KR100461458B1 - 다중층 리포좀 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조되고, 제조된 입자의 크기가 200 내지 5000nm이며, 내부에 생리활성 유효성분을 포집할 수 있는 경피흡수용 다중층 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 제공되는 다중층 리포좀은 단일층 리포좀에 비하여 생리활성 유효성분의 봉입량이 많고 구조적으로 봉입된 유효성분이 안정할 뿐만 아니라, 고압호모기가 아닌 일반적으로 이용 가능한 호모 믹서를 이용하여 제조가 가능하므로 제조공정이 간단하고 경제적이며, 피부 각질세포간극보다 큰 크기로 제조되므로 나노크기의 단일막 리포좀에 비하여 세포간극 통과시 주위세포에 대한 장력으로부터 벗어나 진피층까지 침투가 가능하므로 생리활성 유효성분의 경피흡수를 촉진시키는 데에 이용할 수 있다.

Description

다중층 리포좀 및 그의 제조방법{Multiple layered liposome and preparation method thereof}

본 발명은 경피흡수용 다중층 리포좀에 관한 것으로서, 구체적으로 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조되고, 제조된 입자의 크기가 200 내지 5000nm이며, 내부에 생리활성 유효성분을 포집할 수 있는 경피흡수용 다중층 리포좀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 그 구조가 복잡하고 종종 세포수준에서의 효능이 있다고 알려진 물질을 피부에 적용 시 그 효과가 전혀 나타나지 않는 경우가 많기 때문에, 기능성 화장품을 만들거나 관련 기능성 원료를 제조하기 위해서는 피부구조에 대한 이해를 필요로 한다. 실제로 대부분의 피부과학자와 피부과 의사들도 시험관에서 효능 있는 물질이 반드시 인체에서도 효능이 있는 것으로 나오지 않는 경우가 있음을 경험적으로 알고 있다. 이러한 근원적인 이유는 피부세포의 구조와 이를 구성하는 피부세포들의 존재 양상으로 인해, 유효성분이 피부세포에 도달할 경우에만 효과를 기대할 수 있기 때문이다.

피부는 인체를 이루고 있는 기관 중 가장 큰 기관으로서 표피, 진피 및 피하지방으로 구성되어 있다. 주요기능으로는 인체의 장기보호기능과 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 여러 가지 다양한 역할을 담당하고 있는데, 이중 표피와 진피의 두께는 부위에 따라 다르지만 대략 2 내지 5mm정도이며, 피하지방의 두께는 사람에 따라 큰 차이를 보인다. 진피의 바깥쪽에 있는 표피는 그 두께가 평균 0.1mm 정도밖에 되지 않는데, 주로 각질형성세포라고 하는 피부세포로 만들어져 있고, 그 사이에 갈색의 색소를 만드는 색소세포와 피부면역과 관계있는 세포들이 흩어져 있다. 표피는 다시 아래로부터, 기저층, 유극층, 과립층, 각질층으로 구분되는데, 표피를 구성하는 각질형성세포는 기저층으로부터 발생되어, 케라틴 섬유가 발달되는 유극층, 현미경으로 볼 때 세포 내에 과립이 형성되는 과립층을 거쳐, 피부의 최외각에서 상기 케라틴 섬유와 과립이 단단히 결합된 상태의 죽은 세포로 구성되는 각질층을 형성하게 된다. 10 내지 20층 정도의 편평한 각질세포로 구성되는 각질층은 수화하면 건조중량의 수배에 달하는 물을 함유할 수 있으며 약 10㎛ 정도의 두께를 가지는데, 피부질환 치료를 목적으로 하는 약물이나 미용을 목적으로 하는 화장료 등의 적용시 가장 큰 장벽(barrier)으로 작용하게 된다. 이와 같은 각질층에서 세포간극이 차지하는 비율은 10 내지 30%로 일반 조직에서 세포간극이 차지하는 비율보다는 큰 편이며 여러 층의 중성지질 또는 오일 이중막으로 채워져 있어서 각질층의 장벽기능에 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 피부, 특히 각질층의 장벽기능 때문에, 치료용 약물이나 화장료 개발시 경피흡수성은 매우 중요한 검토 사항중 하나가 되고있다.

따라서, 시험관 시험에서 효능이 있다고 알려진 물질의 피부에 대한 효능은 실제적으로 동물피부나 사람 피부를 이용해 물질의 침투정도를 먼저 살펴보아야 할 것이다. 우리나라의 경우 기능성 화장품은 주름개선, 미백 및 자외선차단 관련 제품에 한정하고 있다. 자외선 차단제품 같은 경우는 피부표면에 이산화티탄과 같은 자외선을 산란할 수 있는 화학성분을 사용하는 경우와 피부표면에서 자외선을 흡수할 수 있는 흡수특성의 화학물질을 사용할 수 있다. 주름개선 같은 경우는 피부의 최외곽층인 각질층이나 표피층에서는 그 효과를 기대하기 힘들며 콜라겐 생합성에 관련된 세포들이 집중적으로 모여 있는 진피층에서 효능을 나타내야만 실제적인 주름개선효과를 기대할 수 있다. 또한, 미백효과는 특별히 세포 중 멜라닌 생성세포에 대한 효과를 나타내야만 함으로써 멜라닌 생성세포가 존재하는 표피층의 제일아랫부분에서 그 효능을 나타낼 수 있어야 한다. 결론적으로 시험관 시험에서 효능이 있다고 알려진 물질이 인체를 대상으로 한 피부에 대한 효능 정도는 그 물질 자체의 피부침투력과 밀접한 상관관계를 갖게 된다. 그러므로 어떤 물질의 주름개선이나 미백에 대한 기능성을 나타내고자 할 경우 피부에서 그 물질의 효능을 미칠 수 있는 부위까지 일정수준까지 침투할 수 있는 능력이 중요하다. 이러한 물질자체의 피부에 대한 침투력은 그 물질의 물리화학적 특성에 따라서 결정되는데 대체로 기름에 잘 녹는 성분이 물에 잘 녹는 성분보다, 분자량이 작은 물질이 분자량이 큰 물질보다, 물질의 양이 많은 경우가 양이 적은 경우보다 잘 침투된다고 알려져 있다.

침투가 어려운 경우 특정 제형이나 특정 기술을 이용하여 그 물질의 피부침투성을 높일 수 있다면 피부에 적용 시 실제적인 효능을 기대할 수 있을 것이다. 또한, 피부침투시험에서 얻어진 기본 자료를 바탕으로 그 물질의 사용농도를 정하고 제형을 정함으로써 실제 제품화 시 사용물질을 이용한 기능성 제품이 가장 좋은 효능을 나타낼 수 있도록 할 수 있다.

