KR100364916B1 - 동종재조합에의한증폭하는내인성유전자의발현의활성화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 1) a) 세포에 존재하는 서열을 수복, 변경, 결실 또는 대체시키는 DNA 서열; 또는 b) 얻어지는 대로의 세포의 내인성 유전자에 정상적으로 기능적으로 결합되어 있지 않은 조절 서열인 DNA 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 외인성 DNA; 2) 세포의 예정된 부위에 있는 게놈 DNA 서열에 상동하는 DNA 서열, 및 3) 선택가능한 마아커를 코드화하는 증폭가능한 DNA 를 포함하는 DNA 서열로 세포를 형질전환시킴으로써 DNA 서열을 함유하는 세포를 생성시키는 단계; b) 단계 a)에서 제조된 세포를 게놈 DNA 서열과 상동하는 서열과 게놈 DNA 서열 사이에 동종 재 조합이 일어나기에 적절한 조건하에서 유지시킴으로써 게놈 DNA 안에 통합 되어 있는 (a)(1), (a)(2) 및 (a)(3)의 DNA 서열 및 내인성 유전자에 기능적으로 결합되어 있는 (a)(1)의 외인성 DNA 를 가지는 척추동물 기원의 동종 으로 제조합된 세포를 제조하는 단계; 그리고 c) 단계 (b) 에서 제조된 동종 제조합체 세포를 선택가능한 마아커를 코드화하는 증폭가능한 DNA 의 증폭을 선택하는 조건하에서 배양함으로써 선택가능한 마아커를 코드화하는 증폭가능한 DNA 및 (1)의 외인성 DNA 에 기능적으로 결합된 내인성 DNA 가 함께 증폭되는 단계로 이루어지며, 그로서 선택가능한 마아커를 코드화하는 증폭된 DNA 및 (A)(1)의 DNA 서열에 기능적으로 결합된 함께 증폭된 내인성 유전자를 함유하며, 그 안에서 함게 증폭된 유전자가 발현되는 동종으로 제조합된 세포가 제조되는 것을 특징으로 하는, 얻어지는 대로의 세포에서는 발현되지 않는, 또는 얻어지는 대로의 세포에서는 상당한 수준으로 발현되지 않는 척추동물 세포에서 게놈 DNA 의 내인성 유전자의 발현을 활성화시키고 그 유전자를 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
Description
발명의 배경
치료 단백질의 투여에 의하여 질병을 치료하기 위한 현재의 방법은 종래의 약제학적 전달(예컨대, 정맥내, 피하, 또는 근내 주사)을 위한 치료 단백질의 시험관내 생성 및 보다 최근에는 유전자 치료법을 포함한다.
치료적으로 관심이 있는 단백질들은 일반적으로 치료적 관심의 단백질을 코드화하는 외인성 DNA를 적절한 세포안으로 도입시킴으로써 생성된다. 유전자 치료법에 대한 현재 이용가능한 방법들은 발현될 유전물질을 포함하는, 예컨대 레트로바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터를 이용한다. 그러나 그러한 방법들은 예를들면 벡터가 제조되는 동안 복제능력있는 바이러스가 생성될 가능성 ; 신규한 세포 특이성, 숙주 범위, 또는 증가된 병원성 및 세포 독성을 가지는 감염성 병원체를 잠재적으로 생성시키는, 치료용 바이러스와 내인성 레트로바이러스 게놈 사이의 재조합; 종양형성 삽입 사건의 위험을 증가시키는 다수의 세포안으로의 독립적인 통합 ; 레트로바이러스안에서의 제한된 클로닝 능력(이것은 치료적 이용가능성을 제한함) 및 관심의 생성물의 단기간적인 생체내 발현이라는 한계를 갖는다. 유전자 생성물을 제공하기 위한 보다 좋은 방법, 특히 현재 활용가능한 방법들과 관련된 위험을 피하고 장기간의 치료를 제공하는 방법이 가치있을 것이다.
발명의 요약
본 발명은 치료용 단백질의 시험관내 생성 및 유전자 치료법에 의한 치료용 단백질의 생성 및 전달을 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 내인성 세포 유전자의 발현을 활성화시키고, 또한 활성화된 내인성 세포 유전자의 증폭을 가능하게 하는 방법을 기재하고 있는데, 이 방법은 치료적 관심의 단백질을 코드화하는 외인성 DNA 의 시험관내 조작 및 트랜스펙션를 필요로 하지 않는다.
본 발명은 또한 단백질, 특히 치료 단백질을 생성하기에 유용한 트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포(즉, 불멸화되지 않은 세포) 및 트랜스펙팅된 불멸화된 세포, 그러한 세포의 제조 방법, 시험관내 단백질 제조를 위해 그런 세포들을 사용하는 방법 및 유전자 치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포들은 척추동물, 특히 포유동물로부터 유래되며, 보다 특히 사람으로부터 유래된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포들은 치료 생성물을 코드화하는 외인성 DNA, 그 자체가 치료 생성물인 외인성 DNA 및/또는 트랜스펙팅된 세포들이 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 일어나는 것 보다 더 높은 수준으로 또는 이것과는 상이한 조절 또는 유도패턴으로 유전자를 발현시키게 하는 외인성 DNA를 함유한다.
본 발명은 또한 일차, 이차, 및 불멸화된 세포들이 외인성 유전물질을 포함하도록 트랜스펙팅시키는 방법, 클론성 세포 스트레인 또는 이종성 세포 스트레인을 제조하는 방법, 및 트랜스펙팅된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들을 사용하여 동물을 면역시키거나 면역된 동물에게서 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 척추동물, 특히 포유동물 기원의 세포에서 유전자를 표적화하거나 또는 동종 재조합하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 DNA가 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포의 게놈의 예정된 부위에 도입되도록 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포안에 동종 재조합을 통해 DNA를 도입시키는 방법에 관한 것이다. 사용되는 표적화 서열은 외인성 DNA 가 삽입될 부위(를 참조로 선택된다)에 의해 결정된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된, 동종 재조합(HR) 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들로서 언급되는 동종 재조합 일차, 이차 또는 불멸화된 세포 및 HR일차, 이차 또는 불멸화된 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 척추동물 기원의 일차, 이차 또는 불멸화된 세포에 존재하며 정상적으로는 세포에서 발현되지 않거나 또는 수득되는 세포에서 생리적으로 유의할만한 수준으로 발현되지 않는 유전자를 활성화시키는(즉, 작동시키는) 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 동종 재조합은 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 명백한 수준 보다 더 높은 수준으로 유전자가 발현되게 하거나 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 명백한 수준과는 상이한 조절 또는 유도패턴을 나타내게 하는 조절서열로 수득되는 세포내의 유전자와 정상적으로 결합된 조절영역을 대체하거나 무력화 시키기 위해 사용된다. 그러므로, 본 발명은 트랜스펙팅된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에서 원하는 생성물을 코드화하는 내인성 유전자를 작동시키거나 활성화시킴으로써 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
1가지 구체예에서, 활성화된 유전자는 선택가능 마아커 유전자의 증폭된 복사체를 함유하고 있는 세포가 이들 세포를 적절한 선택제의 존재하에서 배양함으로써 선택될 수 있는 특성을 갖는 선택가능 마아커 유전자를 포함시킴으로써 추가로 증폭될 수 있다. 증폭된 선택가능 마아커 유전자 가까이에 있거나 이것에 결합된활성화된 내인성 유전자도 증폭된 선택가능 마이커 유전자를 함유하는 세포에서 증폭될 것이다. 활성화된 내인성 유전자의 많은 복사체를 함유하고 있는 세포들은 시험관내 단백질 생성 및 유전자 치료법에 유용하다.
본 발명에 기재된 유전자 표적화 및 증폭은 단리 및 발현이 어려울 정도로 충분히 큰 전사 단위를 형성하는 유전자의 발현을 작동시키거나, 전체 단백질 코딩 영역이 이용가능하지 않거나 클로닝되어 있지 않은 유전자들은 작동시키는 데에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 동종 재조합을 사용하여 시험관내 단백질 제조를 위해 효모 또는 박테리아내로 전달되는 인트론이 없는 cDNA복사체로 유전자를 전환시키는 방법을 설명하고 있다.
본 발명의 트랜스펙팅된 세포들은 사람 및 동물에서의 여러가지 용도에서 유용하다. 1가지 구체예에서, 세포들은 사람 또는 동물에서의 단백질 전달을 위해 사람 또는 동물에 이식될 수 있다. 예를들면, 사람 성장 호르몬(hGH), 사람 EPO (hEPO), 사람 인슐리노트로핀 및 다른 단백질들은 치료를 목적으로 사람에게 전신적으로 또는 국소적으로 전달될 수 있다. 치료 생성물을 발현하는 트랜스펙팅된 세포들을 함유하며, 치료 생성물이 자유롭게 투과될 수 있는 장벽장치를 사용하여 생체내의 고정된 위치에서 세포들을 보유하기 위해 또는 숙주의 면역 시스템으로부터 세포들을 보호하고 격리시킬 수있다. 장벽장치는 특히 유용하며, 트랜스펙팅된 불멸화된 세포, 또 다른 종으로부터의 트랜스펙팅된 세포(트랜스펙팅된 이종세포), 또는 조직적합성 매치되지 않은 도너(donor)로부터의 세포(트랜스펙팅된 동종 세포)를 사람 또는 동물 질환의 치료를 위해 또는 농업적인 용도(예컨대 육류 및 유제품 제조)를 위해 이식될 수 있게 해준다. 장벽장치는 또한 치료가 어떠한 이유로 중단되어야 할 때 제거를 위해 세포에 대한 용이한 접근을 제공함으로써 편리한 단기간(즉, 일시적인) 치료법을 가능하게 한다. 트랜스펙팅된 이종 및 동종 세포들은 단기간 유전자 치료법에 사용될 수 있어서, 세포에 의해 생성된 유전자 생성물이 세포가 숙주의 면역 시스템에 의해 거부될때까지 생체내로 전달될 것이다.
본 발명의 트랜스펙팅된 세포들은 또한 항체 생성을 유도하거나 병원체에 대하여 사람 및 동물을 면역시키는 데에 유용하다. 이식된 트랜스펙팅된 세포들은 숙주의 세포성 및 체액성 면역반응의 자극을 유발하는 면역화 항원들을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들 면역반응들은 장래의 감염성 병원체로부터 숙주를 보호하기 위해(즉, 백신접종을 위해), 진행중인 감염에 대해 유도된 질병에 대항하여 싸우는 능력을 자극하고 증대시키기 위하여, 또는 치료 또는 진단 목적에 유용할 수 있는 트랜스펙팅된 세포들에 의해 생체내 생성된 항원에 대해 유도된 항체들을 생성시키기 위하여 디자인될 수 있다. 제거가능한 장벽장치들은 항원에 대한 노출을 종결시키는 간단한 수단을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또는 달리, 궁극적으로는 거부될 세포들(이종 또는 동종 트랜스펙팅된 세포들)을 사용하여 항원에 대한 노출을 제한할 수 있는데, 이는 세포가 거부되는 경우 항원 생성이 정지될 것이기때문이다.
본 발명의 방법들은 이들에 제한되는 것은 아니지만, 호르몬, 시토카인, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 또는 안티-센스 RNA를 포함하여 광범위한 치료적으로 유용한 생성물들을 생성하는 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법들은 치료 생성물의 시험관내 제조 또는 유전자 치료요법에 유용한 자연적으로 발생하지 않는 리보자임, 단백질, 또는 핵산들을 생성하는 세포들을 제조하기 위해 이용될 수 있다.
제 1도는 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 조절을 받는 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pXGH5를 나타내는 개략도이다.
제 2도는 플라스미드 pcD 의 BamHI에 부위안에 삽입된 플라스미드pSV2neo로부터의 neo 코딩 영역(BamHI-Bglll 단편) ; pBR322 로부터의 pBR322Ori 서열 및 Amp-R; 및 SV40 으로부터의 폴리A, 16s 스플라이스 접점 및 초기 프로모터 영역을 포함하는 플라스미드 pcDNEO 를 나타내는 개략도이다.
제 3도는 플라스미드 pXEPO1 을 나타내는 개략도이다. 진한 검은색 부채꼴 모양은 pUC12 골격을 나타내고, 화살표는 암피실린 내성 유전자의 전사방향을 나타낸다. 사선이 그어져 있는 부채꼴 모양은 마우스 메탈로 티오네인 프로모터(pmMT1)를 나타낸다. 검은색 네모가 중간에 끼어 있는 빈 부채꼴 모양은 사람 에리트로포이에틴 EPO 유전자를 나타낸다(검은색상자는 엑손을 나타내며 화살표는 hEPO 전사방향을 나타낸다). 제한 엔도누클레아제 인지 부위들의 상대적인 위치들도 표시되어 있다.
제 4도는 플라스미드 pE3neoEPO를 나타내는 개략도이다. 사람 에리트로포이에틴 유전자 및 neo 및 amp 내성 유전자들의 위치가 표시되어 있다. 화살표는 다양한유전자들의 전사 방향을 나타낸다. pmMT1은 마우스 메탈로티오네인 프로모터(hEPO 발현을 구동시킴)를 나타내고 pTk 는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터(neo 발현을 구동시킴)를 나타낸다. 지도의 점선 영역들은 사람 HPRT서열의 위치들을 나타낸다. 제한 엔도누클레아제 인지 부위들의 상대적인 위치가 표시되어 있다.
제 5도는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키기 위한 스트래티지의 개략적인 다이아그램이다. 가는 선은 hEPO 서열을 나타내고 ; 굵은 선은 마우스 메탈로티오네인 1 프로모터를 나타내며 , 사선이 그어진 상자는 hGH 의 5'의 번역되지 않은 영역을 나타내고 ; 검은색 상자는 hGH 엑손 1을 나타내고; 흰색 상자는 hEPO 코딩 서열을 나타내며 , Hlll 는 Hindlll 부위를 나타낸다.
제 6도는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키기 위한 스트래티지의 개략적인 다이아그램이다. 가는 선은 hEPO 서열을 나타내고 ; 굵은 선은 마우스 메탈로티오네인 1 프로모터를 나타내며 ; 사선이 그어진 상자는 hGH 의 5'쪽의 번역되지 않은 영역을 나타내고 ; 검은색 상자는 hGH 엑손1 을 나타내며 ; 사선이 그어진 상자는 hEPO 인트론 1 로부터의 10bp 링커를 나타내고 ; 교차로 사신이 그어진 상자는 hEPO의 5'쪽의 번역되지 않은 영역을 나타내며 ; 흰색 상자는 hEPO코딩서열을 나타내고 ; Hlll 는 Hindlll 부위를 나타낸다.
제 7도는 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.44μM 의 메토트렉세이트에서 단계적인 선택에 적용된 표적화된 사람 세포계통에서의 에리트로포이에틴 발현을 나타내는 그래프이다.
제 8도는 플라스미드 pREPO4를 나타내는 개략도이다.
발명의 개관
본 발명 및 본원에 참고로 포함된 출원들에 기재되어 있는 방법들은 임상적적으로 유용한 생성물을 코드화하는 외인성 유전물질(DNA또는 RNA)로 트랜스펙팅된 척추동물, 특히 포유동물 기원의 트랜스펙팅된 일차, 이차, 및 불멸화된 세포, 일차, 이차, 및 불멸화된 세포들이 외인성 유전물질을 포함하도록 트랜스펙팅되는 방법, 외인성 유전물질을 발현하는 클론성 세포 스트레인 또는 이종 세포 스트레인을 제조하는 방법, 본 발명의 트랜스펙팅된 세포의 사용을 통해 유용한 생성물이 요구되는 개체에게 생리적으로 유용한 양으로 임상적으로 유용한 생성물을 제공하는 방법, 트랜스펙팅된 세포들에 의하여 발현된 생성물과 항원적으로 관련된 에피토프를 발현하는 병원성 바이러스 또는 미생물 병원체에 대해 보호하기 위하여 동물을 백신접종하는 방법, 및 트랜스펙팅된 일차, 이차, 및 불멸화된 세포들에 의하여 만들어진 생성물에 대해 유도된 항체를 제조하는 방법들에 관한 것이다. 임상적으로 유용한 생성물은 트랜스펙팅된 세포로부터의 정제에 의하여 시험관내에서 생성되거나 사람이 아닌 동물 또는 사람에 이식함으로써(즉, 유전자 치료법)생체내에서 생성될 수 있다. 시험관내에서 생성되든지 또는 생체내에서 생성되든지 간에, 임상적으로 유용한 생성물은 호르몬, 시토카인, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 안티-센스 RNA 를 포함할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 방법은 자연적으로 발생하지 않는 리보자임, 단백질, 또는핵산을 생성시키는 세포를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 척추동물, 특히 포유동물 기원의 세포에서 유전자 또는 DNA 를 표적화화는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 예정된 부위에서 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포의 게놈 DNA 안에 도입되는 DNA 의 표적화 또는 동종 재조합을 통해서 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에 DNA를 도입시키는 방법에 관한 것이다. 사용되는 표적화 서열은 외인성 DNA 가 삽입될 부위(를 참조로 하여 선택된다)에 의해 결정된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 동종 재조합(HR)일차, 이차, 또는 불멸화된 세포라 명명되는 동종 재조합된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포 및 HR 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 척추동물 기원의 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에는 존재하지만, 세포에서 정상적으로 발현되지 않거나 또는 상당한 수준으로 발현되지 않는 유전자를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 유전자가 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 명백한 수준 보다 더 높은 수준으로 발현 되게 하거나 유전자가 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 명백한 패턴과는 상이한 조절 또는 유도패턴을 나타내게 하는 조절 서열로 유전자와 정상적으로 결합된 조절영역을 대체 또는 무력화시키기 위하여 동종 재조합 또는 표적화가 사용된다. 그러므로, 본 발명은 트랜스펙팅된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에서 원하는 생성물을 코드화하는 내인성 유전자를 활성화 시킴으로써 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
외인성 DNA가 트랜스펙팅된(수용체) 세포의 게놈 DNA와 동종 재조합되는 여러 개의 구체예들이 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 외인성 DNA가 도입되면 정상적으로 발현되지 않거나 또는 시험관내 단백질 제조 또는 유전자 치료법에는 유용하지 않을 정도의 너무 낮은 수준으로 발현되는 유전자의 활성화가 초래된다. 두 번째 구체예에서, 치료적으로 활용성이 있는 생성물을 코드화하는 서열들은 수용체 세포의 게놈의 예정된 부위에서 동종 재조합을 통해 수용체 세포 게놈내에 통합되도록 유도되어, 통합 부위가 정확하게 공지되고, 이 부위가 바람직한 특성에 대해 선택될 수 있게 한다(예컨대, 이 부위는 외인성 DNA를 고수준으로 발현시킴).
세 번째 구체예에서, 본 발명은 트랜스펙팅된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에서 원하는 생성물을 코드화하는 내인성 유전자를 활성화시키고(즉, 작동시키고) 증폭시키는 방법을 설명한다. 즉, 본 발명은 내인성 유전자와 정상적으로 기능적으로 결합되어 있지 않고 (1) 내인성 유전자에 또는 그 가까이에서 숙주 게놈에 삽입되는 경우 내인성 유전자의 발현을 변경(즉, 활성화)시키는 작용을 하며, 추가로 (2) 활성화된 내인성 유전자가 증폭되는 세포를 선택하게 해줄 수 있는 DNA서열들을 게놈 DNA와의 동종 재조합에 의하여 도입시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 유용한 증폭가능 DNA 서열들로는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 선택가능 마아커인 디하이드로 플레이트 환원효소, 아데노신 아미노기이탈효소, CAD 유전자(카르바모일 포스페이트 합성효소, 아스파테이트 트랜스카르바밀라아제, 및 디히드로오로타아제의 삼중기능성 단백질을 코드화함)를 코드화하는 서열들이 있다. 다른 증폭가능 서열들 및 이들 서열들의 개선된 변형체가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 선택가능 마아커를 코드화하는 증폭가능한 DNA 서열 및 내인성 유전자의 발현의 조절을 변경시키는 DNA 서열이 세포 게놈의 예정된 부위에서 게놈 DNA 서열과 상동인 DNA 서열과 함께 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포에 도입된다. 이러한 부위는 일반적으로 치료 생성물을 코드화하는 유전자내에 있거나 이 유전자의 업스트림에 있거나, 원하는 유전자의 기능에 영향을 미치는 부위에 있다. 내인성 유전자의 발현을 변경시키는 DNA 서열, 선택가능한 마아커를 코드화하는 증폭가능 서열, 및 게놈DNA 의 예정된 부위와 상동인 서열들은 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포안에 단일 DNA 구성물로서, 또는 트랜스펙팅된 세포의 게놈에서 물리적으로 결합되는 별도의 DNA 서열로서 도입될 수 있다. 또한, DNA 는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 단일가닥 영역이 있거나 없는 선형의 이중가닥 DNA 로서 도입될 수 있거나, DNA 는 원형 DNA 로서 도입될 수 있다. 외인성 DNA가 세포안에 도입된 후, 세포는 게놈 DNA 와 도입된 DNA 의 부분 사이에서 동종 재조합이 일어나기에 적절한 조건하에서 유지된다. 게놈 DNA 와 도입된 DNA 사이의 동종 재조합은 내인성 유전자의 발현을 변화시키는 서열, 및 선택가능 마아커를 코드화하는 증폭가능 서열에 치료 생성물을 코드화하는 내인성 유전자에 작동가능하게 결합된, 동종 재조합된 일차, 이차, 또는 불멸화된 세포를 초래한다. 생성된 동종 재조합 세포를 선택가능 마아커를 코드화하는 증폭가능 DNA의 증폭을 선택하는 조건하에서 배양하면, 증폭된 선택가능 마아커 및 발현이 변화되어 있는 공동 증폭된 내인성 유전자를 함유하는 세포가 생성된다. 이 방법에 의해 제조된 세포들은 치료 단백질의 발현에 적절한 조건하에서 배양될 수 있어서, 치료 단백질을 시험관내에서 생성하거나, 세포들은 치료 단백질의 생체내 전달(유전자 치료법)에 사용될 수 있다.
