NO312809B1 - Fremgangsmåter for fremstilling av en farmasöytisk sammensetning ved anvendelse av unilamell¶re liposomalearachidonsyremetabolitt formuleringer samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av en farma-søytisk sammensetning som omfatter unilamellære liposomale arachidonsyremetabolitt formuleringer og anvendelse derav.

De forskjellige prostaglandinene er gruppert i flere kategorier (A-I), som er forskjellige når det gjelder varierende substituenter på 5-karbonringen innført i 20-karbonfettsyre-forløperen i løpet av prostaglandinsyntesen. Disse gruppene kan bli ytterligere delt inn basert på antall, og posisjon av dobbeltbindinger i prostaglandinkarbonkjedene. Prostaglandinene antas å virke på deres målceller ved hjelp av cellulære overflatereseptorer. Disse reseptorene antas å bli koblet til andre messenger systemer hvorved prostaglandin-virkningen blir formidlet. Prostaglandinene kan innha et bredt spekter av biologiske aktiviteter.

Enzymene i kroppen kan hurtig deaktivere prostaglandinene. Dette nødvendiggjør hyp-pige administreringer av høye doser av forbindelsene for å opprettholde terapeutiske effektive nivåer i serum. Dette øker kostnadene ved prostaglandinbehandling og fører til muligheten av uønskede bivirkninger. I det prostaglandindeaktivering oppstår hovedsa-kelig når blod passerer gjennom lungene blir forbindelsene generelt administrert intraar-terieit. Liposomale formuleringer kan forlenge den sirkuiatoriske halveringstiden tii arachidonsyremetabolittene, for eksempel prostaglandiner, og kan være behjelpelig med å unngå deaktivering derav i lungene. Slike liposomale formuleringer kan følgelig vanligvis tilveiebringe terapeutiske alternativer.

Mizishuma et al. (J. Rheumatol. 14:97 (1987)) og Hoshi et al. (Drugs. Exptl. Clin. Res. 12(8):681 (1986)) beskriver lipidmikrosfærer inneholdende prostaglandin E\ ( ?GE\). Som beskrevet i Mizishuma et al. (US-PS 4.493.847) og Imagawa et al. (US-PS 4.684.633) utgjør disse "mikrosfærene" prostaglandin-inneholdende fettemulsjoner som_ ikke er liposomer, og som har hverken de samme egenskapene, eller samme fordelene, som liposomale arachidonsyremetabolittformuleringer angitt heri. Shell og See (US-PS

4.820.732 og 4.955.878) beskriver behandlinger for redusering av feilfunksjonen i løpet av angioplasti prosedyrer som involverer administrering av prostaglandin-inneholdende sammensetninger til pasientene. Disse sammensetningene inneholder også en bærer. De flytende bærerene som er beskrevet, for eksempel dehydrerte alkoholer og saltvannsopp-løsninger kan generelt ikke tilveiebringe forlenget frigjøring av en arachidonsyremetabolitt. Fett-belastede mikrosfære bærere som er beskrevet antas å være like store som en rød blodcelle, dvs. minst 7 mikroner i diameter, og kan være mye større. Administrering av så store partikler til dyr kan forårsake vanskeligheter på grunn av at mikrosfærene

kan bli sittende fast og stenge små blodårer, for eksempel lungekapillærer. Liposomene anvendt i foreliggende oppfinnelse har derimot en maksimal størrelse på omtrent 5 mikroner eller mindre, og har fortrinnsvis en størrelse på omtrent 50 nm til omtrent 1 mik-ron. Disse liposomene kan trygt bli administrert til dyr for terapeutiske formål.

Liposomale formuleringer av medikamentene kan ha en forsterket terapeutisk indeks ved å redusere medikamentets toksisitet, øke dets effektivitet eller begge. Liposomale arachidonsyremetabolittformuleringer anvendt ved utførelse av denne oppfinnelsen er nyttige for å lindre eller forhindre sykdommer, forstyrrelser eller tilstander så som toksemiske forstyrrelser, inflammatoriske forstyrrelser og celleaktiveiing adhesjonsforstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en farma-søytisk sanmiensetning for administrering av en arachidonsyremetabolitt til et dyr og fremgangsmåten omfatter administrering til dyret en sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og en unilamellær liposom som omfatter metabolitten, et lipid og en frigjørings-inhiberende vandig buffer. Dyret er fortrinnsvis et menneske og administrering omfatter intravenøs administrering.