피부는 피부세포 간의 간극이 마치 층상구조와 같이 물층-기름층-물층-기름층 등과 같이 반복적인 층으로 이루어져 있으며 기름층의 특성은 세포막의 구조와 비슷한 물리 화학적 성질을 나타내기 때문에(도 1), 아데노신이나 비타민 C와 같은 친수성 물질은 대부분 통과하기가 어렵다. 피부를 통한 유효성분의 주요 통로는 피부세포를 직접 통하는 방법, 피부세포간극을 통하는 방법, 모공 등을 통하는 방법 등이 알려져 있다. 일반적으로, 모공이 크기 때문에 모공을 통해서 주로 침투할 것으로 추정되나 실제 피부를 통한 유효성분의 침투는 대략 1% 정도에 머문다. 실제로는 대부분의 유효성분이 피부세포간극을 통하여 침투하는 것으로 알려져 있다. 피부의 간극은 그 크기가 30 내지 90nm 이하이며 이 간극을 통과하기 위하여는 그 간극보다도 작은 크기가 필수적으로 요구된다. 이러한 이유로 대부분의 화장업계에서 100nm 이하의 작은 크기의 캡슐이나 미셀 등을 제조하고자 다양한 기술을 개발하여 왔다. 또한, 이러한 피부침투 기술로는 피부간극을 확장시키는 알콜이나 이소프로필알콜 및 여러 가지 피부간극확장제를 사용하는 방법, 세포막과 비슷한 구조의 막을 이용한 나노크기의 캡슐인 리포좀을 이용하는 방법, 나노탄소원자를 이용한 인공 나노캡슐이나 타노튜브를 이용한 방법 등 다양한 방법들이 사용되어져 왔다. 그러나, 피부가 생체구조이며 동시에 수 많은 신경과 피부세포로 이루어진 상태로 인공화합물에 대하여 대부분의 경우 자극을 느끼거나 심한 경우 염증반응이 유발되기 때문에, 부작용을 동반하더라도 꼭 피부를 통하여 침투가 필요한 경우에만 한정적으로 인공화합물을 피부간극 확장제로 사용할 수 있다. 또한, 인공의 나노 구조체를 이용하는 방법 역시 인공탄소나 여러 종류의 인공 소재를 이용하기 때문에 인체 내로 유입 시 예측할 수 있는 충분한 양의 안전성 자료를 현재까지는 확보하고 있지 못하다. 따라서, 피부를 통한 유효성분의 침투를 위하여 인체 세포막과 거의 유사한 구조로 되어 있는 리포좀을 이용하는 것이 가장 유리할 것이다(PSIT Vol. 3, No.12, 2000, 417~425).

화장료용 유화 조성물은, 비교적 피부 자극이 적은 비이온성 계면활성제 및 수, 유상 성분과 함께 안정성을 증가시키기 위한 점증제로서 주로 수용성 폴리머를사용하고 이를 유효성분과 함께 호모 믹서로 균질화 하는 방법으로 제조되었는데, 각 성분들의 함량은 점도에 따라 또는 원하는 사용감에 따라 적절하게 조정된다. 그러나, 이렇게 호모 믹서로 유화시켜 제조한 유화 조성물의 경우 2um 이하의 작고 미세한 유화 입자를 만들기가 어렵고 점도가 낮은 유화 제품류에는 적용하기가 힘들다.

일반적으로, 리포좀의 피부에 대한 유용성은 잘 알려져 있으며, 특히 친수성 물질의 피부 내 침투를 위한 장점은 잘 알려져 있다. 그러나, 리포좀의 크기와 침투시키고자 하는 물질의 특성과는 알려진 것이 거의 없다. 실제로 피부세포간극이 30 에서 60nm 정도로 그 틈이 아주 작기 때문에(Journal of controlled release, 32, 1994, 249) 100nm 이하의 리포좀만이 통과 할 수 있다는 주장이 설득력이 있는 것처럼 여겨져 왔으며, 대한민국 등록특허 제10-422763호에서도 같은 논리로 주장되어 피부간극과 같은 크기의 리포좀이나 나노에멀젼의 크기가 40 내지 60nm 정도의 크기의 제조법에 관하여 서술하고 있다. 그러나, 최근 발표된 논문(J. of Controlled Release 59, 1999, 87-97)에 따르면 리포좀의 크기가 100nm 이하가 되면 각질부 통과 시 세포의 장력에 의하여 세포막에 융합되어 버림으로써 실제 진피층까지 도달하기 힘들며 침투하지 못할 것 같은 큰 크기(500nm 내지 1500nm)의 리포좀이 진피층에 도달할 수 있다고 기술되었다. 근본적인 피부침투 원리는 현재까지도 완전히 밝혀지지 않았으나 리포좀은 다른 미셀구조와는 달리 물풍선 같이 그 구조가 유연하여 좁은 틈도 통과할 수 있는 것으로 여겨지고 있다(도 2). 본 발명자는 이 점에 착안하여 피부 내로의 침투가 용이하며 그 크기가 기존 단일막 리포좀 보다 상대적으로 크며, 안정한 리포좀의 용이한 제조법을 개발하고자 하였다.

리포좀의 구조에 따른 리포좀 제조 기술을 분류하면 단일막 리포좀 제조, 다중층 리포좀 제조방법, 다중 액정 리포좀 제조방법 등으로 나눌 수 있다.

대부분의 상업적인 리포좀은 100nm 내외 또는 그 이하의 작은 크기의 단일막 리포좀이다. 이러한 리포좀은 그 크기가 균일하여 열역학적으로 안정하며 제형 안정도가 훨씬 뛰어나다. 또한, 사용감이 좋고 성상이 좋기 때문에 기존 세포간극에 대한 크기 대비 침투력 등에 대한 근거에 힘입어 다양한 제품들이 상업화에 성공하였다. 단일막 리포좀의 제조와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2004-12113호에서는 수첨 레시틴을 유화제로 사용하고 고압호모기를 사용하여 고압으로 유화시킴으로써 유화입자의 크기를 100nm 정도의 미세하고 균일한 입자를 제조함으로써 생리활성 유효성분의 경피 흡수율을 향상시키고자 하였다.