추가의 구체예들도 가능하다. 표적화 사건은 조절서열의 단순한 삽입일 수 있으며, 이로 인해 내인성 유전자가 새로운 조절 서열의 조절하에 놓이게 된다(예를들어, 내인성 유전자의 업스트림 위치에서 프로모터 또는 인핸서, 또는 둘 모두의 삽입에 의함). 표적화 사건은 조직-특이성 네가티브조절 엘레먼트의 결실과 같은 조절 요소의 간단한 결실일 수 있다. 표적화 사건은 기존의 엘리먼트를 대체할 수 있으며; 예컨대 조직-특이적 인핸서는 자연적으로 발생하는 엘리먼트 보다 더 광범하거나 이와는 상이한 세포-타입 특이성을 가지거나 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포와 상이한 조절 또는 유도 패턴을 나타내는 인핸서에 의해 대체될 수 있다. 이 구체예에서, 자연적으로 발생하는 서열들은 결실되고 새로운 서열들이 첨가된다. 모든 경우에, 표적화 사건의 확인은 표적화 DNA 와 물리적으로 결합되어 있는 하나 이상의 선택가능 마아커 유전자를 사용함으로써 촉진될 수 있으며, 이는 외인성 DNA가 숙주 세포 게놈안에 통합되어 있는 세포들의 선택을 가능하게 해준다. 표적화 사건의 확인은 또한 네거티브 선택의 특성을 나타내는 하나 이상의 마커 유전자의 사용에 의해 용이해질 수 있으며, 네가티브적으로 선택가능한 마아커는 외인성 DNA에 결합되지만, 네가티브적로 선택가능한 마아커가 표적화 서열을 플랭킹되도록 배열되고, 숙주세포 게놈의 서열과의 정확한 동종 재조합이 네가티브적으로 선택가능한 마아커의 안정한 통합을 유발하지 않는다. 이러한 목적에 유용한 마아커로는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 유전자 또는 박테리아 크산틴-구아닌 포스포리보실-트랜스퍼라아제(9pt) 유전자가 있다.
본 발명은 또한 동종 재조합을 사용하여 유전자를 cDNA복사체(인트론이 없는 유전자 복사체)로 전환시키는 방법에 관한 것이다. cDNA복사체는 시험관내 단백질 제조를 위해 효모 또는 박테리아안에 전달될 수 있거나 cDNA복사체는 단백질 제조를 위해 포유동물 세포안에 삽입될 수 있다. 만약 cDNA 가 미생물 세포에 전달되는 경우, 표적화 서열들 함유하고 있는 2개의 DNA 구성물(하나는 치료 단백질을 코드화하는 사람 유전자의 업스트림에 있고 나머지 하나는 다운스트림에 있음)를 동종 재조합에 의해 도입된다. 업스트림에 도입된 서열들은 성숙한 프로세싱된 치료 단백질의 제 1 아미노산을 코드화하는 DNA에 있거나 이의 업스트림에 있는 게놈 DNA 서열과 상동인 DNA 서열 ; 레트로바이러스 LTR , 미생물 세포에서 선택하기 위한 마아커를 코드화하는 서열 ; 미생물 세포에서 작용하는 조절 엘리먼트 ; 및 미생물 세포로부터의 분비를 촉진하는 리더 펩티드를 코드화하는 DNA를 포함한다. 업스트림에 도입된 서열은 성숙한 프로세싱된 치료 단백질의 제 1 아미노산을 코드화하는 게놈 DNA와 인접한 위치 또는 이의 업스트림에 도입된다. 다운스트림에 도입된 서열들은 성숙한 프로세싱된 단백질의 최종 아미노산을 코드화하는 DNA에 있거나 이의 다운스트림에 있는 게놈 DNA서열에 상동인 DNA 서열 ; 미생물의 전사 종결 서열 ; 미생물 세포에서 DNA 복제를 유도할 수 있는 서열 ; 및 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
다운스트림에 도입된 서열들은 성숙한 프로세싱된 치료 단백질의 정지 코돈을 코드화하는 DNA 에 인접한 위치 또는 이의 다운스트림에 도입된다. 각각의 DNA 구성물이 세포안에 도입된 후, 세포들은 도입된 DNA 와 게놈 DNA 사이의 동종 재조합에 적합한 조건하에서 유지됨으로써 동종 재조합 세포들을 생성한다. 임의로, DNA구성물중 하나 또는 둘다는 DNA구성물을 함유하는 세포들의 포지티브 또는 네가티브 선택을 위한 하나 이상의 마아커를 코드화할 수 있고, 선택 단계는 DNA 구성물중 하나 또는 둘 모두가 세포안에 도입된 후에 방법에 추가될 수 있다. 또한, 미생물 세포에서 선택을 위한 마아커를 코드화하는 서열 및 미생물 세포에서 DNA복제를 유도할수 있는 서열은 둘 모두 표적화 구성물의 업스트림 또는 다운스트림에 존재 할 수 있거나 미생물 세포에서 선택을 위한 마아커는 표적화 구성물의 다운 스트림에 존재할 수 있고 미생물 세포에서 DNA 복제를 유도할 수 있는 서열들은 표적화 구성물의 업스트림에 존재할 수 있다. 그런 다음 동종 재조합 세포들은 치료 단백질을 코드화하는 유전자의 RNA 생성물의 LTR 유도된 전사, 프로세싱 및 역전사에 적절한 조건하에서 배양된다. 역전사의 생성물은 상술된 2개의 외인성 DNA구성물을 포함하는 DNA 서열들에 작동가능하게 결합되어 있는 치료 단백질을 코드화하는 인트론이 없는 DNA 복사체를 포함하는 DNA구성물이다. 그런 다음, 본 방법에 의해 제조된 인트론이 없는 DNA구성물은 미생물 세포안에 도입된다. 그런 다음 미생물 세포들은 치료 단백질의 발현 및 분비에 적절한 조건하에서 배양된다.
트랜스펙팅된 세포
본원에서 사용되는 바와같이, 용어 일차 세포는 척후동물 조직원(플레이팅되기 전, 즉 디쉬 또는 플라스크와 같은 조직배양 기질에 부착되기 전)으로부터 단리된 세포의 현탁액에 존재하는 세포, 조직으로부터 유래된 체외 이식편에 존재하는 세포, 최초로 플레이팅된 앞의 둘 모두의 세포 유형 및 이러한 플레이팅된 세포로부터 유래된 세포 현탁액을 포함한다. 용어 2 차 세포 또는 세포 스트레인은 배양 동안의 모든 후속 단계에 있는 세포들을 말한다. 즉, 플레이팅된 일차 세포가 배양 기질로부터 분리되고 리플레이팅되는(계대) 최초 시점, 이것을 본원에서 이차 세포라 하며 후속되는 계대의 모든 세포들을 말한다. 이차 세포는 1회 이상 계대된 이차 세포로 구성된 세포 스트레인이다. 세포 스트레인은, 1) 1회 이상 계대되었고 ; 2) 배양중에 유한수의 평균 군집 배가를 나타내며 ; 3) 접촉-억제된 앵커리지 의존성 성장(앵커리지 의존성은 현탁 배양중에 증식되는 세포에는 적용되지 않는다)을 나타내고 ; 그리고 4) 불멸화되지 않는 이차 세포로 구성된다.
본 발명의 방법에 의해 트랜스펙팅된 세포는 다음의 4가지 유형 또는 카테고리에 속한다 : 1) 얻어지는 대로 치료 생성물을 만들거나 함유하지 않는 세포 ; 2) 치료 생성물을 만들거나 함유하지만, 정상적인 것보다 양이 적거나(생리적으로 정상의 저수준 보다 적은 양) 결합이 있는 형태로 만들거나 함유하는 세포 ; 3) 생리적으로 정상적인 수준으로 치료 생성물을 만들지만, 그것들의 함량 또는 생산양이 증대되거나 증가되는 세포 ; 및 4) 치료 생성물을 코드화하는 유전자의 조절 또는 유도패턴을 변화시키는 것이 바람직한 세포.
본 발명의 방법에 의해 트랜스펙팅될 일차 및 이차 세포는 다양한 조직으로부터 얻어질 수 있고 배양중에 유지될 수 있는 모든 세포유형을 포함 할 수 있다. 예를들면, 본 방법에 의해 트랜스펙팅될 수 있는 일차 및 이차 세포로는 섬유아세포, 각질세포, 상피세포(예컨대 포유동물 상피세포, 장 상피세포), 내피세포, 교질세포, 신경세포, 혈액의 유형성분(예컨대 림프세포, 골수세포), 근세포 및 이들 체세포 타입의 전구체가 있다. 일차 세포는 트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포가 투여되는 개체로부터 얻어지는 것이 바람직하다. 그러나, 일차 세포들은 동일 종 또는 다른 종(예컨대 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 소, 새, 양, 염소, 말)의 도너(수용체 이외의)로부터 얻어질 수 있다.
트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포들은 표현형 선택이 있거나 없이 제조되었고, 예를들면 hGH, EPO 및 인슐리노트로핀을 포함하는 치료 생성물을 코드화하는 외인성 DNA를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
불멸화된 세포들은 또한 본 발명의 방법에 의하여 트랜스펙팅될 수 있고 단백질 제조 또는 유전자 치료법에 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 단백질 제조 또는 유전자 치료법에 유용한 불멸화된 사람 세포 계통의 예로는 이들에 한정되는 것은 아니지만, HT1080, HeLa, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종 세포, 2780AD 난소 암종 세포, 라지(ATCCCCL 86) 세포, 쥬르카트(Jurkat)(ATCC TlB 152) 세포, 나말와(ATCC CRL 1432) 세포, HL-60(ATCC CCL 240) 세포, 다우디(ATCC CCL 213) 세포, RPMl 8226(ATCC CCL 155) 세포 및 MOLT-4 (ATCC CRL 1582) 세포가 있다. 다른 종으로부터 불멸화된 세포(예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포 또는 마우스 L세포)가 시험관내 단백질 제조 또는 유전자 치료법에 사용될 수 있다. 또한, 일차 또는 이차 사람세포 뿐만 아니라 시험관내에서 유전자 증폭 특성을 나타내는 다른 종으로부터의 일차 또는 이차 세포도 시험관내 단백질 제조 또는 유전자 치료법에 사용될 수 있다.
외인성 DNA
본 발명의 방법에 의해 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들에 통합되는 외인성 DNA 는 1) 기존의 질환을 치료하거나 또는 질환의 발생을 예방하기에 유용한 단백질 생성물 또는 RNA 생성물(예컨대 hGH, EPO 또는 인슐리노트로핀)과 같은, 세포내에서의 발현이 요구되는 전사 또는 번역 생성물, 또는 번역 또는 전사 생성물의 일부를 코드화하는 DNA 이거나, 2) 기존의 질환을 치료하거나 또는 질환이 발생하는 것을 방지하기에 유용한 전사 조절 서열 또는 DNA와 같은 유전자 생성물을 코드화하지는 않지만 그 자체가 유용한 DNA 이다.
일차, 이차 또는 불멸화된 세포안에 트랜스펙팅된 DNA는 전체의 원하는 생성물을 코드화할 수 있거나 예를들어 생성물의 활성 또는 기능성 부분(들)을 코드화할 수 있다. 생성물은 예를들면, 호르몬, 시토카인, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사인자, 안티-센스 RNA, 또는 리보자임일 수 있다. 부가적으로, 생성물은 자연적으로 발생하지 않는 단백질 또는 핵산(즉, 신규한 단백질 또는 신규한 핵산)일 수 있다. DNA는 자연히 발생하는 공급원으로부터 수득할 수 있거나 유전공학적 기법 또는 합성 프로세스를 사용하여 생성할 수 있다. DNA는 하나 이상의 치료 생성물을 코드화할 수 있다. 트랜스펙션 후, 외인성 DNA는 수용 세포의 게놈안에 (사용된 DNA 구성물에 존재하는 어떠한 추가의 서열과 함께) 안정하게 통합되고, 이로부터 발현되거나 다른 방식으로 기능한다. 또는 달리, 외인성 DNA는 에피솜적으로 세포내에 존재하는 DNA를 표적화하기 위하여 사용될 수 있다.
원하는 생성물을 코드화하는 DNA는 유도가능한 프로모터의 조절을 받는 세포안으로 도입될 수 있으며, 그 결과 생성된 세포 또는 개체안으로 도입된 세포들은 생성물을 발현하지는 않지만 그렇게 되도록 유도될 수 있다(즉, 생성은 트랜스펙팅된 세포들이 생성된 후이지만 이식전에 또는 이식 후에 유도된다). 물론 원하는 생성물을 코드화하는 DNA 는 그것이 도입시 발현되는 방식으로(즉, 유도없이) 세포안에 도입될 수 있다.
본원에서 알 수 있는 바와같이, 유전자 표적화는 유전자의 기존의 조절영역을, 상이한 유전자로부터 단리된 조절서열 또는 유전공학적 방법에 의하여 합성된 신규한 조절서열로 대체하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 조절서열은 프로모터, 인핸서, 스카폴드-부착 영역, 네가티브 조절 엘리먼트, 전사 개시 부위, 조절 단백질 결합부위 또는 상기 서열들의 조합물로 이루어질 수 있다 (또는 달리, 생성된 RNA 또는 단백질의 구조 또는 안정성에 영향을 미치는 서열들은 표적화에 의해 대체되거나, 제거되거나, 첨가되거나 다른 방식으로 변형될 수 있으며, 이러한 서열로는 단백질의 운반 또는 분비 성질을 향상시키거나 조절하기 위한 폴리아데닐화 신호, mRNA 안정성 요소, 스플라이스 부위, 리더 서열들을 포함하거나 단백질 또는 RNA 분자의 기능 또는 안정성을 변경 또는 개선시키는 그 밖의 서열들이 있다). 이 방법에 따르면, 외인성 DNA 의 도입은 내인성 (게놈) 서열의 전부 또는 일부를 대체시키거나 그렇지 않으면 내인성 서열의 기능을 파괴함으로써 내인성 유전자의 발현을 조절하는 내인성 서열의 무력화를 유발한다. 표적화가 단백질 코딩 도메인을 대체시키기 위하여 사용되는 상황에서, 2 이상의 단백질로부터의 구조적, 호소적, 또는 리간드 또는 수용체 결합 성질을 하나의 폴리펩티드안에 조합시킨 다기능성키메라 단백질이 제조될 수 있다.
선택가능 마아커
다양한 선택가능 마아커들은 일차, 이차 또는 불멸화된 세포내로 통합될 수 있다. 예를 들면, 약물 내성, 영양 요구성, 세포독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 선택가능 마아커들이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 선택가능 마아커 유전자들로는 neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, CAD, 및 hisD 가 있다. 부여된 선택가능 표현형은 수용 세포의 확인 및 단리를 가능하게 해준다. 선택가능 마아커들을 코드화하는 증폭가능 유전자들(예컨대, 카르바밀 포스페이트 합성효소, 아스파르트산염 트랜스카르바밀라아제, 및 디하이드로-오로타아제를 코드화하는 다기능성 CAD 유전자, ada 및 dhfr)은 게놈안에 삽입된 선택가능 마아커의 증폭된 복사체를 함유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 추가의 특성을 갖는다. 이 특성은 증폭이 요구되는 인접한 유전자 또는 결합된 유전자의 복사체 수를 상당히 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
선택가능 마아커들은 2가지의 카테고리, 즉, 포지티브 선택성 및 네가티브 선택성으로 나뉘어지며, 이는 각각 포지티브 선택을 위한 마커 및 네거티브 선택을 위한 마커이다. 포지티브 선택에서, 포지티브 선택가능 마아커를 발현하는 세포들은 선택제로 처리하는 경우 생존할 수 있다(예를 들면, neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, mdrl 및 hisD). 네가티브 선택에서, 네가티브 선택가능 마아커를 발현하는 세포들은 선택제가 존재할 때 파괴된다(예를 들면, tk, gpt).
DNA 구성물
외인성 DNA 및, 임의로 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA를 수용 세포에서의 외인성 DNA의 발현에 필요한 추가 서열과 함께 포함하는 DNA 구성물이 코드화된 생성물이 생성되는 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들을 트랜스펙팅시키기 위하여 사용된다. DNA 구성물은 또한 숙주 세포 DNA 와의 동종 재조합을 위한 표적화 서열을 포함할 수 있다. 유전자 생성물(치료 생성물)을 코드화하지 않는 외인성 DNA 서열 및 임의로, 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA 를 포함하는 DNA 구성물이 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들을 트랜스펙팅시키기 위하여 사용될 수 있다. DNA구성물은 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 인산 칼슘 침전, 및 리포솜- 폴리브렌- 또는 DEAE 덱스트란-매개된 트랜스펙션을 포함하는 다양한 방법에 의해 세포안으로 도입될 수 있다. 또는 달리, 레트로바이러스, 헤르페스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-관련된 볼거리(mumps) 및 폴리오바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터들이 DNA를 도입시키기 위하여 사용될 수 있다.
1가지 구체예에서, DNA 구성물은 외인성 DNA, 및 일반적으로 외인성 DNA 서열의 양쪽 말단에 위치한 하나 이상의 표적화 서열을 포함한다.
표적화 서열들은 수득되는 세포의 게놈에 정상적으로 존재하는 DNA 서열들이다(예컨대 필수 유전자, 비필수 유전자 또는 비코드화 DNA, 또는 사전변형을 통해 게놈안에 존재하는 서열들). 그러한 구성물은 호르몬, 시토카인, 항원, 항체, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 안티-센스 RNA, 리보자임 또는 자연적으로 발생하지 않는 단백질 또는 핵산과 같은 치료 생성물을 코드화하는 외인성 DNA를 (수용 세포의 게놈의 예정된 부위에) 통합시키는데 유용하다. 특히, 외인성 DNA 는 다음의 것들중 하나를 코드화할 수 있다 : 인자 VIII, 인자 IX, 에리트로포이에틴, 알파-1 안티트립신, 칼시토닌, 글루코세레브로시다아제, 성장 호르몬, 저밀도 지단백질(LDL) 수용체, 아포리포단백질(예컨대, 아포리포단백질 E 또는 아포리포단백질 A-I), IL-2 수용체 및 이것의 길항물질, 인슐린, 글로빈, 면역글로불린, 촉매성 항체, 인터루킨, 인슐린-유사 성장 인자, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 면역 반응 변형물질, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 신경 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성물질, 및 콜로니 자극 인자, 및 개선되거나 신규한 생물학적 특성 또는 보다 바람직한 생체내 반감기 또는 교체 시간을 가지는 상기 단백질들의 변이체. 그러한 구성물은 또한 치료 생성물인 외인성 DNA, 예컨대 트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포에서 단백질 또는 핵산의 격리에 충분한 DNA 서열들, 세포 조절 단백질에 결합하는 DNA서열들, 이차 또는 삼차 염색체 구조를 변경시키는 DNA 서열들 및 일차 또는 이차 세포들의 게놈 DNA 안으로 도입되는 전사 조절 엘리먼트인 DNA 서열들을 (수용 세포의 게놈의 예정된 부위에) 통합시키는데 유용하다.
외인성 DNA, 표적화 서열들 및 선택가능 마아커는 단일 DNA구성물의 형태로 또는 별도의 구성물로 세포에 도입될 수 있다. DNA구성물의 총길이는 성분들(외인성 DNA, 표적화 서열 및 선택가능 마아커)의 수 및 각각의 길이에 따라 변할 것이다. 전체 구성물의 길이는 일반적으로 최소한 20 누클레오티드일 것이다. 외인성 DNA가 동종 재조합을 진행시키기 위하여 게놈 DNA 와의 충분한 상동성을 가지는 구성물의 경우, 구성물은 단일 성분, 즉 외인성 DNA 를 포함할 것이다. 이 구체예에서, 외인성 DNA 는 그것의 상동성 때문에 또한 게놈 DNA 안으로의 통합을 표적화하는 작용을 하며, 추가의 표적화 서열은 불필요하다. 그러한 구성물은 전체 유전자, 유전자 부분, 조절 엘리먼트 또는 그것의 일부분 또는 제거되는 경우 근접한 조절 및 구조 서열을 기능적으로 근접한 위치에 정위시키는 DNA의 영역과 같은 잔류 DNA 서열을 녹아웃(knock-out)시키거나, 대체시키거나 수복시키는데 유용하다. 또한 그런 구성물은 외인성 DNA 가 결합된 서열들의 선택 또는 증폭에 유용한 마아커를 함유하는 경우에 유용하다.