Den unilamellære liposomen er en stor unilamellær liposom (LUV), fortrinnsvis en LUV som har en diameter på omtrent 100 nm. Arachidonsyremetabolitten administrert til dyret er et prostaglanding, fortrinnsvis et prostaglandin fra E eller I serien, og mest foretrukket, prostaglandin Ei. Lipidet er fortrinnsvis et mettet acylkjedelipid, mere foretrukket er dipalmitoyl, fosfatidylcholin (DPPC). Bufferen er fortrinnsvis en sitronsyrebuffer, mere foretrukket, en sitronsyrebuffer med en pH på omtrent 4,5.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen kan bli anvendt for å behandle dyr som har, forstyrrelser karakterisert ved celleaktivering og adhesjon, betennelse eller toksemi, blant andre indikasjoner. Slike forstyrrelser innbefatter, uten begrensning: reperfusjonsskade, hjerteinfarkt, vaso-okklusiv sykdom, respiratorisk distressyndrom i voksne (ARDS), systemisk inflammatorisk responssyndrom (SIRS), vaskulitis, post-traumatisk sjokk, brannskade, vaso-okklusive forstyrrelser, artrittforstyrrelser, for eksempel gikt, rheumatoid artritis eller filary attires, og autoimmune sykdommer, for eksempel systemisk lupus erytematosus, juvenil diabetes, multippel sklerose eller Hashimotos tyroiditis. Spesielt foretrukne indikasjoner er ARDS og SIRS.

Fremgangsmåten omfatter administrering til dyret av en mengde av liposomen som omfatter en anti-forstyrrelse effektiv mengde av arachidonsyremetabolitten. Generelt omfatter den anti-forstyrrelses effektive mengden av metabolitten minst omtrent 10" 12 g av metabolitten pr kg kroppsvekt til dyret, og utgjør vanligvis fra omtrent 10~<12> g pr kg til omtrent 10~<3> g pr kg. Det er ønskelig at den effektive mengden av metabolitten er fra omtrent 10"^ g pr kg kroppsvekt til omtrent 10~<4> g pr kg. Det er mere ønskelig at den effektive mengden av arachidonsyremetabolitten er omtrent 10"<6> g pr kg kroppsvekt.

Lioposomet anvendt i foreliggende oppfinnelse kan omfatte et tørkebeskyttelsesmiddel, og kan bli dehydrert, lagret og deretter rekonstituert før bruk. Tørkebeskyttelsesmiddelet utgjør fortrinnsvis et saccharid så som maltose, laktose, sukrose, dekstrose, raffinose eller trehalose. Saccharid tørkebeskyttelsesmiddelet er fortrinnsvis maltose.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte administrering av et ytterligere bioaktivt middel, så som et anti-inflammatorisk eller antimikrobielt middel, til dyret.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av eri farmasøytisk sammensetning for behandling av en sykdom kjennetegnet ved celleaktivering og adhesjon, inflammasjon eller toksemi, kjennetegnet ved at den omfatter formuleringen:

(a) en farmasøytisk akseptabel bærer; og

(b) et unilamellært liposom som omfatter:

(i) et lipid; (ii) en frigjøringsinhiberende vandig buffer; (iii) en antisykdomseffektiv mengde av en arachidoninsyremetabolitt som er minst omtrent IO"<12> g av metabolitten pr. kg. kroppsvekt av dyret som skal behandles, hvori nevnte frigjøringsinhiberende buffer øker styrken av metabolittlipidinteraksjoner eller etablerer elektrostatiske repulsjoner^ med metabolitten.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og et unilamellært liposom som omfatter en arachidoninsyrematabolitt, et lipid og en frigjørelsesinhiberende vandig buffer, hvori nevnte fri-gjøringsinhiberende buffer øker styrken av metabolittlipidinteraksjoner eller etablerer elektrostatiske repulsjoner med metabolitten for fremstilling av en sammensetning for behandling av et dyr som lider av en sykdom kjennetegnet ved celleaktivering og adhesjon, inflammasjon eller toksemi.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1. Virkningen av LUV-PGE1 på blodplate aggregasjonen. LUV-PGE1 ("C-53"), fremstilt i henhold til fremgangsmåtene angitt i eksempel 1, nedenfor. X-akse: kontroll, 0,1 mikrogram, 0,6 mikrogram, 1,1 mikrogram og 1,1 mikrogram post-administrering LUV-PGE1 pr kg kroppsvekt (mørkskravert: kollagen: lett skravert: U46613). Y-akse: prosent av kontroll. Figur 2. Hjerteråte vs. eksperimentvarighet i behandlende/kontrollhunder. Fylte firkanter: LUV-PGE1; fylte trekanter: kontroll <*>: tomme liposomer; fylte diamanter: fri PGE1. Figur 3. Venstre arterielt trykk vs. eksperimentell varighet. Fylte firkanter: LUV-PGE1; fylte triangler: kontroll; <*>: tomme liposomer; fylte diamanter; fri PGE1. Figur 4. Infarktstørrelse som prosent av risikosone. X-akse: LUV-PGE1, fri PGE1, tomme liposomer, kontroll. Y-akse: infarktstørrelse/risikosone (%). Figur 5. Myeloperoksidase frigjøring fra myokardialvev. X-akse: infarktsone, grenseso-ne, risikoregion, kontrollsone (mørkt skravert: kontroll; skrålinjer; tomme liposomer: rette linjer: fri PGE1; kryss-skraverte: LUV-PGE. Figur 6. Forhindring av lungeskade etter termisk hudskade med LUV-PGE 1 behandling. X-akse: kontroll, brent, brent pluss LUV-PGE1. Y-akse: prosent albuminlekkasje (cpm høyre lunge/cpm blod). Figur 7. Virkning av tomme liposomer eller fri PGE1 på lungelekkasje i rotter gitt IL-1 intratrachealt. X-akse: saltvannskontroll, IL-1, IL-1 + LUV PGE1, IL-1 + tomme liposomer, IL-1 pluss fri PGE1. Y-akse: lungelekkasje (cpm lunge/cpm blod). Figur 8. Rotte endotoksemimodell. X-akse: tid (dager) post-LPS administrering; Y-akse: prosent overlevelse i behandlingsgruppen. Fylte firkanter: rotter administrert saltvannskontroll (0 ug/kg LPS); åpne firkanter: rotter administrert 10 ug/kg LPS; fylte diamen-ter: 15 ug/kg LPS; åpne diamanter: 25 ug/kg LPS; fylte trekanter: 50 ug/kg LPS; åpne triangler: 75 ug/kg LPS; fylte sirkler: 100 ug/kg LPS. Figur 9. Inhibisjon av sekresjon av human monocyt TNFa og IL-16 i respons til lipopolysaccharid (LPS). X-akse: fri PGE^, LUV-PGE i (unilamellære liposomer inneholdende PGE1 og fremstilt i henhold til prosedyrene beskrevet i dette eksempelet), placebo LUV (store unilamellære liposomer som ikke inneholder PGE1), placebo LUV pluss fri PGE1); y-akse: prosent inhibisjon av TNFa og IL-1B sekresjon; uskravert: TNFa; skravert: IL-16. Figur 10. Attenuering av LPS-indusert dødelighet. X-akse: tid (dager) post-LPS administrering; y-akse; prosent overlevelse i behandligsgruppen. Fylte firkanter: saltvannskontroll (LPS ikke administrert); fylte diamanter: LUV-PGE 1; åpne diamanter: placebo LUV pluss fri PGE1; fylte trekanter: placebo LUV; åpne triangler: LPS kontroll (ingen liposomer eller PGEj); åpne firkanter: fri PGEj. Figur 11. Eliminering av fri PGE^-indusert dødelighet. X-akse saltvannskontroll (ingen LPS, PGEj eller liposomer), LPS kontroll (LPS, men ingen liposomer eller PGE^), LUV-PGE i, placebo LUV pluss fri PGEj, lateks mikrosfærer pluss fr PGEi, placebo, LUV, lateks mikrosfærer; y-akse: prosent overlevelse i behandlingsgruppen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for administrering av en arachidonsyremetabolitt til et dyr. Fremgangsmåten omfatter administrering til dyret av en sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og arachidonsyremetabolitten sammen med en unilamellær liposom. Dyret er fortrinnsvis et menneske og administreringen omfatter intravenøs administrering.

"Farmasøytisk akseptabel bærer" som anvendt heri innbefatter hvilke som helst av stan-dardbærere, fortynningsmidler, eksipienter og lignende generelt for anvendelse når det gjelder administrering av bioaktive midler til dyr, spesielt mennesker. Slike bærere er velkjent innenfor fagområdet og blir generelt valgt med hensyn på et antall faktorer, så

som det bestemte medikamentet som blir anvendt og administrasjonsveien som er vel-_ kjent for fagfolk innenfor dette området, eller som kan bli bestemt uten unødig eksperi-mentering. Egnede bærere innbefatter, men er ikke begrenset til saltoppløsninger så som fysiologiske saltvann (10 vekt-% av volum natriumklorid i vann), vandige dekstrose oppløsninger, for eksempel D5W (5 vekt-% volum dekstrose i vann), og lignende. Den farmasøytiske sammensetningen kan videre omfatte hjelpemidler så som konserver-ingsmidler, anti-oksydeirngsmidler og lignende i mengder, og som kjent for fagfolk innenfor dette området.

Liposomer er selv-sammenstillende substrukturer som omfatter en eller flere bilag av amfipatiske lipidmolekyler hvor hvert bilag omgis rundt et vandig rom. Liposomene kan være unilamellære, det vil si ha et enkelt lipidbilag, eller liposomene kan være multilamellære, dvs. med 2 eller flere lipidbilag. Liposomene ifølge oppfinnelsen er en unilamellær liposom. Liposomen er fortrinnsvis en stor unilamellær liposom (LUV), og fortrinnsvis en LUV med en diameter på omtrent 100 nm.

