JP2001500111A

JP2001500111A - ブタの生殖病および呼吸病に対するポリヌクレオチドワクチン処方

Info

Publication number: JP2001500111A
Application number: JP10506628A
Authority: JP
Inventors: オードネ，ジャン―クリストフ; ブシャルドン，アナベル; フィリップボドゥー; リヴィエール，ミシェル
Original assignee: メリアル
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2001-01-09
Also published as: UA91675C2; HUP9903822A3; TW589190B; US6576243B1; KR20000065256A; DK0912743T3; ES2251030T3; HUP9903822A2; PL331249A1; FR2751224B1; RU2305559C2; UA77935C2; CN1329513C; AU735291B2; AR007864A1; FR2751224A1; EP0912743B1; WO1998003658A1; PL190615B1; CA2261346C

Abstract

(57)【要約】各々が、宿主細胞にインビボで発現可能な形で、ブタ病原体結合価遺伝子を含むプラスミドを含む少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含むブタの呼吸病および生殖病を治療するためのブタワクチン。これら結合価はアウジェスキー病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ不明病ウイルス、パルボビロシスウイルス、ペストウイルスおよびアクチノバシラス症の原因バクテリアから成る二つの群から選択される。上記プラスミドは結合価毎にアウジェスキー病ウイルスについてはgBおよびgD、ブタインフルエンザウイルスについてはHA、NPおよびＮ、不明病ウイルスについてはＥ、Ｎ、ORF3、Ｍ、パルボビロシスウイルスについてはVP2、ペストウイルスについてはE1およびE2、ならびにアクチノバシラス症ウイルスについてはapxI、apxIIおよびapxIIIから構成される群の中から選択される一つ以上の遺伝子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ブタの生殖病および呼吸病に対するポリヌクレオチドワクチン処方本発明は、ブタの生殖病および呼吸病に対する予防接種用ワクチン処方と、それに対応する予防接種の方法に関するものである。この数十年間でブタの生産方法は根本的に変わってきた。呼吸病理学の急速な発達によって閉空間での集中飼育が一般化してきている。ブタ呼吸病の症状は一般にブタ呼吸病コンプレックスとよばれ、ウイルス、バクテリアおよびマイコプラズマを含む広範な病原体が関わっている。呼吸障害に関する主な病原体はアクチノバシラス胸膜肺炎菌、不明病(maladie mysterieuse)ウイルスともよばれる不育症および呼吸症候群ウイルス(PRRS)、アウジェスキー病ウイルス（PRV）およびブタインフルエンザウイルスである。その他のウイルスは、流産、胎児の乾性壊痘および不育症を招く生殖障害を引き起こす。その主要なウイルスは、PRRS、パルボウイルス、および通常の豚コレラウイルス（HCV）である。第２に、ブタインフルエンザウイルスPRVおよびA.（アクチノバシラス）胸膜肺炎菌もこのような障害を引き起こす恐れがある。A.胸膜肺炎菌、HCVおよびPRVでは、死に到る場合もある。さらに、ブタ呼吸病コンプレックスでは微生物間の相互作用が非常に重要である。実際に、ほとんどのバクテリア病原体は、若い動物における鼻咽頭（nasoph arangeal）領域および扁桃の通常の宿主である。これらの病原体は、雌ブタに由来するが、若いブタは、生後数時間で、（cholostral）免疫が有効になる前に、これら病原体を吸入してしまう。上部気道に住む微生物は、宿主の呼吸防御機構が、アクチノバシラス胸膜肺炎菌などの前駆病原体、あるいはウイルスによって損なわれると、下部気道に侵入する恐れがある。肺への侵入は非常に速く、特に、アクチノバシラス胸膜肺炎菌のような前駆病原体の場合には、呼吸上皮細胞線毛や肺胞マクロファージを破損することのできるサイトタキシンを生成するので、急速に侵入する。インフルエンザや、呼吸コロナウイルスおよびアウジェスキーウイルス感染等の重いウイルス感染は、呼吸親和性およびマイコプラズマを伴うバクテリアと共に、呼吸病コンプレックスの病原性を助長する恐れがある。呼吸および生殖の両方に影響を及ぼす病原体もある。生殖病理学の見地から、相互作用も起こり得る。従って、ブタ生殖および呼吸病に関する主な病原体に対する有効な予防対策を開発する必要が生じてくる。これまで開発された処方は、不活性化したワクチン、もしくは生ワクチン、ならびに場合に応じて、これらワクチンの混合物である。これらの開発には、結合価間の適合性および安定性の問題がある。実際、特に、不活性化ワクチンおよび生ワクチンを組み合わせた場合に、使用した各種抗原と処方自体の二つの点から、異なる結合価間の適合性を達成することが必要とされる。また、組み合わせたワクチンの保存、特に、補助薬の存在下での安全の問題もある。これらワクチンは、一般に、かなり高価である。国際特許第WO-A-90,11092号、WO-A-92,19183号、WO-A-94,21797号およびWO-A- 95,20660号は近年開発されたポリヌクレオチドワクチンの技術を利用している。これらワクチンが、宿主細胞において、プラスミドに挿入された抗原を発現可能なプラスミドを使用することは知られている。全ての投与経路（腹腔内、静脈内、筋肉内、経皮、皮内、粘膜等）が提案されており、また、様々なワクチン接種手段を使用することができる。例えば、金の粒子表而にＤＮＡを付着させて放出し、動物の皮膚を通過させるもの（Tangら、Nature、第356号、初期52〜154頁、 1992年）や、皮膚、筋肉、脂肪組織ならびに乳房組織に同時にトランスフェクションすることを可能にする液体噴射式注射器（Furth達、分析生化学、第205号、第365〜368頁、1992年）がある。ポリヌクレオチドワクチンは、裸ＤＮＡと、例えば陽イオン脂質リポソーム内部に配合されるＤＮＡの両方を使用することができる。 M-Fル・ポワチエら（アウジェスキー病（偽狂犬病）ウイルス撲滅第２回国際シンポジウム、1995年８月６〜８日、コペンハーゲン、デンマーク）ならびにM. モンテイユら（動物病理学研究局主催による科学会合、INRA-ENV、国立獣医学校、リヨン、1994年12月13〜14日）は、強力なプロモータである２型アデノウイルス主要遅発性（majorlate）プロモータの制御下で、gD遺伝子の発現を可能にするプラスミドを用いて、アウジェスキー病ウイルスに対する予防接種をブタに試みている。抗体反応レベルが優れているにも拘わらず、保護を認めることはできなかった。