두 번째 구체예에서, DNA 구성물을 외인성 DNA, 표적화 DNA 서열들 및 최소한 하나의 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA를 포함한다. 이 두번째 구체예에서, 구성물 성분들의 순서는 다음과 같을 것이다 : 표적화 서열 - 외인성 DNA - 선택가능 마아커(들)를 코드화하는 DNA - 표적화 서열. 이 구체예에서, 하나 이상의 선택가능 마아커들이 구성물에 포함되며, 이는 선택가능 표현형을 토대로 한 선택을 가능하게 해준다. 구성물을 안정하게 통합시킨 세포들은 선택제를 사용할 때도 생존할 것이며, 안정하게 트랜스펙팅된 세포들의 서브세트는 HR 세포이며, 이는 PCR, 서던 혼성화 및 표현형 스크리닝을 포함하는 다양한 기법에 의하여 확인될 수 있다.
세 번째 구체예에서, DNA 구성물안의 성분들의 순서는 다음과 같다: 표적화 서열 - 선택가능 마아커 1 - 표적화 서열 - 선택가능 마아커 2. 이 구체예에서 선택가능 마아커 2 는 네가티브 선택의 성질을 나타낸다. 즉, 선택가능 마아커 2의 유전자 생성물은 선택가능 마아커 2를 발현하는 세포를 치사시키는 제제(전형적으로는 약물 또는 대사물질 유사체)를 함유하는 적절한 배지 포뮬레이선에서의 성장에 의하여 선택될 수 있다. 선택가능 마아커 1을 플랭킹하는 표적화 서열과 숙주세포 게놈안의 상동성 서열 사이의 재조합은 선택가능 마아커 1 의 표적화된 통합을 초래하지만, 선택가능 마아커 2 는 통합되지 않는다. 그러한 재조합 사건은 선택가능 마아커 1 로는 안정하게 트랜스펙팅되지만 선택가능 마아커 2 로는 안정하게 트랜스펙팅되지 않는 세포들을 발생시키고, 그러한 세포들은 선택가능 마아커 1을 선택하는 선택제 및 선택가능 마아커 2에 반하여 선택하는 선택제를 함유하는 배지에서의 성장에 의하여 선택될 수 있다.
네 번째 구체예에서는 DNA구성물은 증폭된 복사체 수의 포지티브선택가능 마아커를 함유하고 있는 세포들의 선택을 가능하게 해주는 포지티브 선택가능 마아커를 포함한다. 그러한 마아커의 증폭은 플랭킹 DNA 서열들의 공동 증폭을 초래한다. 이 구체예에서, 구성물의 성분들의 순서는 예를 들면 다음과 같다 . 표적화 서열 - 증폭가능한 포지티브 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA - 제 2 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA(임의적임) - 적당한 프로모터 또는 내인성 유전자만을 활성화시키기 위하여 위치된 프로모터의 조절하에 발현될 내인성 유전자에 상응하는 DNA 서열 - 표적화 DNA서열.
DNA 구성물은 외인성 DNA 의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 포함하여 유도성 발현을 가능하게 해준다. 임의로, DNA구성물은 박테리아 복제기원 및 박테리아 항생물질 내성 마아커들을 포함할 수 있으며, 이는 박테리아에서의 대규모의 플라스미드 증식을 가능하게 해준다. 선택가능 마아커를 코드화하는 DNA를 추가의서열들, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 부위 및 스플라이스 접합부와 함께 포함하는 DNA 구성물은 트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포에 선택가능 표현형을 부여하기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, 제 2도에 개략적으로 도시된 플라스미드 pcDNEO). 그러한 DNA 구성물은 본원에 기재된 방법을 사용하여 표적화 DNA 서열과 함께 일차 또는 이차 세포안으로 코트랜스펙션(co-transfection)될 수 있다.
DNA 구성물의 모든 구체예에서, 외인성 DNA는 하나 이상의 생성물을 코드화할 수 있으며, 하나 이상의 치료 생성물일 수 있거나 각각의 생성물일 수 있으며, 이로써 다수의 생성물의 전달을 가능하게 해준다.
트랜스펙팅된 세포들의 용도
본원에 기재된 방법 및 DNA 구성물을 사용하여 제조된 세포들은 광범위한 용도로 사용될 수 있다. 1) 수용 세포에 이미 존재하는 DNA 가 수복, 변경, 결실 또는 대체되거나 ; 2) 치료 생성물(또는 다른 원하는 생성물)을 코드화하거나 그 자체가 치료 생성물인 유전자 또는 DNA 서열이 수용 세포의 게놈내로 예정된 부위에 도입되거나 ; 3) 일차, 이차 또는 불멸화된 세포 수용체에 존재하는 조절서열이 수복, 변경, 결실 또는 대체되어 있거나 ; 4) 전체 유전자 또는 유전자 일부가 수복, 변경, 결실 또는 대체되어 있는, 척추동물 기원의 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들이 제조될 수 있다. 동종 재조합은 또한 조직적합성에 관여하는 세포 표면 마아커들이 변경, 결실 또는 대체되어 있거나 그러한 마아커들의 발현이 변경, 손상 또는 제거되어 있는 유니버셜 도너 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 세포들은 정제되고 통상적인 약제학적 경로에 의해 전달될 수 있는 치료 생성물의 시험관내 제조에 유용하다. 예를 들면, 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 세포들은, 게놈 DNA 서열과 동종 재조합될 때 내인성 표적 유전자의 조절영역이 표적 유전자의 신규한 발현 및/또는 조절을 가능 하게 하여, 궁극적으로는 트랜스펙팅된 세포에 의한 치료적으로 유통한 생성물의 생성을 가능하게 하는 조절영역으로 대체되는 것을 초래하는 조절영역을 함유하는 외인성 DNA 로 트랜스펙팅될 수 있다. 활성화된 내인성 표적 유전자는 적절한 선택가능 마아커 유전자가 표적화 DNA 에 포함된다면 추가로 증폭될 수 있다. 증폭이 있거나 증폭없이, 이들 세포들은 세포내 또는 세포외 단백질 생성물을 수득하기 위해 대규모로 배양될 수 있다.
본 발명의 트랜스펙팅된 세포들은 트랜스펙팅된 일차 세포, 트랜스펙팅된 클론성 세포 스트레인, 트랜스펙팅된 이종 세포 스트레인의 군집으로서, 및 상술된 3가지의 카테고리의 트랜스펙팅된 세포들중 하나의 최소한 하나의 대표적인 세포가 존재하는 세포 혼합물로서, 1) 치료 단백질(예컨대 개체에 없거나, 개체의 생리적인 요구에 비하여 저수준으로 생성되거나, 결함이 있거나 또는 불충분하거나 또는 개체에서 부적절하게 활용되는 단백질 ;효소 기능 또는 수송 기능과 같은 신규한 기능을 가지는 단백질) 또는 2) 치료적 핵산(예컨대 조절 단백질에 결함하거나 그것을 격리시키는 DNA, 유전자 발현을 억제하거나 또는 고유의 효소적 활성을 갖는 RNA)중 어느 하나인 치료 생성물의 전달에 반응하는 비정상적인 또는 바람직하지 않은 질환에 걸린 개체를 치료하기 위한 전달 시스템으로서 유용하다. 치료 단백질 또는 핵산을 제공하는 본 발명의 방법에서, 트랜스펙팅된 일차 세포, 클론성 세포스트레인 또는 이종 세포 스트레인은 비정상적인 또는 바람직하지 않은 질환이 치료되거나 예방되어야 하는 개체에게, 생리적으로 관련된 수준으로 외인성 DNA를 발현하거나 그것을 활용가능하게 만들기에 충분한 양으로 및적절한 경로에 의하여 투여된다. 생리적으로 관련된 수준이란 생성물이 체내에서 생성되는 수준과 비슷한 수준 또는 비정상적이거나 바람직하지 않은 질환을 개선시키는 수준과 비슷한 수준을 말한다. 본 발명의 방법에서 투여된 세포들은 치료 생성물을 코드화하는 외인성 DNA, 그 자체가 치료 생성물인 외인성 DNA, 또는 동종 재조합을 통해 게놈 DNA 의 예정된 부위에 도입되어 수용 세포가 그 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 생성물을 생성하게 하거나 상응하는 형질전환되지 않은 세포에서 일어나는 것보다 더 높은 수준으로 생성물을 생성하게 하는 기능을 하는 조절서열과 같은 외인성 DNA로 트랜스펙팅된 세포들이다. 조절서열(예컨대 프로모터)이 도입되는 구체예에서, 조절서열은 유전자와 정상적으로 결합된 조절서열을 대체하거나 무력화시키고, 그 결과 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포에서 일어나는 것보다 더 높은 수준으로 유전자의 발현을 초래하거나 상응하는 트랜스펙팅되지 않은 세포와 상이한 조절 또는 유도 패턴을 가능하게 해준다.
치료 생성물을 생성하는 불멸화된 세포들은 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고, 1) 치료 단백질의 무작위 통합, 2) 치료 단백질을 세포의 게놈 안으로 표적화시키기 위한 동종 재조합, 3) 치료적으로 관심있는 유전자를 활성화시키거나 작동시키기 위한 동종 재조합, 또는 4) 세가지의 선행방법중 하나와 결합된 유전자 증폭에 의해 제조된 세포들에 의해 만들어진다면 유전자 치료법에 사용될 수 있다.본원에 기재된 발명에 따르면, 불멸화된 세포들은 많은 반투과성 장벽장치의 하나에 봉입된다. 그런 장치의 투과성 성질은 장치가 동물에 이식될 때 세포가 장치를 이탈하는 것을 방지하지만, 치료 생성물은 자유롭게 투과하여 장벽장치를 이탈하여, 이식편을 둘러 싸고 있는 국소 공간으로 들어가거나 전신적인 순환계로 들어갈 수 있도록 하는 정도이다. 이들에 한정되는 것은 아니지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 염화 폴리비닐 중합체 및 염화 폴리비닐 유도체의 중합체들을 포함하는 많은 여과막들이 이 목적에 사용될 수 있다. 또는 달리, 장벽장치들은 다른 종으로부터의 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들이 사람에서의 유전자 치료법에 사용되는 것을 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있다. 다른 종으로부터의 세포들의 사용은 비-사람 세포가 단백질 제조 목적에 유익한 경우 또는 비-사람 단백질이 치료적으로 유용한 경우, 예컨대 연어로부터 유도된 세포들이 연어 칼시토닌의 제조에 사용되는 경우 및 돼지로부터 유도된 세포들이 돼지의 인슐린을 제조하기 위하여 제조되는 경우에 바람직할 것이다.
사람 이외의 종으로부터의 세포들은 또한 시험관내 단백질 제조에 사용될 수 있다. 이들 세포들은 본원에 기재된 방법 및 본원에 참고로 기재된 미국 특허출원들에 기재된 방법들에 의해 제조된 치료 단백질을 생성하는 불멸화된 세포, 일차 세포, 또는 이차 세포일 수 있다. 상기의 치료 생성물은 1) 치료 단백질의 무작위 통합, 2) 치료 단백질을 세포의 게놈안으로 표적화시키기 위한 동종 재조합, 3) 치료적으로 관심있는 유전자를 활성화 또는 작동시키기 위한 동종 재조합, 또는 4)세가지의 선행방법중 하나와 결합된 유전자 증폭에 의해 제조된 세포들에 의해 만들어진다. 다른 종으로부터의 세포들을 사용하는 것은 사람 이외의 세포가 단백질 제조 목적에 유익한 경우(예컨대 CHO 세포)에 또는 사람 이외의 단백질이 치료적으로 또는 상업적으로 유익한 경우, 예컨대 연어로부터 유도된 세포들이 연어 칼시토닌의 제조에 사용되는 경우, 돼지로부터 유도된 세포들이 돼지의 인슐린을 제조하기 위하여 제조되는 경우, 및 소 세포들이 소의 성장 호르몬을 제조하기 위하여 사용되는 경우에 바람직할 수 있다.
본 발명의 트랜스펙팅된 세포들은 사람 및 동물에서의 많은 용도에서 유용하다. 한 구체예에서, 세포들은 사람 또는 동물에서의 단백질 전달을 위해 사람 또는 동물에 이식될 수 있다. 예를 들면, 사람 성장 호르몬(hGH), 사람 EPO (hEPO), 또는 사람 인슐리노트로핀은 치료를 목적으로 사람에게 전신적으로 전달될 수 있다. 치료 생성물이 자유롭게 투과하는 장벽 장치는, 생체내에서 세포를 고정된 위치에 보유하기 위해 또는 숙주의 면역 시스템으로부터 세포를 보호하고 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 장벽장치들은 특히 트랜스펙팅된 불멸화된 세포들, 또 다른 종으로부터의 트랜스펙팅된 세포들(트랜스펙팅된 이종 세포들), 또는 조직 적합적으로 매치되지 않는 세포들(트랜스펙팅된 동종 세포들)이 사람 또는 동물의 질환을 치료할 목적으로 및 농업적인 용도(즉, 육류 및 유제품 제조)로 이식될 수 있게 해준다. 장벽장치는 또한 치료처방이 어떠한 이유로 정지될 경우에 제거용 세포에 대한 용이한 접근을 가능하게 함으로써 편리한 단기간(즉, 일시적인) 치료법을 가능하게 해준다.
본 발명의 트랜스펙팅된 세포들은 또한 병원체에 대하여 항체생성을 유도하거나 사람 및 동물을 면역화시키는 데에 유용하다. 이식된 트랜스펙팅된 세포들은 숙주의 체액성 및 세포성 면역반응의 자극을 초래하는 면역화 항원을 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 면역반응들은 숙주를 장래의 감염성 병원체로부터 보호하기 위하여(즉, 백신접종을 위하여), 진행중인 감염에 대하여 유도된 질병과 싸우는 능력을 자극하고 증대시키기 위하여, 또는 치료 또는 진단목적에 유용할 수 있는 트렌스펙팅된 세포들에 의해 생체내에서 생성된 항원에 대하여 유도된 항체를 생성하기 위하여 디자인될 수 있다. 제거가능한 장벽장치가 항원에 대한 노출을 종결짓는 간단한 수단을 허용하기 위하여 사용될 수 있다. 또는 달리, 궁극적으로는 거부될 세포들(이종 또는 동종의 트랜스펙팅된 세포들)을 사용하는 것은 세포들이 거부 되었을 때 항원 생성이 정지될 것이기 때문에 항원에 대한 노출을 제한하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예의 설명
본원에 기재된 바와 같이, 본 출원인은 DNA 가 일차, 이차 또는 불멸화된 척추동물 세포에 도입될 수 있고, 동종 재조합에 의하여 트랜스펙팅된 일차 또는 이차 세포들의 게놈에 통합될 수 있음을 증명하였다. 즉 본 출원인은 일차, 이차 및 불멸화된 포유동물 세포에서의 유전자 표적화를 증명하였다. 본 출원인은 또한 외인성 DNA 가 동종 재조합(HR) 세포에서 원하는 기능을 가지며 정확하게 표적화된 세포들이 적절하게 표적화된 DNA에 의해 부여된 검출가능한 표현형을 토대로 확인될 수 있음을 증명하였다.
또한, 본 발명은 트랜스펙팅된 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들을 사용하는 단백질 제조방법에 관한 것이다. 방법은 일차, 이차 세포 또는 불멸화된 세포들을 치료 생성물을 코드화하는 외인성 DNA로 또는 치료 생성물을 코드화하는 내인성 유전자를 표적화하고 활성화시키기에 충분한 DNA로 트랜스펙팅시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 실시예 1g, 1j, 2, 3 및 4 는 선택된 내인성 유전자의 표적화 및 활성화에 의한 단백질 제조를 설명한다.
본 출원인은 또한, 유전자 표적화에 의해 활성화된 내인성 세포 유전자를 증폭시키기 위한 DNA 구성물 및 방법(실시예 1f-1k 및 실시예 3)을 설명하고, 유전자 표적화에 의하여 일차, 이차 또는 불멸화된 세포의 게놈의 예정된 부위에 유전자를 삽입시킬 수 있는 방법(실시예 1d)에 대해 설명한다.
본 출원인은 사람 게놈에서 특정한 유전자와(HPRT유전자좌)에 대해 표적화하고 약물 내성 표현형을 토대로 한 선택에 유용한 플라스미드의 구성을 설명한다(실시예 1a), 이 플라스미드는 pE3Neo 로 표시되며, HPRT 유전자좌에서의 세포 게놈안으로의 이의 통합은 hprt, 6-TG 내성 표현형을 가지며, 또한 G418 내성인 세포를 생성시킨다. 기재된 바와 같이, 본 출원 인은 HPRT 유전자의 엑손 3 내에 도입된 DNA의 정위를 증명함으로써, pE3Neo가 확립된 사람 섬유아세포 셀라인에서의 유전자 표적화에서 적절하게 기능한다는 것을 밝혀내었다(실시예 1b).
또한, 본 발명자들은 pE3Neo 를 사용하여 일차 및 이차 사람 피부 섬유아세포에서의 유전자 표적화를 증명한다(실시예 1c). 본 발명은 나아가 DNA 말단의 변형이 게놈 DNA 안으로의 DNA의 표적화를 향상시킨다는 것을 증명한다(실시예 1c밀1e).
실시예 1f-1h 및 2는 사람 EPO유전자의 업스트림에 있는 정상적인 조절서열이 트랜스펙팅되지 않은 상태에서 검출가능한 양으로 EPO 를 발현 하지 않는 일차 또는 이차 섬유아세포 스트레인에서의 hEPO 의 발현을 가능하게 하도록 변형되는 구체예를 예시한다. 한 구체예에서 표적화의 생성 물은 정상적인 EPO 단백질을 무손상 상태로 유지시키지만, 마우스 메탈티오네인 프로모터의 조절하에 놓이게 한다. 실시예 1i 및 1j 는 일차 또는 이차 사람 섬유아세포에서 내인성 성장 호르몬 유전자를 활성화시키기 위해 유사한 표적화 구성물을 사용하는 것을 증명한다. 사람 섬유아세포에서의 EPO 발현을 활성화시키기 위하여 설명된 다른 구체예에서, 표적화 사건의 생성물은 사람 성장 호르몬 유전자의 제 1 엑손이 EPO 엑손 2-5 의 업스트림에 위치한 키메라 전사 단위이다. 전사(마우스 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 있음), 스플라이싱, 및 번역의 생성물은 hEPO 신호 펩티드의 아미노산 1-4 가 hGH 의 아미노산 잔기 1-3 으로 대체되어 있는 단백질이다. 이단백질의 키메라 부분인 신호 펩티드는 세포로부터 분비되기 전에 제거된다.
실시예 5는 유전자(인트론이 있음)를 그 유전자의 발현가능한 cDNA복사체(인트론이 없음)로 전환시키는 세포를 제조하기 위한 표적화 구성물 및 방법 및 그러한 발현가능한 CDNA분자를 미생물(예컨대 효모 또는 박테리아) 세포에서 회수하는 것을 설명한다. 실시예 6은 dhfr 유전자가 증폭되는 세포들의 이중 선택 및 선택을 위해 pREPO4 로 표시되는 표적화 벡터의 구성을 설명한다. 플라스미드 pREPO4는 동종 재조합에 의한 내인성 hEPO 유전자의 활성화 후에 HT1080 세포(불멸화된 사람셀라인)에서 사람 EPO (hEPO) 유전자좌를 증폭시키기 위해 사용되었다. 설명된 바와같이, 메토트렉세이트-함유 배지에서의 단계적 선택은 0.4μM 의 메토트렉세이트에 대해 내성인 세포에서의 hEPO의 생성을 70배 증가시켰다.
실시예들은 표적 유전자들의 단백질 코딩영역에 대한 조작 또는 다른 사용을 필요로 하지 않는 유전자 표적화에 의하여 내인성 유전자를 활성화 하거나 활성화하고 증폭시키기 위한 방법들을 제공한다. 이들 방법에 의하여, 정상적으로는 비활성인 유전자들이 시험관내 단백질 제조(예컨대 약제)또는 생체내 단백질 전달방법(예컨대 유전자 치료법)을 위해 바람직한 성질들을 갖는 세포에서 활성화될 수 있다. 제 5도 및 6도는 hEPO 유전자를 전사적으로 활성화시키기 위한 2가지의 스트래티지를 예시한다.
본원에 기재된 방법들 및 DNA 구성물 또는 플라스미드 또는 당업자에게 명백한 그것들의 변형물을 사용하여, 치료 생성물(예컨대 단백질, 리보자임, 핵산)을 코드화하는 외인성 DNA는 척추동물(예컨대 사람 및 사람 이외의 포유동물) 일차 또는 이차 세포의 게놈의 예정된 부위에 삽입될 수 있다.
본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하려는 의도가 없는 하기의 실시예에 의하여 예시하기로 한다.