다중 액정 리포좀 제조방법은 일반적으로는 사용되지 않는 방법으로서 대한민국 등록특허 제10-0222000호에 상세히 기술되어 있다. 이 특허에 따르면 이 방법에 의하여 고압호모기를 사용치 않고 리포좀과 액정의 장점을 살려 리포좀의 내 외곽을 액정이 감싸고 있는 형태로서 다중 액정이라는 명칭을 사용하였으며 그 증거로서 특정 물리 화학적 물성 또는 피부에 대한 투과성이나 그 평균크기 등에 대한 아무런 증거제시 없이 단지 크기의 유추가 불가능한 사진만을 증거로 제출하였다. 그러나, 사진에서 제시된 리포좀은 리포좀으로서 확인할 수 있는 아무런 증거를 갖고 있지 못하다. 오히려 다중 액정의 제조에 사용된 비이온 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 스테아레이트에 의해 생겨난 수중유 에멀젼 액정인 것으로 여겨진다.상기 등록특허의 발명자들은 액정 형성 유화제인 폴리옥시 에틸렌 스테아레이트가 리포좀을 구성하는 막을 내측과 외측에서 강화한다고 하였다. 그러나, 대부분의 리포좀은 어떠한 타입의 계면활성제에 대해서도 그 구조가 쉽게 와해될 수 있는 취약함을 갖고 있음은 이미 공지의 사실이므로, 리포좀을 강화하기 위하여 사용된 계면활성제가 오히려 리포좀의 구조를 와해하며 동시에 사용된 계면활성제에 의하여 수중 유 액정이 생겨난 것으로 보여진다. 따라서, 이 발명에서 얻어진 다중 액정 리포좀은 사실 폴리옥시 에티렌 스테아레이트와 부가적으로 사용된 여러 가지 유화제들의 반응에 의해서 생겨난 수중유 액정인 것으로 판단된다(도 3).

다중층 리포좀은 그 크기가 균일치 못하며 표준 제조기술이 확립되지 않아 제조과정을 표준화 하기 어려우며 특히 그 크기가 다양하여 시간이 지나면서 침전, 층분리 및 상대적으로 작은 크기의 리포좀이 큰 리포좀으로의 융합 및 성장 등이 관찰되며 이렇게 크기가 성장하는 리포좀은 일정수준으로 성장한 이 후에 터지면서 리포좀 내에 봉입되었던 성분이나 막에 함유되었던 기름성분이 노출되어 수층 위로 떠오르면서 상층부에 엷은 기름띠가 형성되는 문제가 발생한다. 이러한 다중층 리포좀의 문제점과 단일막 리포좀의 성공으로 다중층 리포좀에 대한 실제적인 연구개발이 거의 이루어지지 않았다.

최근, 피부침투에 대한 새로운 학설과 입증이 제시되면서 다중층 리포좀에 대하여 연구 개발되고 있다.

다중층 리포좀의 제조와 관련하여 당업계에 주지되어 있는 방법으로서, 지질 조성물을 유기용매에 용해시킨 다음 유기용매를 진공건조시켜 지질 조성물 층을 형성하고 초음파 등을 이용하여 수용액으로 수화하여 다중층 리포좀을 제조하는 기술이 공지되어 있으며, 또한 대한민국 등록특허 제10-0115076호는 천연지질 및 천연유화제를 함유시켜 고압호모기에 의해 0.035 내지 2㎛ 입자 크기의 미세 다중 라멜라 소구체를 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다.

이외에도 미국특허 등록번호 제 4761288호는 전통적인 고압호모 조건에서 다중층 리포좀을 제조하는 것이 아니라 약 500psi의 낮은 압력으로 고압호모기를 통과시켜 만드는 방법에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 이러한 방법은 1차적으로 용매에 녹인 포스파티딜 콜린을 건조시켜 얇은 필름을 만든 후 수층을 첨가하여 리포좀을 만드는 방법으로 그 공정이 복잡하다. 또한, 미국 등록특허 제4485054호에서도 유화가 끝난 층상의 리포좀에 초음파를 가하여 구상의 리포좀을 유도하여 다중층 리포좀을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있다. 상기의 경우, 모두 특수한 기기나 특수하고 까다로운 조건 하에서 리포좀 제조을 제조해야 하므로 대량의 리포좀을 만들기 위한 상업적인 방법이 되기 어렵다.

일반적으로 리포좀의 제조에는 필수적으로 고압호모기가 사용되는데, 이의 대표적인 것으로는 마이크로플루다이저를 들 수 있다. 마이크로플루다이저는 고압을 이용하여 유화를 수행하는 기계로서, 200 내지 2000 기압의 고압을 사용하여 상압 1기압으로 유화물이 유출될 때 발생하는 압력 변동에 의한 케비테이션(cavitation) 및 충돌력으로 유화입자를 미세하게 만드는 원리를 이용한다. 이러한 기계를 도입함으로써 나노수준의 유화미셀을 손쉽게 제조할 수 있는 반면, 고압호모기의 사용에는 숙련된 기술이 요구될 뿐만 아니라, 고압 호모 조건에 따라 리포좀의 성상이 많은 영향을 받기 때문에 일반적인 화장품, 의약 관련 업체에서는 쉽게 접근하기 어려운 기술적 한계를 가지고 있다.

본 발명에서는 이에 대한 해결 방안으로 누구나 쉽게 기존의 제조설비(예: 일반 호모 믹서)만으로 피부침투와 안정성 면에서 우수하고, 유효성분의 봉입량이 많은 다중층 리포좀을 제조하고자 시도하였다. 이러한 과정에서 리포좀 제조에 사용되는 유도제로서 포스파티딜콜린을 단독으로 사용하지 않고 생체막과 유사한 조성을 갖는 유상 성분의 혼합물을 특정 조성비로 사용함에 따라 고압호모기를 사용하지 않고도 낮은 교반 속도의 일반 호모기를 사용하여, 피부세포간극의 크기 보다 큰 크기를 갖고 피부침투능이 우수하며 생리활성 유효성분의 봉입량이 많으면서도 안정한 다중층 리포좀을 만들 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상술한 바와 같은 종래의 문제점들을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 피부침투능이 우수하고, 봉입된 생리활성 유효성분의 함량이 높으며, 봉입된 유효성분의 안정성이 증진되고, 제조 공정이 간단하여 제조원가가 저렴한 경피흡수용 다중층 리포좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 경피흡수용 다중층 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 경피흡수용 다중층 리포좀에 생리활성 유효성분이 포집된 경피흡수용 조성물을 제공하는 것이다.

도1은 생리활성 유효성분이 피부의 세포간극을 통해 진피층으로 이동하는 모습을 나타낸 그림이다.

도2는 리포좀에 의한 생리활성 유효성분의 피부내 진피층으로의 침투를 나타낸 그림이다.

도 3은 수중 유 액정의 현미경사진을 나타낸 그림이다.

도4는 본 발명에 따라 제조된 다중층 리포좀의 전자현미경 사진을 나타낸 그림이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조되고, 제조된 입자의 크기가 200 내지 5000nm이며, 내부에 생리활성 유효성분을 포집할 수 있는 경피흡수용 다중층 리포좀에 관한 것이다.

리포좀이란 일반적으로 소수성 부분과 친수성 부분을 가지는 지질이 물에 분산하여 고배열, 판상미셀 또는 밀폐형 막을 형성함으로써 물과 평형상태를 이루는 지질 이중막을 말하며, 본원에 사용된 다중층 리포좀은 지질 이중막이 (물층-지질이중막층)-(물층-지질이중막층)과 같이 반복되는 원형의 다수의 동심성 막으로 된 리포좀을 말한다.