Liposomene kan bli fremstilt ved hjelp av forskjellige teknikker som er velkjente for fagfolk innenfor dette området. Se for eksempel Deamer og Uster, "Liposome Prepara-tion: Methods and Mechanisms", in: Liposomes (M. Ostro, ed), Marcel Dekker (New York), s. 27-51 (1983); Cullis et al., in: Liposomes, From Biophysics to Therapeutics (M.J. Ostro, ed.), Marcel Dekker, s. 39-72 (1987)). BanghanVs procedure (J. Mol. Biol. 13:238 (1965)) produserer ordinære multilamellære vesikler (MLV), dvs. liposomer med to eller flere lipidbilag, og involverer oppløsning av en eller flere amfifile lipider i en eller flere organiske oppløsningsmidler. Lipidene blir deretter tørket, og de tørkede lipidene blir rehydrert med en vandig oppløsning for å danne MLV. Lenk et al. (US-PS 4.522.803, 5.030.453 og 5.169.637).Fountain et al (US-PS 4.588.578) og Cullis et al.

(US-OS 4.975.282) beskriver fremgangsmåter for fremstilling av multilamellære liposomer som har et oppløst stoff innesluttet i deres vandige rom, i det konsentrasjonen av det oppløste produktet i hvert av rommene er vesentlig likt. Unilamellære liposomer kan bli dannet ved eter eller eianolinjeksjon eller infusjonsmetoder. Unilamellære liposomer kan bli produsert fra multilamellæreliposomer ved ekstrusjon av multilamellære liposomer, under trykk, gjennom filtere med definerte porestørrelser som beskrevet av Cullis et al. (US-PS 4.975.282) og Loughrey et al. (US-PS 5.059.421). Ekstrusjon, samt prosedyrer som homogenisering, møllesonikering og French Press anvendelse kan bli anvendt for å redusere liposomstørrelsen som kan bli bestemt ved hjelp av prosedyrer som fri-fraktur elektronmikroskopiske undersøkelser av liposomen, samt kvasi-elektrisk lysspredning.

"Arachidonsyre metabolitter" er prostaglandiner, eller forbindelsene kan bli omdannet til prostaglandiner, for eksempel kunstig eller i kroppen til dyret. Prostaglandier er en gruppe på 20-karbonfettsyrer inneholdende en 5-karbin ring, pluss syv- og åtte-karbonkjeder, som er dannet fra arachidonsyre og andre 20-karbon fettsyrer med minst tre dobbeltbindinger (for eksempel "essensielle" fettsyrer 8,11,14-eikosatrinoisk syre, 5,8,11,14-eikosatetraenoisk syre; se for eksempel Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, supra). Arachidonsyre er det mest av av disse 20-karbonprosta-glandin forløperene i mennesker.

20-karbon vesentlig fettsyreprostaglandinforløpere, mellomprodukter dannet i løpet av prostaglandinsyntesen, for eksempel prostanoisk syre, og strukturelle analoger som kan bli omdannet til disse forbindelsene, er "arachidonsyremetabolitter". "Prostaglandin-relaterte forbindelser", for eksempel leukotriener, tromboksaner, lipoksiner og prostacyk-liner, innbefatter forbindelser som er funksjonelt relaterte til prostaglandiner og som også kan bli oppnådd fra 20-karbon essensielle fettsyreprostaglandinforløpere. Prostaglandiner, prostaglandin-relaterte forbindelser og eikosanoider, samt strukturelle analoger som kan bli omdannet til slike forbindelser, utgjør også "arachidinsyre metabolitter". Arachidonsyre metabolitten administrert til dyr i henhold til foreliggende oppfinnelse er et prostaglandin, fortrinnsvis et E eller I serie prostaglandin, og fortrinnsvis prostaglandin Ei-

"Assosiasjon" av en arachidonsyremetabolitt med en liposom betyr generelt at metabolitten er innesluttet i liposomets vandige rom, eller er assosiert med det indre eller ytre monolaget til liposomets bilag, for eksempel ved hjelp av elektrostatiske interaksjoner mellom metabolitten og hodegruppene til monolagets komponent amfipatiske lipider. En foretrukket fremgangsmåte for dannelse av unilamelære liposomale formuleringer ifølge oppfinnelsen er assosiasjon av metabolitten med lipidet i etanol i likhet med teknikken til Batzri et al., Biochem. et Biophys. Acta., 198:1015 (1973) ved anvendelse av en transmembran konsentrasjonsgradient som beskrevet i Bally et al. (US-PS 5.077.056). I denne teknikken blir lipid og prostaglandin oppløst sammen i et vandig-blandbart organisk oppløsningsmiddel så som etanol og deretter sakte tilsatt til en første vandig oppløsning. Eventuelt kan et konserveringsmiddel så som butylert hydroksytolu-en (BHT) bli blandet sammen med lipidet i oppløsningen.