現在、gD遺伝子および同じプロモータを挿入した組換え型アデノウイルスをブタに接種した後、保護領域に満足のゆく結果が記録されており、gDグルシオタンパク質は、ブタにおいて保護を誘導する能力があることを証明している。しかし、ポリヌクレオチドワクチン接種方法ではブタの保護は達成されていない。本発明は、呼吸病および／または生殖病に関与する多数の病原体に対するブタの予防接種用多価性ワクチン処方を提供する。本発明の別の目的は、結合価同士の相互適合性および安定性に関して要求される全ての基準を満たした地謡で、互いに異なる結合価を組み合わせたワクチン処方を提供することにある。本発明の別の目的は、同じ賦形剤で互いに異なる結合価を組み合わせることができるワクチン処方を提供することである。本発明のさらに別の目的は、使用が容易、かつ安価なワクチン使用がを提供することである。本発明のさらにまた別の目的は、効率および持続性レベルが高く、しかも安全性に優れ、残留物のない多価性保護を含む保護を達成することができるワクチン処方ならびにブタの予防接種方法を提供することである。本発明は、少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含む特にブタ生殖病および／または呼吸病に対するブタワクチン処方であって、各ポリヌクレオチドワクチン結合価は、一つのブタ病原体結合価の遺伝子を取り入れて、宿主細胞にインビボでそれを発現するプラスミドを含み、これら結合価はアウジェスキ-病ウイルス(PRVすなわち偽狂犬病（pseudorage）ウイルス)、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、ブタ不明病(maladie mysterieuse)ウイルス(PRRSウイルス) 、パルボビロシス(parvovirose)ウイルス(HCVウイルス)、通常の豚コレラウイルス(HCVウイルス)、およびアクチノバシラスの原因となるバクテリア（A.胸膜肺炎菌）から成る群より選択され、上記プラスミドは、一つの結合価につき、アウジェスキー病ウイルスについてはgBおよびgD、ブタインフルエンザウイルスについてはHA、NPおよびＮ、PRRSについてはORF5(E)、ORF3、ORF6(M)、パルボビロシスウイルスについてはVP2、通常の豚コレラウイルスについてはE1、E2 、A.胸膜肺炎菌についてはapxI、apxIIおよびapxIIIから構成される群より選択される一つ以上の遺伝子を含むことを特徴とするワクチン処方を提供する。本発明における「結合価(valencey)」とは、対象とする病原体のウイルスに対する保護を達成する少なくとも一つの抗原を意味し、結合価は準結合価として対象の病原体の一つ以上の菌株からの一つ以上の改質天然遺伝子を含んでいてもよい。病原体遺伝子とは、完全な遺伝子だけではなく、保護反応を誘導する能力を維持するフラグメントを含む様々なヌクレオチド配列を意味する。遺伝子の概念は、実施例で詳細に記載した配列と均等なもの、すなわち、同じタンパク質をコードする配列に相当するヌクレオチド配列を含んだ異なる遺伝子を含む。また、遺伝子の概念には一つの菌株または菌株群に特有の交差保護または保護をもたらす対象とする病原体の他の菌株のヌクレオチド配列が含まれる。さらに、この概念は、宿主動物による生体内発現を容易にするために改質された同じタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含んでいる。好ましくは、本発明に従うワクチン処方は、アウジェスキーおよびブタインフルエンザ結合価を含み、これら結合価に、好ましくは、PRRSやA.胸膜肺炎菌（アクチノバシラス症）結合価から選択された他の結合価を付加することができる。また、パルボビロシスおよび通常の豚コレラ結合価から選択されるその他の結合価を任意に付加することもできる。結合価の任意の組合せが可能であることは言うまでもない。しかし、本発明では、PRRSおよびA.胸膜肺炎菌が後に続くアウジェスキーおよびブタインフルエンザ結合価が好ましいと考えられる。ブタ呼吸病を対象とする予防接種では、結合価はアウジェスキー、ブタインフルエンザ、PRRSおよびアクチノバシラス症から選択するのが好ましい。ブタ生殖病を対象とするワクチン接種では、結合価はPRRS、パルボビロシス、通常の豚コレラおよびアウジェスキーから選択するのが好ましい。アウジェスキー結合価に関しては、gDおよびgDのいずれかを使用することができる。好ましくは、両遺伝子を使用するが、この場合には、異なるプラスミド、あるいは同一のプラスミドにマウントする。ブタインフルエンザ結合価に関しては、HAおよびNP遺伝子を使用するのが好ましい。これら二つの遺伝子のいずれか、もしくは両遺伝子を同時に使用することができ、異なるプラスミド、あるいは同一のプラスミドにマウントする。好ましくは、一つ以上のインフルエンザウイルス菌株、特に、現場で見いだされる様々な菌株からのHA配列を同じワクチン中に組み合わせる。また、NPは交差保護をもたらすため、単一菌株からの配列で十分である。 PRRS結合価に関しては、好ましくは、ＥおよびORF3、あるいは代替的に、Ｍ遺伝子を使用する。これらの遺伝子は、単独で、もしくは組み合わせて使用することができる。組み合わせる場合には、個々のプラスミド中に、あるいはこれら遺伝子の二つまたは三つを組み合わせたプラスミド中にマウントすることができる。少なくとも二つの菌株、特に、ヨーロッパ株およびアメリカ株から得られた遺伝子を同じワクチン中に組み合わせれば有利である。豚コレラ結合価に関しては、二つの異なるプラスミド、もしくは場合に応じて同一のプラスミド中に、E1およびE2遺伝子のいずれか、あるいはE1およびE2を組み合わせて使用することができる。アクチノバシラス症結合価に関しては、個々のプラスミド、あるいは混合プラスミド中にマウントした前述の三つの遺伝子のうちの一つ、もしくはこれら遺伝子の二つまたは三つの組合せを使用して、A.胸膜肺炎菌の各血清型に対する保護を達成することができる。apxI、IIおよびIII抗原については、特に実施例にあるように、無毒化した抗原を得るために、コード配列を変更することも考えらえる。本発明のワクチン処方は、特に、筋肉内経路による予防接種のために、一般に 0.1〜10ml、特に、１〜５mlの投与量として提供することができる。この投与量は、各型のプラスミドにつき、10ng〜１mg、好ましくは、100ng〜5 0μｇ、さらに好ましくは、１μｇ〜250μｇとする。好ましくは、一般に、生理的食塩水(0.9％NaCl)、超純水、TE緩衝剤等であるワクチン接種賦形剤に単純に装入された裸プラスミドを使用する。もちろん、従来の技術に記載されているポリヌクレオチドワクチンの形態すべてを使用することができる。各プラスミドは、宿主細胞に、制御下で挿入された遺伝子の発現を達成することができるプロモータを含む。これは、一般に、強力な真核プロモータ、特に、ヒトまたはネズミ、あるいは場合に応じて、ラット、ブタおよびギニアブタから得られたサイトメガロウイルス早期CMV-IEプロモータである。