KR100355246B1

KR100355246B1 - 단층라멜라리포좀성아라키돈산대사물질조성물을사용한치료방법

Info

Publication number: KR100355246B1
Application number: KR1019960702299A
Authority: KR
Inventors: 마크 제이. 오스트로; 앤드루 에스. 야노프; 샤르마 알. 민치
Original assignee: 더 리포좀 컴퍼니, 인코퍼레이티드
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2003-01-06
Also published as: NO961778L; NO312809B1; CA2175057A1; AU8130894A; NO312810B1; ATE191141T1; DK0726763T3; KR960705544A; EP0726764A1; DE69423773D1; EP0726763A1; EP0726764B1; ES2144118T3; KR960705543A; GR3033817T3; JPH09511216A; DE69420859T2; ES2136271T3; PT726763E; ATE184785T1

Abstract

본 발명은 프로스타글란딘 E1 과 같은 아라키돈산 대사물질을 동물에 투여하는 방법을 제공하는 것이다. 지질과 방출저해성 수용성 완충액으로 구성된 단층라멜라 리포좀과 연합된 대사물질은 일반적으로 사람인 동물에 투여될수 있다. 본 방법은 세포활성과 흡착, 염증 또는 독혈증을 특징으로 하는 질환을 가진 동물의 치료에 사용될수 있다.

Description

단층라멜라 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물을 사용한 치료방법

제 1 도는 혈소판응집에서 LUV-PGE1 의 효과를 나타낸다. LOV-PGE1("C-53"; 하기실시예1에 따라 제시된 과정으로 준비됨) X축; 콘트롤, 동물 체중당 0.1μg, 0.6μg, 1.1μg 과 1.1μg 후 투여 LUV-PEG1(짙은쪽: 콜라겔; 옅은쪽:U46613). Y축:콘트롤 %.

제 2 도는 처리된/콘트롤 개에서 심장속도와 실험시간을 나타낸다. □ :LUV-PEG1; △ :콘트롤, * : 빈리포좀; ◇ : 자유 PGE1.

제 3 도는 실험시간 대 좌측동맥 압력을 나타낸다.

□ :LUV-PGE1; △ :콘트롤; * : 빈리포좀; ◇ : 자유 PGE1.

제 4 도는 위험시에 지역 %에서 경색크기를 나타낸다.

X축: LUV-PGE1; 자유 PGE1, 빈리포좀, 콘트롤,

Y축: 경색크기/위험지역(%).

제 5 도는 심근조직에서 미엘로퍼옥시다제 방출을 나타낸다.

X축: 경색지역, 광역지역, 위험지역, 콘트롤지역

(▤: 콘트롤; ▥: 빈리포좀; ▨: 자유 PGE1; ▧: LUV-PGE1.

제 6 도는 LUV-PGE1 처리로 피부 화상후 폐손상 예방을 나타낸다.

X축:콘트롤, 화상, 화상+LUV-PGE1.

Y축: 알부민 누출 %(cpm right lung/cpm blood).

제 7 도는 기관내로 IL-1 을 제공한 쥐에서 폐누출에 빈리포좀 또는 자유 PGE1 의 효과를 나타낸다.

X축: 염콘트롤, IL-1, IL-1+LUV-PGE1, IL-1+빈리포좀, IL-1+자유 PGE1. Y축: 폐누수(cpmlung/cpm 혈액).

제 8 도는 쥐의 엔도톡시마 모델. X축: LPS 투여후 시간(날); Y축: 처리집단에서 생존빈도. □: 염콘트롤 (0μg/kg LPS)를 투여받은 쥐; ○: 10μg/kg LPS 를 투여받은 쥐; ◆: 15μg/kg LPS 을 투여받은 쥐; ◇:25μg/kg LPS 를 투여 받은쥐; ▲ :50μg/kg LPS 를 투여받은 쥐; △:75μg/kg LPS 를 투여받은 쥐; ●:100μg/kg LPS를 투여받은 쥐.

제 9 도는 리포풀리사카라이드(LPS)에 반응하여 사람 단세포 TNFα와 IL-1β의 분비저해를 나타낸다.

X축:자유 PGE1, LUV-PGE1(실시예에 따라 준비되고 PGE1 을 포함하는 단층라멜라 리포좀), 위약 LUVs (PGE1 을 포함하지 않은 큰 단층라멜라 리포좀), 위약 LUVs+자유 PGE1. Y축TNF α 와 IL-1β 분비의 저해 음영이 없는 부분:TNFα; 음영부분: IL-1β.

제 10 도는 LPS-유도된 치사율의 감쇠. X축:LPS 투여후시간(날); Y축:처리집단의 생존율; ■:염콘트롤 (LPS 가 투여안됨); ◆:LUV-PGE1; ◇:위약 LUVs+자유 PGE1; ▲; 위약 LUVs; △;LPS 콘트롤(리포좀 없거나 또는 PGE1 이 없음); □: 자유 PGE1.

제 11 도는 자유 PGE1-유도된 치사율의 제거. X축:염용액 (LPS, PGE1 또는 리포좀없음), LPS 콘트롤(LPS, 단 리포좀 또는 PGE1은 없음), LUV-PGE1, 위약 LUVs+자유 PGE1, 라텍스 소포+자유 PGE1, 위약 LUVs, 라텍스 소포; Y축:처리집단에서 생존율.

본 출원은 1993년 11월 16일자 출원된 미국특허출원 08/152,852 의 연속출원의 일부이고, 1992년 11월 16일자 출원된 미국특허출원 07/821,648 의 연속출원의 일부이고, 이는 현재 미국특허 5,262,168 이고, 1988년 5월 18일자 출원된 미국특허출원 07/195,228 의 연속이고 이는 현재 미국특허 5,082,664 이고 이는 다시 1987년 5월 2일자 출원된 미국특허출원 053,305 의 연속 출원의 일부이고 이는 현재 포기되었으며, 본 출원은 또한 1994년 1월 11일자 출원된 미국연속출원 08/180,089 의 연속출원의 일부이고 이는 1993년 11월 4일자 출원된 미국출원 147,898 의 연속출원이며, 이는 현재 포기되었다. 본 출원은 단층라멜라 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물의 치료요법적 이용에 관계한다.

다양한 프로스타글란딘은 몇가지 집단(A-1)으로 분류할수 있는데 이는 프로스타글란딘 합성동안에 20개 탄소지방산 저구체내로 유입되는 5개탄소 고리에 다야한 치환체로 구분된다. 이들 집단은 또한 프로스타글란딘의 탄소사슬에 이중결합의 수와 위치에 따라 또한 세분될수 있다. 프로스타글란딘은 세포표면 수용체에 의해 이들의 표적세포에 활동하는 것으로 보여지는데 이들 수용체들은 프로스타글란딘 활동을 중재하는 제 2 메신저 시스템과 결합되어 있는 것으로 보인다. 프로스타글란딘은 광범위한 생물학적 활성을 가진다.

체내에 있는 효소는 프로스카글란딘을 신속히 비활성화시킨다. 이는 일반적으로 혈청내에 치료요법적으로 효과적인 수준을 유지시키기 위해 다량의 화합물을 빈번히 투여는 것이 요구되고 따라서 프로스타글란딘 치료비용이 증가하고 원하지 않는 부작용의 가능성도 유도한다. 또한, 프로스타글란딘의 비활성화는 혈액이 폐를 통과할때 주로 발생하므로 화합물은 일반적으로 동맥내 투여될수 있다. 리포좀성 조성물은 프로스타글란딘과 같은 아라키톤산 대사물질의 순환 반감기를 연장시킬수 있고 폐에서 이들의 비활성화를 피하는 것을 도울수 있다. 따라서 이와 같은 리포좀성 조성물이 또다른 치료요법적 용도를 제공할 수도 있다.

Mizishuma et al. (J. Rheumatol. 14:97 (1987) 와 Hoshi et al. (Drug. Expt1. Clin. Res. 12(8):681 (1986))는 프로스타글란딘 E1(PGE1)을 포함하는 지질소포에 대해 상술하였다. 그러나 Mizishuam et al. (U.S. Patent No. 4,493,847)와 Imagawa et al. (U.S. Patent No. 4,684,633)에서 상술한 것과 같이 이들 "소포"는 실제 프로스타글란딘을 포함하는 지질 유액이고 이는 리포좀이 아니다. 따라서 여기에서 제시하는 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물과 같은 동일한 성질이나 동일한 장점을 가지지 않는다. Shell and See (U.S. Patent Nos. 4,820,732 및 4,955,878)에서는 환자에 프로스타글란딘-함유 조성물을 투여하는 것과 관계하는 맥관형성 과정동안에 기능이상을 감소시키는 치료에 대해 상술하였다. 이들 조성물은 또한 담체를 포함할수도 있다. 그러나 탈수된 알코올과 염용액과 같이 여기에서 상술한 지질담체는 일반적으로 아라키돈산 대사물질의 지연방출을 제공하지는 않는다. 상술된 지방을 실온 소포담체는 직경이 적어도 7 미크론이되는 적혈구 세포와 같이 크거나 더클수도 있다. 동물에 이와 같은 큰크기의 입자투여는 소포가 폐 모세혈관과 같은 작은 혈관 벽에 엉겨붙기 때문에 어려움이 있다. 본 발명에서 사용된 리포좀은 대조적으로 최대크기가 5 미크론 정도이고, 적절하게는 50nm 내지 1 미크론이다. 이들 리포좀은 치료목적으로 동물에 안전하게 투여할수 있다.