실시예 1. 유전자 표적화에 의한 트랜스펙팅된 세포 스트레인의 제조
유전자 표적화는 트랜스펙팅용 DNA가 동종 재조합 사건을 통해 염색체 DNA 서열안으로 통합되거나 부분적으로 염색체 DNA 서열을 대체시킬 때 일어난다. 그러한 사건은 어떠한 주어진 트랜스펙팅 실험의 과정중에 일어날 수 있지만, 그것들은 통상적으로 비동종 또는 변칙적 재조합에 의해 플라스미드 DNA가 통합되는 막대한 양의 사건에 의해 마스킹된다.
a. 사람 세포에서 유전자 표적화 사건의 선택에 유용한 구성물의 생성
표적화된 사건을 선택하기 위한 1가지 방법은 트랜스펙팅 DNA의 통합에 기인하는 유전자 기능의 손실에 대한 유전적 선택에 의한 것이다. 사람 HPRT 유전자좌는 효소 히포크산틴-포스포리보실 트랜스퍼라아제를 코드화한다. hprt- 세포는 누클레오시드 유사체인 6-티오구아닌(6-TG)을 함유하는 배지에서의 성장에 의하여 선택된다 : 야생형(HPRT+) 대립형질을 가지고 있는 세포들은 6-TG 에 의해 치사되는 한편, 돌연변이(hprt-) 대립형질을 가지고 있는 세포들은 생존할 수 있다. 따라서, HPRT 유전자 기능을 파괴하는 표적화된 사건을 함유하고 있는 세포들은 6-TG 배지에서 선택가능하다.
HPRT 유전자좌에 대해 표적화하기 위한 플라스미드를 구성하기 위하여, HPRT 서열의 위치 11,960 에서 18,869 까지 연장되어 있고[참고문헌: Genebank name HUMHPRTB; Edwards, A. et al., Genomics 6:593-608(1990)] HPRT 유전자의 엑손 2 와 3 을 포함하는 6.9kb 의 Hindlll 단편을 pUC12 의 Hindlll 부위내로 서브클로닝하였다. 생성된 클론을 HPRT 유전자 단편의 엑손 3 에 있는 유일한 Xhol 부위에서 절단하고, pMC1Neo(Stratagene)로부터의 neo 유전자를 함유하고 있는 1.1kb 의 Sall-Xhol 단편을 삽입시켜서 엑손 3 의 코딩 서열을 붕괴시켰다. HPRT 의 전사방향과 반대되는 neo 전사의 방향을 가지는 한 배향을 선택하여 pE3Neo로 표시하었다. 정상직인 HPRT 엑손 3 을 neo 파괴된 변형체로 대체시키는 것은 hprt, 6-TG 내성 표현형을 초래할 것이다. 그러한 세포는 또한 G418 내성 일 것이다.
b. 확립된 사람 섬유아세포 세포 계통에서의 유전자 표적화
불멸화된 세포 계통에서의 표적화의 입증으로서 및 pE3Neo가 유전자 표적화에서 적절하게 기능함을 입증하기 위하여, 사람 섬유아세포 세포계통 HT1080 (ATCC CCL 121)을 일렉트로포레이션에 의하여 pE3Neo 로 트랜스펙팅시켰다.
HT1080 세포를 일렉트로포레이션 전에 15% 의 소혈청(Hyclone)이 첨가된 HAT (히포크산틴/아미노프테린/크산틴) 보충된 DMEM 중에 유지시켰다. 일렉트로포레이션시키기 2일 전에 세포들을 아미노프테린이 없는 동일 배지에 옮겼다. 지수적으로 성장하는 세포들을 트립신으로 처리하고, DMEM/l5% 소혈청으로 희석하고, 원심분리한 후, PBS (인산염 완충 식염수)에 최종 세포부피를 13.3 백만 세포/ml 로 재현탁시겼다. pE3NeO 를 Hindlll 로 분해하고, pUC12 골격으로부터 8kb 의 HPRT-neo 단편을 분리한후, 페놀추출 및 에탄올 침전에 의해 정제한 다음 600μg/ml 의 농도로 재현탁시켰다. 일렉트로포레이션 큐빗(0.4cm 전극 갭 ; Bio-Rad Laboratories)에 50μl (30μg)을 750㎕ 의 세포 현탁액(1천만개 세포)과 함께 첨가하였다.
일렉트로포레이선은 450 볼트에서, 250μF (Bio-Rad Gene Pulser; Bio-Rad Laboratories)에서 수행하였다. 큐빗의 내용물을 15% 의 소혈청이 첨가된 DMEM 에 즉시 첨가하여 25ml 의 배지당 일백만 세포의 세포 현탁액을 수득하였다. 처리된 세포 현탁액 25ml 을 150mm 직경의 조직배양 디쉬 상에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 24 시간후에 G418 용액을 플레이트에 직접 첨가하여 최종 농도 800μg/ml G4l8를 수득하였다.
5일 후, 배지를 DMEM/15% 소혈청/800μg/ml G418로 교환하였다. 일렉트로포레이션시킨지 9일후에, 배지를 DMEM/15% 우혈청/800μg/m㎕ G418 및 10μ M의 6티오구아닌으로 교환하였다. G418 및 6-TG 에 대해 내성인 콜로니들을 이중 선택을 개시한지 14 내지 16일 후에 클로닝 실린더를 사용하여 선택하였다.
HT1080 세포에서의 5회의 대표적인 표적화 실험의 결과를 하기 표 1 에 나타낸다.
표 1
트랜스펙션 5 의 경우, G418' 콜로니의 전체 수율을 측정하기 위해 디자인된 대조 플레이트는 33,700개의 G418' 콜로니들이 초기의 1×107개의 처리된 세포로부터 생성될 수 있음을 나타냈다. 그러므로, 표적화된 사건 대 표적화되지 않은 사건의 비율은 66/33,700 또는 1 대 510 이다. 5회의 실험을 합친 경우, 표적화된 사건들은 3.6 × 106의 빈도로, 또는 처리된 세포의 0.00036% 로 일어난다.
neo 및 HPRT유전자로부터 유래된 프로브를 사용하는 제한 효소 및 서던 혼성화 실험은 neo 유전자를 HPRT 액손 3 내의 예정된 부위의 HPRT 유전자좌에 국재화시켰다.
c. 일차 및 이차 사람 피부 섬유아세포에서의 유전자 표적화
pE3Neo 를 Hindlll로 분해하고, PUC12 골격으로부터 8kb 의 HPRT-neo 단편을 분리한 다음, 페놀추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. DNA를 2mg/ml 로 재현탁시켰다. 0.5ml 의 부피내에 있는 3백만 개의 이차 사람 포피 섬유아세포들을 250 볼트 및 960㎌ 에서, 100μg 의 Hindlll pE3Neo(50㎕) 와 함께 일렉트로포레이션시켰다. 총 9백만개의 처리된 세포에 대하여 3회의 별도의 트랜스펙션을 수행하였다. 세포들을 프로세싱시키고 G418 내성에 대해 선택하였다. 150mm 의 배양 디쉬당 500,000개의 세포를 G418 선택을 위해 플레이팅하였다. 선택하에서 10일 후, 배양 배지를 400μg/ml 의 G418 및 10μM 의 6-TG 를 함유하고 있는 사람 섬유아세포 영양 배지로 교환하였다. 2가지의 약물조합을 사용한 선택을 10일 더 계속 하였다. 플레이트를 현미경에 의해 스캐닝하여 2가지 약물에 대해 내성인 사람 섬유아세포 콜로니들을 정위시켰다. G418rt-TGr콜로니들의 분획은 9백만 개의 처리된 세포당 4 이다. 이들 콜로니들은 콜로니를 형성할 수 있는 모든 세포의 0.0001% (또는 백만분의 일)를 구성한다. G418r콜로니의 전체 수율을 측정하기 위하여 디자인된 대조 플레이트는 9 × 106개의 처리된 세포로부터 2,850개의 G418r콜로니가 생성될 수 있음을 나타냈다. 그러므로, 표적화된 사건 대 표적화되지 않은 사건의 비율은4/2,850, 또는 1 대 712 이다. neo 및 HPRT유전자로부터 유래된 프로브를 사용하는 제한효소 및 서던 혼성화 실험을 사용하여 neo 유전자를 HPRT 액손 3 내의 예정된 부위의 HPRT 유전자좌에 정위시키고, 표적화가 이들 4가지의 클론성 세포 스트레인에서 일어났음을 증명하였다. 2가지 약물에 대하여 내성인 콜로니들은 일차 세포를 트랜스펙팅함으로써 또한 단리하였다(1/3.0 × 107).
여러 개의 pE3Neo 표적화 실험의 결과는 하기 표 2 에 요약되어 있다. Hindlll 소화된 pE3Neo 를 직접 트랜스펙팅시키거나 엑소투클레아제 lll로 처리하여 트랜스펙팅 전에 5' 단일 가닥의 돌출부(overhang)를 생성하였다(실시예 1c참조). 길이가 175 에서 930 염기쌍인 단일 가닥 영역을 가지고 있는 DNA 프리퍼레이션(preparation)을 시험하였다. Hindlll 만을 사용하여 절단된 pE3Neo 를 사용하여, 1/799개의 G418-내성 콜로니는 HPRT유전자좌에서 neo 유전자의 표적화된 삽입을 갖는 것으로 제한효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 확인되었다 (총 24개의 표적화된 콜로니가 단리됨). 17bp 의 돌출부를 사용하였을 때 표적화는 최대로 자극되었고(약 10배 자극), 1/80 G418r콜로니가 HPRT에서의 표적화에 대해 진단적인 제한단편을 나타내었다 (총 9개의 표적화된 클론이 단리됨). 그러므로, 본원에 기재된 조건 및 재조합 DNA 구성물을 사용하는 경우, 표적화는 정상적인 사람 섬유 아세포에서 쉽게 관찰할 수 있고, 전체적인 표적화 빈도(G418-내성에 대해 안정하게 트랜스펙팅된 클론의 총수에 의해 나누어진 표적화된 클론의 수)는 실시예 1e 에 기재된 방법에 의해, 단일 가닥의 돌출 꼬리를 함유하는 표적화 구성물로 트랜스펙팅함으로써 자극될 수 있다.
표 2
사람 섬유아세포의 HPRT 유전자좌에 대한 표적화
d. 사람 게놈안으로의 치료적 관심의 유전자의 표적화된 삽입을 위한 구성물의 제조 및 그것을 유전자 표적화에 사용하는 방법.
치료적 관심의 유전자가 neo 유전자에 인접한 위치 또는 그 가까이에서, HPRT 코딩영역내에 삽입되어 있는 pE3Neo의 변형체를 수용체 일차 또는 이차 세포 게놈의 특정한 위치에 치료적 관심의 유전자를 표적화하는 데 사용할 수 있다. pE3Neo의 이러한 변형체는 hGH 유전자를 HPRT유전자좌에 표적화하기 위하여 구성될 수 있다.
pXGH5 (제 1도에 개략적으로 도시됨)를 EcoR1으로 분해시키고, hGH 유전자 및 결합된 마우스 메탈로티오네인(mMT) 프로모터를 함유하고 있는 4.1kb 단편을 단리한다. EcoR1 돌출부를 대장균 DNA 중합효소로부터의 클레노우 단편으로 채운다. 별도로, pE3Neo 를 neo 단편과 HPRT 엑손 3의 집점(엑손 3 으로의 삽입체의 3' 접점)을 절단하는 Xhol 으로 분해시킨다.
선형화된 플라스미드의 Xhol 돌출 말단을 대장균 DNA 중합효소로부터의 클레노우 단편으로 채운 후, 생성된 단편을 4.1kb 의 평활 말단 hGH-mMT 단편에 연결시킨다. 연결 혼합물로부터 유래된 박테리아 콜로니들을 제한효소 분석에 의하여 hGH-mMT 단편의 단일 복사체 삽입에 대하여 스크리닝하고 hGH 유전자가 neo유전자와 동일한 방향으로 전사되는 하나의 배향을 선택하여, pE3Neo/hGH로 표시한다. pE3Neo/hGH를 Hindlll로 분해시켜, HPRT, neo 및 mMT-hGH 서열을 함유하고 있는 12.1kb 단편을 방출시켰다. 분해된 DNA 를 실시예 1c 에서 설명한 바와 같이 처리하고 일차 또는 이차 사람 섬유아세포 안으로 트랜스펙팅시켰다. G418rTGr콜로니들을 선택하여 실시예 1c 에서 설명한 바와같이 HPRT유전자 안으로의 mMT-hGH 및 neo 서열의 표적화된 삽입에 대하여 분석한다. 개개의 콜로니들을 상업적으로 입수가능한 면역검정(Nichols Inslitute)을 사용하여 hGH 발현에 대하여 검정한다.
이차 사람 섬유아세포들을 pE3Neo/hGH 로 트랜스펙팅시키고, 티오구아닌-내성 콜로니들을 안정한 hGH 발현에 대하여 제한효소 및 서던 혼성화에 의하여 분석하였다. 분석한 13개의 TGr콜로니들중에서 내인성 HPRT 유전자좌안에 hGH 유전자가 삽입되어 있는 8개의 콜로니들을 확인하였다.
8개의 모든 스트레인들은 상당량의 hGH 를 안정하게 발현하였는데, 평균 발현수준은 24시간당 22.7μg/106개 세포였다. 대안적으로, 플라스미드 pE3neoEPO (도 4)가 EPO를 인간 HPRT유전자와에 표적화시키는 데에 사용될 수 있다.
세포의 게놈 DNA의 특정한 위치에 치료적 관심의 유전자를 표적화 하기 위하여 동종 재조합을 사용하는 것은, 증폭된 복사체 수의 유전자를 함유하고 있는 세포들이 적절한 약물 선택요법에 대한 세포들의 노출에 의하여 선택될 수 있게 해주는 유전자의 삽입에 의해 치료목적 (예를 들어, 약제학, 유전자 요법)용 생성물을 생성시키는 데에까지 확장될 수 있고 이를 위해 보다 유용하게 될 수 있다. 예를 들면, pE3Neo/hGH (실시예 1d)는 dhfr, ada, 또는 CAD 유전자를 pE3Neo/hGH 의 hGH 또는 neo 유진자에 바로 인접한 위치에 삽입시킴으로써 변형될 수 있다. 일차, 이차 또는 불멸화된 세포들은 그러한 플라스미드로 트랜스펙팅시키고, 정확하게 표적화된 사건을 확인한다. 이들 세포들을 또한 증폭된 유전자를 함유하고 있는 세포들의 선택에 적절한 약물의 농도를 증가시키면서 처리한다(dhfr의 경우에 선택제는 메토트렉세이트이며, CAD 의 경우 선택제는 N-(포스폰아세틸)-L-아스파테이트(PALA)이고, ada 의 경우 선택제는 아데닌 누클레오시드(예컨대, 알라노신)이다). 이런 방식으로 치료적 관심의 유전자의 통합체는 증폭된 복사체가 선택되는 유전자와 공동 증폭될 것이다. 그러므로, 치료용 유전자를 생성하기 위한 세포의 유전 공학은 (표적화 구성물이 통합되고 증폭된 복사체들이 증폭된 세포에 잔류하는 부위를) 예정함으로써 쉽게 조절될 수 있다.
e. 표적화를 향상시키기 위한 DNA 말단의 변형
여러 계통의 증거들은 3'-돌출 말단이 대장균, 박테리오파지, 맥주효모균 및 제노푸스 라에비스의 특정한 동종 재조합 경로에 관여함을 암시한다. 제노푸스 라에비스 난모세포에서, 수백 염기쌍의 길이를 갖는 3'-돌출부를 가지고 있는 분자들은 제한효소 분해에 의하여 생성된 매우 짧은 돌출부(4bp)를 가지고 있는 분자들보다 마이크로 주입후 훨씬 더 빠르게 유사하게 처리된 분자들과 동종 재조합된다.효모의 경우, 수백 염기쌍의 길이를 갖는 3'-돌출단부의 생성은 감수분열 재조합에서 속도제한 단계인 것으로 여겨진다. 사람 세포에서의 재조합에 3'-돌출 말단이 포함된다는 증거는 아직 보고된 바 없으며, 어떠한 짧은 길이의 변형된 DNA 기질이 임의의 종에서 표적화(동종 재조합의 한가지 형태)를 촉진하는 것으로 밝혀진 바 없었다. 사람세포에서, 표적화에 대한 3'-돌출 말단의 효과는 시험되지 않았다. 다음 실시예 및 실시예 1c에서 설명되는 실험은 5'-돌출 말단이 일차, 이차 및 불멸차된 사람 섬유아세포에서의 표적화를 자극하기에 효과적임을 암시한다.
트랜스펙팅용 DNA 분자의 말단을 변형시킴으로써 표적화를 향상시키는 것에 대해 보고된 것은 없었다. 이 실시예는 분자의 말단을 이중 가닥의 형태로부터 단일 가닥의 형태로 전환시킴에 의해 선형 DNA 분자의 단부들을 변형시키는 것이 일차 및 이차 사람 섬유아세포의 게놈안으로의 표적화를 자극할 수 있음을 예시해주는 기능을 한다.
1100μg 의 플라스미드 pE3Neo (실시예 1a)를 Hindlll로 분해시켰다.
이 DNA 는 페놀추출 및 에탄올 침전 후에 직접 사용할 수 있거나 HPRT 및 neo 유전자만을 함유하는 8kb 의 Hindlll 단편을 겔 전기영동에 의하여 pUC12 벡터 서열로부터 분리할 수 있다. Hindlll로 분해된 DNA를 Exolll 로 분해시키면, 각각의 유리 3' 말단에서 시작하여 각각의 말단에서의 집중적인 액소투클레오라이틱 분해를 생성시켜서 5'-돌출 말단을 남긴다. 엑소누클레오라이틱 작용의 크기 및 그 결과 생성되는 5'-돌출부의 길이는 EXolll 분해의 시간을 변화시킴으로써 조절될 수 있다. Hindlll로 분해된 pE3Neo 100μg 을 Exolll 으로 소화시키는 것은 제조업자가 권고하는 조건에 따라 30초, 1분, 1.5분, 2분, 2.5분, 3분, 3.5분, 4분, 4.5분 및 5분동안 수행하였다. 분해 정도를 모니터하기 위하여, Exolll 처리된 DNA 1μg 을 함유하고 있는 각 시간좀으로부터의 일정액을 공급업자에 의해 제시된 조건하에서 녹두 누클레아제(Promega)로 처리하고, 샘플을 겔 전기영동에 의하여 분별화하였다. 처리되지 않은 Hindlll 분해된 pE3Neo 와 Exolll 및 녹두의 누클레아제로 처리한 동일분자의 크기의 차이를 측정한다. 이 크기의 차이를 2 로 나누면 분자의 각 단부에서의 5'-돌출부의 부분의 평균 길이가 얻어진다. 상술한 시간점 및 30℃ 에서의 분해를 사용하는 경우, 생성된 5'-돌출부는 100 내지 1,000 염기의 범위여야 한다.
각 시간점으로부터의 Exolll 처리된 DNA 60μg (pE3Neo의 총 Hindlll 분해물)을 정제하여 실시예 1C 에서 기재한 조건하에서 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포내로 일렉트로포레이션시켰다. 각각의 Exolll 처리된 제제에 의해 표적화가 증가되는 정도는 G418r6-TGr콜로니의 수를 계수하고, 이 수를 Exolll 으로 처리하지 않은 Hindlll 소화된 pE3Neo를 이용한 표적화와 비교함으로써 정량화된다.
3'-돌출단부의 효과는 또한 유사한 시스템을 사용하여 정량화될 수 있다. 이 경우에 Hindlll 소화된 pE3Neo를 공급자가 제시하는 조건하에서 다양한 시간 간격 동안 박테리오파지 T7 유전자 6 엑소누클레아제(United States Biochemicals)로 처리하였다. 소화 정도의 측정(말단당 생성되는 3'-돌출부의 평균 길이) 및 일렉트로포레이션의 조건은 Exolll 으로 처리된 DNA 에 대해 설명한 것과 같다. 각각의 T7 유전자 6 엑소누클레아제로 처리된 제제에 의해 표적화가 증가되는 정도는 G418r6-TGr콜로니의 수를 계수하고, 이 수를 T7 6 유전자 6 엑소투클레아제로 처리하지 않은 Hindlll 소화된 pE3Neo를 이용한 표적화와 비교함으로써 정향화된다.
5' 및 3' 돌출 말단을 생성하기 위한 다른 방법들도 가능한데, 예를 들면, 상호 부분적으로 중복되는 2개의 선형 분자들의 변성 및 어닐링은 각각이 양쪽 말단에 3'-돌출부를 갖거나 5'-돌출부를 가지고 있는 분자들의 혼합물 뿐만 아니라, 출발 선형 분자들과 구별할 수 없는 리어닐링된 단편들을 생성할 것이다. 돌출부의 길이는 2개의 DNA 단편 사이에 공통적이지 않는 DNA 의 길이에 의해 측정된다.
f. 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포에서 마우스 메탈로티오네인프로 모터의 조절하에 사람 메리트로포이에틴 유전자를 놓기 위한 표적화 플라스미드의 구성.
다음은 사람 에리트로포이에틴 (EPO) 유전자의 업스트림에 있는 정상적인 포지티브 및 네가티브 조절서열이 변화되어 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포(얻어지는 대로는 EPO 를 상당량으로 발현하지 않는)에서 사람 에리트로포이에틴의 발현이 일어나게 되는 본 발명의 한 구체예를 예시하기 위한 것이다.