본 발명은 단일막 리포좀이 아닌 다중층 리포좀을 형성시킴으로써 단일막 리포좀에 비해 여러 층의 막이 층상으로 쌓여 있어서 체적이 비약적으로 증가하기 때문에 봉입할 수 있는 유효성분의 양이 단일막 리포좀에 비하여 100배 이상에서 1000배에 이른다. 또한, 단일막에 비해 유상성분이 최외곽층을 제외하고는 곧바로 외부 수층에 노출되지 않음으로써 내부층에 속한 유상부나 수상부의 물질은 단일막에 비하여 산화적 스트레스나 빛에 의한 영향, 금속이온 및 여러 가지 외부환경에 대한 영향을 덜 받는다. 따라서, 다중층 리포좀은 불안정한 물질의 포집에 특히 유리하다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 다중층 리포좀은 0.1 내지 15.0중량%의 스쿠알란, 0.1 내지 10.0중량%의 스테롤, 0.1 내지 15중량%의 세라마이드, 0.1 내지30.0중량%의 중성지질 또는 오일, 0.1 내지 30.0중량%의 지방산 및 0.1 내지 10.0중량%의 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조된다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 다중층 리포좀은 0.1 내지 10.0중량%의 스쿠알란, 0.1 내지 5.0중량%의 스테롤, 0.1 내지 10중량%의 세라마이드, 0.1 내지 20.0중량%의 중성지질 또는 오일, 0.1 내지 20.0중량%의 지방산 및 0.1 내지 5.0중량%의 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조된다. 가장 바람직한 양태에서, 본 발명의 다중층 리포좀은 0.1 내지 5.0 중량%의 스쿠알란, 0.1 내지 2.5 중량%의 스테롤, 0.1 내지 5.0 중량%의 세라마이드, 0.1 내지 10.0 중량%의 중성지질 또는 오일, 0.1 내지 10.0 중량%의 지방산 및 0.1 내지 2.5 중량%의 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조된다.

본 발명의 다중층 리포좀의 제조에 사용된 스쿠알란은 안전성이 높고, 화학적으로 불활성인 유성 원료로서 상어의 간유, 여러 동물의 간이나 사람의 피지, 올리브기름, 참기름, 쌀겨기름, 효모 등에도 함유되어 있다. 스쿠알렌(C₃₀H₅₀)을 니켈촉매 존재하에서 수소를 첨가하여 얻은 스쿠알란(C₃₀H₆₂)은 피부에 친화적이고 경피흡수율을 증대시키므로 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 다중층 리포좀의 제조시, 동물성 또는 식물성 스쿠알란 또는 이의 유도체를 단독으로 사용하거나 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

스테롤은 피부침투성이 좋고 자극도 적어서 유연제, 유화제, 유화 안정제 등으로 사용되며, 소포(vesicle)을 안정화시키는 효과를 가지고 있다. 동물성 스테롤 및 식물성 스테롤을 모두 사용할 수 있으며, 그 예로서 콜레스테롤, 캄페스테롤(campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 베타 시토스테롤(β sitosterol), 후코스테롤(fucosterol) 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 다중층 리포좀의 제조시, 상기한 스테롤을 단독으로 사용하거나 이들의 혼합물도 사용할 수 있다.

세라마이드는 스핑고리피드의 일종으로 스핑고신과 리놀레인산과 같은 다양한 지방산으로부터 제조된다. 장쇄 염기인 스핑고신의 아미노기에 지방산이 아미드 결합된 구조를 가지며 1차적으로 장벽기능을 하며 동시에 수분과 결합하는 기능, 면역조절의 기능도 갖고 있다. 동물 및 식물 기원의 모든 세라마이드를 사용할 수 있으며, 파이토스핑고신, 세라마이드 III 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 다중층 리포좀 제조시, 1종의 세라마이드을 단독으로 사용하거나 2종 이상의 세라마이드를 함께 사용할 수 있다.

중성지질은 트리글리세라이드를 칭하며, 오일은 식물성 오일 및 동물성 오일을 모두 포함한다. 그 예로서 식물성 오일은 올리브오일, 동백오일, 현미유, 마카데미아넛오일 등을 사용할 수 있고, 동물성 오일은 탤로(tallow), 라드(lard), 타조유 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 다중층 리포좀 제조시, 중성지질, 식물성 오일 및 동물성 오일을 단독으로 사용하거나 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

지방산은 화장품이나 의약 원료로 사용되는 모든 지방산을 사용할 수 있으며, 탄소수 6 내지 20의 지방산이 바람직하고, 이러한 지방산은 직쇄 또는 측쇄 형태를 가질 수 있다. 바람직한 지방산의 예로는 스테아르산, 올레산, 리놀산, 팔미트산, 리놀렌산, 미리스트산 등이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