약물을 리포좀에 넣는 것은 약물의 독성를 감소시키고 이의 효과를 증가시킴으로써 치료요법을 강화시킬수도 있다. 본 발명에서 이용된 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물은 독혈증질환, 염증성 질환과 같은 질병 또는 질환과 세포활성 그리고 흡착성 질환과 같은 것을 예방 또는 제거하는데 유용하다.

발명의 요약

본 발명은 동물에 아라키돈산 대사물질을 투여하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 제약학적 수용가능한 담체, 대사물질, 지질, 방출-저해성 수용성 완충액으로 구성된 단층라멜라 리포좀으로 이루어진 조성물을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 적절하게는 동물은 사람이고 투여는 정맥투여이다.

적절하게는, 단층라멜라 리포좀은 큰 단층라멜라 리포좀(LUV)이고 좀더 적절하게는 직경이 100nm 인 것이다. 적절하게는 동물에 투여되는 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘이고 더욱 적절하게는 프로스타글란딘 E 또는 1 시리즈, 최적으로는 프로스타글란딘 E1 이다. 적절하게는 지질은 포화된 아실사슬지질이고 좀더 적절하게는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이다. 적절하게는 완충액은 시트로산 완충액이고, 더욱 적절하게는 pH 가 4.5 인 시트르산 완충액이다.

본 발명의 방법은 세포활성, 흡착에 의한 질환, 염증, 독성에 의해 고통받는 동물의 치료에 사용될수 있다. 이와 같은 질병에는 재환류손상, 심근경색, 혈관-폐쇄질환, 성이니호흡 곤란 증후군(ARDS), 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 맥관염, 외상후 쇼크, 화상, 혈관-폐쇄질환, 관절염 질환 예로써 통풍, 류마티스 관절염 또는 팔라리 아트리스 그리고 자가면역질환 예로써 전신 홍반성 낭창, 청소년 당뇨, 다발성 경화증 또는 하시모토 갑상선염을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 특별히 적절하게는 ARDS 와 SIRS 이다.

아라키돈산 대사물질의 항-질환 효과량으로 구성된 리포좀 일정양을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 일반적으로, 대사물질의 항-질환 효과량은 동물 체중 Kg 당 대사물질 10^-12g 이고 일반적으로 Kg 당 10^-12내지 10^-3g이 된다. 바람직하게는 대사물질의 효과량은 체중당(Kg) 10^-8g 내지 10^-4g 이 된다. 더욱 바람직하게는 아라키돈산 대사물질의 효과량은 체중당 10^-6g 이 된다.

본 발명의 방법에 사용되는 리포좀은 건조보호제로 구성될수 있고 이들은 탈수되어 저장되고 사용전에 재구성될수도 있다. 건조 보호제는 적절하게는 엿당, 젖당, 설탕, 덱스트로즈, 라피노즈 또는 트레할로즈와 같은 사카라이드이다. 적절하게는 사카라이드 건조 보호제는 엿당이다.

본 발명의 방법은 항염증제 또는 항균제와 같은 추가의 생활성제를 동물에 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명은 동물에 아라키돈산 대사물질을 투여하는 방법을 제공한다. 방법은단층라멜라 리포좀과 관련된 아라키돈산 대사물질과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 조성물을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 적절하게는 동물은 사람이고 투여는 정맥투여로 구성된다.

여기에서 사용되는 "제약학적 수용가능한 담체"는 동물 특히 사람에게 생활성제의 투여와 연관하여 일반적으로 사용하는 표준 담체, 희석제, 부형제등을 말한다. 이와 같은 담체는 본 기술분야에 공지의 것이고 통상의 기술을 잘숙지한자에게 공지된 투여경로의 사용된 특정약물과 같은 다수의 인자에 의해 일반적으로 선택될 수 있는데 실험없이 결정할수도 있다. 적절한 담체에는 생리학적 염(물에 염화나트륨 10wt%) 용액 수용성 덱스트로즈용액 예로 D5W(물에 덱스트로즈 5 wt%)등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 제약학적 조성물은 방부제, 항-산화제와 같은 부형제가 추가로 포함될수 있고 이는 본 기술에 숙지된 자에게 공지이다.

리포좀은 양쪽성 지질부자의 하나이상의 이중층으로 구성된 자가-합체구조로 각 이중층은 수용성부분을 에워싸고 있다. 따라서 리포좀은 단일 지질이중층을 가지는 단층라멜라 또는 2개이상의 지질이중층을 가지는 다층 라멜라가 될수 있다. 본 발명의 리포좀은 단층라멜라 리포좀이다. 적절하게는 리포좀은 큰 단층라멜라 리포좀(LUV)이고 좀더 적절하게는 직경이 100nm 인 LUV 이다.

리포좀은 본 기술에 숙지된자에 공지인 다양한 기술에 의해 준비될수 있다. Deamer and Uster, "Liposome Preparation; Methods and Mechanisms," in: Liposomes (M. Ostro, ed.), Marcedl Dekker (New York), pp. 27-51 (1983); Cullis et al., in:Liposomes, From Biophysics to Therapeutics (M. J. Ostro,ed.), Marcel Dekker, pp. 39-72 (1987)). Bangham's 과정(J. Mol. Biol. 13:238 (1965)은 "통상"의 다층라멜라 소포(MLVs) 즉 2개이상의 지질 이중층의 리포좀을 생산하고 하나이상의 유기용매에 하나이상의 양쪽성 지질을 용해시키는 것으로 구성된다. 그다음 지질은 건조시키고, 건조된 지질은 MLVs 를 형성하기 위해 수용액으로 수화시킨다. Lenk et al. (U.S. Patent Nos. 4,522,803, 5,030,453 and 5,169,637), Fountain et al. (U.S. Patent No. 4,588,578) 와 Cullis et al. (U.S. Patent No. 4,975,282)은 이들의 수용성 격실에 포획된 용질을 가지는 다층라멜라 리포좀을 생산하는 방법을 상술한다. 각 격실에 있는 용질의 농도는 실제 동일하다. 단층라멜라 리포좀은 에테르 또는 에탄올 주사 또는 주입방법에 의해 형성될수 있다. 단층라멜라 리포좀은 Cullis et al. (U.S. Patent No. 4,975,282) and Loughrey et al. (U.S. Patent No. 5,059.421)에 따라 일정한 포어크기의 필터를 통하여 압력하에 다층라멜라 리포좀 압출에 의해 다층라멜라 리포좀에서 생산될 수도 있다. 압출과 균질화, 밀링 초음파분쇄 그리고 프렌치 프레스와 같은 과정으로 리포좀의 크기를 감소시킬수 있는데 이와 같은 과정은 리포좀의 냉동-분절 전자현미경 검사와 콰시-전자광 스케터링과 같은 과정에 의해 결정될수도 있다.

"아라키돈산 대사물질"은 프로스타글란딘 또는 동물의 체내 또는 인공적인 조건에서 플스타글란딘으로 전환될수 있는 화합물이다. 프로스타글란딘은 5개탄소 고리와 7개와 8개탄소 사슬을 포함하는 20-탄소 지방산 집단인데 이는 아라키돈산과 적어도 세개 이중결합을 가지는 다른 20-탄소 지방산에서 만들어질수 있다(e.g., the "essential" fatty acids 8,11,14-eicosatrienoic acid,5,8,11,14-eicosatetraenoic acid or 5,8,11,14,17-eicosapentanoic acid; see, e.g., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, supra). 아라키돈산은 사람에게 가장 풍부한 20개 탄소 프로스타글란딘 전구물질이다.

20개 탄소 지방산 프로스타글란딘 전구체, 프로스타글란딘 합성동안에 형성된 중간물질 예로써 프로스탄산과 이들 화합물로 전환될수 있는 구조적 유사체들이 "아라키돈산 대사물질"이다. "프로스타글란딘-관련 화합물" 예로써 루코트리엔, 트롬보산, 리폭신과 프로스타사이클린은 프로스타티글란딘에 기능적으로 연관된 화합물을 포함하고, 이들은 20개 탄소 지방산 프로스타글란딘 전구체에서 유도될수도 있다. 프로스타글란딘, 프로스타글란딘-관련 화합물과 에코사노이드 그리고 이들 화합물로 전이될수 있는 구조적 유사체는 "아라키돈산 대사물질"이다. 적절하게는 본 발명에 따라 동물에 투여될수 있는 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘 적절하게는 E 또는 1 시리즈 프로스타글란딘이고 가장 적절하게는 프로스타글란딘 E1 이다.