사람 EPO 코딩영역의 업스트림에만 있는 영역은 PCR에 의해 증폭 될 수 있다. 이 목적에 유용한 3개 세트의 프라이머를 공개된 사람 EPO의 분석후예 디자인하였다[참고문헌: Genbank designation HUMERPA; Lin, F-K, et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA 82. 7580-7584 (1985)]. 이들 프라이머쌍은 609, 603, 또는 590bp 의 단편을 증폭시킬 수 있다.
표 3
3개의 단편은 실질적으로 중복되며, 본 목적에 대해 상호교환가능하다. 번역 출발 부위에 대하여 -623 에서 -14 까지 연장되어 있는 609bp의 단편(HUMERA 누클레오티드 위치 2 에서 610)에 Clal 링커를 양쪽 말단에 연결시켰다. 생성되는 Clal-결합된 단편을 Clal으로 분해시키고, p블루스크립트llSK/+(Stratagene)의 Clal 부위에 삽입시키는데, 배향은 HUMERA 누클레오티드 위치 610이 플라스미드 폴리링커의 Sa11 부위에 인접하게 된다.
이 플라스미드, p5'EPO 를 EPO 업스트림 단편의 유일한 Fspl 또는 Sfil 부위(각각 HUMERA 누클레오티드 위치 150 및 405)에서 별도로 절단하고, 마우스 메탈로티오네인 프로모터에 연결시켰다. 전형적으로, mMT-1 유전자로 부터의 1.8kb 의 EcoRl-Bglll [mMT 코딩서열을 함유하지 않음 ; Hamer, D. H. and Walling M., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982) ; 이 단편은 또한 젠뱅크(Genbank)로부터 입수가능한 mMT 서열들 ; 즉, MUSMT1, MUSMTlP, MUSMTlPRM 의 분석으로부터 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 마우스 게놈 DNA 로부터 공지 방법에 의하여 단리될 수 있음]을 공지 방법에 의하여 평활 말단으로 만들고, Sfil 분해되거나(또한 평활 말단으로 만들어짐) Fspl 소화된 p5'EPO와 연결시켰다. 생성되는 클론의 배향을 분석하고 이전의 mMT Bglll 부위가 플라스미드 폴리링커의 Sall 부위에 근접하여 있는 클론을 일차 및 이차 사람 섬유아세포를 표적화하기 위해 사용한다. 이 배향은 mMT 전사를 최종 구성물에서 HUMERPA 누클레오티드 위치 610 을 향하도록 유도한다. 생성되는 플라스미드를 Fspl 및 Sfil 부위에 각각 삽입되어 있는 mMT 에 대하여 P5'EPO-mMTF 및 P5'EPO-mMTS 로 표시한다.
추가의 업스트림 서열은 최초 표적서열의 업스트림에 놓여 있는 네가티브 조절 엘리먼트 또는 인핸서를 변형, 결실 및/또는 대체하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. EPO 의 경우에, 간외 조직 및 신장외 조직에서 EPO 발현을 억제하는 네가티브 조절 엘리먼트[참고문헌: Semenza, G. L.etal., Mol. Cell Biol. : 10· 930-938 (1990)]가 결실될 수 있다. 6kb 단편내에 서의 일련의 결실이 준비된다. 결실된 영역은 광범위한 숙주세포 활성을 가지는 인핸서[예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 인핸서]로 대체될 수 있다.
p블루스크립트llSk/+벡터 내의 609bp 의 5'EPO 단편의 배향을 선택 하였는데, 이는 HUMERPA 서열이 BamHl (원위) 및 Hindlll 부위 (근위) 보다이들의 5' 말단 상에서 앞서 위치하기 때문이다. 그러므로, 609bp 단편[Semenza, G. L. et al., Mol. Cell Biol. 10 : 930-938 (1990)]의 업스트림에 정상적으로 놓여 있는 6kb 의 BamHl-Hindlll 단편은 공지방법에 의하여 게놈 DNA로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 박테리오파지, 코스미드, 또는 효모 인공 염색체 라이브러리는 프로브로서의 609bp의 PCR 증폭 단편으로 스크리닝될 수 있다. 원하는 클론은 6kb 의 BamHl-Hindlll 단편을 가질 것이며, 그것의 확인은 공지방법에 의하여 측정된 사람 EPO 유전자에 대한 제한 지도와 이의 제한 지도를 비교함으로써 확인될 수 있다. 또는 달리, 프로브로서 609bp 의 단편을 사용하여 EPO 유전자의 업스트림에 있는 사람 게놈의 제한 지도를 작성함으로써 HUMERPA 코디네이트 2 와 609 사이에서 기원하여 업스트림의 BamHl 부위를 지나 뻗어 있는 단편을 생성하는 효소들을 확인할 수 있으며; 이 단편은 겔 전기영동에 의하여 사람 게놈 DNA의 적절한 소화물로부터 단리될 수 있고, 박테리아 또는 효모 클로닝 벡터내로 연결 될 수 있다. 정확한 클론은 609bp 의 5'EPO 프로브에 혼성화될 것이고, 6kb 의 BamHl-Hindlll 단편을 함유할것이다. 단리된 6kb의 단편을 적절한 배향으로 p5'EPO, p5'EPO-mMTF 또는 P5'EPO-mMTS에 삽입시킨다 (Hindlll부위가 HUMERPA 누클레오티드 위치 2 에 인접하도록). 추가의 업스트림 서열은 염색체 워킹(walking) 기법을 사용하는 공지 방법들에 의해, 또는 609bp 의 5'EPO 프로브에 혼성화하는 효모 인공 염색체를 단리시킴으로써 단리될 수 있다.
상술된 클로닝 스트래티지는 EPO 의 업스트림에 있는 서열이 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포의 후속되는 표적화된 트랜스펙팅에 대해 시험관내에서 변형될 수 있게 해준다. 스트래티지는 mMT 프로모터의 간단한 삽입 뿐만 아니라 네가티르 조절영역의 결실, 및 광범위한 숙주세포 활성을 가지고 있는 인핸서에 의한 대체를 설명한다.
g. 사람 EPO 유전자를 플랭킹하는 서열에 대한 표적화 및 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 스크리닝에 의한 단리
표적화를 위하여, 플라스미드를 플라스미드 골격으로부터 삽입물을 유리시키는 제한효소들로 절단한다. p5'EPO-mMTS의 경우에, Hindlll 및 Sall 소화는 EPO 유전자의 조절영역에 구성물을 표적화하지 위하여 DNA의 각각 405bp 및 204 염기쌍에 의하여 5'측과 3'측 상에서 플랭킹되어 있는 1.8kb의 mMT프로모터로 구성된 2.4kb 의 표적화 단편을 방출시킨다. 이 DNA 또는 2.4kb 표적화 단편을 단독으로 페놀추출 및 에탄올 침전에 의하여 정제하고 실시예 1c 에 기재된 조건하에서 일차 또는 이차 사람 섬유아세포에 트랜스펙팅시킨다. 트랜스펙팅된 세포들을 사람 섬유아세포 영양 배지중의 150mm 디쉬상에 플레이팅한다. 48 시간후에 세포를 24 웰디시에10,000 세포/cm2의 밀도[웰당 약 20,000 세포 ; 만약 표적화가 106개의 클론가능한 세포당 1 사건의 비율로 일어난다면(실시예 1c) 약 50 웰이 1회 발현 콜로니를 단리하기 위해 검정될 필요가 있을 것임]로 플레이팅한다. 트랜스펙팅용 DNA가 EPO 의 업스트림에 있는 상동 영역에 표적화되어 있는 세포들은 mMT 프로모터의 조절하에 EPO 를 발현할 것이다. 10일 후, 전체 웰 상층액을 시판되는 면역검정용 키트(Arngen)를 사용하여 EPO 발현에 대해 검정한다. EPO 합성을 나타내는 웰로부터의 클론들을 공지의 방법을 사용하여, 전형적으로 개별적인 웰 또는 플레이트로 분리된 세포들의 이종 군집의 분획을 검정하고, 이들 포지티브 웰들의 분획을 검정하고, 그리고 필요에 따라 반복하고, 궁극적으로는 웰당 한 세포로 시딩된 96-웰 미소역가 플레이트를 스크리닝하여 표적화된 콜로니를 단리함으로써 단리한다. 전체 플레이트 용해물로부터의 DNA는 또한 HUMERPA 누클레오터드 위치 1 의 업스트림에 있는 프라이머와 결함된 mMT특이한 프라이머를 사용하여 단편의 증폭을 위한 PCR 에 의해 분석될 수 있다. 이 프라이머 쌍은 DNA 서열을 토대로 정확하게 예상되는 크기의 DNA 단편을 증폭시켜야 한다. 포지티브 플레이트를 트립신으로 처리하고 계속해서 더 낮은 희석률로 리플레이팅하고, DNA 제조 및 PCR 단계들을 표적화된 세포를 단리하기에 필요한 만큼 반복한다.
본원에 설명된 표적화 계획은 또한 통상적인 약제학적 전달을 위해 hGH 를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080(ATCC CCL 121) 섬유아세포, HeLa (ATCC CCL 2) 세포, MCF-7 (ATCC HTB 22) 유방암 세포, K-562(ATCC CCL 243) 백혈병 세포, KB (ATCC CCL 17) 암종 세포 또는 2780AD [참고문헌: Van der Bliek, A. M. et al., Cancer Res. 48 : 5927-5932 (1988)] 난소 암종 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
h. 사람 EPO 운전자를 플랭킹하는 서열에 대한 표적화 및 포지티브 또는 조합된 포지티브/네가티브 선택 시스템에 의한 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 단리
p5'EPO-mMTF, p5'EPO-mMTS, 및 추가의 업스트림 6kb 의 BamHl-HinDlll 단편을 가지고 있는 상기 플라스미드들의 유도체를 구성하기 위한 스트래티지는 mMT 프로모터에 인접한 위치에 neo 유전자를 삽입시키는 추가의 단계를 수반할 수 있다. 또한, 네가티브 선택 마아커, 예를 들면, gpt [pMSG(파마시아) 또는 또 다른 적절한 공급원으로부터]가 p블루스크립트IISK/+ 폴리링커의 HUMERPA 서열에 인접한 위치에 삽입될 수 있다. 전자의 경우에는, G418r 콜로니들를 단리하여 콜로니들의 푸울로부터 제조된 DNA의 PCR 증폭 또는 제한효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 스크린하여 표적화된 콜로니들을 확인한다. 후자의 경우에는, G418r콜로니들을 6-티오크산틴을 함유하고 있는 배지에 위치시켜, gpt유전자의 통합에 반하여 선택한다[참고문헌: Besnard, C. et al., Mol. Cell Biol. 7 : 4139-4144 (1987)].
또한, HSV-TK 유전자는 gpt로서 삽입체의 반대쪽에 놓일 수 있어서, 400μg /ml 의 G418, 100μM 의 6-티오크산틴, 및 25μg/ml 의 간시클로비어를 함유하고 있는 사람 섬유아세포 영양 배지에서 세포를 성장시킴으로써 neo 에 대하여 및 gpt및 TK에 반하여 선택하는 것을 가능하게 한다. 이중 네가티브 선택은 진실한 표적화 사건에 대한 거의 절대적인 선택을 제공하여야 하고 서던 블롯 분석은 궁극적인 확인을 제공한다.
본원에서 설명된 표적화 계획은 또한 통상의 약제학적 전달을 위해 hEPO를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080 섬유아세포, HeLa 세포, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종세포 또는 2780AD 난소 암종 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
i. 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포에서 마우스 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 사람 성장 호르몬 유전자를 위치시키기 위한 표적화 플라스미드의 구성
하기 실시예는 사람 성장 호르몬 유전자의 업스트림에 있는 정상적인 조절 서열이 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포에서 사람 성장 호르몬의 발현을 가능하게 하기 위해 변경되어 있는 본 발명의 한 구체예를 예시하기 위한 것이다.
EPO 유전자 조절영역을 표적화하기 위해 실시예 1f 에서 설명한 것과 유사한 표적화 분자들을 사람성장 호르몬 N 유전자의 5' 말단으로부터 유도된 클로닝된 DNA 단편들을 사용하여 만들었다. HUMGHCSA (젠뱅크엔트리) 누클레오티드 위치 3787-5432 에 걸쳐 있는 대략 1.8kb 단편(2개의 EcoNl 부위의 위치는 클로닝 또는 상기 단편을 포함하는 서브클론들의 진단적 분해를 위해 편리한 크기의 단편을 생성함)을 상기 영역내에 있는 HUMGHCSA 서열의 분석에 의해 디자인된 PCR 프라이머에 의해 증폭시킨다. 이 영역은 hGH 유전자 N 인트론 1 의 중간으로부터 번역 출발부위에 대해 5'의 대략 1.54kb에 있는 업스트림 위치까지 뻗어 있다. pUC12 를EcoRl 및 BarmHl 으로 소화시키고, 클레노우를 사용하여 평활 말단을 만든 후, 회석조건하에서 재원형화하여 EcoRl 및 BamHl 부위들이 결실된 플라스미드를 만들었다. 이 플라스미드는 pUC12XEB 로 표시한다. Hindlll 링커를 증폭된 hGH 단편에 연결시키고 그 결과의 단편을 Hindlll로 소화시키고 Hindlll 소화된 pUC12XEB에 연결시킨다. 그 결과 생성되는 플라스미드, pUC12XEB- 5'hGH 를 EcoRl 및 BamHl 으로 소화시켜, hGH 전사 개시부위 바로 업스트림에 놓여 있는 0.5kb 단편을 제거한다. 소화된 DNA를 mMT-1 유전자로부터의 1.8kb 의 EcoRl-Bglll [mMT 코딩서열을 함유하지 않음 ; Hamer, D. H. and Walling M., J. Mol. Appl.Gen. 1 : 273-288 (1982) ; 이 단편은 또한 젠뱅크로부터 입수가능한 mMT 서열들 ; 즉, MUSMTl, MUSMTlP, MUSMTIPRM 의 분석으로부터 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 마우스의 게놈 DNA 로부터 공지방법에 의하여 단리될 수 있음]에 연결 시켰다. 이 플라스미드 p5'hGH-mMT는 업스트림 hGH 서열에 의해 양쪽에서 플랭킹되어 있는 mMT 프로모터를 갖는다.
상술된 클로닝 스트래티지는 hGH 의 업스트림에 있는 서열이 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 섬유아세포의 후속되는 표적화된 트랜스펙팅에 대해 시험관내에서 변형될 수 있게 해준다. 설명된 스트래티지는 mMT 프로모티의 간단한 삽입을 설명한다. 예컨대, 광범위한 숙주세포 특이성을 갖는 인핸서가 삽입된 mMT 서열의 업스트림에 삽입되는 그 밖의 스트래티지가 예측될 수 있다.
j. 사람 hGH 유전자를 플랭킹하는 서열에 대한 표적화 및 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 스크리닝에 의한 단리
표적화를 위하여, 플라스미드를 플라스미드 골격으로부터 삽입물을 유리시키는 제한 효소들로 절단한다. p5'hGH-mMT 의 경우에, Hindlll 소화는 hGH 유전자의 조절영역에 구성물을 표적화하기 위하여 DNA 의 5'쪽과 3'쪽에 플랭킹되어 있는 1.8kb 의 mMT 프로모터로 구성된 2.9kb 의 표적화 단편을 방출시킨다. 이 DNA 또는 2.9kb 표적화 단편을 단독으로 페놀추출 및 에탄올 침전에 의하여 정제하고 실시예 11 에 기재된 조건하에서 일차 또는 이차 사람 섬유아세포에 트랜스펙팅시킨다. 트랜스펙팅된 세포들을 사람 섬유아세포 영양 배지중에서 150mm 디쉬삼에 플레이팅한다. 48 시간후에 세포를 24 웰 디쉬에 10,000 세포/cm2의 밀도(대략 웰당 20,000 세포 , 표적화가 106개의 클론가능한 세포당 1 사건의 비율로 일어난다면(실시예 1c)약 50 웰이 l회 발현 콜로니를 단리하기 위해 검정될 필요가 있을 것이다]로 플레이팅한다. 트랜스펙팅용 DNA가 hGH 의 업스트림에 있는 상동성 영역에 표적화되어 있는 세포들은 mMT 프로모터의 조절하에 hGH 를 발현할 것이다. 10일 후, 전체 웰 상층액을 시판되는 면역검정용 키트(Nichols)를 사용하여 hGH 발현에 대해 검정한다. hGH 합성을 나타내는 웰로부터의 클론들을 공지의 방법을 사용하여, 전형적으로 개별적인 웰 또는 플레이트로 분리된 세포들의 이종 군집의 분획을 검정하고, 이들 포지티브 웰들의 분획을 검정하고, 그리고 필요에 따라 반복하고, 궁극적으로는 웰당 한 세포로 시딩된 96-웰 미소역가 플레이트를 스크리닝하여 표적화된 콜로니를 단리함 으로써 단리한다. 전체 플레이트 영해물로부터의 DNA 는 또한HUMGHCSA 누클레오티드 위치 5,432의 다운스트림에 있는 프라이머와 결합된 mMT특이한 프라이머를 사용하여 단편의 증폭을 위한 PCR 에 의해 분석될 수 있다. 이 프라이머 쌍은 DNA 서열을 토대로 정확하게 예상되는 크기의 DNA 단편을 증폭시켜야 한다. 포지티브 플레이트는 트립신으로 처리하고 계속해서 더 낮은 희석률로 리플레이팅하고, DNA 제조 및 PCR 단계들을 표적화된 세포를 단리하기에 필요한 만큼 반복한다.
본원에 실명된 표적화 계획은 또한 통상의 약제학제 전달을 위해 hGH 를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HTIO8O섬유아세포, HeLa 세포, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종세포 또는 2780AD 난소 암종 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
k. 사람 hGH 유전자를 플랭킹하는 서열에 대한 표적화 및 포지티브 또는 조합된 포지티브/네가티브 선택 시스템에 의한 표적화된 일차, 이차 및 불멸화된 사람 섬유아세포의 단리
p5'hGH-mMT 를 구성하기 위한 스트래티지는 mMT 프로모터에 인접한 위치에 neo 유전자를 삽입시키는 추가의 단계를 수반할 수 있다. 또한, 네가티브 선택 마아커, 예를 들면 gpt [pMSG(파마시아) 또는 다른 적절한 공급원으로부터]가 pUC12 폴리링커의 HUMGHCSA 서열에 인접한 위치에 삽입될 수 있다. 전자의 경우에는, G418r콜로니들을 단리하여 콜로니들의 푸울로부터 제조된 DNA의 PCR 증폭 또는 제한효소 및 서던 혼성화 분석에 의하여 스크리닝하여 표적화된 콜로니들을 확인한다. 후자의 경우에는, G418r콜로니들을 티오크산틴을 함유하고 있는 배지에 놓아 gpt 유전자의 통합에 반하여 선택한다[참고문헌: Besnard, C. et al., Mol. Cell Biol. 7 : 4139-4144 (1987)]. 또한, HSV-TK 유전자는 gpt로서 삽입체의 반대쪽에 위치할 수 있어서, 400μg/ml 의 G418, 100μM 의 6-티오크산틴, 및 25μg/ml 의 간시콜로비어를 함유하고 있는 사람 섬유아세포 영양 배지에서 세포를 성장시킴으로써 neo 에 대하여 및 gpt 및 TK에 반하여 선택하는 것을 가능 하게 한다. 이중 네가티브 선택은 진실한 표적화 사전에 대한 거의 절대적인 선택을 제공하여야 한다. 서던 블롯 분석은 확인을 위한 것이다.
본원에서 설명된 표적화 계획은 또한 통상의 약제학적 전달을 위해 hGH 를 제조하기 위한 목적을 위해 불멸화된 사람세포(예를 들면, HT1080 섬유아세포, HeLa 세포, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종세포 또는 2780AD 난소 암종 세포)에서 hGH 발현을 활성화시키는데 사용될 수 있다.
실시예 1f 및 1i 에서 설명되고, 실시예 1g, 1h, 1j 및 1k 에서 사용된 표적화 구성물은 활성화된 내인성 유전자, 및 증폭가능 선택성 마아커가 증폭되는 세포들을 선택하기에 유용한 증폭가능 선택가능 마아커(예컨대 ada, dhfr, 또는 CAD)를 포함하도록 변형될 수 있다. 치료 생성물을 코드화하는 내인성 유전자를 발현할 수 있거나 발현하는 그러한 세포들은 통상의 약제학적 전달 또는 유전자 요법을 위한 단백질(예컨대 hGH 및 hEPO)를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
1. 일렉트로포레이션에 의한 외인성 DNA 및 선택가능 마아커 유전자로의 일차 및 이차 섬유아세포의 트랜스펙션
지수적으로 성장하는 또는 초기 정지기의 섬유아세포를 트립신으로 처리하고 영양 배지를 함유하는 플라스틱 표면으로부터 세정한다. 세포 현탁액의 일정액을 계수를 위해 취하고, 남아 있는 세포들에 대해서는 원심분리를 수행한다. 상층액을 흡인제거하고 펠렛을 5ml 의 일렉트로포레이션 완충액(20mM 의 HEPES pH 7.3, 137mM NaC1, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM 덱스트로스)중에서 재현탁시킨다. 세포들을 원심분리하고, 상층액을 흡인제거한 후, 세포를 1mg/ml 의 아세틸화된 우혈청 알부민을 함유하고 있는 일렉트로포레이션 완충액에 재현탁시킨다. 최종 세포 현탁액은 대략 3 × 106세포/ml 을 함유한다. 일렉트로포레이션은 재현탁 직후에 수행되어야 한다.