さらに一般的には、プロモータは、ウイルスあるいは細胞のいずれかから得たものでよい。ウイルス性プロモータとしては、SV40ウイルス早期または遅発性プロモータ、あるいはラウスニワトリ肉腫ウイルスLTRプロモータを挙げることができる。また、例えば遺伝子自体のプロモータ等、遺伝子の抽出源であるウイルスからのプロモータでもよい。細胞性プロモータとしては、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えば、デスミンプロモータ(ボルモントら、超顕微鏡的細胞学および病理学、1990年、第22号、初期17号〜122頁；Zhenlinら、遺伝子、1989年、第78号、第243〜254頁)、あるいは代替的に、アクチンプロモータを挙げることができる。同じプラスミド中に数種の遺伝子が存在する場合には、これらは、同じ転写単位、あるいは二つの異なる単位に提示することができる。本発明による異なるワクチン結合価の組合せは、好ましくは、各結合価の抗原を発現するポリヌクレオチドプラスミドを混合することによって達成することができるが、数種の結合価の抗原が、同じプラスミドにより発現されるようにすることも可能である。本発明はまた、PRV、PRRS、PRV、HCVおよびA.胸膜肺炎菌から構成される群より選択されるウイルスの一つからの一つ以上の遺伝子をコードする一つ以上のプラスミドを含む一価ワクチン処方を提供する。尚、これら遺伝子は、すでに記載されたものである。一価性以外に、これら処方は、遺伝子の選択、遺伝子の組合せ、プラスミドの組成、投与量等に関して、前述した特徴を有していてもよい。一価ワクチン処方は、(i)既に述べた多価ワクチン処方の製造のために、（ii ）それぞれ実際病状に対して、(iii)別の病気に対する別の種類のワクチン(生または不活性化全、組換え、サブユニット)と組み合わせて、あるいは(iv)以下に述べるようなワクチン用の追加免疫として、使用することができる。また、本発明によれば、従来タイプの初期ワクチン、すなわち、特に、生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択された初期ワクチンを接種したブタに予防接種するためのワクチンを製造することを目的として、本発明の一つ以上のプラスミドを使用する。この初期ワクチン（一価または多価）は、プラスミドによってコードされた抗原、または、交差保護をもたらす抗原を有する(すなわち、含む、あるいは、発現することができる)。驚くべきことに、ポリヌクレオチドワクチンには、強力な追加免疫効果があり、これによって、免疫反応が増幅すると同時に、持続性の高い免疫を獲得することができる。一般に、初期接種ワクチンは、様々な動物用ワクチン製造者が市販しているワクチンから選択することができる。また、本発明は、前述の初期接種ワクチンと、追加免疫用の本発明によるワクチン処方とを一つにした予防接種キットを提供する。これはまた、前述の初期接種用の追加免疫として本発明の処方の使用を指示する小冊子を伴う本発明のワクチン処方に関する。さらに、本発明は、前述のワクチン処方の有効投与量の投与を含むブタ生殖病およびまたは呼吸病に対するブタの予防接種方法を提供する。この予防接種方法は、ワクチン処方の一回分以上の投与量の投与を含み、これらの投与量を短い間隔で連続して、および／または長い間隔を置いて連続して投与することが可能である。本発明のワクチン処方は、この予防接種方法においては、ポリヌクレオチドワクチン接種のための従来技術で提案された様々な投与経路により、周知の投与技術を用いて、投与することができる。予防接種は、特に、液体噴射式、特に多重噴射式注射器、特に、数個の孔またはノズル、特に５〜６個の孔またはノズルを備えた噴射ヘッドを用いた注射器、例えば、フランス、ラオンのアンドスコプチック（Endoscoptic）杜が製造販売しているPigjet装置等を用いて、皮内経路に適用できる。この装置を用いた投与量は、好ましくは0.1〜0.9ml、特に、0.2〜0.6ml、さらに好ましくは0.4〜0.5mlまで減少することができ、この量を１または複数回、好ましくは、２回投与することができる。本発明はさらに、前述の初期ワクチン接種と、本発明のワクチン処方による追加免疫を行うことから成る予防接種方法を提供する。本発明方法の好ましい態様では、第一に、動物に、従来の、特に不活性化、生、弱毒化もしくは組換えタイプのワクチン、あるいは代替的に、サブユニットワクチンの有効量を投与して、初期ワクチン接種を実施し、次に、好ましくは２〜６週間後に、本発明に従う多価または一価ワクチンを投与する。本発明はまた、ワクチン処方の製造法、すなわち、異なる結合価およびこれらの混合物の製造方法に関するものである。以下、添付の図面を参照にて本発明およびその実施例さらに詳しく説明する。図面リスト図１：プラスミドpVR102 図２：PRVgB遺伝子（NIA3株）の配列図３：プラスミドpAB090の構造図４：PRVgD遺伝子（NIA3株）の配列図５：プラスミドpPB098の構造図６：ブタインフルエンザHA遺伝子（HIN1株）の配列図７：プラスミドpPB143の構造図８：ブタインフルエンザ即遺伝子（HIN1株）の配列図９：プラスミドpPB42の構造図10：ブタインフルエンザHA遺伝子（H3N2株）の配列図11：プラスミドpPB144の構造図12：ブタインフルエンザ即遺伝子（H3N2株）の配列図13：プラスミドpPB132の構造図14：プラスミドpAB025 図15：プラスミドpAB001 図16：プラスミドpAB091 図17：プラスミドpAB092 図18：プラスミドpAB004 図19：プラスミドpAB069 図20：プラスミドpAB061 図21：プラスミドpPB162 図22：プラスミドpPB163 図23：プラスミドpPB174’ 図24：プラスミドpPB189 図25：プラスミドpPB190 配列番号一覧配列ID番号１：PRVgB遺伝子（NIA3株）の配列配列ID番号２：オリゴヌクレオチドAB166 配列ID番号３：オリゴヌクレオチドAB167 配列ID番号４：オリゴヌクレオチドAB168 配列ID番号５：オリゴヌクレオチドAB169 配列ID番号６：PRVgD遺伝子（NIA3株）の配列配列ID香号７：オリゴヌクレオチドPB101 配列ID番号８：オリゴヌクレオチドPB102 配列ID番号９：オリゴヌクレオチドPB107 配列ID番号10：オリゴヌクレオチドPB108 配列ID番号11：ブタインフルエンザHA遺伝子（HIN1株）の配列配列ID番号12：オリゴヌクレオチドPB097 配列ID番号13：オリゴヌクレオチドPB098 配列ID番号14：ブタインフルエンザNP遺伝子（HIN1株）の配列配列ID番号15：オリゴヌクレオチドPB095 配列ID番号16：オリゴヌクレオチドPB096 配列ID番号17：ブタインフルエンザHA遺伝子（H3N2株）の配列配列ID番号18：ブタインフルエンザNP遺伝子（H3N2株）の配列配列ID番号19：オリゴヌクレオチドAB055 配列ID番号20：オリゴヌクレオチドAB056 配列ID番号21：オリゴヌクレオチドAB001 