리포좀과 아라키돈산 대사물질의 "연합"은 일반적으로 리포좀 수용성 격실내에 대사물질이 포획되거나 또는 리포좀 이중층중 내측 또는 외층 단층과 연합하는데 이는 대사물질과 단층성분 양쪽성 지질의 머리기 사이에 정전기적 상호작용에 의한 것이다. 본 발명의 단층라멜라 리포좀 조성물의 적절한 형성방밥은 Bally et al. (U.S. Patent No. 5,077,056)에서 기술한 바와 같은 막통과 농도차를 이용하여 Batzri et al., Biochim. et Biophys. Acta., 298:1015 (1973)의 기술과 유사한 에탄올에서 지질과 대사물질을 연합시키는 것이다. 이 기술에서 지질과 프로스타글란딘은 에탄올과 같은 수용성-혼합가능한 유기용매에 동시에 용해되고 그다음 제 1 수용액에 서서히 첨가한다. 선택적으로, 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT)와 같은 방부제가 용액에서 지질과 혼합될수 있다.

생성된 리포좀 분산액은 100nm 포어크기의 필털르 통하여 밀어냄으로써 좀더 균일한 집단으로 크기를 감소시킬수 있는데 필터는 직선통로 또는 비틀림 통로형이 될수도 있다. 이 과정에 사용되는 적합한 필터는 Anotec Separation 에서 만들어진 Anopore^TM필터와 같은 산화알루미늄 다공성막이다. 이와 같은 리포좀 집단은 미국특허 5,008,050 의 압출과정에 의해 형성될수도 있다. 압력하여 필터를 통하여 리포좀을 통과시키는 압출과정은 크기에 대해 리포좀을 균일한 집단으로 형성시키게 한다. 리포좀이 필터를 통하여 1회이상 통과할때 요구되는 통과횟수는 소요의 리포좀 크기를 얻기위해 필요한 것에 결정될수 있다.

본 발명에 이용된 필터크기는 최종 리포좀 생성물의 소요크기에 따라 선택될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 리포좀은 평균직경이 200nm 이하가 적절하다. 본 발명에 사용된 개별 리포좀은 직경이 500nm 이하가 된다. 좀더 적절하게는 리포좀은 100nm 직경을 가는데 이는 이 크기의 리포좀이 폐의 모세상을 통하여 통과할수 있는 것으로 알려지고 따라서 다른 기관과 조직을 통하여 통과할수 있을 것이기 때문이다. 따라서 약 100nm 의 포어크기를 가지는 필터는 압출단계에서 적절하게 선택될수 있다. 크기가 감소된 리포좀은 220nm Millipack 필터를 통하여 통과하는 것과 같이 멸균여과 될수도 있다(Millipore, Inc., Bedford, MA).

본 발명의 방법에 사용된 단층라멜라 리포좀은 대사물질, 지질 그리고 방출 저해성 수용성 완충액으로 구성된다. 지질은 적절하게는 대사물질-지질 상호관계를 강화시키고 따라서 리포좀에서부터 대사물질의 방출을 저해시킨다. 이와 같은 지질이 방출-저해 지질"이다. 프로스타글란딘-지질 상호작용을 강화 시키는 경향이 있는 지질의 인자는 물과 다른 작은분자에 침투성이 적은 지질이중층을 만드는 경향이 있는 인자 예로써 반 데르 발스, 쌍극자-쌍극자 그리고 아실사슬 사이의 다른 상호작용 즉 아실사슬이 이중층에 좀더 근접하게 하는 등의 증가시키는 인자등이 포함되나 이에 한정시키지는 않는다. 예로써 이중충의 아실 사슬에서 이중결합의 수는 이중층에서 서로에 대해 사슬배열에 영향을 줄수도 있다. 이중결합의 수가 적을수록 아실사슬이 좀더 근접하게 포개어질수 있어 이중층에 프로스타글란딘 전이에 대한 장벽이 될수 있다. 따라서, 적절한 지질은 포화된 아실사슬이다. 포화된 아실사슬과 적절한 지질은 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC) 이다. 그러나 다른 포화된 사슬지질이 이용될수도 있다.

리포좀에서 수용성 완충액은 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질의 방출을 저해하거나 또는 막을수 있다. 이와 같은 수용성 완충액이 "방출-저해성 수용성 완충액"이다. 적절한 방출-저해 완충액의 특징은 대사물질과 정전기적 척력을 만들거나 또는 대사물질-지질 상호작용을 강화시키는 것을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 또한 더큰 완충성 능력의 완층액과 따라서 소요의 ph를 유지하는데 능력이 큰것이 방출-저해 완충액이 된다. 적절한 방출-저해성 완충액은 시트르산 완충액이고 특히 ph 4.5 인 시트르산이 된다.

본 발명의 방법은 세포활성 그리고 흡착 염증과 독성을 특징으로 하는 질환을 겪는 동물에 아라키돈산 대사물질을 투여하는데 이용된다. 이 방법은 항-질환 효과량의 대사물질로 구성된 리포좀 효과량을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 본 발명에 따라 치료가능한 질병은 재환류 손상, 전신 염증반응 증후군(SIRS), 성인호흡 곤란 증후군(ARDS), 심근경색, 맥관염, 화상, 외상후 쇼크, 맥관-차단질환, 류마티스 관절염, 통풍과 필라리 관절염과 같은 그리고 전신 홍반성 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경화증과 하시모토 갑상선염을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

특정질화은 세포 예로써 혈액에서 혈소판과 호중구의 비정상적 활성화와 이들의 결과적인 흡착 또는 주변 맥관내피에 활성화된 세포의 흡착을 특징으로 한다. 이와 같은 활성화의 흡착질환은 의료질병의 다양한 범주에서 문제가된다. 예로써 내피세포, 맥관, 프루랄, 심막 또는 복막내피세포등이 인터루킨-1 (IL-1)와 같은 사이토킨, 종양 괴사인자-알파(TNF-α) 또는 박테리아성 내독소에 의해 활성화될수 있다. 유사방식으로 혈액세포, 특히 호중구와 혈소판은 GM-CSF, 박테리아성 내독소, 박테리아성 화학물질, TNF-α 와 상보적인 C5a 성분과 같은 물질에 의해 활성화될수있다.

활성화된 세포는 서로 부착될수 있는 이들의 표면에 흡착부위를 가진다. 활성화된 그리고 부착된 세포는 덩어리를 형성하고 폐와 심장과 같은데서 볼수 있는 작은 혈관에 엉겨붙어 주변조직으로 혈액의 흐름을 감소시킨다. 활성화된 세포는 활성화된 맥관내피세포에 헙착할수 있고 이와 같은 흡착은 맥관내피의 연속적인 알갱이 분해를 유도하거나 또는 세포손상을 시키는 중간물질 예로 슈퍼옥사이드 음이온(O₂ ^-)와 단백질 분해성 효소등의 방출을 유도한다.

본 발명에서 세포활성과 흡착질환중에는 재환류 질환이 있는데 이는 폐쇄된 혈관벽의 재환류에 관계하거나 또는 혈액이 일시적으로 중단되는 외과술이다(Seewaldt-Becker et al., "Effect of Anti-Adhesive Antibodies on Reperfusion Injury," (Springer et al., eds.) in:Leukocyte Adhesion Molecules, Springer- Verlag, New York (1990) pp. 138:148; and "Adhesion in Disease and Therapy," (Springer et al., eds.), in:Leukocyte Adhesion Molecules, Springer-Verlag, New York (1990), pp. 85-156)). 혈관벽에 차단이 있을경우에 주변내피세포와 하류 허혈조직이 손상받을수 있다. 차단이 제거되었을때 내피세포가 추가로 손상될수도 있다. 이와 같은 손상은 혈액흐름이 손상된 지역에서 복구후에 호중구와 혈소판의 활성화를 유도한다.

활성화되고 연속하여 세포간 흡착이 있는 일부세포는 아라키돈산 대사물질에 대한 표면수용체를 가진다. 이론에 한정됨이 없이 이들 수용체에 결합함으로써 아라키돈산 대사 물질로의 치료는 세포간 흡착의 상승된 수준을 책임지고있는 세포표면 수용체를 비활성화시킴으로써, 세포활성과 흡착 질환 관련 손상을 감소시킬수도 있다.