레시틴은 인지질의 일종으로서 글리세롤의 한쪽에 인산 및 콜린 등의 친수성 성분이 결합되고 다른 쪽에는 소수성의 아실기가 결합된 구조를 하고 있어 그 특성상 수상부나 유상부 모두에 함유가 가능하다. 레시틴은 탄소수 12 내지 24의 지방산 사슬을 갖고 포스파티딜콜린 함량이 20% 이상의 것이 바람직하다. 본 발명의 다중층 리포좀의 제조시 유도체 형태의 레시틴이 바람직하게 사용될 수 있으며, 그러한 예시로서 레시틴 분자내의 불포화 이중결합을 포화시킨 수소첨가 레시틴(hydorgenated lecithin), 인지질의 지방산 사슬을 부분적으로 가수분해하여 제조된 리소레시틴, 레시틴에 하이드록시기를 도입한 하이드록실레이티드 레시틴 등을 들 수 있다. 상기한 레시틴 및 그 유도체는 동물 또는 식물 유래의 것이 모두 사용될 수 있다. 본 발명의 다중층 리포좀의 제조시, 상기한 식물성 또는 동물성 기원의 레시틴 또는 이의 유도체를 단독으로 사용하거나 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 다중층 리포좀은 방부제, 항산화제, 안정화제, 점증제 등을 추가로 포함하여 이의 안정도를 개선할 수 있다. 방부제는 합성 또는 천연 유래의 방부제 모두 사용가능하며 이들의 혼합물도 사용할 수 있다. 일반적으로 방부제는 0.01%에서 20% 이내로 첨가될 수 있다. 항산화제는 BHT, 에르솔베이트, 토코페롤, 아스탁산친, 식물성 플라보노이드 등과 그 유도체 및 다양한 식물유래의 항산화 물질이 첨가될 수 있다. 안정화제는 리포좀의 성상을 안정화 하기 위한 것으로서 리포좀 제조 후에 첨가되어 질 수 있으며, 폴리올 계열, 당류 등이 사용될 수 있다.폴리올 계열로는 부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 다이 프로필렌 글리콜, 에틸 카비톨 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 당류로는 트레할로스, 설탕, 만니톨, 솔비톨, 키토산 등을 포함하여, 단당류, 올리고당류, 고분자 전분 등도 사용될 수 있다. 제조된 리포좀의 수분산 안정도를 보다 향상시키기 위한 점증제는 천연유래의 다양한 점증제를 포함하여 아크릴아마이드 류 및 합성 고분자 점증제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 아카시아검, 잔탄검, 젤란검, 로커스트빈검, 전분 등의 천연고분자와 하이드록시 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 등의 셀룰로스유도체, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜 등의 합성고분자와 이들의 공중합체 및 가교된 형태의 물질이 사용될 수 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다중층 리포좀의 그의 내부에 생리활성 유효성분을 포함한다. 이러한 생리활성 유효성분은 리포좀에 포집되어 생리 기능을 증진시킬 수 있는 모든 물질을 포함하며, 특정한 것에 한정되지 않는다. 단백질, 펩타이드, 핵산, 합성 화합물, 천연 추출물, 당류, 비타민, 무기질 등이 포함될 수 있으며, 이들은 천연에서 분리하거나 화학적으로 합성하거나 재조합적으로 생산할 수 있다. 하나의 예시로서, 생리활성 유효성분은 독소, 효소, 호르몬, 신경전달물질, 이뮤노글로불린, 다당류 등이 있다. 또 다른 예시로서, 생리활성 유효성분에는 면역조절제, 항생제, 항종양제, 항염증제, 해열제, 진통제, 항부종제, 진해 거담제, 진정제, 근육이완제, 항간질제, 항궤양제, 항우울제, 항알레르기제, 강심제, 항부정맥제, 혈관확장제, 혈압강하제, 당뇨치료제, 항상성제제, 호르몬제, 항산화제, 육모제, 양모제,항균제, 미백제, 콜라겐 합성 촉진제, 주름 제거·완화제, 피부장벽 강화제, 피부 보습력 증강제 또는 피부 미용제 등이 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다중층 리포좀은 바람직하게는 3개 내지 20개의 막으로 구성되고, 상기 막에는 소수성 유효성분이 존재하며, 상기 막의 내부 중앙부와 막 간극에는 친수성 유효성분이 존재하고, 양극성 물질은 막과 내부중앙부 또는 막 간극에 걸쳐있는 형태로 존재한다. 이러한 본 발명의 다중층 리포좀의 입자 크기는 200nm 내지 5000nm이며, 바람직하게는 200nm 내지 3000nm 이고, 보다 바람직하게는 800nm 내지 1000nm이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 다중층 리포좀에 생리활성 유효성분이 포집된 경피흡수용 조성물에 관한 것이다.

이러한 조성물의 적용에는 특별한 제한은 없으며, 예를 들면 유연 화장수, 영양화장수, 크림, 팩, 젤, 패치 등의 기초 화장료와 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌져 등의 세정료, 치약, 구강 청정제 등의 구강용 조성물, 헤어 토닉, 젤, 무스 등의 정발제, 양모제, 염모제 등의 모발용 조성물, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 의약품 및 의약외품 등에 폭넓게 적용 가능하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분을 50℃ 내지 75℃로 가온하여 용해시키는 단계; (b) 수상 성분을 50℃ 내지 75℃로 가온하여 용해시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 용해된 성분들을 혼합하여 500 내지9000rpm(revolutions per minute) 의 속도로 교반하여 입자 크기가 200 내지 5000nm인 다중층 리포좀을 형성시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 경피흡수용 다중층 리포좀의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다중층 리포좀 제조에 사용되는 유상 성분은 상기한 바와 같으며, 이들은 최종 리포좀 조성물을 기준으로 하여 1 내지 30중량%, 바람직하게는 1.0 내지 5.0 중량%를 차지한다.

수상 성분은 물 이외에 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 폴리올류가 포함될 수 있으며, 또한 친수성 식물성 플라보노이드나 로즈마리 추출물 등과 같이 항산화 효능이 있는 성분이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 다중층 리포좀의 제조시, 유상 성분 및 수상 성분은 각각의 용해조에서 호모 믹서 또는 패들 믹서로 혼합 및 용해시킨다. 유상 성분은 유기 용매, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소-프로판올, 부탄올 등의 알코올, 보다 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 용해시키며, 알코올에 용해시킬 경우 60℃ 정도의 비교적 낮은 온도에서 쉽게 용해되며 완전 용해가 가능하다.

상기 별도의 용해조에서 제조된 유상 성분의 혼합물을 수상 성분의 혼합물에 투입하여, 500rpm 내지 9000rpm, 바람직하게는 2000 내지 4000rpm, 보다 바람직하게는 3000rpm의 속도로 1내지 30분, 바람직하게는 3 내지 10분, 보다 바람직하게는 4 내지 6분 동안 교반한다. 이러한 유화 방법은 당업계에서 수중유 타입의 에멀젼을 만들기 위해 통상 사용하는 방식이기 때문에 특별한 기술 습득이 필요하지 않다. 상기한 교반 유화는 프로펠라 믹서, 디스퍼, 호모 믹서, 호모게나이져, 콜로이드분쇄기, 초음파유화기 등의 당업계에서 널리 이용되는 다양한 분산 유화기를 사용하여 달성할 수 있다. 특히, 호모 믹서는 의약품, 화장품 및 식품에서 균질한 혼합을 위하여 일반적으로 사용되는 교반 장치로서, 교반 속도 및 교반 시간을 조절하여 적정크기의 리포좀을 조절할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 다중층 리포좀의 제조 과정에 고압호모기를 전혀 사용치 않고 일반적인 저속 호모기를 사용함으로써, 일반적인 의약 원료 제조업체나 화장품 관련 업체에서 용이하게 본 발명의 다중층 리포좀의 제조가 가능하다.

본 발명에 따라 제조된 다중층 리포좀은 입자 크기가 바람직하게는 200 내지 5000nm, 보다 바람직하게는 200 내지 1500nm, 더욱 바람직하게는 800nm 내지 1000nm이고, 점도가 1cps 내지 5000cps인 미세하고 균일한 입자이다.

본 발명의 다중층 리포좀에 포함되는 생리활성 유효성분이 소수성일 경우는 유상 성분에 친수성일 경우는 수상 성분에 미리 용해시켜서 첨가할 수 있다. 생리활성 유효성분이 열에 약한 경우는 유화가 끝난 후 45℃ 이하의 온도에서 유화물에 첨가하여 교반함으로써 만들어진 리포좀내로 도입될 수 있다.

본 발명에서 얻어진 리포좀을 좀 더 균일하게 제조하고자 할 경우에는 2차 가공 과정이 이용될 수 있다. 1차 제조된 다중층 리포좀을 고압호모기 또는 마이크로플루이다이저 등을 사용하여 고압으로 통과시킴으로서 보다 균일한 다중층 리포좀을 얻을 수 있다.