配列ID番号22：オリゴヌクレオチドAB002 配列ID番号23：オリゴヌクレオチドAB170 配列ID番号24：オリゴヌクレオチドAB171 配列ID番号25：オリゴヌクレオチドAB172 配列ID番号26：オリゴヌクレオチドAB173 配列ID番号27：オリゴヌクレオチドAB007 配列ID番号28：オリゴヌクレオチドAB010 配列ID番号29：オリゴヌクレオチドAB126 配列ID番号30：オリゴヌクレオチドAB127 配列ID番号31：オリゴヌクレオチドAB118 配列ID番号32：オリゴヌクレオチドAB119 配列ID番号33：オリゴヌクレオチドAB174 配列ID番号34：オリゴヌクレオチドAB189 配列ID番号35：オリゴヌクレオチドAB190 配列ID番号36：オリゴヌクレオチドAB175 配列ID番号37：オリゴヌクレオチドAB176 配列ID番号38：オリゴヌクレオチドAB191 配列ID番号39：オリゴヌクレオチドAB192 配列ID番号40：オリゴヌクレオチドAB177 配列ID番号41：オリゴヌクレオチドAB278 配列ID番号42：オリゴヌクレオチドAB279 配列ID番号43：オリゴヌクレオチドAB280 配列ID番号44：オリゴヌクレオチドAB307 配列ID番号45：オリゴヌクレオチドAB303 配列ID番号46：オリゴヌクレオチドAB306 配列ID番号47：オリゴヌクレオチドAB304 配列ID番号48：オリゴヌクレオチドAB305実施例１ウイルスの培養ウイルスを細胞変性効果が得られるまでウイルスに適した細胞系で培養する。各ウイルスについて使用する細胞系は当業者には公知のものであるが、簡単に言えば、ウイルスをイーグルの最少必須培地（MEM培地）もしくは別の適した培地で培養し、使用したウイルスに感応する細胞に感染多重度１で実験対象のウイルス株を接種する。次に、感染した細胞を37℃で培養する。尚、培養時間は細胞変性効果が現れるのに必要な時間（平均36℃）とする。実施例２バクテリアの培養およびバクテリアDNAの抽出アクチノバシラス胸膜肺炎菌株をA.Rycroftらが記載している（遺伝子微生物学誌、1991年、初期37号、第561〜568頁）通りに、培養した。J.Sambrookらが記載した標準的方法（分子クローニング：研究室便覧、第２版、ColdSpringHarbor 研究所、ColdSpringHarbor、ニューヨーク、1989年）に従って、高分子量ＤＮＡ (染色体ＤＮＡ)を製造した。実施例３ウイルス遺伝子DNAの抽出培養後、上澄みおよび分離した細胞を回収し、ウイルス懸濁液全体を＋４℃、 1000ｇで、10分間遠心分離にかけ、細胞の残屑を除去する。次に、＋４℃、400, 000ｇで１時間、超遠心分離してウイルス粒子を回収し、ペレットを最小容量の緩衝剤（10mMトリス、１mMEDTA；pH8.0）に溶解させる。この濃縮ウイルス懸濁液を、硫酸ナトリウムドデシル(SDS)（0.5％最終）の存在下で、プロテイナーゼＫ（100μｇ／ml最終）で処理する。次に、フェノール／クロロホルム混合物を用いてウイルスＤＮＡを抽出した後、２容量の無水エタノールで沈殿させる。− 20℃で一晩放置した後、ＤＮＡペレットを乾燥し、最小容量の無菌の超純水中に溶解させる。その後、制限酵素を用いて消化することができる。実施例４ウイルス遺伝子RNAの分離当業者には公知の方法に従い、RNAウイルスを精製した。次に、P.Chromczynsk iおよびN.Sacchiにより記載された「チオシアン酸グアニジウム／フェノール−クロロホルム」抽出方法（分析生化学、1987年、初期62号、初期56〜159頁）を用いて、各ウイルスの遺伝子ウイルスＲＮＡを分離した。実施例５分子生物学方法 J.サンブルックらにより記載された標準的分子生物学方法(分子クローニング：研究所便覧、第２版、ColdSpringHarbor研究所、ColdSpringHarbor、ニューヨーク、1989年)を用いて、すべてのプラスミドの製造を実施した。「ジーンクリーン」キット（BIO101社、ラ・ジョラ、カリフォルニア）を用いて、本発明に使用したすべての制限フラグメントを分離した。実施例６ RT-PCR 法特定のオリゴヌクレオチド（増幅したフラグメントのクローニングを容易にするために５'末端に制限部位を含む）を合成して、これらオリゴヌクレオチドが、増幅すべき遺伝子のコード領域を完全に覆うようにする(具体的な例を参照)。標準的方法（J.サンブルックら、分子クローニング：研究所便覧、第２版、Cold SpringHarbor研究所、ColdSpringHarbor、ニューヨーク、1989年）に従い、逆転写（RT）反応およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した。各RT-PCR反応は、一対の特定アンプリマーを用いて、またテンプレートとして、抽出したウイルス遺伝子ＲＮＡを採用して、実施した。増幅した補足ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出した後、制限酵素で消化した。実施例７プラスミドpVR1012 プラスミドpVR1012（図１）は、米国カリフォルニア州サンジエゴのバイカル社から入手した。その製造については、J.Hartikkaらが記載している(ヒトの遺伝子治療、1996年、第７号、初期205〜1217頁)。実施例８プラスミドpAB090（PRVgB遺伝子）の製造 ApaIを用いて、プラスミドpPR2.15（M．リヴィエールら、ウイルス学誌、1992 年、第66号、第3424〜3434頁）を消化し、アウジェスキー病ウイルス（NIA3株） gBグリコタンパク質をコードする遺伝子を含む2665bpApaI-NaeIフラグメント（フラグメントＡ）を遊離する(図２および配列ID番号１)。下記の二つのオリゴヌクレオチド：をハイブリッド形成することにより、開始ATGコドンからApaI部位まで、gD遺伝子の配列を含む33bpフラグメントが、５'におけるPstI部位の形成を伴って、再形成された(フラグメントＢ)。下記の二つのオリゴヌクレオチド：をハイブリッド形成することにより、NaeI部位からTAG停止コドンまで、gD遺伝子の配列を含む45bpフラグメントが、３'におけるBamHI部位の形成を伴って、再形成された(フラグメントＣ)。予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）中に、フラグメントＡ、ＢおよびＣを一緒に結紮することによって、プラスミドpAB09O（7603bp ）を得た(図３)。実施例９プラスミドpPB098(PRVgD遺伝子）の製造 SalIおよびBglIIを用いて、プラスミドpPR29（M．リヴィエールら、ウイルス学誌、1992年、第66号、第3424〜3434頁）を消化し、アウジェスキー病ウイルス（NIA3株）gDグリコタンパク質をコードする遺伝子の３'部分を含む711bpSalI-B glIIフラグメント（フラグメントＡ）を遊離する(図４および配列ID番号６)。 