PGE1 과 PGE2 는 개에서 관상동맥 주변에 차단자 기구를 배치함으로써 심근경색의 자극후에 재환류된 경색크기를 감소 시키는데는 효과가 약한 것으로 나타났다(Jugdutt et al., "Dissimilacts of Prostacycn, Prostaglandin E ProstaglandinMyocardial Infarct Ze after Coronarusion in Conscious," Circulation CH, 49(3):685-700 981). 보고된 테스트에 따르면, 6시간이상 지속적인 동맥주입을 경유하여 프로스타글란딘이 투여되면 약물은 상대적으로 많은 양이 투여되게된다. 지속적인 주입에 필요한 PGE1 과 같은 자유 비-리포좀성 프로스타글란딘이 생체내에서는 상당히 짧은 반감기를 가지고 혈액에서 효과적인 수준을 유지하기 위해서는 지속적으로 보충되어야 한다. 또한, 프로스타글란딘은 폐를 통해 열액이 통과할때 단순한 정맥투여보다는 동맥주입이 필요하고 프로스타글란딘은 신속하게 비활성화 된다. 또한, 생체내에서 PGE1 의 상당수준의 분포는 저혈압, 심박급속증과 설사와 같은 전신적 효과를 유도하는 것으로 공지되어 있다.

환자가 쇼크, 화상, 폐혈증, 흡인호흡과 식용이상항진과 같은 ARDS 로 유도되는 경우에 있게될때 신체에서 폐보다는 다른 많은 기관이 영향을 받게된다. 이와 같은 상태의 원인과 임상적 과정은 매우 다양하다. 가령, 심각한 감염성 있는 환자에서는 엔도톡신이 세균 세포벽으로부터 방출되고, 염증성 과정이 시작되어 폐혈증 쇼크가된다. 다시, 폐혈증/쇼크 증상이 감염의 원인인 것에 한정하지는 않지만 엔도톡신이 관련안될수도 있으나 그럼에도 불구하고 TNF, IL-1 상보체와 루코트린엔 같은 인자의 방출을 촉진시킨다.

맥관 형성술은 기구를 폐쇄된 동맥내에 삽입시키고 팽창시켜 차단된 혈관을 개방시키는 기술에 관계한다. 이 기술이 관상동맥 질병의 조절에 매우 일상적이기는 하지만 이 과정이후에 6개월간 치료받은 환자의 33% 이상이 이미 개방된 혈관의 재폐쇄를 경험하게된다. 이 상태는 기구과정으로 인한 맥관 내피세포에서의 손상으로 개시되는 것으로 보인다. 노출된 세포의 매트릭스는 활성화된 혈소판의 몇개층에 신속히 결합하게된다. 일단 혈소판이 결합하면, 다양한 성장인자를 방출하게 되고 이로써 혈관이 다시 차단될 위치의 혈관 아래에 있는 연근세포의 증식을 초래하게된다. 혈소판이 세포의 매질에 결합되는 것을 방지함으로써, 재폐쇄를 유도하는 일련의 과정을 차단할수 있다. 따라서, 맥관형성 과정에 혈소판 흡착을 막는 약물의 급속한 투여는 재차단을 방지하게된다.

최근에 De Servi et al., European Heart Journal, "Prostaglandin E administration in unstable angina patients undergoing PTCA; preliminary results", August 1990. 는 맥관형성술전에 관상동맥내로 PGE1 을 투여한 불안정한 안기나[인후, 편도선의 염증; (angina)] 환자의 임상적 시도 결과에 대해 발표하였다. 약물은 24시간동안 주입되었다. 이 연구결과에서 PGE1-처리집단에서 맥관형성술이후 6개월간 재협착증 발생율은 처리안된 집단보다 약 50% 가 감소되었다. 단 PGE1 처리는 24시간 지속시켰다.

급성 심근경색(좀더 일상적인 말로는 심장마비)은 응혈에 의해 심장근육에 혈액공급이 차단됨을 말한다. 혈액이 장시간 심장에 도달하지 못하는 경우 환자는 죽게된다. 관상동맥 차단이 일어날때 환자는 조직 플라시미노겐 활성인자(tPA) 또는 스트렙토키나제와 같은 섬유분해제로 처리하여 응혈을 녹이고 차단은 자체 해결되수 있다. 이 두경우에, 혈류는 심장의 허혈(산소-결합된) 부위에 재공급된다. 심장으로의 혈액의 재흐름이 재환류라 한다. 재환류는 환자의 삶을 구하는데 필수적이나 심장근육에 추가손상 즉 재환류 손상이 있을수 있다. 재환류 송산은 염증성카스케이드의 최종결과로 공지되어 있다.

응혈제거후에 재화류 손상에 추가하여 심근경색으로 고통받는 환자는 다른 2차문제로 고통을 받을수 있다. 예로써, 정상적인 혈류를 심장으로 복원한후에 호중구와 혈소판이 모두 활성화된다. 활성화도니 혈소판은 서로 흡착되고 관상동맥을 재차단하게되어 심장으로의 혈류속도가 시간이 지남에 따라 감소되는 상황이 된다. 일부 경우에 완전하 재차단이 일어날수 있다. 내피세포에 호중구의 결합을 방지하는데 더하여 PGE1 은 혈소판 응집을 막거나 감소시켜 제거되지 않는 경우에는 재환류 현상이 없다.

Sherma et al., The American Journal of Cardiology, "intracoronary Prostaglandin E1 Plus Strepatakinase in Acute Myocardial Infarction", page 1161, Dec. 1986, vol. 58 는 급성 심근경색의 임상적 세팅에서 관상동맥내 스트렙토키나제와 함께 서서히 관상동맥 주입에 의해 자유 PGE1 의 투여는 관상동맥내 스트렙토키나제 단독만의 콘트롤 집단과 비교하였을때 양성의 임상적 결과를 제공한다. 이 결과에서 재환류까지 시간이 감소 되었고, 요구되는 스트렙토키나제의 약량이 감소되고, 10일후에 혈관환자의 % 가 증가된 것으로 나타났다. 이 연구에서의 단점은 서서히 관상동맥으로 약물주입이 매우 성가시고 특별한 기술도구와 숙달된 조수가 요구된다. 이 방식에는 혈압이 상당히 떨어지는 것을 볼수 있기 때문에 PGE1 의 신중한 적정양이 요구된다.

염증은 손상에 반응하여 손상된 혈관과 주변조직에서 일어나는 세포학적 그리고 조직학적 반응과정이다(Stedman's Medical Dictionary (IIIustrated) (24thedition, J.V. Basmajian et al., eds.), williams and Wilkins, Baltimore, MD (1982), pp. 707-708). 이와 같은 자극에 대한 염증반응은 국소반응이고 그결과로 형태학적 변화, 파고 또는 손상물질의 제거와 재생기작의 활성화가 된다. 따라서, 염증은 동물이 자체로 치료하는 과정의 일부가된다.

그러나, 염증은 비정상적인 생리학적 자극에 반응하여 발생될수도 있고 체내에 문제르 일으킬수도 있다. 예로써 관절은 통풍, 필라리 관절염, 류마티스 관절염과 림질환과 같은 관절 질환에 의해서 염증을 일으킬수 있다{Stedman's Medical Dictionary (IIIustrated), supra at pages 123-124). 이 상태는 주변에서 세포가 염증지역으로 들어가는 세포의 일혈을 특징으로 한다. 이와 같은 일혈을 저해하거나 비정상적인 생리학적 자극에 반응하는 염증반응을 저해시킬수 있는 프로스타글란딘과 같은 물질이 염증을 제거하는데 사용될수도 있다.

독혈증(중독증)은 숙주동물에 독소와 다른 독성물질을 포함하는 미생물과 같은 감염성 물질의 감염과정동안에 관찰될수 있는 임상적인 상황이다. 가령, 대장균과 같은 특정 그람-음성 박테리아에 의한 감염동안에 리포폴리사카라이드(LPS)가 세포벽으로 부터 방출되어 세포벽이 파괴된다. 그다음 LPS 는 숙주동물에 세포의 죽음을 유도한다. 동물에서 중독증 상태가 발생되는데 LPS 와 같은 독소는 패혈증 또는 순환계에서 미생물의 조작에 의한 전신계 질환에 이용될수 있다(Stedman's Medical Dictionary (IIIustrated), supra at pages at pages 1274-1275 and 1464). 독혈증은 외상자극 예로 물리적 또는 화학적 외상에 동물이 노출된 경우에도 일어날수 있다.

전신 홍반성 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경색증과 하시모토갑상선염과 같은 "자가-면역 질환"은 고유조직은 동물의 면역 시스템이 공격함으로써 일어나는 것을 특징으로 한다.

아라키돈산 대사물질의 "항-질병 효과량"은 본 발명의 방법에 따라 치료되는 질환과 연관하여 세포활성과 흡착, 염증, 독혈증 또는 다른 질병의 제거, 저해 또는 예방에 효과가 있는 양을 의미한다. 일반적으로 대사물질의 효과량은 동물 체중당(Kg) 10^-12g 대사물질 바람직하게는 10^-12g 내지 10^-3g/kg 이다. 좀더 바람직하게는 대사물질의 효과량은 10^-8g 내지 10^-4g/kg 이다. 가장 바람직하게는 효과량은 아라키돈산 대사물질이 동물체중 Kg 당 10^-6g 이 된다.