본 발명에 따라 별도의 용해조에서 제조된 유상 성분의 혼합물과 수상 성분의 혼합물을 일반적인 호모 믹서를 사용하는 조건에서 형성된 본 발명의 다중층 리포좀은 12개월 후에도 입자의 크기가 일정하게 유지되는 뛰어난 안정성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 경피 흡수 효과는 고압호모기를 이용하여 제조한 다중층 리포좀과 유사한 투과 속도와 투과량을 나타내었다. 즉, 본 발명은 고압호모기와 같은 고가의 장비를 사용하지 않고서도 이러한 고가의 장비를 사용하여 제조된 다중층 리포좀과 유사한 경피흡수 효과를 나타내었다. 또한, 본 발명의 다중층 리포좀은 사람을 상대로 한 자극시험에서도 피부에 자극을 유발하지 않는 우수한 인체 안전성을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 리포좀 제조는 제조공정이 간단하고 제조원가가 저렴할 뿐만 아니라, 생리활성 유효성분을 내부에 포집하고 있는 다중층 리포좀, 바이오 캡슐 또는 입자를 이용하여 향상된 경피흡수 능력을 부여함으로써, 인체에서 치유, 완화, 관리 등을 목적으로 하는 화장품, 식품, 및 의약품에 응용되어 질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

<실시예 1> 일반 호모 믹서를 이용한 다중층 리포좀의 제조

본 발명에 의한 제조방법은 비교적 짧은 시간 내에, 마이크로플루이다이저 같은 고압호모기와 같은 특수한 기기의 도움없이 일반적으로 사용되는 저속 호모기를 이용하여 제조가 가능하다. 본 발명의 다중층 리포좀은 다음의 순서대로 제조하였다.

1) 정제수를 온도 50℃ 정도로 올린 후 아데노신을 넣어 패들 믹서로 혼합 교반하여 완전히 용해시켰다

2) 하기 표 1에 제시된 유상성분을 별도의 용해조에 투입하여 70℃ 내지 75℃로 가온하여 완전 용해시켰다.

3) 상기 2)의 유상성분을 상기 1)항의 용해조에 투입하여 5분 동안 3000rpm의 교반속도의 호모 믹서로 혼합하여 리포좀을 제조하였다.

4) 리포좀의 보존성을 증진시키기 위하여 45℃로 3)항의 교반액을 냉각시킨 후 항산화제와 점증제 및 방부제 등을 첨가하였다.

본 발명의 다중층 리포좀 제조에 사용된 성분의 비율은 하기 표 1과 같다.

다중층 리포좀의 조성비

구분	성분명	중량 %
		시험예 1	시험예 2	시험예 3
유상부	스쿠알란	3.00	3.00	3.00
	세라마이드	1.00	1.00	1.00
	식물성 스테롤	2.00	-	2.00
	콜레스테롤	-	2.00	-
	동백오일	5.00	5.00	5.00
	스테아르산	1.00	1.00	1.00
	에탄올	10.00	10.00	10.00
	레시틴	2.50	-	1.00
	수첨레시틴	-	2.50	1.50
	토코페릴아세테이트	0.3	0.3	0.3
수상부	아데노신	0.04	0.04	0.04
	정제수(100%가 되도록 첨가)	Up to 100	Up to 100	Up to 100
첨가제	내츄로틱스(천연방부제)	2.00	2.00	2.00
	잔탄검	적당량	적당량	적당량
	식물성 폴리페놀	적당량	적당량	적당량
	솔비톨	적당량	적당량	적당량

<비교예 1> 고압호모기를 이용한 나노크기의 리포좀 제조

대한민국 공개특허 제10-2004-0012113호에 제시된 방법에 따라 제조하였다. 다만 비교시험을 위하여 상기 특허에서 제시된 유효성분인 알부틴 대신에 본 발명에서 지표물질로 사용하기 위한 아데노신을 유효성분으로 사용하였다.

성분 %

식물성 스쿠알란 6.0

페닐트리메치콘 3.0

사이클로펜타실록산 2.0

메도우폼시드오일 0.1

토코페릴아세테이트 0.1

글리세린 4.0

아데노신 0.04

트리소듐이디티에이 0.01

디프로필렌글라이콜 5.0

수첨레시틴 1.0

에탄올 3.0

방부제 적당량

향 적당량

색소 적당량

정제수 up to 100 ml

<비교예 2> 유기용매를 사용한 박막(thin film) 법에 의한 리포좀 제조

미국 특허 제4761288호의 실시예 1에 제시된 방법에 의하여 제조하였다. 다만 비교시험을 위하여 상기 특허에서 제시된 유효성분인 미녹시딜(Minoxidil) 대신에 본 발명에서 지표물질로 사용하기 위한 아데노신을 유효성분으로 사용하였다.

성분

디-알파 디팔미토일 포스파티딜콜린 400 mg

콜레스테롤 200 mg

아데노신 40 mg

에탄올 1 ml

프로필렌 글리콜 0.7 ml

칼슘 클로라이드(8mM) 8.3 ml

<비교예 3> 일반 호모 믹서를 사용한 다중액정 리포좀

대한민국 등록특허 제10-0222000호에 제시된 실시예 1에 제시된 방법에 따라 제조하였다. 다만 첨가제로서 아데노신을 대체하여 첨가하였다.

성분 %

폴리옥시에틸렌스테아레이트 3.15

폴리옥시에틸렌 디히드록시 스테아레이트 0.64

협타메틸노난 5.00

초산토코페롤 0.50

고급알코올 1.50

고급지방산 1.50

마이크로 크리스탈린 납 0.50

지방산 글리세라이드 6.00

정제수 10.00

부틸렌 글리콜 1.50

농 글리세린 2.00

방부제 0.40

요소 0.30

인지질 0.50

정제수 56.61

조합향료 0.20

아데노신 0.04

실리콘 오일 1.00

<비교예 4> 고압호모기를 사용한 다중층 리포좀 제조

1995년도 한국에서 발행된 화장품 학회지 제 21-1호(38권)에 김인영 등에 의해 발표된 논문에 제시된 방법에 따라 제조하였다. 유효성분으로서 수층에 아데노신을 첨가하여 사용하였다.