Eco47IIIおよびSalIを用いて、プラスミドpPR29を消化し、アウジェスキー病ウイルス（NIA3株）gDグリコタンパク質をコードする遺伝子の５'部分を含む498 bpEco47III-SalIフラグメント（フラグメントＢ）を遊離する。下記の二つのオリゴヌクレオチド：をハイブリッド形成することにより、開始ATGコドンからEco47III部位まで、gD 遺伝子の５'配列を含む15bpフラグメントが、５'におけるPstI部位の形成を伴って、再形成された(フラグメントＣ)。精製後、予めPstIおよびBglIIで消化したベクターpVR1012（実施例７）中に、フラグメントＡ、ＢおよびＣを一緒に結紮することによって、プラスミドpPB098 （6076bp）を得た(図５)。実施例10 プラスミドpPB143（ブタインフルエンザHA遺伝子、H1N1株）の製造実施例４に記載した方法で製造したブタインフルエンザウイルス（SIV、H1N1 “SW”株）遺伝子ＲＮＡと、下記オリゴヌクレオチド：を用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、SI VH1N1から、HAタンパク質をコードする遺伝子（図６および配列ID番号11）を180 3bpPCRフラグメントとして正確に分離した。精製後、このフラグメントをベクターPCRII-ダイレクト（インビトロジェン（Invitrogen）商品番号K2000-01）と結紮して、ベクターpPB137（5755bp）を得た。ベクターpPB137をEcoRVおよびNotI で消化することにより、HA遺伝子を含む1820bpEcoRV-NotIフラグメントを遊離した。このフラグメントを、予めEcoRVおよびNotIで消化したベクターpVR1012（実施例７）中で結紮することによって、プラスミドpPB143（6726bp）を得た(図７) 。実施例11 プラスミドpPB142（ブタインフルエンザNP遺伝子、H1N1株）の製造実施例４に記載した方法により製造したブタインフルエンザウイルス（SIVH1N 1“SW”株）遺伝子RNAと、下記オリゴヌクレオチド：を用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、SI VH1N1から、NPタンパク質をコードする遺伝子（図８および配列ID番号14）をSai I-NotIフラグメントとして正確に分離した。精製後、このフラグメントをベクターPCRII-ダイレクト（インビトロジェン（Invitrogen）商品番号K2000-01）と結紮して、ベクターpPB127（5519bp）を得た。ベクターpPB127をSalIおよびNotIで消化して、NP遺伝子を含む1560bpSalI-Not Iフラグメントを遊離した。次に、このフラグメントを、予めSalIおよびNotIで消化したベクターpVR1012(実施例７)中で結紮することによって、プラスミドpPB 142（6451bp）を得た(図９)。実施例12 プラスミドpPB144（ブタインフルエンザHA遺伝子、H3N2株）の製造実施例４に記載した方法で製造したブタインフルエンザウイルス（菌株SIVH3N 2、コート・ドュ・ノール、1987年）遺伝子ＲＮＡと、下記オリゴヌクレオとを用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、 SIVH3N2から、HAタンパク質をコードする遺伝子（図10および配列ID番号17）をP stI-NotIフラグメントとして正確に分離した。精製後、1765bpRT-PCR生成物をベクターPCRII-ダイレクト（インビトロジェン（Invitrogen）商品番号K2000-01）と結紮して、ベクターpPB120（5716bp）を得た。ベクターpPB120をNotIで消化して、HA遺伝子を含む1797bpNotI-NotIフラグメントを遊離した。次に、このフラグメントを、予めNotIで消化したベクターpVR1 012（実施例７）中で結紮することによって、プロモータに対して正しい配向のH 3N2HA遺伝子を含むプラスミドpPB144（6712bp）を得た(図11)。実施例13 プラスミドpPB132（ブタインフルエンザNP遺伝子、H3N2株）の製造実施例４に記載した方法で製造したブタインフルエンザウイルス（菌株SIVH3N 2、コート・ドュ・ノール、1987年）遺伝子ＲＮＡと、下記オリゴヌクレオとを用いて、実施例６に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 SIVH3N2から、NPタンパク質をコードする遺伝子（図12および配列ID番号18）をSalI-NotIフラグメントとして正確に分離した。精製後、1564bpRT-PCR生成物をベクターPCRII-ダイレクト（Invitrogen商品番号K2000-01）と結紮して、ベクターpPB123（5485bp）を得た。ベクターpPB123をSalIおよびNotIで消化して、NP遺伝子を含む1558bpSalI-Not Iフラグメントを遊離した。次に、このフラグメントを、予めSalIおよびNotIで消化したベクターpVR1012(実施例７)中で結紮することによって、プラスミドpPB 132（6449bp）を得た(図13)。実施例14 プラスミドpAB025（PRRSVORF5遺伝子、Lelystad株）の製造実施例４に記載した方法で製造したPRRSVウイルス（Lelystad株）遺伝子ＲＮＡ（J.ムーランベールら、ウイルス学、1993年、初期９号、第62〜72頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 PRRSウイルス、Lelystad株から、エンベロープ・グリコタンパク質Ｅ（gp25）をコードする“ORF5”遺伝子を正確に分離した。精製後、630bpRT-PCR生成物をSal I-BamHIと結紮して、617bpSalI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB025（5486bp）を得た(図14)。実施例15 プラスミドpAB001（PRRSVORF5遺伝子、US株）の製造実施例４に記載した方法により製造したPRRSVウイルス（ATCCVR2332株）遺伝子ＲＮＡ(J．ミュールトーら、始原ウイルス学、1995年、初期40号、初期451〜1 460頁)と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、 PRRSウイルス、ATCC-VR2332株から、エンベロープ・グリコタンパク質Ｅ(“gp25 ”)をコードする遺伝子を正確に分離した。精製後、620bpRT-PCR生成物をPstIおよびBamHIで消化して、606bpPstI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB001（5463bp）を得た(図15)。実施例16 プラスミドpAB091（PRRSVORF3遺伝子、Lelvstad株）の製造実施例４に記載した方法で製造したPRRSVウイルス（Lelystad株）遺伝子ＲＮＡ（J.