일반적으로, 자유 대사물질의 약량에 비교할때 리포좀성 대사물질의 상당히 낮은 약량으로 소요의 효과를 얻을수 있다. 전술한 것과 같이, 생체내에서 자유 프로스타글란딘의 신속한 대사과정 때문에 치료하는 환자의 혈액에 효과적인 수준으로 유지되기 위해서는 이들 약물의 상대적으로 많은양의 상당히 지속적인 주입이 요구된다. 그러나 프로스타글란딘의 혈액내 수준이 높아서 나타나는 저혈압, 빈박증, 설사에는 투여될 자유 프로스타글란딘의 양을 제한해야 한다. 또한, 프로스타글란딘의 고가로 인해 이와 같은 다량의 투여는 상당히 비용이 많이든다. 본 발명의 방법은 상당히 저렴한 비용과 부작용의 감소시키고 아라키돈산 대사물질의 효과적인 투여를 제공한다.

아라키돈산 대사물질, 예로써 프로스타글란딘 처리는 세포활성과 흡착, 독혈증, 염증 그리고 다른 증상이 있는 환자에서 나타나는 손상을 감소시킨다. 세포활성제에 대한 수용체를 가지는 동일세포는 대사물질에 대한 표면수용체를 가진다. 대사물질이 이들 수용체에 결합될때 세포간흡착의 상승된 정도의 책임이 있는 세포수용체를 비활성화시킨다. 이와 같은 비활성화 기작은 대사물질/수용체 상호작용에 의해 유발되는 세포간 cAMP 수준에서 단백질 키나제 A-중재된 양이 증가되는 것으로 보인다. 세포-세포간 결합없이 O₂- 같은 공인자와 다양한 분해성 효소는 방출되지 못하고 조직손상이 감소된다.

PGE1 은 호중구와 혈소판 응집 그리고 활성화된 내피세포에 이들의 결합에 대해 강력한 저해물질인 것으로 알려져 있다. PGE1 과 같은 아라키돈산 대사물질은 염증을 저해하고, 일단 개시된 것도 저해시킬수도 있는 능력을 가진 것으로 보인다. 염증 중개자인 호중구의 세포의 방출은 사이클릭 아데노신 모노포스포이트 (cAMP)의 세포내 저장의 상승 또는 제거에 의해 중재될수 있다.

염증 중개물질인 호중구의 세포외 방출은 사이클릭 아데노신모노포스페이트 (cAMP)와 사이클릭 구아노신 모노포스 페이트(cGMP)의 세포내 저장의 상승 또는 제거에 의해 조절될수 있는 것으로 보인다. cAMP 의 상승은 염증 중개물질의 방출을 감소시키는 반면 cCMP 의 상승의 이들 중개물질의 방출을 강화시킨다. cAMP 는 이들의 세포내 수준이 일단 증가하면 초기에 이들을 개시하는 안자에 무관하게 염증을 종료시키기 때문에 때때루 "초우주적인 종료스위치"로 불린다. 중요하게는 PGE1 과 같은 일부 프로스타글란딘은 cAMP 를 상승시키기 때문에 항-염증제로써 PGE1 의이용에 대한 이론을 제공한다. PGE1 은 "초우주적인 종료 스위치"로 활동하는 물질로 간주될수 있다. 시험관내에서 세포-세포간 흡착의 중재에 필수적인 수용체의 활성을 방해함으로써 PGE1 은 호중구와 혈소판이 이들 자체와 내피세포에의 결합을 저해하는 것으로 보여진다. 이와 같은 저해는 세포내 cAMP 의 상승과 일치한다. 세포-세포 결합없이, O₂- 같은 공인자와 다양한 분해효소는 방출되지 않고 세포 손상은 제거된다. 따라서, PGE1 은 강력한 항-염증제로써 실제 작용한다. 이는 중개물질이 IL-1, TNF, 상호요소, 루코트리엔 또는 다른 것이건간에 염증을 방지시키고 이를 중단시킬수 있다.

리포좀은 이들의 작용이 필요한 부위로 프로스타글란딘의 수송을 위한 유익한 담체가된다. 특정이론 또는 기작에 한정됨이 없이, 리포좀은 활성화된 세포에 끌리거나 활성화된 표면에 흡착될수 있다. 그다음 프로스타글란딘은 항-세포흡착 작용에 이의 수송을 위해 손상부위에서 이용될수 있다. 활성화된 세포에 흡착되도록 리포좀의 끌림에 대한 한가지 이론은 리포좀이 혈액에서 피브로넥틴과 비트로넥틴에 의해 옵소닌 [혈액속에 있으면서 백혈구의 살균작용을 돕는일]화 된다는 것이다. 옵소닌작용은 세균들이 대식세포에 의해 효과적으로 신속하게 섭취되도록 하기 위해 박테리아를 변형시키는 과정이다. 따라서, 옵소닌화된 리포좀은 피브로넥틴과 비트로넥틴에 대한 수용체를 발현하기 위해 활성화된 호중구에 즉시 끌려 갈수 있고 따라서 감염부위로 연합된 프로스타글란딘을 수송할수 있다.

리포좀의 지질이중층을 가로질러 pH 농도차에 의해 대사물질이 리포좀에 연합된 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물이 치료요법적으로 유용하다. pH 4.5 시트르산 완충액과 같은 산성 수용성 완충액을 내재하는 리포좀성 조성물이 막을 가로지르는 pH 농도차를 만드는데 적합하다. 이와 같은 농도차에 의한 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질은 pH 농도차가 유지되는한 리포좀과 연합되어 남아있는 경향이 있다. 그러나 리포좀이 투여될때 동물체내에서 농도차가 붕괴되면 아라키돈산 대사물질이 점진적으로 리포좀과 분리되게된다. 그다음 대사물질은 리포좀과 연합했을때 보다는 호중구와 같은 세포에 있는 이에 상응하는 표면수용체와 상호작용이 더 잘되거나 따라서 활성화되어 세포간 흡착이 이루어지게된다.

본 발명에 따라 사용된 단층라멜라 리포좀에는 리포좀에서의 지질의 재배열을 방해하지 않는 사카라이드, 요소, 덱스트란, 알부민과 폴리비닐알코올과 같은 일반적으로 친수성 화합물인 건조보호제로 구성될수 있고 리포좀이 탈수되어 재구성될때 리포좀내에 포획된 고유의 내용물은 그내부에 유지된다. 건조 보호제는 일반적으로 강력한 수소결합 수용체인데 일반적으로 이중층 구조의 분자간 공간을 유지시키는 화학적 공간구조 특징을 보유한다. 만노스, 갈락토즈, 트레할로즈, 라파노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토즈 또는 덱스트로즈와 같은 사카라이드는 적절한 건조보허제이다. 말토즈가 특별히 적합하다.

사카라이드는 리포좀을 준비할때 사용되는 수용상의 중량에 대체 약 5 내지 10wt% 적절하게는 10wt% 농도에서 건조보호제로 사용된다. 만니톨이 임의의 사카라이드와 결합되어 사용될 수도 있으나 단독으로 사용되었을때는 만니톨은 리포좀 크기를 유지 시키는데 실패함을 알수 있었다. 만니톨은 0-2% 농도에서 사카라이드와연합하여 사용될수 있는데, 약 1% 농도가 적합하다. 사카라이드의 총 농도는 약 5% 내지 20% 적절하게는 10% 내지 12% 가장 적합하게는 약 10% 범위에서 사용된다. 10% 덱스트로즈에 0.01% EDTA 와 에탄올 ml 당 5mg BHT 에서 조성물에 BHT 또는 EDTA 와 같은 추가의 보호제가 포합될수도 있다.

리포좀의 탈수는 리포좀은 상당기간 저장할수 있게 하는데 이들 리포좀은 개체에 투여될 필요가 있을때 재구성될 수도 있다. 탈수화 과정은 적절하게는 Schneider et al. (U.S. Patent No. 4,229,360) and Janoff et al., (U.S. Patent No. 4,880,635)의 과정에 따라 리포좀과 연관된 건조 보호제를 사용하여 적절하게 실행될수 있다. 또는 건조보호제는 탈수가 냉동없이 실행되어 탈수-재수화 과정을 통하여 리포좀 이중층의 일체통합성을 유지하기 위해 리포좀에 충분한 물이 남아있는 경우에, 생략될수도 있다.

냉동건조된 프로스타글란딘-리포좀 조성물은 6℃ 또는 25℃에서 자장될때 적어도 1년이상 안정하다. 리포좀막으로 아라키돈산 대사물질의 삽입후에 냉동건조는 대사물질에 물의 근접을 차단하고 따라서 가수분해를 방지한다. 조성물의 HPLC 분석을 이용한 안정성 연구에서는 6℃에 1년간 저장하였을때 PGE1 의 분해산물이 없는 것으로 나타났다. 냉동건조된 리포좀이 이용될경우 재수화과정은 리포좀으로 전술한 것과 같이, 증류수, 주사용물(WFI) 또는 적정 pH 의 완충액 또는 수용액을 첨가함으로써 이루어진다. 그다음 리포좀은 서서히 혼합함으로써 수용액내로 재현탁된다. 재수화는 약 25℃에서 실시한다.