Den resulterende liposom dispersjonen kan bli redusert i størrelse i en mere homogen populasjon, for eksempel ved ekstrusjon gjennom et filter, fortrinnsvis med 100 nm po-restørrelse, i det filteret har enten rett stykke eller vridd stykke. Et foretrukket filter for anvendelse i denne prosessen er en aluminoumoksyd porøs film så som Anopore<TM >filtere dannet av Anotec Separations. En slik populasjon av liposomer kan bli dannet ved ekstrusjonsprosedyrene ifølge US-PS 5.008.050. Slike ekstrusjonsprosedyrer hvor liposomene blir sendt gjennom et filter under trykk muliggjør dannelsen av homogene populasjoner av liposomer med hensyn på størrelse. Når liposomene blir sendt mer enn en gang gjennom filteret, vil antall passeringer som er nødvendige bli bestemt ut fra det som er nødvendig for å oppnå den ønskede liposomstørrelsen. Filterstørrelsene som anvendes blir valgt ifølge den ønskede størrelsen på det endelige liposomproduktet. I foreliggende oppfinnelse er liposomer med en gjennomsnittlig diameter på mindre enn omtrent 200 nm foretrukket. Den individuelle liposomen anvendt i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis mindre enn omtrent 500 nmi diameter. Liposomen har fortrinnsvis en diameter på omtrent 100 nm, i det liposomer med denne størrel-sen generelt er kjent for å passere gjennom kapillærsjiktet til lungen og kan derfor passere gjennom til andre organer og vev. Et filter som har en porestørrelse på omtrent 100 nm blir fortrinnsvis valgt for anvendelse i ekstrusjonstrinnet. Størrelses-reduserte liposomer kan også bli sterilfiltrerte, så som ved passering gjennom et 220 nm Millipak filter (Millipore, Inc., Bedford, MA).

Den unilamellære liposomen anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter metabolitt, et lipid og en frigjørings-inhiberende vandig buffer. Lipidet øker fortrinnsvis styrken til metabolitt-lipid interaksjonene og inhiberer følgelig frigjøring av metabolitten fra liposomen. Slike lipider er "frigjørings-inhiberende lipider". Lipidbaserte faktorer som øker styrken til prostaglandin-lipid interaksjonene innbefatter, men er ikke begrenset til, faktorer som gjør lipidbilagene mindre permeable for vann og andre små molekyler, for eksempel faktorer som øker Van der Waals, dipol-dipol og andre interaksjoner mellom acylkjedene og følgelig gjør at acylkjedene blir pakket nærmere sammen i bilaget. Antall dobbeltbindinger i bilagenes acylkj eder kan for eksempel påvirke kjedens arrangering med hensyn til hverandre i bilaget. Desto lavere antall dobbeltbindinger, desto nærmere blir acylkjedene pakket sammen, og følgelig presenterer en barrie-re overfor et prostaglandin som går gjennom bilaget. Foretrukne lipider har følgelig mettede acylkj eder. Foretrukket lipid med mettede acylkj eder er dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC). Andre lipider med mettet kjede kan også bli anvendt.

Vandige buffere i liposomer kan også inhibere eller forhindre frigjøringen av en arachir donsyremetabolitt assosiert med en liposom. Slike vandige buffere er "frigjørings-inhi-berende vandige buffere". Karaktertrekkene til foretrukne frigjørings-inhiberende buffere innbefatter, men er ikke begrenset til, evnen til å etablere elektrostatiske frastøt-ninger med metabolittene eller for å forsterke metabolitt-lipid interaksjonene. Buffere med en høyere buffringskapasitet og følgelig en større evne til å opprettholde ønsket pH vil bli bedre frigjørings-inhiberende buffere. Foretrukne frigjørings-inhiberende buffere er sitronsyrebuffere, spesielt sitronsyrebuffere som har en pH på omtrent 4,5.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å administrere en arachidonsyremetabolitt til et dyr påvirket av en forstyrrelse kjennetegnet ved celleaktivering og ad-hesj on, betennelse og/eller toksemi, blant andre indikasjoner. Fremgangsmåten omfatter administrering til dyret av en mengde av liposomen som omfatter en anti-forstyrrelses-effektiv mengde av metabolitten. Forstyrrelsene som kan bli behandlet i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter, uten begrensning: reperfusjonsskade, systemisk inflammatorisk responssyndrom (SIRS), respiratorisk distress syndrom i voksne (ARDS), hjerteinfarkt, vaskulitis, brannskade, post-traumatisk sjokk, vaso-okklusive forstyrrelser, arthrit forstyrrelser, så som rheumatoid arthritis, gout og filary arthritis, og auto-immune forstyrrelser så som systemisk lupus erytematosus, juvenile diabetes, multippel sklerose og Hashimotos thyriuditis.