ムーランベールら、ウイルス学、1993年、初期９号、第62〜72頁）と、下記オリゴヌクレオチド：を用いて、実施例６に記載した方法に従うRT-PCR反応を実施することにより、PR RSウイルス、Lelystad株から、エンベロープ・グリコタンパク質“gp45”をコードする“ORF3”遺伝子を正確に分離した。精製後、818bpRT-PCR生成物をPstIおよびBamHIで消化して、802bpPstI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB091（5660bp）を得た(図16)。実施例17 プラスミドpAB092（PRRSVORF3遣伝子、USA株）の製造実施例４に記載した方法により製造したPRRSVウイルス（ATCC-VR2332株）遺伝子ＲＮＡ（J．ミュールトーら、始原ウイルス学、1995年、初期40号、初期451〜 1460頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、 PRRSウイルス、ATCC-VR2332株から、エンベロープ・グリコタンパク質“gp45” をコードする“ORF3”遺伝子を正確に分離した。精製後、785bpRT-PCR生成物をP stIおよびBamHIで消化して、769bpPstI-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB092（5627bp）を得た(図17)。実施例18 プラスミドpAB004（ブタパルボウイルスVP2遺伝子）の製造実施例４に記載した方法で製造したブタパルボウイルス（NADL2株）遺伝子ＲＮＡ（J.Vasudevacharyaら、ウイルス学、1990年、初期78号、第611〜616頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、ブタパルボウイルスVR2タンパク質をコードする遺伝子を含む1757bpフラグメントを増幅した。精製後、RT-PCR生成物をPstIおよびBamHIで消化して、1740bpPst I-BamHIフラグメントを分離した。このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB 04（6601bp）を得た(図18)。実施例19 プラスミドpAB069（豚コレラHCVE1遺伝子）の製造実施例４に記載した方法で製造した豚コレラウイルス（HCV）(アルフォート株 )遺伝子RNA（G.メイヤーら、ウイルス学、1989年、初期71号、初期8〜27頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、 HCVウイルスから、E1タンパク質をコードする配列を1363bpRT-PCRフラグメントとして分離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化して、134 9bpSalI-BamHIフラグメントを得た。このフラグメントを、予めPstIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB069（6218bp）を得た(図19)。実施例20 プラスミドpAB061（豚コレラHCVE2遺伝子）の製造実施例４に記載した方法で製造した豚コレラウイルス（HCV）(アルフォート株 )遺伝子ＲＮＡ（G.メイヤーら、ウイルス学、1989年、初期71号、初期8〜27頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、実施例６に記載した方法に従いRT-PCR反応を実施することにより、 HCVウイルスから、E2タンパク質をコードする配列を1246bpRT-PCRフラグメントとして分離した。精製後、このフラグメントをSalIおよびBamHIで消化して、 1232bpSalI-BamHIフラグメントを得た。このフラグメントを、予めPstIおよびBa mHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpAB061(6101bp)を得た(図20)。実施例21 プラスミドpBP162（欠失アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxI遺伝子）の製造アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxI遺伝子のクローニングを行うことによって、アミノ酸719と846の間にあるグリシンを多く含むアミノ酸領域（カルシウムイオンの結合に関与する）を欠失する。実施例２および３に記載した方法で製造したアクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型１）遺伝子ＤＮＡ（J.フレイら、感染と免疫、1991年、第59号、第3026〜30 32頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素Ｉタンパク質をコードするapxI遺伝子の５'部分をSalI-EcoRIフラグメントとして増幅した。精製後、2193bpPCR生成物をSalIおよびEcoRIで消化して、2183bp SalI-EcoRIフラグメント（フラグメントＡ）を得た。アクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型１）遺伝子ＤＮＡ（J.フレイら、感染と免疫、1991年、第59号、第3026〜3032頁）と、下記オリゴヌクレオチド：BP190 とを用いて、PCR反応を実施することにより、アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素Ｉタンパク質をコードするapxI遺伝子の３'部分をEcoRI-BamHIフラグメントとして増幅した。精製後、576bpPCR生成物をEcoRIおよびBamHIで消化して、566b pEcoRI-BamHIフラグメント（フラグメントＢ）を得た。これらフラグメントＡおよびＢを、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpPB162(7619bp)を得た(図21)。実施例22 プラスミドpBP163（欠失アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxII遺伝子）の製造アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxII遺伝子のクローニングを行うことによって、アミノ酸716と813の間にあるグリシンを多く含むアミノ酸領域（カルシウムイオンの結合に関与する）を欠失する。実施例２および３に記載した方法で製造したアクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型９）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツら、感染と免疫、1991年、第59号、第4497〜 4504頁）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIタンパク質をコードするapxII遺伝子の５'部分をSalI-EcoRIフラグメントとして増幅した。