본 발명의 방법은 동물에 추가으 생활성제를 투여하는 것으로 구성되는데 예로써 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질에 생활성제를 추가하는 것이다. 여기에서 사용되는 "생활성제"는 동물에 투여될 물질의 조성물 또는 화합물을 의미한다. 여기에서는 동물에서 생물학적 활성을 가지는 물질과 진단의 형 또는 상형성에 필요한 물질을 포함한다. 생활성제에는 항-바이러스성, 항-박테리아성, 항-곰팡이성 항-기생충성 화합물, 항-대사물성, 항-글루코민성, 항-염증성 또는 항 신조직 형성 화합물, 스테롤, 탄수화물, 아미노산, 펩티드, 단백질, 이뮤노글로블린, 면역조절제, 염료, 독수 효소, 호르몬, 신경전달물질, 당단백질, 방사능라벨, 방사불투성 화합물, 형광성 화합물, 세포수용체 단백질, 세포수용체 리간드, 산등제 화합물, 기관직 확대제, 국소마취제, 성장촉진제, 재생물질등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 추가의 활성물질은 본 발명의 기술에 숙지된자에게 공지된 동물에 영향을 주는 다른 질환의 치료에 필요한 기준에 따라 특정 지시에 의해 선택될수 있다. 추가의 생활성제는 추가으 아라키돈산 대사물질이 될수도 있다.

본 발명의 다음의 실시예에서 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 기술에 숙지된자는 이들 실시예가 다음의 청구범위에서 설명한 것과 같은 본 발명은 단순히 설명한 것임을 인지할것이다.

실시예 1

리포좀 준비

1500ml 리포좀 PGE1 은 다음의 성분들로 구성된다:

성분 Per 1500ml Per ml

에그 포스파티딜콜린(EPC) 7L06g 4.4mg

말토즈 모노하이드레이트 150.0g 100mg

에탄올(무스) 8.38ml 0.00558ml

부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT) 45mg 0.03mg

PGE1 15mg 0.01mg

주입용 물, USP qs 1500ml

준비

주입용 물 1350ml 을 비이커에 넣고 적어도 30분간 질소분무를 한다. 150g 말토즈(J.T. Baker, Phillipsburg NJ)를 물에 첨가하고 녹을때까지 혼합하고 질소분무는 지속한다. 이로써 pH 4.81 에서 혼합물 1440ml 이 생성된다.

또 다른 비이커에서 에그 포스파티딜콜린(EPC)(Nippon Oil and Pats, Hyogo, Japan) 7.06g 을 6ml 에탄올(무수)와 혼합하고 용해될때까지 혼합하고 45mg BHT 를 첨가하여 용해될때까지 혼합 시킨다. 이 혼합물에 15mg PGE1 을 첨가하여 용해될때까지 혼합하고 나머지 에탄올 2.37ml 은 혼합물이 저울용기내에 남아있는 PGE1을 세척하는데 사용된다.

에탄올 용액은 10ml 용량 유리주사기에 넣고 14 가우지 캐뉼라를 통하여 11분간 말토즈용액에 서서히 주사하고 신속히 혼합하는데 질소분무는 지속한다. 에탄올/지질 혼합물의 추가시에 용액은 흐리게되고 이는 리포좀 형성을 나타내는 것이다. 그다음 현탁액은 주사용물로 1500ml 최종용적이 되게 희석한다.

리포좀 분산액은 직선통로형 필터인 0.2㎛ 포어크기 Nucleopore폴리카보네이트(Nuclepore, Pleasanton CA)를 통하여 3회 압축시키고 그다음 이에 상응하는 0.1㎛ 필터를 통하여 5회압출시킨다. 생성된 리포좀의 입자크기는 콰시-전자 광분산(QELS)(Nicomp Particle Sizer)를 이용하면 0.169㎛ (S.D. 0.041㎛)임을 알수 있다. 일정크기 리포좀 분산액은 0.22㎛ Millipak 멸균밀터를 통하여 통과시킨다. 마지막으로 10.5ml 분산액을 바이알에 채우고 실시예2의 과정에 따라 냉동건조된 생성물을 형성시킨다. 이는 즉시 사용되거나 또는 미래에 사용을 위해 저장시킬수 있다.

냉동건조된 생성물은 0.01M 아세테이트 완충액 10ml (pH 4.3)으로 재수화시키고 생성된 현탁액은 pH 가 약 4.3 이다. 리포좀내에 PGE1 의 포획은 HPLC 에 의해 결정되는데 이로써 이용가능한 PGE1 의 적어도 98% 가 리포좀에 포획되었음을 알수 있었다. 재수화된 현탁액 ml 당 약 9.0㎛ PGE1 의 농도가 되어 있다.

냉동건조과정

50ml 용량의 상부구멍이 있고, 부틸-고무마개가 있는 플린트 (Flint) 냉동건조 바이알에 PGE1 을 포함하는 10.5ml 수용성 현탁된 리포좀을 채운다. 이들 바이알은 리포필라이저(PV-24 Stoker Lyophilizer)내에 선반에 넣고 1.5 시간동안 0℃ 에서 유지시킨다. 선반의 온도는 분당 0.8℃ 속도로 -45℃로 감소시키고 1시간동안 유지시키며 그다음에 100㎛ Hg 의 진공을 공급한다. 선반온도는 분당 0.5℃ 속도로 -28℃ 로 상승시키면서 100㎛ Hg 진공은 지속한다.

바이알은 100㎛ Hg 진공에서 50시간동안 -28℃ 를 유지시킨다. 선반온도는 분당 0.5℃ 속도는 +25℃ 로 상승 시키고 22시간 유지시킨다. 바이알은 부분적 진공하에 마개를 막는다.

급성 심근 경색/생체내 리포좀성 PGE1 테스트

실시예1의 재수화된 리포좀을 혈관차단으로 인한 심근경색의 치료와 동시에 재환류 손상을 감소시키는 수단으로써 생체에서 테스트하였다. 총 53 마리(25-35kg) 개를 약량범위 시도와 경색연구에 사용하였다. 다음의 이유로 분석에서 제외된 개도 있다. 경색부위의 방대한 측부화(4), 부검시에 심장기생충(1) 그리고 차단동안 심장마비(1). 40마리개중 생존한 27마리개가 분석에 적합하였다: 7마리는 각 콘트롤로, 리포좀성 PGE1 (LUV-PGE1)과 리포좀성 콘트롤(빈 또는 "plain" 리포좀) 집단과 PGE1-콘트롤(자유 PGE1) 집단에 6마리.

우선, 심근 경색 연구에 사용될 적합한 약량을 결정하기 위해 약량-범위 시도가 있었다. 심장속도, 평균 동맥혈압, 심장방출과 폐 모세 웨지 압력의 측정동안에 리포좀성 PGE1 의 양을 증가 시켰다. 혈액샘플을 혈소판 응집 연구를 위해 일정간격으로 취한다(제 1 도). 10 내지 20분간 알약으로 2.0㎍/kg 이상의 약량이 공급되면 상당한 빈뱍과 심장방출의 상당한 증가(2배)와 함께 일시적인 저혈압이 나타났다. 혈소판 응집이 0.1㎍/kg 에서 부분적으로 저해되고 전체적으로 0.6㎍/kg 에서 저해되었다. 10분이상 수송된 0.5㎍/kg 약량은 심장속소를 증가시키고 심장방출은 약간 증가시킨 것으로 보인다. 잠정적인 결과를 적정화하기 위해 각 0.5㎍/kg 의 리포좀성 PGE1 의 2개 약량을 제공하는 것을 선택한다. 제 1 주사는 경색 관련 동맥의 차단후에 주입하고 다른 하나는 재환류 바로 직전에 주입한다. 이 방법은 허혈기간을 통하여 그리고 재환류 초기 기간에 효과가 있는 것으로 나타났다. 리포좀성 PGE1 의 효과는 투여후 일정시간 지속되는 것으로 나타났다. 이와 같은 관찰은 내피세포와 세포의 매질에 혈소판 응집과 흡착과 관련된 맥관형성술 이후에 재환류와 재협착증 이후에 재차단이 중요한 것으로 나타났다.

