산 영역 (칼슘이온 결합 포함)을 결실시킨다.
PCR 반응을 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, 1992, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB278 (30머) (서열번호 41)
PB303 (32머) (서열번호 45)
SalI-ClaI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 5' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 2133 bp 의 PCR 생성물을 SalI 및 ClaI 으로 절단하여 2122 bp 의 SalI-ClaI 단편을 수득한다 (단편 A).
PCR 반응을 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, 1992, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB306 (31머) (서열번호 46)
PB307 (32머) (서열번호 44)
ClaI-BamHI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 3' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 518 bp 의 PCR 생성물을 ClaI 및 BamHI 으로 절단하여 506 bp 의 ClaI-BamHI 단편을 수득한다 (단편 B).
단편 A 및 B를 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 함께 결찰시켜, 플라스미드 pPB189 (7496 bp)를 수득한다 (도 24).
AxIII에서 결실의 제 3 예 (플라스미드 pPB190) :
악티노바실루스 플루로뉴모니아 apxIII 유전자를 클로닝하여 아미노산 718 내지 876 사이의 글리신-풍부 아미노산 영역 (칼슘이온 결합 포함)을 결실시킨다.
PCR 반응을 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라 제조된 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, 1992, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB278 (30머) (서열번호 41)
PB304 (33머) (서열번호 47)
SalI-ClaI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 5' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 2172 bp 의 PCR 생성물을 SalI 및 ClaI 으로 절단하여 2161 bp 의 SalI-ClaI 단편을 수득한다 (단편 A).
PCR 반응을 악티노바실루스 플루로뉴모니아 (혈청형 8) 게놈 DNA (M. Smits, 1992, Genbank sequence accession No. = X68815) 및 하기 올리고뉴클레오티드를 가지고 수행하여 :
PB305 (31머) (서열번호 48)
PB307 (32머) (서열번호 44)
ClaI-BamHI 단편의 형태인, (악티노바실루스 플루로뉴모니아 헤모리신 III 단백질을 코드하는) apxIII 유전자의 3' 말단 부분을 증폭시킨다. 정제후, 548 bp 의 PCR 생성물을 ClaI 및 BamHI 으로 절단하여 536 bp 의 ClaI-BamHI 단편을 수득한다 (단편 B).
단편 A 및 B를 미리 SalI 및 BamHI 으로 절단시킨 벡터 pVR1012 (실시예 7)에 함께 결찰시켜, 플라스미드 pPB190 (7565 bp)를 수득한다 (도 25).
실시예 24 : 플라스미드의 제조 및 정제
동물의 예방접종을 위한 플라스미드를 제조하기 위해서, 주로 초나선 형태의 정제된 플라스미드 현탁액을 수득할 수 있는 모든 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법들은 당 분야의 숙련자에게는 이미 공지되어있다. 특히, 문헌 [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이 에티늄 브로마이드의 존재하에서 염화세슘 농도구배상에서 2 회 연속적으로 초원심분리하는 알킬리 용균을 언급할 수 있다. 또한, 공업적 규모로 예방접종을 위해 사용될 수 있는 플라스미드를 제조하는 방법을 기재하고 있는 특허출원 PCT WO 85/21250 및 PCT WO 96/02658을 참고로 할 수 있다. 백신을 제조하기 위해서 (실시예 17 참고), 정제된 플라스미드를 재현탁시켜 저장 가능한 고농도 (> 2 mg/ml) 의 용액을 수득한다. 이를 위해서, 플라스미드는 초정제수 또는 TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl; 1 mM EDTA, pH 8.0) 중 어느 하나에 재현탁된다.
실시예 25 : 관련 백신의 제조
관련된 백신의 제조를 위해 필요한 각종 플라스미드를 그들의 농축 용액 (실시예 16) 으로부터 출발하여 혼합한다. 각각의 플라스미드의 최종 농도가 각 플라스미드의 유효 투여량에 상응하도록 혼합물을 제조한다. 백신의 최종 농도를 조절하는데 사용될 수 있는 용액은 0.9% NaCl 용액 또는 PBS 완충액중 어느 하나일 수 있다.
리포좀, 양이온성 지질과 같은 구체적인 제형들이 백신의 제조를 위해 사용될 수 있다.
실시예 26 : 돼지의 예방접종
플라스미드당 100 μg, 250 μg 또는 500 μg 의 투여량으로 돼지에 예방접종을 한다.
주사는 근육내용 바늘을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 경우에 있어서, 백신의 투여량은 2 ml 의 부피로 투여된다.