슈퍼코일링된 플라스미드 DNA를 0.4cm 의 전극 캡을 가지고 있는 멸균 큐벳(Bio-Rad)에 첨가한다. 최종 DNA 농도는 일반적으로 최소한 120 μg/ml 이다. 그런 다음, 0.5ml 의 세포 현탁액(대략 1.5 × 106세포를 함유함)을 큐벳에 첨가하고, 세포 현탁액과 DNA 용액을 부드럽게 혼합하였다. 일렉트로포레이션을 진-펄서 장치(Bio-Rad)로 수행하였다. 정전용량 및 전압을 각각 960㎌ 및 250-300V으로 설정하였다. 전압이 증가함에 따라 세포 생존성은 감소하지만, 도입된 DNA를 게놈안으로 안정하게 통합시킨 생존 세포의 비율은 극적으로 증가한다. 이들 파라미터가 제공되면, 대략 14 내지 20mSec의 펄스 시간이 관찰되어야 한다.
일렉트로포레이팅된 세포들을 실온에서 대략 5분동안 유지시킨 후, 큐빗의내용물을 멸균 전달 피펫으로 부드럽게 분리하였다. 그런 다음 세포들을 10cm 디쉬 중의 10ml의 미리 가온시켜 놓은 영양 배지(상기와 같이 15% 우혈청이 첨가됨)에 직접 첨가하고 상술된 바와같이 인큐베이션하였다.
그 다음날, 배지를 흡인 제거하고 10ml 의 새로운 배지로 교체한 후, 16 내지 24시간 더 인큐베이션하였다. 클로닝 효율을 측정하고 G418-내성 콜로니들을 선택하기 위한 세포의 계대배양을 그 다음날 수행하였다. 세포들을 트립신으로 처리하고, 계수한 후 플레이팅하였는데; 전형적으로, 섬유아세포는 클로닝 효율을 측정하기 위해서는 10cm 디쉬당 103개의 세포로 플레이팅 하였고, G418 선택을 위해서는 10cm 디쉬당 1-2×104개의 세포로 플레이팅 하였다.
사람 섬유아세포는 섬유아세포 영양 배지(15%의 우혈청 함유)중에 300-400μg/ml의 G418로 구성된 배지(Geneticin, 대략 50%의 효능을 지닌 이 황산염; Gibco)에서 G418 내성에 대해 선택된다. 클로닝 효율은 G418의 부재하에서 측정한다. 플레이팅된 세포들을 12 내지 14일 동안 인류베이팅한후, 이 때에 콜로니들을 포르말린으로 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후, (플레이팅된 클로닝 효율에 대해서는) 계수하거나, (G418 플레이트에 대해서는) 클로닝 실린더를 사용하여 단리하였다. 토끼 섬유아세포의 일렉트로포레이션 및 선택은, 사용한 선택 조건을 제외하고는 본질적으로는 사람 섬유아세포에 대하여 설명된 것과 같이 수행하였다. 토끼의 섬유아세포는 1g/ml 의 G418 을 함유하고 있는 배지에서 G418 내성에 대해 선택된다.
섬유아세포를 새롭게 절출된 사람 포피로부터 단리하였다. 배양물을 DMEM+1O% 우혈청중에 cm당 50,000 세포로 시딩하였다. 배양물이 집밀도(confluency)에 이르렀을 때, 섬유아세포를 트립신 처리에 의하여 수거하고 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙팅시켰다. 일렉트로포레이션 조건은 플라스미드 pcDNEO를 이용한 트랜스펙션에 의해 평가되었다. 거의 최적의 조건을 사용하는 대표적인 일렉트로포레이션 실험(250 볼트의 일렉트로포레이션 전압 및 960㎌의 정전용량 세팅에서의 플라스미드 PcDNEO 60μg)은 588 개의 처리된 세포당 하나의 G418 콜로니(모든 처리된 세포의 0.17%), 또는 71개의 클론가능한 세포당 하나의 G418 콜로니(1.4%)를 생성하였다.
거의 최적의 조건에서 9회의 별도의 일렉트로포레이션 실험(300볼트의 일렉트로포레이션 전압 및 960㎌ 의 정전용량 세팅에서의 플라스미드 pcDNEO 60μg)을 수행하였을 때, 1,899개의 처리된 세포당 평균 하나의 G418 콜로니(0.05%)를 관찰할 수 있었다(범위는 1/882 내지 1/7,500 처리된 세포임). 이는 38개의 클론가능한 세포 당 평균 하나의 G418 콜로니(2.6%)에 상응한다.
계대수가 낮은 일차 사람 섬유아세포를 플라스미드 ; pcDNEO 및 pXGH5 와의 코트랜스펙션에 의하여 hGH 를 발현하는 세포로 전환시켰다.
전형적으로, 2개의 플라스미드의 동물 혼합물 60μg을 거의 최적의 조건(300볼트의 일렉트로포레이션 전압 및 960㎌ 의 정전용량 세팅)에서 트랜스펙션 시켰다. 그러한 실험의 결과는 14,705개의 처리된 세포당 하나의 G418 콜로니가 있음을 나타냈다.
동일한 트랜스펙션 조건하에서 단리된 이들 및 다른 세포들의 hGH발현 데이터를 하기에 요약한다. 궁극적으로는, 모든 G418r콜로니중 98%가 다량의 배양물을 생성하기 위하여 증식될 수 있다.
분석된 G418r클론의 수 154
클론을 발현하는 G418r/hGH의 수 65
평균 hGH 발현 수준 2.3μg hGH/106세포/24시간
최대 hGH 발현 수준 23.0μg hGH/106세포/24시간
안정한 트랜스펙턴트는 또한 동일한 플라스미드 분자상에 neo 와 hGH 유전자가 존재하는 DNA 구성물인 pXGH301에 의한 일차 또는 이차 사람 섬유아세포의 일렉트로포레이션에 의해 생성되었다. pXHG301 은 2-단계 과정에 의해 구성되었다. pBR322 로부터의 Sall-Cla1 단편(pBR322 에서의 위치 23-651)을 단리하고 Sall-Clal 소화된 pcDNEO 에 삽입시켜서, pcDNEO 의 SV40 초기 프로모터 영역의 업스트림에 BamHl에 부위를 도입하었다. 이 플라스미드 pBNEO 를 BamHl 으로 소화시키고, SV40초기 프로모터의 조절하에 neo 유전자를 함유하고 있는 2.1kb 단편을 단리해내고 8amHl 소화된 pXGH5 에 삽입시켰다. neo 와 hGH 가 서로에 대하여 동일한 방향으로 전사되는, 2.1kb의 BamHl 단편의 단일 삽입물을 지닌 하나의 플라스미드를 단리하였다. 이 플라스미드를 pXGH301 로 표시하였다. 예를 들어, 1.5 ×106개의 세포를 60μg의 pXGH301 을 사용하여 300 볼트 및 960 ㎌ 에서 일렉트로포레이션하였다. G418 내성 콜로니들을 1.5 × 10개의 처리된 세포당 652개의 G418 내성 콜로니들의 빈도(2299개의 처리된 세포당 1)로 트랜스펙팅된 이차 섬유아세포로부터 단리하였다. 이들 콜로니들의 대략59%가 hGH 를 발현한다.
실시예 2. 사람 성장 호르몬 및 에리트로포이에틴 서열이 융합되어 있는 키메라 전사 단위를 초래하는 표적화 플라스미드의 구성
이하에서는, 사람 EPO 유전자의 업스트립에 있는 정상적인 조절서열이 이것들의 트랜스펙팅 되지 않은 상태에서 얻어진 것처럼 검출될 수 있는 양으로 EPO 를 발현시키지 않는 일차 또는 이차 섬유아세포 스트레인에서 hEPO의 발현이 가능해지도록 변형되는, 본 발명의 2가지 추가의 구체예를 예시한다. 이러한 구체예에 있어서, 표적화 사건의 생성물은 사람의 성장 호르몬 유전자의 제 1 액손이 EPO 액손 2-5 의 업스트림에 위치하는 키메라 전사 단위이다. 전사, 스플라이싱 및 번역의 생성물은 hEPO 신호 펩티드의 아미노산 1-4 가 hGH 의 아미노산 잔기 1-3 으로 치환된 단백질이다.
이 두가지 구체예는 삽입되는 외래 조절서열의 상대적 위치 및 최종의 프로 세싱된 전사체를 형성시키는데 일어날 필요가 있는 스플라이싱의 특이한 패턴에 있어서 상이하다.
플라스미드 pXEPO-10 은 hEPO 의 엑손 1 을 사람의 염색체 7상에 있는 내인성 hEEPO 유전자에 대한 유전자 표적화에 의해 hGH 의 엑손은 1 로 대체시키기 위하여 디자인된다. 플라스미즈 pXEPO-10 을 하기와 같이 구성된다. 먼저, 중간 플라스미드 pT163 은 hEPO 코딩영역의 업스트립에 놓여 있는 6kb 의 Hindlll-BamHl 단편(실시예 1f참조)을 Hindlll-BamHl 소화된 P블루스크립트ll SK+ (Stratagene, LaJolla, CA)안에 삽입시킴으로써 구성된다. 이러한 연결 생성물을 Xhol 및 Hindlll 으로 소화시키고, pMClneoPolyA[Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. Cell 51 : 503-512 (1987) ; Strategene, LaJolla, CA 로부터 구입가능함]로부터의 1,1kb Hindlll-Xhol 단편에 연결시켜 pT163 을 생성한다. 올리고누클레오티드 13.1-13.4 를 중합 효소 연쇄 반응에서 사용하여 마우스 메탈로티오네인 1 (mMT-1) 프로모터 -hGH 엑손 1 /서열이 hEPO 인트론 1 서열에 추가로 융합되어 있는 융합 단편을 생성시킨다. 먼저, 올리고투클레오티드 13.1 및 13.2를 사용하여 pXGH5 (제 1도)로부터의 대략 0.73kb의 mMT-1 프로모터-hGH 엑손 1 단편을 증폭시킨다. 다음으로, 올리고누클레오티드 13.3 및 13.4를 사용하여 사람의 게놈 DNA로부터의 hEPO 인트론 1로 주로 이루어진 대략 0.57kb 단편을 증폭시킨다. 최종적으로, 2개의 증폭된 단편을 혼합하고, 올리고누클레오티드 13.1 및 13.4 로 추가로 증폭시켜서 mMT-1 부분의 5' 쪽에서의 Sall부위 및 hEPO 인트론 1 서열의 3' 쪽에서의 Xhol 부위에 의해 플랭킹된 최종 융합 단편(융합 단편 3)을 생성시킨다. 융합 단편 3 을 Xhol 및 Sall 으로 소화시키고 Xhol 으로 소화된 pT163에 연결시킨다. 연결 혼합물을 대장 균안에 형질전환시키고, Xhol 부위가 hEPO 인트론 1 서열의 3' 위치에서 재생되어 있는 융합 단편 3 의 단일 삽입체가 함유된 클론을 확인하고, pXEPO-10으로 표시하였다.
13.1 5' AAAAGTCGAC GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CAGCCTGGAG
Sall Kpnl
(SEQ ID NO 5)
13.2 5' CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGTACTC
GCGGGCTGGG CG (SEQ ID NO 6)
13.3 5' CGCCCAGCCC GCGAGTACTC ACCTGTAGCC ATTGCCGCTA
GG (SEQ ID NO 7)
13.4 5' TTTTCTCGAG CTAGAACAGA TAGCCAGGCT GAGAG
Xhol
(SEQ ID NO 8)
올리고 13.1의 비-볼드체 영역은 이것의 5' 경계로서 :천연의 Kpnl 부위를 가지고 있는 mMT-1 프로모터와 동일하다. 볼드체 타입은 5' 경계를 Sall 부위로 전환시키는 Sall 부위 꼬리를 나타낸다. 올리고 13.2 및 13.3의 볼드체 영역이 hGH 서열을 나타내는 반면, 비-볼드체 영역은 hEPO 유전자로부터의 인트론 1 서열을 나타낸다. 올리고 13.4의 비-볼드체 영역은 hEPO 인트론 1의 마지막 25 염기와 동일하다. 볼드체 영역은 증폭된 단편의 3' 경계를 Xhol 부위로 전환시키는 Xhol 부위 꼬리를 포함한다.
플라스미드 pXEPO-11은, 유전자 표적화에 의해서, 사람의 염색체 7 상에 위치된 내인성 hEPO 유전자좌에 있는 프로모터 영역 및 hEPO 구조 유전자의 업스트림에 있는 hGH 의 엑손 1 및 mMT-1 프로모터를 위치시키기 위해 디자인된 것이다. 플라스미드 pXEPO-11은 하기와 같이 구성된다.
올리고누클레오티드 13.1 및 13.5-13.7을 중합효소 연쇄 반응에서 사용하여 마우스 메탈로티오네인 1 (mMT-1) 프로모터 - hGH 엑손 1 서열이 hEPO 코딩영역에 대하여 -1 내지 -630 에 있는 hEPO 서열에 추가로 융합되어 있는 융합 단편을 생성시킨다. 먼저, 올리고누클레오티드 13.1 및 13.5는 pXGH5(제 1도)로부터의 대략 0.73kb 의 mMT-1 프로모터 - hGH 엑손 1 단편을 증폭시키는데 사용된다. 다음으로, 올리고누클레오티드 13.6 및 13.7을 사용하여 사람의 게놈 DNA로부터, hEPO 코딩영역에 대하여 -1 에서 -620에 있는 hEPO 서열로 주로 이루어진 대략 0.62kb 단편을 증폭시킨다. 올리고 13.5 와 13.6 은 hGH 인트론 1 - hEPO 프로모터 영역에 위치된 10bp 의 링커서열을 함유하며, 이것은 천연의 hEPO 인트론 1 스플라이스 도너 부위에 상응한다. 최종적으로, 2개의 증폭된 단편을 혼합하고 올리고투클레오티드 13.1 및 13.7을 사용하여 추가로 증폭시켜서 mMT-1 부분의 5' 위치에서의 Salll 부위 및 hEPO 프로모터 영역의 3' 위치에서의 Xhol 부위에 의해 플랭킹되는 최종 융합 단편(융합 단편 6)을 생성시킨다. 융합 단편 6 을 Xhol 및 Sall 으로 소화시키고 Xhol 으로 소화된 pTl63에 연결시킨다. 연결 혼합물을 대장균안에 형질전환시키고, Xhol 부위가 hEPO 프로모터 서열의 3' 위치에서 재생되어 있는 융합 단편 6 의 단일 삽입체가 함유된 클론을 확인하고, pXEPO-11로 표시하였다.
13.5 5' CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGTACTC AAGCTTCTGG
Hindlll
GCTTCCAGAC CCAG (SEQ ID NO 9)
13.6 5' CTGGGTCTGG AAGCCCAGAA GCTTGAGTAC TCACCTGTAG
Hindlll
CCATTGCCGC TAGG (SEQ ID NO 10)
13.7 5' TTTTCTCGAG CTCCGCGCCT GGCCGGGTC CCTC
Xhol
(SEQ ID NO 11)
올리고 13.5 및 13.6의 볼드체 영역은 hGH 서열을 나타낸다. 이탤릭체로 된 영역은 hEPO 인트론 1의 처음 10 염기쌍에 상응하는 것이다. 올리고의 나머지는 hEPO 코딩 영역에 대하여 -620 에서 -597 에 있는 hEPO 서열에 상응한다. 올리고 13.7의 비-볼드체 영역은 hEPO 코딩 영역에 대하여 -1 에서 -24에 있는 염기와 동일하다. 볼드체 영역은 증폭된 단편의 3' 경계를 Xhol 부위로 전환시키는 Xhol 부위 꼬리를 포함한다.
플라스미드 pXEPO-10 은 BamHl 및 Xhol에 의한 분해에 의한 유전자 표적화를 위해 사용될 수 있으며, hEPO 서열의 양쪽에서 플랭킹되어 있는 mMT-1 /hGH 융합체를 함유한 7.3kb 단편을 방출시킨다. 이 단편(표적화단편 1)은 사람의 EPO 유전자좌로의 표적화를 유도하기 위해 hEPO 코딩영역 및 hEPO 인트론 1 서열의 업스트림에 있는 -620 과 약 -6620 사이에 놓여 있는 서열만을 가지며, 어떠한 hEPO 코딩서열도 함유하지 않는다. 표적화 단편 1 은 상기 실시예 1c 에서와 같은 것들과 유사한 조건을 사용하여 일차 또는 이차 사람 피부 섬유아세포로 트랜스펙션된다. G418-내성 콜로니를 96-웰 플레이트의 각각의 웰안에 찍어넣고 ELlSA 검정(R&D Systims, Minneapolis MN)에 의해 EPO 발현에 대해 스크리닝한다. 트랜스펙팅을DNA가 사람 게놈안으로 무질서하게 통합되어 있는 세포들은 EPO를 생성 시킬 수 없다. 트랜스펙팅용 DNA가 내인성 hEPO 인트론 1 및 hEPO 업스트림 서열과 동종 재조합되어 있는 세포들은, mMT-1 프로모터와 비-전사된 서열 및 hGH 5' 번역되지 않은 서열과 hGH 엑손 1 이 정상적인 hEPO 프로모터 및 hEPO 엑손 1 을 대체하는 키메라 유전자를 함유한다(제 5도 참조), 표적화 단편 1 중의 비-hEPO 서열은 hEPO 인트론 1 의 다운스트림에 있는 hEPO 서열에 결합된다. 정상적인 hEPO 조절영역의 mMT-1 프로모터로의 대체는 EPO 를 정상적으로 발현시키지 않는 섬유아세포의 EPO 유전자를 활성시킬 것이다. hEPO 엑손 1 의 hGH 엑손 1 로의 대체는, hEPO 신호 펩티드의 처음 4개의 아미노산이 hGH 의 아미노산 1-3 으로 대체됨으로써, 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현 세포로 부터 분비되는 기능적인 키메라 신호 펩티드를 생성하는 단백질을 초래한다.
플라스미드 pXEPO-11 은 hEPO 서열에 의해 양쪽에 플랭킹되어 있는 mMT-1 /hGH 용합체를 함유한 7.4kb 단편을 방출시키기 위하여 BamHl 및 Xhol 로 소화시킴으로써 유전자 표적화를 위해 사용할 수 있다. 이 단편(표적화 단편 2)은 사람의 EPO 유전자좌로의 표적화를 유도하기 위해 hEPO 코딩영역의 업스트림에 있는 -1 과 약 -6620 사이에 놓여 있는 서열만을 가지며, 어떠한 hEPO 코딩서열도 함유하지 않는다. 표적화 단편 2를 상기 실시예 1g 에서와 같은 것들과 유사한 조건을 사용하여 일차 또는 이차 사람 피부 섬유아세포에 트랜스펙팅시킨다. G418-내성 콜로니를 96-웰플레이트의 각각의 웰안에 찍어넣고 ELISA 검정(R&D Systims, Minneapolis, MN)에 의해 EPO 발현에 대해 스크리닝된다. 트랜스펙팅용 DNA가 사람 게놈안으로무작위로 통합되어 있는 세포들은 EEPO를 생성시킬 수 없다. 트랜스펙팅용 DNA가 내인성 hEPO 프로모터 및 업스트림 서열과 동종 재조합되어 있는 세포들은 mMT-1 프로모터와 비-전사된 서열, hGH 5' 비번역된 서열과 hGH 액손 1, 및 hEPO 인트론 1의 최초 10 염기로 이루어진 10 염기쌍의 링커가 hEPO 코딩영역에 대하여 위치 -620 에 놓여 있는 Hindlll 부위에 삽입되어 있는 키메라 유전자를 함유한다(제 6도 참조), 정상적으로 사일런트 hEPO 프로모터의 업스트림에 mMT-1 프로모터가 편재되면 일차 또는 이차 피부 섬유아세프에서, 메시지 판독 (5' 에서 3') 비-번역된 메탈로티오네인 및 hGH 서열, hGH 액손 1, hEPO 인트론 1의 처음 10 염기쌍과 동일한 DNA의 10 염기, 그리고 정상적인 hEPO 프로모터 및 hEPO 엑손 1 (EPO 코딩서열에 대해 -620 에서 +13)의 합성을 유도할 것이다. hEPO 인트론 1 로부터의 10 염기쌍의 링커서열은 hEPO 엑손 2 바로 업스트림에 있는 다음의 다운스트림의 스플라이스 억셉터 부위에 hGH 엑손 1 을 융합시키기 위해 스플라이스 도너 부위로서 작용한다. 따라서, 생성되는 전사체의 프로세싱은 hEPO 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1 서열을 스플라이싱할 것이다. hEPO 엑손 1 의 hGH 엑손 1 서열로의 대체는 hEPO 신호 펩티트의 최초의 4개 아미노산이 hGH 의 아미노산 1-3 으로 대체됨으로써 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현 세포로부터 분비되는 기능적인 키메라 신호 펩티드를 생성시키는 단백질을 초래한다.
pXEPO-10 및 pXEPO-11과 관련된 일련의 구성물은 공지된 방법에 의해 구성될 수 있다. 이러한 구성물에 있어서, mMT-1 프로모터 및 hGH서열의 상대적 위치뿐만 아니라, mMT-1/hGH 서열이 hEPO 업스트림 서열에 삽입되는 위치는 유전자 표적화를촉진하는 대용 키메라 전사 단위를 생성하거나, 융합 전사체의 더욱 효과적인 발현을 초래시키거나, 다른 바람직한 특성을 가지도록 다양하게 변화된다. 이러한 구성물은 유사한 결과를 낳을 것이며, hGH-hEPO 융합 유전자는 정상적인 hEPO 유전자좌에 대한 유전자 표적화에 의해 외인성 프로모터의 조절하에 놓이게 된다. 예를 들면, hEPO 유전자의 업스트림에 있는 6kb 의 Hindlll-BamHl 단편 (실시예 1f 참조)은 neo 유진자 및 mMT-1 프로모터/hGH 융합 단편의 삽입을 위한 부위로서 사용될 수 있는 수많은 제한효소 인지 서열을 갖는다. 이러한 부위의 1가지인 Hindlll 부위의 약 1.3kb 업스트림에 있는 Bglll 부위는 이 영역중에서 유일하며 하나 이상의 선택가능 마아커 및 일차, 이차 또는 불멸화된 사람 세포에서 EPO 발현을 활성시키는 작용을 할 다른 유전자로부터 유도된 조절영역의 삽입을 위해 사용될 수 있다.