리포좀성 PGE1, 자유 PGE1, 빈 리포좀과 콘트롤 집단은 심장 속도에서의 효과에 대해 연구하였다. 테스트 개는 펜토바르비탈 나타륨으로 마취시키고 정맥내 펜토바르비탈과 이노바르(드로페리돌/펜타닐)로 유지시킨다. 동맥차단은 좌측 하강 대동맥을 연결함으로써 자극받을 수 있다. 차단후 10분뒤에 0.5㎍/kg 리포좀-결합된 PGE1 은 제 1 집단에는 10분동안 정맥내로 투여하고 제 2 집단에는 치료없이 콘트롤 동물로 유지시키다. 리포좀 주입은 추가의 이노바 소량의 투여로 인한 반작용으로 심장박동이 증가되는 경향이 있다. 테스트에서는 콘트롤과 처리된 동물 사이에 실험을 통하여 심장박동 속도에서는 큰차가 없음을 볼수 있다. 차단후 100분에 제 2 약량 0.5㎍/kg 을 10분간 투여한다. 2시간후 연결을 제거하고 혈관의 급속 재환류를 시킨다. 2시간후에 개를 마취시키고 심장에서 심근경색 손상를 검사하였다. 결과는 제 2 도에 요약하였다. 자유 PGE1 을 제공받은 집단은 초기약량의 주입후 심장속도가 상당히 상승하였고 재환류까지 유지되었다. 이와 같은 상승은 나머지 3 집단 동물에서는 나타나지 않았다. 이와 같은 상승은 혈관확장 때문에 상보적인 빈박이 된다.

총 7마리 개가 콘트롤 집단에 포함되고, 7마리 개가 리포좀성 PGE1 으로 치료받는다. 테스트 기간동안에 평균 동맥압력은 상대적으로 일정하게 유지되고 콘트롤과 처리된 집단 사이에 큰 차이가 없었다. 차단후에 각 집단에 평균 좌측 동맥압력이 증가되었으나 이들 집단 사이에는 큰 차이가 없었다. 그결과는 제 3 도에 요약하였다.

기대한 것과 같이, 15㎛ 방사능활성 소포에 의해 측정하였을때 심장혈류는 차단후에 모든 동물에서 상당히 감소되었음을 볼수 있다. 테스트 동물에서 리포좀성 PGE1 주입후에 측부혈류에 상단한 개선을 없었는데 이는 리포좀성 PGE1 의 소포 혈관확장 효과가 미비함을 나타내는 것이다.

재환류로 혈류는 콘트롤 동물과 비교했을때 치료된 개에서는 상당히 증가되었다. 심장검사에서 위험부위 %(허혈동안에 흐름이 낮은 지역)로 표현되는 심근경색크기는 처리안된 콘트롤 개에서와 비교하였을때 리포좀성 PGE1 으로 처리된 개에서 약 50% 감소된 것으로 나타났다. 또한 리포좀성 PGE1 의 투여는 혈액에서 혈소판 응집을 거의 완전하게 저해시키는 것으로 나타났다.

제 4 도에서는 리포좀성 PGE1, 자유 PGE1, 빈 리포좀 또는 염콘트롤을 제공받은 4개 집단에서 결과를 요약해 놓은 것이다. 리포좀성 PGE1 은 총 1.0㎍/kg 을 각 10분이상 2회 0.5㎍/kg주입으로 제공받은 것이다. 자유 PGE1 은 1㎍/kg 분에서 총90분간 또는 전체 약량이 9㎍/kg 이 되도록 주입하였다.

테스트는 동물의 허혈조직내로 백혈세포의 침입을 측정하는 것으로 실시하였다. 동물로부터 심장을 추출한후에 1) 경색부위, 2) 위험부위내에 경색지역의 확장지역, 3) 위험(허혈) 지역과 4) 위험시에 부위 이외에 제어지역에서 샘플을 수득하였다(위험지역은 차단된 혈관에 의해 공급되는 심장부위이다). 조직은 액체 질소로 신속하게 냉동시키고 분석할때까지 -70℃ 로 유지시킨다. 미엘로퍼옥시다제(호중구에서만 발견되는 효소)는 각 동물심장에서 4개 각 지역에서 분석하였다. 처음에 6마리 콘트를 동물에 의와 같은 방식으로 테스트하고 이들중 하나(표에서 CONT 4)만 이 테스트를 통하여 비정상으로 나타났고 이는 완전함의 범위내에 속하는 것으로 나타났다. 리포좀성 PGE1(LIPO 1-4)로 처리된 동물중 4마리만이 이 연구에 포함되었다. 이 결과는 표1에서 나타내는데 비교목적을 위해 효소단위당 미엘로퍼옥시다제의 수준으로 나타났다:

각 집단에서 추가로 개를 테스트하였다. 제 5 도에서는 테스트된 4 집단 각각에 분석에 적합한 개들의 총 결과를 요약해 놓은 것이다.

상기표에서 - 선은 특정값의 측정이 되지 않은 것으로 표시한 것이다.

실시예 3

ARDS 의 예방에 대한 생체내 테스트

성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)는 외상, 화상, 흡인호흡과 산소과다증을 포함하나 이에 국한되지 않은 다양한 증상의 부차적인 질환이다. 이 질병은 모세혈관 손상으로 죽는 간질성 육종을 특징으로 한다. 일단 폐에 액체로 채워지면 호흡이 곤란하게되고 환자의 5-60% 는 죽게된다.이 사건의 연속으로 비참한 결과로 도달하는 것은 초기상태에 따라 다양해진다. C3a, C5a, IL-1 와 TNF 와 같은 인자는 호중구를 활성화시킨다. PGE1의 작용방식은 세포활성화의 기작과는 무관하다. PGE1 존재시에 호중구는 활성화되지 않고, 이미 활성화된 경우에도 중단되어 질병을 막는다.

폐손상이 열손상 또는 직접적인 IL-1 의 기관지내 주입에 의애 유도된 ARDS 의 설치류 모델에서 연구를 시행하였다. 다음의 실시예에서 설명한 것과 같이, 리포좀성-PGE1 의 약량은 액체의 누출이 폐로가는 것을 막고 호중구의 유입이 폐로 들어가는 것을 상당히 감소시킨다.

실시예1의 재수화된 리포좀성 PGE1 은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)의 개시에 대해 예방으로 생체내에서 테스트하였다. 테스트 쥐는 7 또는 8마리 동물을 포함하는 세집단으로 나누고 각각은 8 ㎍/kg 리포좀성-PGE1 또는 열손상과 동시에 염용액으로 처리하거나 열손상(45초간 70℃ 물에 담금) 후에 염용액으로 처리하였다. 제 1 집단은 리포좀성 PGE1 으로 처리하나 제 2 집단은 리포좀성 PGE1로 처리하지않고 동일한 외상을 가지고 제 3 집단은 처리도 없고 외상도 없다. 쥐를 죽이기 한시간전에 125 I-알부민은 폐로 유색의 누출이 있음을 나타내는 표식으로 정맥내로 주사한다. 열손상후 4시간뒤에 동물을 죽인다. 이연구 결과는 제 6 도에 나타내었다.

이와 같은 외상의 효과는 손상을 입은 동물의 폐에서 알부민 수준이 상승됨으로써 ARDS 의 개시를 알수 있다. 처리안된 손상을 입은 동물에서는 폐에서 알부민 수준이 모두 상당히 증가되었음을 나타내었다. 또한, 이들 7마리 동물중 6마리가 죽었다. 리포좀성 PGE1 으로 처리한 동물에서 알부민 수준은 처리안된 콘트롤 집단보다도 상당히 낮은 것으로 볼수 있다. 또한, 7마리 PGE1으로 처리된 동물중에서 외상으로 인해 죽은 것은 없었다. 이결과에서 리포좀성 PGE1 의 효과는 ARDS 의 개시에 대한 예방효과가 있음을 나타낸다.

기관지내 IL-1 의 주입에 의해 유도된 ARDS 의 생체내 치료테스트

재조합 IL-1 의 기관지내 주입은 쥐에서 폐손상과 호중구유입을 유도한다.(제 7 도). 리포좀성 PGE1 치료는 IL-1 유도된 폐손상과 호중구 유입을 감소시킨다. 상업적으로 이용가능한 50ng 인터루킨-1 (IL-1) 또는 염(콘트롤 집단)은 쥐의 기관지내로 주입되어 폐로의 호중구이 유입과 소포로 액체의 누출을 유도한다. 실시예1의 재수화된 리포좀성 PGE1 또는 자유 PGE1 또는 빈 리포좀 6㎍/kg 의 정맥치료는 IL-1 을 제공받은 쥐에서 IL-1 의 투여후 2.5 시간에 제공하였다. 염만을 공급받은 쥐는 40 마리, 54 마리는 IL-1을 제공받고 처리하지 않았으며, 6 마리는 IL-1 을 제공받고 리포좀 PGE1 으로 처리하고, 6 마리는 IL-1 을 제공받고 빈 리포좀으로처리하고, 6 마리는 IL-1 을 제공받고 자유 PGE1으로 처리하였다.