Visse forstyrrelser er kjennetegnet ved unormal aktivering av celler, for eksempel blodplater og neutrofiler, i blodet, og ved påfølgende adhesjon av disse cellene til hverandre eller til aktiverte celler i det omgivende vaskulære endothelet. Slik celleaktivering og adhesjonsforstyrrelser er et betydelig problem innen mange forskjellige medisinske pa-tologiske områder. Endothelceller, for eksempel vaskulære, plurale, perikardiale eller abominale endothelceller, kan bli aktivert av cytokiner, for eksempel interleukin-1 (IL-1), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) eller bakterielle endotoksiner. På samme måte kan blodceller, spesielt neutrofiler og blodplater bli aktivert av midler så som GM-CSF, bakterielle endotoksiner, bakterielle kjemo tiltrekkende midler, TNF-alfa og C5a kom-ponenten til komplement.

Aktiverte celler har addisjonsseter på deres overflater hvorved de kan adherere til hverandre. Aktiverte og adhererte celler kan danne klumper som kan tilstoppe små blodårer som de som finnes i lunger og hjerte, og kan dermed redusere blodstrømningen til omgivende vev. De aktiverte cellene kan også adherere til aktiverte vaskulære endothelceller; og slik adhesjon kan føre til påfølgende degranulering av vaskulært endothel, eller til frigjøring a<y> mediatorer for celleskade, så som superoksidanion (O2-) og proteolytis-ke enzymer.

Blant celleaktiverings- og adhesjonsforstyrrelser som foreliggende oppfinnelse er rettet mot er reperfusjonsforstyrrelser, som de som er relatert til reperfusjon av okkluderte blodårer, eller tilfeldig ved kirurgi hvor blodstrømmen temporært er stoppet (se for eksempel Seewaldr-Becker et al., "Effect of Anti-Adhesive Antibodies on Reperfusion injury", (Springer et al., eds.) i: Leukocyte Adhesion Molecules: Springer-Verlag, New York (1990), s. 138-148; og "Adhesion in Disease and Therapy", (Springer et al., eds), i: Leukocyte Adhesion Molecules, Springer-Verlag, New York (1990), s. 85-156). Når det er en blokkering i en blodåre kan omgivene endotelceller, samt nedstrøms ischemisk vev, bli skadet. Det kan til og med bli ytterligere skade på nærliggende endotelceller når okklusjonen blir fjernet. Slike skadede celler kan igjen indusere aktivering i neutrofiler og blodplater etter gjenopprettelse av blodstrømmen til de påvirkede områdene.

De samme cellene som blir aktivert og deretter gjennomgår intracellulær adhesjon kan også ha overflatereseptorer for arachidonsyremetabolitter. Uten å være begrenset til noen teori er det antatt at behandling med arachidonsyremetabolitter, ved binding til disse reseptorene, kan redusere celleaktiveringen og adhesjonsforstyrrelses-assosiert skade ved deaktivering av celleoverflate reseptorene ansvarlig for de forhøyede nivåene av den intercellulære adhesjonen.

PGEi og PGEI2 har blitt funnet å (se, Jugdutt et al., "Dissimilacts of Prostacycn, Prostaglandin E Prostaglandin Myocardial Infarct ze after Coronarusion in Conscious", Circulation CH, 49(3):685-700 981) ha "scant"-effekt når det gjelder å redusere infarkt-størrelsen hos hunder som ble reperfusert etter stimulering av et hjerteinfarkt ved passering av en okkluderingsslynge rundt en koronararterie i rapporterte tester ble prostaglandin administrert via kontinuerlig arteriell infusjon over en 6 timer lang periode og resulterte i administrering av en relativt stor medikament dose. Behovet for denne kontinuerlige infusjonen antas å være at fri, dvs. ikke-hposomale prostaglandiner så som PGEj har en ekstrem kort halveringstid in vivo, og må bli kontinuerlig tilført for å opprettholde et effektivt blodnivå. Det antas videre at prostaglandin blir hurtig inaktivert når blodet passerer gjennom lungene som nødvendiggjør arteriell infusjon i stedenfor en enkle-re intravenøs administrering. Distribusjon av høye nivåer PGEj in vivo er kjent for å indusere systemiske effekter så som hyptensjon, tachykardia og diaré.