주사는 5 곳의 주사점에서 0.2 ml (주사점당 0.04 ml) 의 투여량을 전달하는 액체 제트 주사 기구 (바늘없음) (예를 들어, "PIGJET" 기구) 를 사용하여 피부내로 수행될 수 있다. 상기 경우에 있어서, 백신의 투여량은 0.2 또는 0.4 ml 부피로 투여되는데, 이는 각기 1 또는 2 회 투여에 상응한다. 2 회 연속 투여를 PIGJET 기구를 이용하여 수행하는 경우, 상기 투여는 2 곳의 주사 지점이 약 1 내지 2 센티미터 정도의 거리로 서로 떨어지도록 공간을 유지한다.

Claims (30)

  1. gB, gD, 및 gB 및 gD로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는, 아우제스키병 바이러스 유래의 핵산 서열을 함유하고, 상기 핵산을 돼지 숙주세포 생체내에서 발현하는 플라스미드, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 돼지 (porcine) 백신.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드가 gB 및 gD 단백질 모두를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드가 gB 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 플라스미드가 gD 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  5. 제 1 항에 있어서, gB 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 1 플라스미드 및 gD 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 2 플라스미드를 포함하는 백신.
  6. E, ORF3 및 M, 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는, PRRS 바이러스 유래의 핵산 서열을 함유하고, 상기 핵산 서열을 돼지 숙주세포 생체내에서 발현하는 플라스미드, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 돼지 백신.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 플라스미드가 E 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 플라스미드가 ORF3 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 플라스미드가 M 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  10. 제 6 항에 있어서, PRRS 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 1 플라스미드 및 또 다른 PRRS 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 2 플라스미드를 포함하는 백신으로서, 상기 제 1 플라스미드 및 제 2 플라스미드의 PRRS 단백질은 E, ORF3 및 M, 및 그들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신.
  11. E1, E2, 및 E1 및 E2로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는, 돼지(hog) 콜레라 바이러스 유래의 핵산 서열을 함유하고, 상기 핵산 서열을 돼지 숙주세포 생체내에서 발현하는 플라스미드, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 돼지 백신.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 플라스미드가 E1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 플라스미드가 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 플라스미드가 E1 및 E2 단백질 모두를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 백신.
  15. 제 11 항에 있어서, E1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 1 플라스미드 및 E2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 제 2 플라스미드를 포함하는 백신.
  16. 제 1 항에 있어서, 핵산 서열의 발현이 CMV-IE 프로모터, SV40 초기(early) 프로모터, SV40 후기(late) 프로모터, 라오스 살코마 바이러스 LTR 프로모터 및 세포골격(cytoskeleton) 유전자의 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 조절하에 이루어지는 백신.
  17. 제 6 항에 있어서, 핵산 서열의 발현이 CMV-IE 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 라오스 살코마 바이러스 LTR 프로모터 및 세포골격 유전자의 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 조절하에 이루어지는 백신.
  18. 제 11 항에 있어서, 핵산 서열의 발현이 CMV-IE 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 라오스 살코마 바이러스 LTR 프로모터 및 세포골격 유전자의프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 조절하에 이루어지는 백신.
  19. 제 16 항에 있어서, 프로모터가 CMV-IE 프로모터인 백신.
  20. 제 17 항에 있어서, 프로모터가 CMV-IE 프로모터인 백신.
  21. 제 18 항에 있어서, 프로모터가 CMV-IE 프로모터인 백신.
  22. 생 전백신 (live whole vaccine), 불활성화된 전백신(inactivated whole vaccine), 서브유닛 백신 (subunit vaccine) 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신을 돼지에 투여한 후, 제 15 항에 기재된 백신을 상기 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지 숙주의 백신접종 방법.
  23. 생 전백신, 불활성화된 전백신, 서브유닛 백신 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신을 돼지에 투여한 후, 제 20 항에 기재된 백신을 상기 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지 숙주의 백신접종 방법.
  24. 생 전백신, 불활성화된 전백신, 서브유닛 백신 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신을 돼지에 투여한 후, 제 25 항에 기재된 백신을 상기 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지 숙주의 백신접종 방법.
  25. 제 1 항에 기재된 백신을 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지의 백신접종 방법.
  26. 제 6 항에 기재된 백신을 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지의 백신접종 방법.
  27. 제 11 항에 기재된 백신을 돼지에 투여하는 것을 포함하는 돼지의 백신접종 방법.
  28. (i) 제 1 항에 기재된 백신 및 (ii) 생 전백신, 불활성화된 전백신, 서브유닛 백신 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돼지 백신을 포함하는 키트.
  29. (i) 제 6 항에 기재된 백신 및 (ii) 생 전백신, 불활성화된 전백신, 서브유닛 백신 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돼지 백신을 포함하는 키트.
  30. (i) 제 11 항에 기재된 백신 및 (ii) 생 전백신, 불활성화된 전백신, 서브유닛 백신 및 재조합 백신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 돼지 백신을 포함하는 키트.
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