성분 %

지질 15.0-20.0

프로필렌글리콜 5.0

세틸포스페이트 0.5

정제수 적당량

말산 1.0

타르타르산 1.0

젖산 1.0

정제수 up to 100

<실시예 2> 리포좀의 크기 결정

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에서 제조된 리포좀에 대하여 입자측정기(Particle size analyser, Model 370 Nicomp사, 미국)를 이용하여 각 시료 별로 3회씩 유화 입자의 크기를 측정하고 그 결과의 평균치와 600X 배율의 현미경 하에서 관찰된 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

입자분석기에 의한 리포좀의 크기 측정

항목	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4	시험예1	시험예2	시험예3
입자크기분포	30-200	1000-15000	>3000	150-350	200-1500	200-1500	200-1500
평균입자크기(nm)	100	4000	4000	250	800	1000	900
성상	단일막 리포좀	다중층 리포좀	수중 유액정	단일막-다중층 혼합리포좀	다중층 리포좀	다중층 리포좀	다중층 리포좀

상기한 표 2의 결과를 통해 알 수 있는 바와 같이, 고압호모기를 사용하여리포좀을 만들 경우 단일막(비교예 1)과 다중층(비교예 4) 모두에서 그 크기가 고압호모기를 사용치 않은 경우보다 크기가 일정하고 작다. 이 두 경우 모두 고압호모기의 통과 압력과 통과 온도, 통과 횟수 등에 의하여 크기가 영향을 받는다는 것을 익히 공지된 사실이다. 유기용매를 사용하여 엷은 이중막을 만든 후에 수화시켜 다중층 리포좀을 만드는 경우(비교예 2)에는 그 크기가 매우 다양하여 1μm에서 15μm에 이르는 광범위한 크기의 리포좀이 만들어진다. 이 경우에는 크기가 너무 불규칙하기 때문에 열역학적으로 불안정할 뿐만 아니라 상대적으로 작은 크기의 리포좀 입자가 큰 리포좀 입자의 장력 하에 놓이게 되어 접근하다가 최종적으로는 융합되며, 이런 과정을 반복하게 되면 리포좀이 성장하게 되며 풍선과 같이 한계점을 지나게 되면 터지게 되고, 시간이 지남에 따라 성상이 불안정하고 깨어진 리포좀 때문에 포접되었던 오일류가 수층으로 노출되어 결국 에멀젼의 가장 상층으로 올라와 분리되어 오일층을 형성하게 된다. 따라서, 비교예 2는 제조방법이 비교적 쉬운 리포좀 제조법이나 상업적으로 사용하기에는 무리가 있는 것으로 사료된다.

반면, 시험예 1, 2 및 3에서는 입자의 분포가 모두 200에서 1500nm 정도로 일정하게 나타났으며 평균크기는 800에서 1000nm 정도인 것으로 나타났다. 또한, 현미경 판독에서 모두 다중층 리포좀인 것으로 나타났으며 그 층의 수는 3개에서 20개 이상에 이르는 것으로 밝혀졌다(도 4). 도 4는 시험예 1의 리포좀을 전자현미경으로 찍은 사진이다.

<실시예 3> 리포좀의 안정도

시험예 1과 비교예 1, 2, 3 및 4에서 얻어진 입자의 크기를 상대습도 70% +/- 5, 온도 25℃로 조절되는 항온기 내에 보관하여 안정도를 살펴본 결과를 요약하여 표 3에 나타내었다. 표 3에서 리포좀 입자의 크기는 모두 nm이다.

리포좀의 안정도

항목	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	시험예 1	시험예 2	시험예 3
제조직후	100	4000	4000	250	800	1000	900
2주 후	100	4200	4010	280	800	900	902
1달 후	110	6020	3988	410	810	1010	913
3개월 후	130	4020	4207	1100	805	989	897
12개월 후	210	6200	4023	980	796	1012	902

상기 표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1에 제시된 100nm 정도의 나노사이즈 크기의 리포좀은 열역학적으로 안정하며 1개월 동안의 그 크기에 변화가 거의 없고 3개월, 12개월에 이르러서야 그 크기가 약 2배 정도 커지는데 그쳤다. 비교예 3의 다중 액정은 리포좀이 아닌 수중유 액정으로 판단되며, 그 크기가 1년 이상 안정한 상태로 유지되었다. 비교예 2의 유기용매를 이용한 다중층 리포좀은 그 크기가 4000에서 6000nm정도로 유지되었다. 비교예 4에서 얻어진 리포좀은 시간이 지남에 따라 리포좀 크기의 변화가 심하게 나타났다. 한편, 시험 예 1, 2 및 3 모두에서는 그 크기가 비교적 일정하게 유지되었으며 특히 시험예 1에서 가장 뛰어난 안정화 정도를 나타냈다.

<실시예 4> 리포좀의 경피흡수 시험

본 발명의 시험예 1과 비교예 3 및 4를 사용하여 경피 흡수 정도를 시험하였다. 경피흡수는 털을 제거한 기니아 피그(Jackson Laboratories) 피부를 대상으로 프란츠 투과셀 (PermeGear, Inc.)을 이용하여 측정하였다. 시험 직전, 털을 제거한 기니아 피그의 복부 부분의 피부를 채취하여, 평방 1㎠의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 0.9㎝인 투과셀에 장착하고, 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽면(donor 용기)은 상기한 비교예 3, 4 및 시험예 1의 리포좀을 0.5㎖ 넣어주었다. 반대쪽 면(receptor 용기)은 정제수와 에탄올이 4:1 중량비로 혼합된 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험시 온도는 실제피부 온도인 32℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 후, 피부를 통과한 아데노신의 양을 측정하여, 도포 농도 당 피부흡수량(㎍/㎠/중량％)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

아데노신의 정량 분석은 가스 크로마토그래피 방법과 고속 액체 크로마토그래피 방법으로 수행하였으며, 그 조건은 각각 다음과 같다:

[가스 크로마토그래피 방법]

주입기 : 스플릿 비율 1:50

검출기 : FID(Flame Ionization Detector)

컬 럼 : 30m DBWAX 0.25mm LD

컬럼 압력 : 10psi

주입기 온도 : 250℃

검출기 온도 : 250℃

오븐 온도 프로그램

시작 : 200℃

가열 속도 : 4℃/분, 250℃ 까지

[고속 액체 크로마토그래피 방법]

기기: Dionex P530 pump, ASI-100 automated sample injector

컬럼 : Phenomenex Luna 5u (C18(2)), 150x 4.6 mm

이동상 : 10 mM KH2PO4 : water = 92:8 (0-6.5 min) -40:60 (7.5-12 min) - 92:8 (12.5-15 min) gradient system

유속 : 0.6 ml/min

검출기 : UV/Vis Detector UVD 340S 260 nm

주입 부피:10 ul

가동시간: 25 min

아데노신의 경피흡수량(㎍/cm²)

구분	시료	경과시간(hour)	평균
		1		2	3
		0	4	8	12	0	4	8	12	0	4	8	12	0	4	8	12
경피잔류	비교예 3	0	5	15	20	0	8	18	23	0	4	14	19	0	5.7	15.7	20.7
	비교예 4	0	76	160	175	0	87	168	178	0	97	181	193	0	86.7	169.7	182
	시험예 1	0	66	171	180	0	48	156	192	0	69	164	179	0	61	163.7	183.7

상기한 표 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 일반 액정으로 판명된 비교예 3의 수중유 액정은 피부내로 아데노신을 거의 이송하지 못하였다. 반면, 마이크로플루이다이저를 이용하여 제조한 비교예 4의 다중층 리포좀은 비교예 3에 비하여 시간 의존적으로 아데노신을 피부내로 흡수시켜 통과시켰다. 본 발명에 따른 다중층 리포좀은 비교예 4와 비교하여 거의 비슷한 투과 속도와 투과량을 나타내었다. 따라서, 본 발명에서 얻어진 일반 저속 호모 믹서를 사용한 리포좀 제조기술은 고가의 장비를 필요치 않으면서도 기존 고가의 장비를 사용하여 제조된 리포좀과 유사한 성능을 나타내었다.