Når pasienter blir utsatt for påkjenninger som kan føre til ARDS, så som traumer, brann-sår, sepsis, aspirasjon og hyperoksi, kan mange organer i kroppen andre enn lunger bli påvirket. Årsakene og kliniske forløp til denne tilstanden kan variere meget. For eksempel når det gjeldet et tilfelle hvor en pasient med alvorlig infeksjon hvor endotoksin blir frigjort fra de bakterielle celleveggene blir betennelseskaskaden initiert og fører til sept-isk sjokk. Igjen på grunn av at sepsis/traumesyndrom ikke er begrenset i årsak til infeksjoner er det mulig at endotoksin ikke er involvert, men til tross for dette blir frigjøring av faktorer så som TNF, IL-1 komplement og leukotriener utløst.

Angioplasti er en teknikk hvorved en ballong blir satt inn i en okkludert arterie og opp-blåst for å åpne blokkerte blodårer. Til tross for at denne teknikken har blitt rutinemes-sig ved behandling av koronar arterie sykdom i 6 måneder etter denne prosedyren opp-lever over 33% av de behandlede pasientene restenose, eller reokklusjon av tidligere åpnede blodårer. Det antas at denne tilstanden begynner med skade på vaskulært endothel som ofte er et resultat av ballongprosedyren. Den eksponerte ekstracellulære matrisen vil hurtig bli bundet til flere lag av aktiverte blodplater. Når blodplatene blir bundet vil de frigjøre forskjellige vekstfaktorer som vil resultere i proliferasjon av glatte mus-kelceller som ligger under åren til det punkt hvor åren blir reokkludert. Ved å forhindre blodplater fra å bli bundet til den ekstracellulære matrisen kan man ødelegge kaskaden av heneldser som resulterer i restenose. Akutt administrering ved tidspunkt for angioplasti prosedyren av et medikament som forhindrer blodplateadhesjon kan forhindre restenose.

Nylig har De Servi et al, European Heart Journal, "Prostaglandin E administration in unstable angina patients undergoing PTCA; preliminary results", august 1990, publisert resultatene fra et klinisk forsøk i pasienter med ustabil angina som ble gitt en intrakoronar infusjon av PGEj før og etter angioplasti. Medikamentet ble infusert over en 24-timer periode. Resultatene av denne studien viste at restenoseraten 6 måneder etter angioplasti i PGEj-behandlet gruppe ble redusert med omtrent 50% i forhold til den ubehandlede kontrollgruppen, til tross for at behandling med PGE^ bare varte i 24 timer.

Akutt myokardial infarkt (vanligvis angitt som hjerteinfarkt) refererer til en blokkering av blodtilførselen i musklene i hjertet og ér vanligvis forårsaket av en blodkoagel. Dersom blodet blir forhindret fra å nå hjertet i for lang tid vil pasienten dø. Når en okklusjon av koronar arterien oppstår blir pasienten enten behandlet med et fibrinolytisk middel, så som vevsplasminogenaktivator (tP A) eller streptokinase, for å oppløse koagelen, eller blokkeringen kan oppløse seg selv. I begge tilfeller blir blodstrømningen gjenopp-tatt til ischemisk (oksygen-tappet) region av hjertet. Denne gjensfrømningen av blod inn i hjertet blir kalt reperfusjon. Fordi reperfusjon er nødvendig for å redde pasientens liv forårsaker det ytterligere skade på hjertemuskelen betegnet reperfusjonsskade. Reperfusjonsskade er kjent for å være sluttresultatet av den inflammatoriske kaskaden.

I tillegg til problemet med reperfusjonsskade etter koagelfjerning kan pasienter som lider av hjerteinfarkt lide av andre sekundære problemer. Etter at den normale blod-strømningen blir gjenopprettet til hjertet blir både neutrofiler og blodplater aktivert. Aktiverte blodplater adhererer cfte til hverandre og begynner å reokkludere koronararterien som resulterer i en situasjon hvor raten av blodstrømningen til hjertet reduseres over tid. I noen tilfeller vil fullstendig reokklusjon oppstå. PGEj forhindrer i tillegg til å forhindre neutrofil binding til endotelceller, blodplateaggregasjon og reduserer, om ikke elimi-nerer, den manglende tilbakestrømningen.

Sharma et al., The American Journal og Cardiology, "Intracoronary Prostaglandin E\ Plus Streptokinase in Acute Myocardial Infarction", s 1161, desember 1998, vol. 58, har vist i et klinisk oppsett med akutt hjerteinfarkt at administrering av fri PGE^ ved sakte intrakoronar infusjon sammen med intrakoronar stryptokinase tilveiebringer positive kliniske resultater når sammenlignet med en kontrollgruppe med intrakoronar streptokinase alene. Resultatene viste redusert reperfusjonstid, redusert nødvendig streptokinase-dose, øket prosentandel blodårer opprettet etter 10 dager og høyere ejeksjonsrfaksjoner. Ulempen med studien er at medikamentet må bli gitt ved sakte intrakoronar infusjon som er arbeidskrevende og krever spesialiserte fasiliteter og trenet personale. Denne metoden krever også nøye titrering av PGEi dosen slik at signifikante fall i blodtrykket fremkommer.