먼저, 중간 플라스미드 pT164 는 hEPO 코딩영역의 6kb 업스트림에 있는 Hindlll-BamHl 단편(실시예 1f)을 Hindlll-BamHl 소화된 P블루스크립트llSK+(Stratagene, LaJolla, CA)안으로 삽입시킴으로써 구성된다. 플라스미드 pMClneoPolyA [Thomas, K. R. and Capecchi, M,R, Cell 51:503-512 (1987); available from Stragene, LaJolla, CA]를 BamHl 및 Xhol로 분해시키고, 대장균 DNA 중합효소의 클레노우 단편으로 처리함으로써 평활 말단으로 만들고, 그 결과 생성된 1.1kb 단편을 정제한다. pT164 를 Bgllll로 분해시키고, 대장균 DNA 중합효소의 클레노우 단편으로 평활 말단으로 만든다. 이 2 가지의 선행 평활 말단을 가지는 단편을 함께 연결시켜 컴피턴트 대장균내로 형질전환시킨다. 1.1kb neo단편의 단일 삽입체를 가지는 클론을 단리하고 제한효소 분석법으로 분석하여 평활 Xhol 및 Bglll 부위의 융합에 의해 재생성된 Bglll 부위가 플라스미드 pT164 에 존재하는 유일한 Hindlll 부위로 부터 1.3kb 벗어나서 편재되어 있는 클론을 확인하였다. 그 결과 형성된 플라스미드인 pT165는 neo 전사 단위의 5' 쪽을 플랭킹하는 유일한 Bglll 부위에서 절단될 수 있다.
올리고누클레오티드 13.8 및 13.9 를 중합효소 연쇄 반응에서 사용하여 마우스 메탈로티오네인 1 (mMT-1) 프로모터 - hGH 엑손 1 서열이 스플라이스 도너 부위를 포함한 10 염기쌍 단편에 부가적으로 융합되어 있는 단편을 생성시켰다. 선택된 스플라이스 도너 부위가 천연의 hEPO 인트론 1 스플라이스 도너 부위에 상응하지만, 더 많은 수의 스플라이스 도너 부위 또는 컨센서스 스플라이스 도너 부위가 사용될 수 있다. 올리고누클레오티드(13.8 및 13.9)를 사용하여 pXGH5 로부터 약 0.73kb mMT-1 프로모터 -hGH 엑손 1 단편을 증폭시킨다 (제 1도). 증폭된 단편(단편 7)을 Bglll로 소화시키고 Bglll로 분해된 pT165에 연결시킨다. 연결 혼합물을 대장균안에 형질전환시키고, mMT-1 프로모터중의 kpnl 부위가 neo 유전자의 5' 단부에 근접되어 있으며 mMT-1 프로모터가, 전사가 유일한 Hindlll 부위를 향하여 유도되는 방향으로 배향되는 단편 7의 단일 삽입체를 함유한 클론을 확인하여 pXEPO-12 로 표시하였다.
13.8 5' AAAAGATCT GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CAGCCTGGAG
Bglll Kpnl
(SEQ ID NO 12)
올리고 13.8의 비-볼드체 영역은 그것의 5' 경계로서 천연의 Kpnl 부위를 가지고 있는 mMT-1 프로모터와 동일하다. 볼드체 타입은 5' 경계를 Bglll 부위로 전환시키는 Bglll 부위 꼬리를 나타낸다.
13.9 5' TTTTAGATCT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT TGCCGCTAGG
Bglll
(SEQ ID NO 13)
올리고 13.9의 비-볼드체 영역은 hGH 서열을 나타낸다. 이탤릭체로된 영역은 hEPO 인트론 1의 최초 10 염기 쌍에 상응하는 것이다.
밑줄그은 Bglll 부위는 플라스미드 구성 목적으로 첨가된 것이다.
플라스미드 pXEPO-12 를 BamHl 및 Hindlll 를 이용한 소화에 의한 유전자 표적화를 위해 사용하여 hEPO 서열에 의해 양쪽에서 플랭킹되어 있는 mMT-1/hGH 용합체 및 neo 유전자를 함유한 7.9kb 의 단편을 방출시킨다. 이 단편(표적화 단편 3)은 사람 EPO 유전자좌의 업스트림에서 표적화를 유도하기 위해 hEPO 코딩 영역의 업스트림의 약 -620 과 약 -6620 사이에 놓여 있는 서열만을 가지며, 어떠한 hEPO 코딩 서열도 함유하지 않는다.
표적화 단편 3을 상기 실시예 1b 및 1c 에서와 같은 것들과 유사한 조건을 이용하여 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 피부 섬유아세포에 트랜스펙팅시킨다. G418-내성 콜로니를 96-웰 플레이트의 각각의 웰안에 찍어넣고 ELlSA 검정(R&D Systims, Minneapolis, MN)에 의한 EPO 발현에 대해 스크리닝한다. 트랜스펙팅용 DNA가 사람 게놈안으로 무작위로 통합되어 있는 세포들은 EPO를 생성시킬 수 없다.트랜스펙팅용 DNA가 내인성 hEPO 프로모터 및 업스트림 서열과 동종 재조합되어 있는 세포들은 mMT-1 프로모터와 비-전사된 서열, hGH 5' 미번역 서열과 hGH 액손 1, 및, hEPO 인프론 1 의 최초 10 염기로 이루어진 10 염기쌍 링커가 hEPO 코딩 영역에 대하여 상대적인 위치 약 -1920 에 놓여 있는 Bglll 에서 삽입되어 있는 키메라 유전자를 함유한다. 정상적으로 사일런트인 hEPO 프로모터의 업스트림에 mMT-1 프로모터가 편재되면 일차, 이차, 또는 불멸화된 사람 섬유아세포(또는 다른 사람 세포)에서, (5' 에서 3' 으로) 비-번역된 메탈로티오네인 및 hGH 서열, hGH 엑손 1, hEPO 인트론 1 의 최초 10 염기쌍에 동일한 DNA의 10 염기, 그리고 hEPO 업스트림 영역 및 hEPO 엑손 1 (EPO코딩 서열에 대해 약 -1920 내지 +13 으로부터)을 판독하는 메시지의 합성이 유도될 것이다. hEPO 인트론 1 로부터의 10 염기쌍 링커서열은 hGH 엑손 1을, hEPO 엑손 2의 바로 업스트림에 있는 다운스트림 스플라이스 도너 부위에 융합시키기 위한 스플라이스 억셉터 부위로서 작용한다. 따라서, 그 결과 생성된 전사물의 프로세싱은 hEPO 업스트림 서열, 프로모터 영역, 엑손 1 및 인트론 1 서열을 스플라이싱할 것이다. pXEPO-10, -11, 및 -12 를 사용하는 경우, 메시지의 후-전사 프로세싱은 mMT-1 프로모터와 hEPO 엑손 1 사이의 hEPO 업스트림 서열중에 놓여 있는 스플라이스 억셉터 부위를 제거하기 위한 시험관내 돌연변이 유발에 의해 개선될 수 있으며, 이것은 원하는 메시지의 생성을 위해 필요한 생산성 스플라이싱 사건의 수준을 감소시킨다. hEPO 엑손 1 의 hGH 엑손 1 로의 대체는 hEPO 신호 펩티드의 최초 4개 아미노산이 hGH 의 아미노산 1-3으로 대체되는 단백질을 초래함으로써, 성숙한 단백질로부터 후-번역 프로세싱에 의해 제거되고 발현세포로 부터 분비되는 기능성 키메라 신호 펩티드를 생성한다.
실시예 3. 서열 업스트림의 표적화된 변형 및 표적화된 유전자의 증폭.
EPO 유전자가 상기에서 설명된 방법에 의해 활성화된 사람의 세포는 만약 표적화 플라스미드가 유전자 증폭현상에 의해 세포 독성제의 높은 수준에 대한 내성을 부여할 수 있는 마아커 유전자를 함유한다면, neo/mMT-1/EPO 전사 단위를 증폭시키도록 유도될 수 있다. 선택가능 마아커 유전자, 예컨대 디히드로폴레이트 환원효소(dhfr, 선택제는 메토트렉세이트), 다기능성 CAD 유전자[카르바밀 인산염 합성효소, 아스파테이트 트랜스카르바밀라제, 및 디히드로-오로타아제를 코드화한다 ; 선택제는 N- (포스포노아세틸)-L-아스파테이트 (PALA)], 및 아데노신 아미노기이탈효소 (ada , 선택제는 아데닌 누클레오시드)는, 다른 유전자들 중에서도 불멸화된 사람 세포 계통중에서 증폭될 수 있는 것으로 증명되어 있다[Wright, J. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 1791-1795 (1990)]. 이들 연구에 있어서, 유전자 증폭은 많은 불멸화된 사람 세포 계통에서 발생되는 것으로 기록되어 있다. HT1080, HeLa, MCF-7유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암세포, 또는 2780AD 난소 암세포 모두는 적합한 선택 조건하에서 증폭을 나타낼 수 있다.
플라스미드 pXEPO-10 및 pXEPO-11 은 정상적이거나 돌연변이체인 dhfr 유전자의 상기 플라스미드의 유일한 hindlll 부위로의 삽입에 의해 변형될 수 있다. HT1080 세포의 적합한 DNA로의 트랜스펙션, G418-내성(neo 유전자에 의해 부여됨)에 대한 선택, 및 hEPO 유전자가 hEPO 유전자의 업스트림에 있는 정확한 위치에 대한 neo, dhfr, 및 mMT-1 서열의 유전자 표적화에 의해 활성화된 세포의 확인 후에,이러한 세포는 dhfr 의 증폭 및 결합된 neo, mMT-1, 및 hEPO 서열의 공동 증폭에 대해 선택되도록 메토트렉세이트(MTX)에서의 단계적 선택에 대해 노출될 수 있다[참고문헌: Kaufman, R, J. Technique 2:221-236 (1990)]. 이 단계적 선택의 계획은 먼저 세포를 낮은 수준의 MTX (0.01 내지 0.08μM) 에 노출시킨 후, 계속해서 250μM MTX 이하 또는 이상의 MTX 농도의 증분 증가에 노출시키는 것으로 이루어진다. 0.04 내지 0.08μM MTX 의 선형 증분 단계 및 연속적으로 2배 증가된 MTX 농도가 증폭된 트랜스펙션된 세포 계통을 선택하는 데에 효과적일지라도, 상대적으로 다양하게 적은 증분 또한 효과적일 것이다. 증폭은 dhfr 유전자 복사체 수의 증가에 의해 모니터링되어 시험관내 hEPO 발현을 측정함으로써 확인된다. 이러한 스트래티지에 의해, hEPO 의 실질적인 과발현은 hEPO 코딩영역의 완전히 바깥쪽에 놓여 있는 서열의 표적화된 변형에 의해 달성될 수 있다.
사람 세포에서의 hGH 발현의 활성화를 위해 상기에서 설명된 구성물(실시예 1i 및 1k)과 유사한 구성물은 또한 비-코딩 서열에 대한 유전자 표적화 및 연속적 증폭으로 hGH 유전자를 과발현시키는 세포를 얻기 위해 dhfr 유전자를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다.
실시예 4. 불멸화된 사람 섬유아세포 계통에서 사람 EPO 유전자좌의 표적화 및 활성화
내인성 hEPO 유전자가 사람 섬유아세포 세포에서 활성화될 수 있을 것이라는 가설을 시험하기 위하여 표적화 구성물 pXEPO-13 을 제조하였다.
먼저, 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터(mMT-1)에 융합된 hEPO 유전자의 첫번째 코돈의 업스트림에 있는 63bp 의 게놈 hEPO 서열을 함유하는 플라스미드 pT22.1 을 구성하였다. mMT-1 와 hEPO 서열을 융합시키기 위하여 PCR 에서 올리고투클레오티드 22.1 내지 22.4 를 사용하였다. 이들 프라이머들의 특성은 다음과 같다 : 22.1 은 mMT-1 Kpnl 부위의 28bp 업스트림에서 출발하는 mMT-1 프로모터의 절편에 상동인 21 염기의 올리고누클레오티드이며 ; 22.2 와 22.3 은 융합이 hEPO 유전자의 첫번째 코돈으로부터 35 염기 업스트림에서 출발하는 28bp의 hEPO 서열과, mMT-1 천연 Bglll 부위를 포함하고 mMT-1 서열안으로 30 염기만큼 뻗어 있는, 올리고누클레오티드 22.2 의 염기 29 에서 출발하는 mMT-1 서열을 함유하도록 hEPO 와 mMT-1 서열의 융합을 규정하는 58개의 누클레오티드 상보적 프라이머이고, 22.4 는 길이가 21 누클레오티드이고 hEPO 유전자의 첫번째 코돈으로부터 725 염기 다운스트림에서 출발하는 hEPO 서열과 상동이다. 이들 프라이머 들을 상술한 바와 같이 mMT-1 과 hEPO 서열의 용합체를 포합하는 1.4kb의 DNA 단편을 증폭시키기 위하여 사용하였다. 그 결과 생성된 단편을 kpnl 으로 소화시키고 (PCR 단편은 2개의 kpnl 부위 : mMT-1 프로모터 영역에 있는 단일의 천연 kpnl 부위 및 hEPO 서열에 있는 단일의 천연 kpnl부위를 함유함), 정제하였다. 플라스미드 pXEPOl (제 3도)을 또한 kpnl 으로 소화시켜서 1.4kb 단편 및 6.4kb 단편을 방출시켰다. 6.41kb 단편을 정제하여 1.4kb 의 Kpnl PCR 융합체 단편에 연결시겼다. 그 결과 생성된 구성물을 pT22.1 로 명명하였다. 두번째 중간체인 pT22.2 는 hEPO 구조 유전자의 업스트림에 놓여 있는 대략 6kb의 Hindlll-BamHl 단편(실시예 1f 참조)을 BamHl 및 Himdlll 로 소화된 pBSlISk+ (Stratagene, LaJolla, CA)에 연결 시킴으로써 구성하였다. 세번째 중간체인 pT22.3은 먼저 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자를 함유하고 있는 pMCINEOpolyA (Stratagene, LaJolla, CA)로부터 1.1kb 의 Xhol/BamHl 단편을 절출시킴으로써 구성하였다. 그런 다음 단편을 DNA 중합효소 1 의 클레노우 단편(New England Biolabs)으로 평활 말단으로 만들었다. 그런 다음, 이 단편을 pBSlISk+(DNA 중합효소 1 을 사용하여 유사하게 평활 말단으로 만들어짐)의 Hincll 부위에 연결시켜서 pT22.3 을 만들었다. 네번째 중간체인 pT22.4 는 pT22.3 으로부터 neo 유전자를 포함하고 있는 1.1kb 의 Xhol/Hindlll 단편을 정제하고 이 단편을 Xhol 및 Hindlll 로 소화된 pT22.2에 연결시킴으로써 만들었다. 그러므로 pT22.4는 hEPO 단편의 업스트림에 있는 BamHl-Hindlll의 Hindlll 쪽에 인접한 위치에 neo 유전자를 함유한다. 마지막으로, pXEPO-13 은 pT22.1 로부터 2.0kb 의 EcoRl/Accl 단편을 먼저 절출시킴으로써 생성시켰다. 이 단편의 EcoRl 부위는 mMT-1 프로모터의 5' 경계를 규정하는 한편, Accl 부위는 hEPO 엑손 5 내에 존재한다. 그러므로, Accl/EcoRl 단편은 거의 완전한 hEPO 발현 단위를 함유하며, 단지 엑손 5의 일부분과 천연 폴리아데닐화 부위만이 없다. 이러한 2.0kb 의 EccRl/Accl 단편을 정제하고, DNA 중합효소 1 의 클레노우 단편으로 처리하여 평활 말단으로 만든 후, Xhol 으로 소화된 블런트 단부의 pT22.4에 연결시켰다.
HT1080 세포들을 Pvul-BamHl 소화된 pXEPO-13 으로 트랜스펙팅시켰다. 이 방법으로 소화된 pXEPO-13 은 3개의 단편 : amp 유전자의 일부를 포함하는 1kb 의 벡터 단편, 나머지 벡터 서열의 1.7kb 단편 및 hEPO, neo 및 mMT-1 서열을 함유하는 대략 10kb 의 단편을 생성한다. 대략 10kb의 이러한 BamHl/Pvul 단편은 BamHl 부위로부터의 순서대로 하기 서열들을 함유하였다 . 대략 6.0kb 의 업스트림 hEPO 게놈 서열, 1.1km 의 neo 전사 단위, 0.7kb 의 mMT-1 프로모터 및 엑손 5 내에 절단된 hEPO 코딩서열을 함유하고 있는 2.0kb 의 단편. 이 방식으로 소화된 pXEPO-13 의 45μg 을 일천 이백만개의 세포를 일렉트로포레이션(일릭트로포레이션 조건은 실시예 1b 에서 설명한 바와 같다)에서 사용하였다. 이 일렉트로포레이션을 총 8회 반복하였고, 그 결과 총 9천 6백만개의 세포가 일렉트로포레이션되었다. 세포들을 ml 당 백만 세포의 밀도를 제공하도록 배지와 혼합하고, 1ml의 일정액을 총 96개의 150mm 조직배양 플레이트(Falcon)로 분배하였으며, 각각은 최소한 35ml 의 DMEM/l5% 소혈청을 함유하였다. 그 다음날, 배지를 흡인 제거하고 0.8mg/ml 의 G418 (gibco) 을 함유하는 새로운 배지로 교체하였다.
인큐베이팅한지 10일 후, 각각의 플레이트의 배지를 ELISA 분석에 의한 hEPO 에 대해 샘플링하였다(R & D Systems). 96개 플레이트 중 6개가 10mU/ml 이상의 hEPO 를 함유하였다. 이들 플레이트 중 하나인 #l8 을 hEPO 발현 콜로니의 정제를 위해 선택하였다. 96개 150mm 디쉬는 각각 약 600개의 G418 내성 콜로니를 함유하였다(모든 96 플레이트에 대해 평가된 총 G418 내성 콜로니의 수는 57,600개 이다). 플레이트 #l8 상에 있는 대략 600개의 콜로니들을 트립신으로 처리하고 364개의 웰 플레이트(Sterilin)에 ml 당 50개 세포로 리플레이팅하였다. 인큐베이팅한지 일주일 후에, 364 웰 플레이트의 큰 웰당 대략 10개 콜로니에서 단일 콜로니들이 가시화되었다(이들 플레이트는 24개의 큰 웰의 각각의 웰내에 있는 16개의 작은 웰로 구성된다). 각각의 웰을 이 시점에서 hEPO 발현에 대해 스크리닝하였다. 큰웰중 2개가 20mU/ml 이상의 hEPO 가 들어 있는 배지를 함유하였다. 웰 번호 A2가 16개의 작은 웰 중에 분배되어 있는 15개 콜로니를 함유하는 것으로 발견되었다. 각각의 이들 작은 웰의 내용물을 트립신으로 처리하고 96 웰 플레이트의 16개의 개별적인 웰에 옮겼다. 인큐베이팅 한지 7일 후에, 각각의 이들 웰로부터의 배지를 hEPO ELISA 분석을 위해 샘플링하였다. 단지 하나의 웰(웰 번호 10)이 hEPO 를 함유하였다. 이 세포 스트레인을 HT165-l8A2-10 으로 표시하고, 정량적인 hEPO 분석, RNA 단리 및 DNA 단리를 위해 배양액중에서 증식시켰다. hEPO 생성의 정량적인 측정결과 2,500 mU/106세포/24시간의 값을 얻었다.
hEPO 엑손 5 의 Accl 부위로부터 3'의 미번역 영역의 Bglll 부위로 연장되는 0.2kb 의 DNA 프로브를 사용하여 HT165-l8A2-10 세포로부터 단리된 RNA 를 프로빙하였다. 엑손 5 내에 있는 Accl 부위에서 절단된 표적화 구성물, pXEEPO-13 은 이들 Accl/Bglll 서열을 함유하지 않으므로, hEPO유전자좌에서의 표적화에 의해 진단적이다. 천연 hEPO 서열과 동종방식 으로 재조합되는 세포 스트레인만이 Accl/Bglll 서열과 상동인 서열을 함유하는 hEPO mRNA 를 생성할 것이다. HT165-l8A2-10은 노던 블롯에서 32-P표지된 Accl/Bglll hEPO 프로브와 혼성화되는 예측된 크기의 mRNA를 발현 하는 것으로 밝혀졌다. 제한효소 및 서던 분석은 neo 유전자 및 mMT-1 프로모터가 HT165-l8A2-10세포에서 2개의 hEPO 대립형질중 하나에 대해 표적화되었음을 확인시켜 주었다.