精製後、2190bpPCR生成物をSalIおよびEcoRIで消化して、2180bp SalI-EcoRIフラグメント（フラグメントＡ）を分離した。アクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型９）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツら、感染と免疫、1991年、第59号、第4497〜4505頁）と、下記オリゴヌクレオチド:BP192 とを用いて、PCR反応を実施することにより、アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIタンパク質をコードするapxII遺伝子の３'部分をEcoRI-BamHIフラグメントとして増幅した。精製後、473bpPCR生成物をEcoRIおよびBamHIで消化して、463b pEcoRI-BamHIフラグメント（フラグメントＢ）を得た。フラグメントＡおよびＢを、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR1012 （実施例７）と結紮することによって、プラスミドpPB163(7513bp)を得た(図22) 。実施例23 プラスミドpBP174'、pB189およびpB190 （欠失アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxII遺伝子）の製造 AxIIIにおける欠失の初期例（プラスミドpBP174'）：アクチノバシラス胸膜肺炎菌apxIII遺伝子のクローニングを行うことによって、アミノ酸733と860の間にあるグリシンを多く含むアミノ酸領域（カルシウムイオンの結合に関与する）を欠失する。実施例２および３に記載した方法で製造したアクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号:X68 815)と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、（アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする）apxIII遺伝子の５'部分をSalI-ClaIフラグメントとして増幅した。精製後、2216bpPCR生成物をSalIおよびClaIで消化して、2 205bpSalI-ClaIフラグメント（フラグメントＡ）を分離した。アクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号:X68815)と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、(アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする)apxIII遺伝子の３'部分をClaI-BamHIフラグメントとして増幅した。精製後、596bpPCR生成物をClaIおよびBamHIで消化して、583 bpClaI-BamHIフラグメント（フラグメントＢ）を得た。フラグメントＡおよびＢを共に、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR 1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpPB174'(7658bp)を得た( 図23)。 AxIIIにおける欠失の第２例(プラスミドpBP189)：アクチノバシラス胸膜肺炎菌a pxIII遺伝子のクローニングを行うことによって、アミノ酸705と886の間にあるグリシンを多く含むアミノ酸領域（カルシウムイオンの結合に関与する）を欠失する。実施例２および３に記載した方法で製造したアクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ(M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号:X688 15)と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、（アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする）apxIII遺伝子の５'部分をSalI-ClaIフラグメントとして増幅した。精製後、2133bpPCR生成物をSalIおよびClaIで消化して、2 122bpSalI-ClaIフラグメント（フラグメントＡ）を分離した。アクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号：X68815）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、(アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする)apxIII遺伝子の３'部分をClaI-BamHIフラグメントとして増幅した。精製後、518bpPCR生成物をClaIおよびBamHIで消化して、506 bpClaI-BamHIフラグメント（フラグメントＢ）を得た。フラグメントＡおよびＢを共に、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR 1012（実施例７）と結紮することによって、プラスミドpPB189(7496bp)を得た( 図24)。 AxIIIにおける欠失の第３例(プラスミドpBP190)：アクチノバシラス胸膜肺炎菌a pxIII遺伝子のクローニングを行うことによって、アミノ酸718と876の間にあるグリシンを多く含むアミノ酸領域（カルシウムイオンの結合に関与する）を欠失する。実施例２および３に記載した方法で製造したアクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号：X6 8815）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、（アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする）apxIII遺伝子の５'部分をSalI-ClaIフラグメントとして増幅した。精製後、2172bpPCR生成物をSalIおよびClaIで消化して、2 161bpSalI-ClaIフラグメント（フラグメントＡ）を分離した。アクチノバシラス胸膜肺炎菌（血清型８）遺伝子ＤＮＡ（M.スミッツ、1992年、遺伝子バンク配列受入れ番号：X68815）と、下記オリゴヌクレオチド：とを用いて、PCR反応を実施することにより、(アクチノバシラス胸膜肺炎菌溶血素IIIタンパク質をコードする)apxIII遺伝子の３'部分をClaI-BamHIフラグメントとして増幅した。