<실시예 5> 인체 안전성 시험

사람을 상대로 한 자극시험으로서 첩포 시험(patch test)을 수행하여 자극유무를 판단하여 자극이 있으면 어느 정도이며 다른 진정성분으로 완화 가능한지를점검하였다. 시험은 임상 전문기관인 더마프로㈜에서 수행하였으며, 최소 30명의 인원이 시험에 참가하고, 결과에 따라 화장품 원료로서 부적격한 경우는 탈락시켰다. 첩포 부위는 사람의 상등부(정중선의 부분은 제외) 또는 전완부와 같은 인체사용 시험을 평가하기에 적정한 부위를 폐쇄 첩포하였다. 원칙적으로, 첩포 48시간 후에 팻취를 제거하고 제거에 의한 일과성의 홍반의 소실을 기다린 후 관측하여 판정하였으며, 판정은 피부과 전문의 5년이상 동종업계의 전문 종사자의 책임 하에 이루어졌다.

구체적으로, 첩포시험은 하기의 방법에 따라 진행하였다. 30명의 피험자를 대상으로, 사람의 정상피부(등 또는 전박부)에 핀 챔버(Finn Chamber, 직경 5mm)를 사용하여 첩포 시험을 수행하였다. 핀 챔버에 시료를 소량 넣은 뒤 피부에 스캔포 테이프(Scanpor tape)를 사용하여 붙였다. 첩포를 붙이고 이틀간 붙여 둔 후 첩포를 제거하고 30분 후 첩포 부위의 피부상태를 판독하였다. 이틀 후 동일부위를 다시 한번 판독하였다. 판독기준은 다음과 같은 국제 접촉피부염 연구위원회가 추천한 첩포 시험 결과의 판독기준을 이용하였다. 피험자들이 첩포 시험 3일 전부터 판독이 완료될 때까지(총 1주일) 일체의 항히스타민제의 복용을 금지하였다. 30명의 피험자를 대상으로 실시한 첩포 시험을 판독하여 IR 반응(자극반응) 및 알레르기성 반응 생성 여부를 확인하였다.

국제 접촉피부염 연구위원회가 추천한 첩포 시험 결과의 판독기준

± 의양성

1+ 약양성(비수포성)

2+ 강양성(수포성)

3+ 초강양성

4+ 자극성

인체 안전성 시험 결과, 본 발명의 다중층 리포좀은 72시간 경과 후에도 피부에 자극을 유발하지 않는 우수한 안전성이 있음이 입증되었다(표 5).

인체 안전성 시험

번호	시험물질	처치후 48시간 경과	처치후 72시간 경과	반응도(n=30)
		±	1+	2+	3+	4+	±	1+	2+	3+	4+	48시간	72시간	평균
1	비교예1	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.8	0	0.4
2	비교예2	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.8	0	0.4
3	비교예3	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.8	0	0.4
4	비교예4	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.4	0	0.2
5	시험예1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0	0	0
6	시험예2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0	0	0
7	시험예3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0	0	0

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 제공되는 다중층 리포좀은 단일층 리포좀에 비하여 유효성분의 봉입량이 많고 구조적으로 봉입된 유효성분이 안정할 뿐만 아니라, 고압호모기가 아닌 일반적으로 이용 가능한 호모 믹서를 이용하여 제조가 가능하므로 제조공정이 간단하고 경제적이며, 피부 각질세포간극보다 큰크기로 제조되어 나노크기의 단일막 리포좀에 비하여 세포간극 통과시 주위세포에 대한 장력으로부터 벗어나 진피층까지 침투가 가능하므로 생리활성 유효성분의 경피흡수를 촉진시키는 데에 이용할 수 있다.

Claims (10)

1. 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분의 혼합물을 사용하여 제조되고, 리포좀 전체 중량을 기준으로 스쿠알란이 0.1 내지 10.0중량%, 스테롤이 0.1 내지 5.0중량%, 세라마이드가 0.1 내지 10중량%, 중성지질 또는 오일이 0.1 내지 20.0중량%, 지방산이 0.1 내지 20.0중량%, 레시틴이 0.1 내지 5.0중량% 함유되며, 제조된 입자의 크기가 200 내지 5000nm인, 내부에 생리활성 유효성분을 포집할 수 있는 경피흡수용 다중층 리포좀.
2. 제1항에 있어서, 입자 크기가 200 내지 1500nm인 다중층 리포좀.
3. (a) 스쿠알란, 스테롤, 세라마이드, 중성지질 또는 오일, 지방산 및 레시틴을 포함하는 유상 성분을 50℃ 내지 75℃로 가온하여 용해시키는 단계; (b) 수상 성분을 50℃ 내지 75℃로 가온하여 용해시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 용해된 성분들을 혼합하여 500 내지 9000rpm의 속도로 교반하여 입자 크기가 200 내지 5000nm인 다중층 리포좀을 형성시키는 단계를 포함하는, 경피흡수용 다중층 리포좀의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 리포좀 전체 중량을 기준으로, 스쿠알란이 0.1 내지 10.0중량%, 스테롤이 0.1 내지 5.0중량%, 세라마이드가 0.1 내지 10중량%, 중성지질 또는 오일이 0.1 내지 20.0중량%, 지방산이 0.1 내지 20.0중량%, 레시틴이 0.1 내지 5.0중량%인 방법.
5. 제3항에 있어서, 입자 크기가 200 내지 1500nm인 방법.
6. 제 3 항에 있어서, 교반속도가 2000 내지 4000rpm 인 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 다중층 리포좀을 고압호모기를 통과시켜 2차적으로 분쇄 및 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 제3항의 방법에 따라 제조된 경피흡수용 다중층 리포좀.
9. 제1항 또는 제8항의 다중층 리포좀에 생리활성 유효성분이 포집된 경피흡수용 조성물.
10. 제9항에 있어서, 생리활성 유효성분이 단백질, 펩타이드, 핵산, 천연추출물, 합성 화합물, 당, 비타민 또는 무기질인 조성물.