이들 결과는 동종 재조합이 사람 섬유아세포에서 정상적으로 사일런트인 유전자에 조절 영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있으며, 그 결과 그 유전자의 기능직 활성화를 유발함을 입증해준다.
22.1 5' CACCTAAAAT GATCTCTCTG G (SEQ ID NO 14)
22.2 5' CGCGCCGGGT GACCACACCG GGGGCCCTAG ATCTGGTGAA
GCTGGAGCTA CGGAGTAA (SEQ ID NO 15)
22.3 5' TTACTCCGTA GCTCCAGCTT CACCAGATCT AGGCCCCCG
GTGTGGTCAC CCGGCGCG (SEQ ID NO 16)
22.4 5' GTCTCACCGT GATATTCTCG G (SEQ ID NO 17)
실시예 5. 인트론이 없는 유전자의 제조
유전자 표적화는 또한 유전자 발현 및 시험관내 단백질 제조를 위해 효모 또는 박테리아에 전달하기 위한, 인트론이 없는 프로세싱된 유전자를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, hGH 는 효모에서 하기에 설명되는 방법에 의해 제조될 수 있다.
2개의 별도의 표적화 구성물을 제조한다. 표적화 구성물 1 (TC1)은 레트로바이러스 LTR 서열, 예컨대 몰로니 취과동물 백혈병 바이러스(MoMLV)로부터의 LTR, 사람 세포에서의 선택을 위한 마아커(예컨대 Tn5로 부터의 neo 유전자), 효모에서의 선택을 위한 마아커(예컨대 효모 URA3 유전자), 효모에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 조절 영역(예컨대 GAL4 프로모터), 및 임의로 hGH 에 융합될 때 효모 세포로부터 hGH 의 분비를 가능하게 할 서열(리더서열)을 포함한다. 벡터는 또한 사람 세포에서 레트로 바이러스 폐키징을 가능하게 하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 구성물은 상기 서열들이 양 측면상에서 게놈 hGH 유전자 N 서열과 동종 재조합이 일어날 때 hGH 유전자 N 코돈 1 (성숙한 프로세싱된 단백질의 아미노산 위치 1 에 상응함)의 바로 업스트림에 TC1 중의 외인성 서열을 통합시킬 hGH 게놈 서열에 의해 플랭킹되도록 조직화된다. 통합이 일어날 때 DNA 서열의 순서는 다음과 같다 : hGH 업스트림 및 조절 서열, neo 유전자, LTR, URA3 유전자, GAL4프로모터, 효모 리더 서열, 성숙한 단백질의 아미노산 1 을 포함하고 이것의 다운스트림에 있는 hGH 서열들. 표적화 구성물 2 (TC2)는 효모에서 플라스미드가 복제되기에 충분한 서열(예컨대 2-미크론 써클 또는 ARS 서열), 효모 전사 종결 서열, 바이러스 LTR, 및 사람 세포에서의 선택을 위한 마아커 유전자 (예컨대 박테리아 gpt유전자)를 포함한다. 구성물은 상기 서열들이 게놈 hGH 유전자 N 서열과 동종 재조합이 일어날 때 hGH 유전자 N 정지 코돈의 바로 다운스트림에 TC2 중의 외인성 서열을 통합시킬 hGH 게놈 서열에 의해 양쪽에서 플랭킹되도록 조직화된다. 통합이 일어날 때 DNA 서열들의 순서는 다음과 같다 : hGH 엑손은 5 서열, 효모 전사 종결 서열, 효모 플라스미드 복제 서열, LTR, gpt 유전자, hGH 3' 미번역 서열.
TC1 및 TC2 로부터 유래된 선형 단편을 hGH 유전자를 플랭킹하는 그것들의 각각의 위치에 대해 차례로 표적화한다. 이들 세포를 헬퍼 레트로 바이러스로 초감염시킨 후, 이 영역을 통한 LTR 유도된 전사는 양쪽 말단상에 LTR 서열을 가지는 RNA를 유발할 것이다. 이 RNA의 스플라이싱은 정상적인 hGH 인트론이 제거된 분자를 생성할 것이다. 프로세싱된 전사체의 역전사는 프로세스된 hGH 융합 유전자의 이중 가닥의 DNA 복사체의 축적을 유발할 것이다. DNA를 이중 표적화되고 레트로바이러스로 감염된 세포로부터 단리하여 LTR 내에서 전사 단위를 1회 절단하는 효소로 1회 소화시킨다. 소화된 물질을 원형화를 촉진하는 조건하에서 연결시키고, 효모 세포안에 도입시킨 후, 세포를 계속하여 URA3 유전자에 대한 선택을 위해 노출 시킨다. URA3 유전자(TC1 및 TC2에 의해 도입된 서열 및 프로세싱된 hGH 유전자에 의해 도입된 서열에 결합됨)를 취한 세포만이 성장할 수 있었다. 이들 세포들은 갈락토오스 유도시 hGH 단백질을 발현할 것이고 성숙한 생물학적으로 활성의 hGH 분자를 생성하기 위해 분비될 때 절단될 융합된 효모 리더 펩티드 서열에 의하여 세포로부터 hGH 단백질을 분비할 플라스미드를 함유한다.
박테리아 세포에서의 발현은 TC1 및 TC2 에서, 단순히 pBR322 로 부터의 암피실린-내성 유전자를 효모 URA3 유전자로, tac 프로모터 [참고문헌: deBoer etal., Proc. Natl, Acad. Sci, 80 : 21-25 (1983)]를 효모 GAL4 프로모터로, 박테리아 리더 서열을 효모 리더 서열로, pBR322 복제 기원을 2-미크론 써클 또는 ARS 서열로, 및 박테리아 전사 종결[예컨대 trpA 전사 터미네이터 ; Christie, G. E. et al., Proc. narl. Acad. Sci 78 : 4180-4184(1981)] 서열을 효모 전사 종결 서열로 대체함으로써 이루어진다. 마찬가지로, hEPO는 단순히 hEPO 표적화 서열을 hEPO 표적화 서열로 대체하여, 효모 또는 박테리아 리더 서열이 hEPO 코돈 1 (성숙한 단백질의 아미노산 위에 1 에 상응함)의 바로 업스트림에 위치하게 함으로써 효모 및 박테리아에서 발현될 수 있다.
실시예 6. 불멸화된 사람 세포 계통에서의 EPO 유전자의 활성화 및 증폭
dhfr 발현 단위의 pXEPO-13 (실시예 4참조)의 유일한 Hindlll 부위안 으로의통합은 이중 선택 및 dhfr 유전자가 증폭된 세포를 선택할 수 있는 새로운 표적화 벡터를 초래한다. pXEPO-13 중에 있는 단일 Hindlll 부위는 neo 유전자 및 사람의 EPO 유전자의 업스트림에 천연적으로 있는 게놈 서열의 접점을 규정한다. 이 부위에 dhfr 유전자를 정위시키는 것은 천연의 EPO 유전자좌로부터 유래된 DNA 서열에 의해 둘러싸인 neo 및 dhfr 유전자를 지닌 구성물을 제공한다. pXEPO-13과 같이 이것은 동종 재조합에 의해 EPO 유전자좌에 대해 표적화하기에 유용하다. 그러한 구성물은 pREPO4로 표시되고, 제 8도에 도시된다. 플라스미드는 사람의 EPO유전자의 엑손 5의 일부 및 엑손 1-4뿐만 아니라, hEPO 코딩 영역의 업스트립에 있는 Hindlll - BamHl 단편을 포함한다. pSVe, pTk 및 pmMT-1 는 SV40 초기 영역, 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나아제 (TK) 유전자 및 마우스 메탈로티오네인-1 유전자로부터의 프로모터에 상응한다. 이것은 하기와 같이 생성하였다 : Hindlll - 소화된 pXEPO-13 을 정제하여 DNA 중합효소 1 의 클레노우 단편으로 평활 말단으로 만들었다. dhfr 발현 단위를 얻기 위해, 플라스미드 구성물 pF8CIS9080 (Eaton et al., Biochemistry 25 : 8343-8347 (1986))을 EcoRl 및 Sall 로 소화시켰다. 이 소화물로부터 dhfr 발현 단위를 함유한 2kb 단편을 정제하여 DNA 중합효소 1 의 클레노우 단편으로 평활 말단으로 만들었다. 이 dhfr - 함유 단편을 pXEEPO-13의 평활 Hindlll 부위에 결찰시켰다. 이 결찰물의 일정분획을 대장균안으로 형질전환 시켜 암피실린 선택 플레이트상에 플레이팅하였다. 37℃ 에서 밤새 인큐베이팅 한후, 각각의 박테리아 콜로니를 관찰하여 선별하여 성장시켰다. 이 배양액으로부터 미니플라스미드 프리퍼레이션을 만들었으며, 생성된 DNA를 효소, Bgll + Hindlll, 및Sfil 으로 제한효소 분해시켜서, 삽입된 dhfr 단편들의 배향을 결정하였다. 이들 프리퍼레이션 중 하나로부터의 플라스미드 DNA는 dhfr 단편의 2kb 삽입체를 함유함을 밝혀냈다. 상기 플라스미드중에서 dhfr 발현 단위의 전사 배향은 근접한 neo 유전자의 배향에 반대됨을 밝혀냈다. 이 구성물을 pREPO4로 표시하였다.
플라스미드 pREPO4를 동종 재조합에 의해 내인성 hEPO 유전자를 활성화시킨 후 세포중에서 hEPO 유전자좌를 증폭시키기 위해 사용하였다.
이러한 구성물을 사용한 유전자 활성화는 약제 메토트렉세이트(MTX)를 사용함으로써 증가된 DHFR 발현의 선택을 가능하게 한다. 전형적으로, 증가된 DHFR 발현은 DNA 증폭을 통한 복사체 수의 증가에 의해 발생할 것이다.
순수한 결과는 dhfr 서열과 함께 활성화된 EPO 유전자의 공-증폭일 것이다.
활성화된 EPO 유전자whk의 공-증폭은 EPO 발현을 증가시킬 수 있다.
표적화 실험은 pREPO4를 사용하여 HT1080 세포에서 수행하였다.
hEPO 발현 계통 HTREPO-52를 단리하였다. 이 계통을 EPO 생성에 대해서는 서던 및 노던 블롯에 의해 정량적으로 분석하였다. 2가지 스트레인 모두 dhfr/neo/mMT-1 서열의 단일 복사체로 표적화되는 것으로 밝혀졌다.
0.8mg/ml 의 G418 선택하에서 얻어진 발현수준은 약 1300mU/106세포/1일이었다. 표적화된 EPO유전자좌가 dhfr 발현 단위를 함유하기 때문에, 안티플레이트 약제, MTX에 의해 DHFR의 증가된 발현을 선택할 수 있었다. 따라서, 이러한 스트레인은 0.02, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4μM 의 MTX 로 단계적 선택하였다. 이 스트레인의 대량 배양물의 초기 선택 결과는 하기 표 4 및 제 7도에 나타난다.
표4
MTX의 상술된 수준과 관련된 선택은 계통 HTREPO-52 에서의 EPO 발현 증가에 성공적이었으며, 0.4μM MTX에 대해 내성인 세포 계통중에서 EPO 생성의 70배 증가가 관찰되었다. EPO 유전자좌의 증폭의 확인은 MTX - 내성 세포 계통중에서 서던 블롯 분석에 의해 달성되었으며, 이는 모체(비표적화된) hEPO 대립유전자에 비해 활성화된 hEPO 유전자좌의 복사체 수의 약 10배의 증가를 나타내었다.
Claims (47)
- 세포의 염섹체 DNA 내에 표적화된 유전자의 전사 부위의 업스트림에 존재하는 표적 부위와 동종 재조합되는 경우에 세포내에서 표적화된 유전자의 발현을 변조시키는 DNA 구성물로서, 제 8도에 도시된 플라스미드 pREPO4인 DNA구성물.
- 생체외에서 세포중의 표적화된 유전자의 발현을 변조 시키는 방법으로서,(a) 게놈이 (i) 내인성 조절 영역을 갖는 표적화된 유전자; 및(ii)표적 부위를 포함하는 세포를 제공하는 단계;(b) (i) 표적 부위와 상동인 표적화 서열,(ii) 외인성 조절 서열;(iii) 엑손;(iv) 증폭가능한 마아커를 코드화하는 서열의 다수의 복사체를 함유하는 세포의 선택을 가능케 하는 증폭가능한 마아커를 코드화하는 서열; 및(v) 엑손의 3' 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 스플라이스-도너 부위를 포함하는 DNA구성물을 제공하는 단계;(c) 세포를 DNA 구성물로 트랜스펙팅시켜 트랜스펙팅된 세포를 생성 시키는 단계;(d) 트랜스펙팅된 세포를 동종 재조합에 적합한 조건하에서 유지시켜, 게놈이 외인성 조절 서열, 구성물 유래된 엑손 및 구성물 유래된 스플라이스-도너 부위뿐만 아니라 표적화된 유전자의 모든 엑손을 포함하는 동종 재조합 세포를 생성시키는 단계;(e) 증폭가능한 마아커를 코드화하는 서열의 다수의 복사체를 갖는 세포를 선택하는 조건하에서 동종 재조합 세포를 배양시키는 단계; 및(f) 동종 재조합 세포를 외인성 조절 서열의 조절을 받는 전사에 적합한 조건하에 유지시켜서, 구성물 유래된 엑손, 표적화된 유전자 및 구성물 유래된 엑손과 표적화된 유전자 사이에 있는 임의 서열의 전사체를 생성시켜, 구성물 유래된 스플라이스-도너 부위에 상응하는 전사체의 RNA가 표적화된 유전자내의 부위에 상응하는 전사체의 스플라이스-억셉터 부위에 대한 스플라이싱을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,전사체의 스플라이스-억셉터 부위가 표적화된 유전자의 제 2 엑손의 스플라이스-억셉터 부위에 상응함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,구성물 유래된 엑손이 CAP 부위를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서,구성물 유래된 엑손이 누클레오티드 서열 ATG를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,동종 재조합 세포중에서, 단계 (b) 의 성분 (ii) 내지 (iv)가 표적화된 유전자의 내인성 조절 영역의 업스트림에 위치함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,DNA 구성물이 표적화된 유전자의 내인성 조절 서열의 업스트림에 위치한 서열과 상동인 제 2 표적화 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 치료 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 호르몬, 시토카인, 항원, 항체, 효소, 응고 인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질 또는 전사 인자를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 칼시토닌, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린 유사 성장인자, 부갑상선 호르몬, 신경 성장 인자, 인터루킨, 면역글로불린, 촉매성 항체, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 조직플라스미노겐 활성화물질, 혈액 응고 인자 Vlll, 아포리포단백질 E, 아포리포 단백질 A-1, 글로빈, 저밀도 지단백질 수용체, IL-2 수용체, IL-2 수용체 길항물질, 알파-1 안티트립신 및 면역 반응 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 함에 있어서,표적화된 유전자가 성장 흐르몬을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,외인성 조절 서열에 프로모터, 인핸서,스카폴드 부착 영역 또는 전사 인자 결합 부위임을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서,DNA 구성물이 제 2 조절 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서,외인성 조절 서열이 SV-40 유전자의 조절 서열, 사이토메갈로바이러스 유전자의 조절 서열 또는 마우스 메탈로티오네인-1 유전자의 조절 서열임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,(g) 동종 재조합 세포를 전사체의 스플라이싱 및 번역에 적합한 조건하에 유지시키는 단계; 및(h) 전사체의 번역 생성물이 생성되었음을 확인하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서,표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항의 방법에 의해 제조되고, 구성물 유래된 엑손에 의해 코드화된 제 1 아미노산 서열 및 표적화된 유전자의 일부 또는 전부에 의해 코드화된 제 2 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질로서, 제 1 아미노산 서열이 표적화된 유전자의 제 1 내인성 엑손에 의해 코드화된 아미노산 서열과 상이한 융합 단백질.
- 제 17 항에 있어서,표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제 17항에 있어서,서열이 사람 성장 호르몬 신호 펩티드의 아미노산 1-3을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 게놈내에 전사 단위가 혼입된 배양된 척추동물 세포로서, 전사 단위가 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 외인성 유전자의 3' 말단에 있는 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 스플라이스-도너 부위가 내인성 유전자의 제 2 내인성 엑손의 내인성 스플라이스-억셉터 부위에 작동적으로 결합되어 있고, 세포가 외인적으로 유래된 증폭가능한 마아커 유전자를 포함하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 칼시토닌, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, 신경 성장 인자, 인터루킨, 면역글로불린, 촉매성 항체, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, 조직플라스미노겐 활성화물질, 혈액 응고 인자 Vlll, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 A-1, 글로빈, 저밀도 지단백질 수용체, IL-2 수용체, IL-2 수용체 길항물질, 알파-1 안티트립신 및 면역 반응 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 성장 호르몬을 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 게놈내로 전사 단위가 혼입된 배양된 척추동물 세포로서,전사 단위가 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 외인성 유전자의 3' 말단에 있는 스플라이스-도너 부위를 포함하며, 전사 단위의 성분들 모두는 내인성 유전자의 내인성 전사 개시 부위의 업스트림에 위치하고, 스플라이스-도너 부위가 내인성 유전자의 제 2 내인성 액손의 내인성 스플라이스-억셉터 부위에 작동적으로 결합되어 있고, 세포가 라지(Raji) 세포, 쥬르카트(Jurkat) 세포, 나말와(Namalwa) 세포, HL-60 세포, 다우디(Daudi) 세포, RPMI 8226 세포, U-937 세포, 보우스(Bowes) 흑색종 세포, Wl-38VA13 서브라인 2R4 세포 및 MOLT-4세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
- 제 2 항에 있어서,증폭가능한 마아커가 디히드로폴레이즈트 환원효소, 아데노신 아미노기이탈효소, 및 삼중기능성 효소인 카르바모일 포스페이트 합성효소-아스파테이트 트랜스카르바밀라아제-디히드로오로타아제(CAD)로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 세포가 사람 기원임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 세포가 1차 또는 2차 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,세포가 불멸화된 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,세포가 불멸화된 사람 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,세포가 HT1080 세포, HeLa 세포, MCF-7 유방암 세포, K-562 백혈병 세포, KB 암종 세포, 2780AD 난소 암종 세포, 라지(Raji) 세포, 쥬르카트(Jurkat) 세포, 나말와(Namalwa) 세포, HL-60 세포, 다우디(Daudi) 세포, RPMI 8226 세포, MOLT-4세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 마우스 L 세포로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 인터페론을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 혈액 응고 인자 IX를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 글루코셀[브로시다아제를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 콜로니 자극 인자를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서,표적화된 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 34 항에 있어서,구성물 유래된 엑손이 에리트로포이에킨의 제 1 엑손의 코딩 서열과 동일한 코딩 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 34 항에 있어서,구성물 유래된 엑손이 에리트로포이에틴의 제 1 엑손의 코딩 서열과 상이한 코딩 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 34 항에 있어서,구성물 유래된 엑손이 사람 성장 호르몬의 제 1 엑손의 코딩 서열과 동일한 코딩 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 인터페론을 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 혈액 응고 인자 IX를 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 글루코세레브로시다아제를 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 콜로니 자극 인자를 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20 항에 있어서,내인성 유전자가 에리트로포이에틴을 코드화함을 특징으로 하는 세포.
- 제 20항,제 21항,제 22항 제 23항 제 38 항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 배양된 척추동물 세포를 사람을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 사람을 제외한 포유동물에게 단백질을 제공 하는 방법으로서, 내인성 유전자가 단백질을 코드화하는 방법.
- 제 43항에 있어서,사람을 제외한 포유동물에게 도입되기 전에, 배양된 척추동물 세포가 장벽 장치의 내부로부터 장벽 장치의 외부로 단백질을 이동시킬 수 있는 장벽 장치내에 봉입됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 44 항에 있어서,장벽 장치가 세포가 장벽 장치로부터 이탈하는 것을 방지함을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서,DNA 구성물이 도 8에 도시된 플라스미드 pREPO4를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 20 항에 있어서,전사 단위가 도 8에 도시된 플라스미드 pREPO4로부터 유래됨을 특징으로 하는 세포 또는 이의 선조세포(ancestor).
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