精製後、548bpPCR生成物をClaIおよびBamHIで消化して、536 bpClaI-BamHIフラグメント（フラグメントＢ）を得た。フラグメントＡおよびＢを共に、予めSalIおよびBamHIで消化したベクターpVR 1012（実施例７）と結紮することにより、プラスミドpPB190(7565bp)を得た(図2 5)。実施例24 プラスミドの製造および精製動物の予防接種を目的とするプラスミドを製造するためには、主としてスーパーコイル状をした精製プラスミドの懸濁液が得られる方法であれば、どんな方法を用いてもよい。これらの方法は、当業者には公知である。特に、J.サンブルックら（分子クローニング：研究所便覧、第２版、ColdSpringHarbor研究所、Cold SpringHarbor、ニューヨーク州、1989年）により記載されたアルカリ溶解方法を挙げることができる。この方法では、臭化エチジウムの存在下で、所定の塩化セシウム勾配での超遠心分離を２回連続して行う。また、予防接種に使用することができるプラスミドを工業レベルで生産する方法を記載した特許出願PCTWO85/21 250号およびPCTWO96/02658号を参照してもよい。ワクチン（実施例17参照）を製造する目的で、精製されたプラスミドを再懸濁し、保存に適した高い濃度（＞2m g/ml）の溶液を得る。これを実施するために、プラスミドは、超純水もしくはTE 緩衝剤（10mMトリス-HCl；１mMEDTA、pH8.0）のいずれかにおいて、再懸濁する。実施例25 関連ワクチンの製造関連ワクチンの製造に必要な各種プラスミドをまずそれらの濃縮溶液と混合する(実施例16)。混合物は、各プラスミドの最終濃度が、各プラスミドの有効投与量に相当するように製造する。ワクチンの最終濃度を調整するのに使用できる溶液は、0.9％NaCl溶液、あるいはPBS緩衝剤のいずれかでよい。また、リポソーム、陰イオン脂質のような特定の配合物をワクチン製造のために使用することも可能である。実施例26 ブタの予防接種各型プラスミドにつき、100μｇ、250μｇもしくは500μｇの投与量のワクチンをブタに接種する。注射は、注射針を用いて、筋肉内経路で行うことができる。この場合、ワクチン量は、２mlの容量を投与する。注射は、５箇所で0.2ml（注射１箇所当たり0.04ml）の投与量を射出する液体噴射式注射装置（針なし）(例えば、“PIGJET”装置)を用いて、皮内経路で実施することができる。この場合、ワクチン量は、0.2または0.4mlの容量を投与するが、これは、それぞれ１回または２回の投与に相当する。PIGJET装置を用いて、２回の連続した投与を行う場合には、二つの注射領域の間に１〜２cmの間隔を設けて投与する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/187 39/187 39/23 39/23 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リヴィエール，ミシェルフランス国 69130 エキュリシュマンデュシャンスリエ 11

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも三つのポリヌクレオチドワクチン結合価を含む、ブタの生殖病および／または呼吸病に対するブタワクチン処方であって、各ポリヌクレオチドワクチン結合価は、宿主細胞でインビボで発現するように一つのブタ病原体結合価の遺伝子を有するプラスミドを含み、各結合価はアウジェスキー病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、ブタ不明病ウイルス、パルボビロシスウイルス、通常の豚コレラウイルスおよびアクチノバシラス症の原因バクテリアから成る群の中から選択され、上記プラスミドは、結合価毎に、アウジェスキー病ウイルスについてはgBおよびgD、ブタインフルエンザウイルスについてはHA、NPおよびＮ、不明病ウイルスについてはＥ、ORF3、Ｍ、パルボビロシスウイルスについてはVP2、通常の豚コレラウイルスについてはE1、E2、アクチノバシラス症についてはapxI、apxIIおよびapxIIIで構成される群の中から選択される一つ以上の遺伝子を含むことを特徴とするワクチン処方。２．少なくともアウジェスキーおよびブタインフルエンザ結合価を含む請求項１に記載のワクチン処方。３．不明病およびアクチノバシラス症から選択される結合価のうち少なくとも一つをさらに含む請求項２に記載のワクチン処方。４．通常の豚コレラ結合価を含む請求項３に記載のワクチン処方。５．不明病、パルボビロシスおよび通常の豚コレラ結合価の群から選択される少なくとも一つの結合価をさらに含む請求項２に記載のワクチン処方。６．豚コレラウイルスHAおよび／またはNP遺伝子を含む請求項１に記載のワクチン処方。７．不明病ウイルスＥおよび／またはORF3遺伝子を含む請求項１に記載のワクチン処方。８．アウジェスキーからのgBおよびgDを含む請求項１または２に記載のワクチン処方。９． 0.1〜10ml、好ましくは１〜５mlの投与量で与えられる請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン処方。 10． 0.1〜0.9ml、特に、0.2〜0.6ml、好ましくは0.4〜0.5mlの投与量で、液体噴射、好ましくは数回の噴射によって皮内投与するのに適した請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン処方。 11．各プラスミド型につき10ng〜1mg、好ましくは100ng〜500μｇ、さらに好ましくは１μｇ〜500μｇを含む請求項10に記載のワクチン処方。 12．ポリヌクレオチドワクチンによってコードされた抗原、または交差保護をもたらす抗原を有する請求項１〜11のいずれか一項に記載のワクチン処方の、生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択される初期ワクチンを接種したブタに予防接種するためのワクチン製造での使用。 13．請求項１〜11のいずれか一項に記載のワクチン処方と、生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択されたワクチンとを組み合わせた予防接種キットであって、初期ワクチンが、ポリヌクレオチドワクチンによってコードされた抗原または交差保護をもたらす抗原を有し、後者のワクチンを初期予防接種として投与するか、上記ワクチン処方を用いた追加免疫として投与することを特徴とするキット。 14．生全ワクチン、不活性化全ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンから成る群より選択されたポリヌクレオチドワクチンプラスミドによってコードされた抗原または交差保護をもたらす抗原を有する初期ワクチンの追加免疫として処方可能であることを記載した指示書を有する、請求項１〜11のいずれか一項に記載のワクチン処方。