IL-1 을 제공후에 4.5 시간뒤에 많은 호중구는 이미 조직으로 침윤하였고 쥐는 혈류에서 표식으로써 125 I 알부민을 주사하였다. 알부민 주입후 30분뒤에 쥐를 죽이고 폐를 제거하여 폐로의 액체 누출은 조직에서 동위원소 양을 결정하여 정량화하였다. 폐누출지수는 폐에서 라벨된 알부민 125 I-알부민의 cpm 을 혈류에서 라벨된 125 I-알부민 양으로 나눈것을 기초하여 계산하였다. 폐누출은 제 7 도의 Y 축에 나타낸다. 7 도에서 나타낸 것과 같이 처리없이 IL-1 의 염을 공급받은 동물에서의 폐누출의 약 2.5 배가 되었다. 그러나 IL-1 침윤후에 리포좀성 PGE1 치료를 받았을경우 폐누출색인은 콘트롤에서와 동일하였다. 중요한 것은 자유 PGE1 또는 빈 리포좀으로도 처리받지 않은 경우 폐누출에 약간 효과가 있었다.

일련의 과정은 임상적 세팅에서 볼수 있는 것이다. 손상이 유도되고 치료는 적절한 진단이 있은후에 개시한다.

실시예 4

쥐 내독소중 연구

EPC-함유 PGE1 MLVs 의 준비

에그 포스파티딜콜린 (EPC) 원액 (20mg/ml 에탄올)을 다음과 같이 준비한다: 1g 건조 EPC 를 순수알코올 50ml 에 넣고 가볍게 흔들면서 용해시키고 50ml 갈색병에 뚜껑을 덮어둔다. 생성용액은 20℃에 저장한다. PGE1 원액(1mg/ml 에탄올)은 다음과 같이 준비한다. 20mg 건조 PGE1 은 20ml 바이알에 옮기고 20ml 알코올을 첨가한다. PGE1 은 가볍게 흔들면서 에탄올에 녹이고 생성용액은 -20℃ 에 저장한다.

EPC 원액(9.75ml)와 PGE1 원액(0.5ml)을 500ml 밑-둥근 플라스크에서 복합시키고 에탄올은 30℃에서 적어도 2시간동안 회전증발에 의해 제거한다. 건조된 EPC/GPE1 은 리포좀 현탁액을 형성하기 위해 pH 4.5 완충액(예로써 50mM 아세테이트 150mM NaCl, pH-4.5 (NaOH 로 조정); 유리비드는 건조 EPC/PGE1 의 재현탁에 도움이된다)에서 재현탁시킨다. 이 현탁액은 4℃ 에서 저장한다.

DPPC-포함하는 PGE1 MLVs 의 준비

DPPC 원액은 메틸렌클로라이드에 용해된 디팔미토일 포스파티 딜콜린(DPPC) 1.035g 을 이용하여 전술한 것과 같이 준비할수 있다. 건조된 DPPC/PGE1 혼합물의 재수화는 약 52℃ 에서 3-5분간 흔들면서 욕조에서 가열하면된다.

쥐 내득혈증 모델

그람-음성 박테리아의 감염으로 열, 저혈압, 백혈구의 수변화와 설사와 같은 증상이 있다. 이와 같은 감염은 혈관내 응집을 분해시키고 비가역적 쇼크를 유발한다. 상당량의 문헌에서 내독성 쇼크의 과정의 중재에 백혈구의 세포연관으로 IL-1, IL-6 와 TNF α를 유도함을 나타내었다. 우리의 시험관 데이타에서 배양된 단세포로부터 이들 사이토킨의 저해를 나타내었기 때문에 LPS-유도된 죽음의 감쇠에 PGE1 아 특정 조성물의 효과를 평가하기 위해 치사률을 이용하여 쥐 내독혈증의 모델을 개발하였다.

실험은 스프라그-도웨리 쥐에서 대장균 LPS(리포폴리사카라이드; 세로타입 055:B5)에 대한 LD₅₀을 만들도록 고안되었다. 이들 실험으로부터의 데이타는 제 8도에 나타내었고 이는 LD₅₀이 50㎍/kg 임을 나타낸다. LPS 약량을 다른말이 없는한 연속실험에 사용되었다.

숫컷 스프라우그-도우리 쥐, 각 126-150g 을 물과 음식에 대해 새로운 환경에 길들인다. 0 시간대에 쥐집단(n=16)에 단일 알약으로 대장균 리포폴리사카라이드 또는 염콘트롤(no LPS)을 주사하였다. LPS 투여후에 다양한 시간(일)대에서 치사율을 평가 하였다.

리포폴리사카라이드(LPS)와 PGE1 에 대한 반응에서 종양 괴사인자 알파(TNF α)와 인터루킨-1 베타(IL-1 β) 합성의 저해

흡착성 사람 단세포는 0 시간대에 LPS(1㎍/ml/10 세포) LPS 로 자극을 받는다. 자유 PGE1(리포좀내 포획되지 않음), LUV-PGE1(실시예에 따른 과정으로 준비된 큰 단층라멜라 리포좀(LUVs), LUV-PGE1 "위약" 리포좀(LUVs 는 PGE1 을 포함하지 않음), LUV 위약 리포좀 + 자유 PGE1, 위약 리포좀 또는 염콘트롤(PGE1 은 없음)은 동시에 주사하였다 (10㎛ PGE1). 분비된 TNFα 와 IL-1β 는 세시간에서 평가하였다. 이 실험결과는 제 9 도에서 (α,β) 나타내었다.

LPS-유도된 치사율의 감쇠

숫컷 스프라우그-도우리 쥐에서 각 자유 PGE1, LUV-PGE1(40㎍/kg PGE1) 위약 LUVs (PGE1 을 포함하지 않음; 40㎍/kg PGE1-LUV-PGE1 약량을 가진 리포좀의 수와 동일한 입자수) 또는 위약 LUVs(40㎍/kg 지질등가) + 자유 PGE1(40㎍/kg)를 주사하였다. 각 집단에는 12마리 쥐가 있다. 생존은 LPS 투여후 6,12,18 과 24일에 각 집단에서 평가하였다. 그결과는 제 10 도에 나타내었다.

자유 PGE1-유도된 치사율의 제거

숫컷 스프라우그-도우리 쥐에 각 0 시간에 50㎍/kg LPS 를 주사하였다. 자유 PGE1 (40㎍/kg), LUV-PGE1 (40㎍/kg PGE1), 위약 LUVS (40㎍/kg 지질등가 즉 위약 LUVs 의 수는 체중 Kg 당 프로스타글란딘 E1 40㎍ 약량과 관련하여 존재하는 LUVS 수와 동일함), 라텍스 소포(수는 위약 LUVs 수와 동일) 또는 라텍스 소포 + 자유 PGE1 을 동시에 i.v. 로 주사한다. 처리집단(16 마리쥐)에서 생존은 24시간내에 평가하였다. 결과는 제 11 도에 나타내었다.

Claims

세포활성, 흡착, 염증, 독혈증 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 있어서,

조성물은

(a) 제약학적으로 수용가능한 담체;

(b) (i) 지질;

(ii) 방출-저해성 수용성 완충액;

(iii) 아라키돈산 대사물질로 구성된 단층라멜라 리포좀으로 구성되고; 이때 아라키돈산 대사물질의 효과량은 치료대상 동물 체중 kg에 대해 10^-12g이고, 방출-저해성 완충액은 아라키돈산 대사물질과 지질의 상호작용 강도를 증가시키고, 대사물질과는 정전기적인 척력을 가지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 투여는 정맥투여인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 단층라멜라 리포좀은 직경이 약 100nm인 리포좀인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘인 것을 특징으로하는 제조 방법.
제 3 항에 있어서, 프로스타글란딘이 프로스타글란딘 E1인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 지질은 포화된 아실사슬 지질인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 6 항에 있어서, 포화 아실사슬 지질은 디팔미토일 포스파티딜콜린인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 완충액은 시트르산 완충액인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 8 항에 있어서, 시트르산 완충액의 pH 는 4.5인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 질환은 재환류손상, 전신 염증반응 증후군, 심근경색, 성인 호흡곤란 증후군, 맥관염, 화상, 외상후 쇼크, 맥관-차단질환 또는 관절염과 자가면역질환으로 구성된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 관절염을 류마티스 관절염, 통풍 또는 필라리 관절염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 자가면역질환은 조직적 홍반성 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경화증 또는 하시모토 갑상선염인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 질환은 전신 염증반응 증후군 또는 성인호흡 곤란증후군인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 kg 당 대사물질 약 10^-12g 내지 10^-3g인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 kg 당 대사물질 약 10^-8g 내지 10^-4g인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 15 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 kg 당 대사물질 약 10^-6g인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 리포좀은 건조 보호제로 구성된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 17 항에 있어서, 건조보호제는 사카라이드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 18 항에 있어서, 사카라이드느 말토즈, 락토즈, 덱스트로즈, 트레할로즈, 라피노즈 또는 슈크로즈인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 19 항에 있어서, 사카라이드는 말토즈인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 동물에 추가의 생활성제를 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 제조 방법.