Inflammasjon er en prosess med cytologiske og histologiske reaksjoner som oppstår i påvirkede blodårer, og omgivende vev, i respons til en skade se for eksempel Stedman's Medical Dictionary (illustrated) (24th edition, J.V. Basmajian et al., eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1982) s.707-708). lnflammatoriske responser til slike timuli innbefatter lokale reaksjoner og resulterende morfologiske forandringer, destruksjon eller fjerning av skadede materialer og aktivering av repareringsmekanismer. Inflammasjon kan følgelig være en del av prosessen hvorved dyret leger seg selv.

Inflammasjon kan også oppstå i respons til unormale fysiologiske stimuli og kan forårsake problemer i kroppen. Ledd blir for eksempel betente når det gjelder arthrit tilstander så som gout, filary arthritis, rheumatoid arthrit og Lyme sykdom (se for eksempel Stedman's Medical Dictionary (illustrated), supra at s. 123-124). Disse tilstandene kan være karakterisert av ekstravasasjon av celler, dvs. vandring av celler fra sirkulasjonen og inn i det betente området. Midler, så som prostaglandiner, som kan inhibere slik ekstravasasjon, eller som ellers kan inhibere inflammatoriske responser overfor unormale fysiologiske stimuli, kan bli anvendt for å lindre betennelsen.

Toksemi i kliniske manifestasjoner observert i løpet av infeksjonsforløpet til infeksiøse midler, for eksempel mikrober, som inneholder toksiner og andre forbindelser som er giftige for vertsdyret. For eksempel blir det i løpet av infeksjonene med visse gram-negative bakterier så som E. coli, et lipopolysaccharid (LPS) frigjort fra celleveggen når det blir brutt ned. LPS kan deretter indusere celledød i vertsdyret. Toksemiske tilstander oppstår i dyr hvor toksiner så som LPS er blitt gjort tilgjengelige, dvs. i septiske tilstander, eller tilstander med systemisk sykdom forårsaket av formering av mikroorganismer i sirkulasjon (se for eksempel Stedman's Medical Dictionary (illustrated), supra at s. 1274-1275 og 1464). Toksemi kan også være et resultat av eksponering av dyret overfor traumatiske stimuli, for eksempel fysiologiske eller kjemiske traumer.

"Auto-immune forstyrrelser", så som systemisk lupus erythenatosus, juvenile diabetes, multippel sklerose og Hashimotos tyroiditis, er kjennetegnet ved at dyrets immunsystem angriper egne vev.

"Anti-forstyrrelseseffektive" mengder av en arachidonsyremetabolitt eller hvilke som helst mengder effektive for å lindre, inhibere eller forhindre celleaktivering og adhesjon, betennelse, toksemi eller andre indikasjoner assosiert med forstyrrelsen som blir behandlet ifølge foreliggende oppfinnelse. Den effektive mengden av metabolitten omfatter fortrinnsvis minst omtrent 10" 12 g av metabolitt pr kg kroppsvekt til dyret, og fortrinnsvis fra omtrent 10" 12 g kg til omtrent 10"<3> g/kg. Det er mest ønskelig at den effektive mengden av metabolitten omfatter fra omtrent 10"<8> g pr kg kroppsvekt til omtrent 10"<4> g pr kg. Det er mest ønskelig at den effektive mengden omfatter omtrent 10"<6> g arachidonsyremetabolitt pr kg kroppsvekt til dyret.

En betydelig lavere dosering av den liposomale metabolitten, sammenlignet med en dosering av fri metabolitt, er nødvendig for å oppnå ønsket effekt. Som angitt ovenfor,

på grunn av hurtig metabolisme av frie prostaglandiner in vivo, har lange kontinuerlige infusjoner av relativt store doser av disse medikamentene vært nødvendig for å opprettholde et effektivt blodnivå i pasienten som blir behandlet. Hypotensjon, tachykardia og diaré forårsaket av høye blodnivåer av prostaglandiner begrenser mengdene av frie prostaglandiner som kan bli administrert. De høye kostnadene til prostaglandiner gjør at det_ er meget dyrt å administrere slike store doser. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer effektiv administrering av arachidonsyremetabolitter ved reduserte kostnader og med reduserte bivirkninger.

Arachidonsyremetabolitten, for eksempel prostaglandin, behandling kan redusere ska-den i dyr som er påvirket med forstyrrelser kjennetegnet ved celleaktivering og adhesjon, toksemi, betennelse og andre indikasjoner. I noen celler som har reseptorer for cellulære aktiveringsmidler kan også ha overflatereseptorer for metabolittene. Det antas at når metabolittene blir bundet til deres reseptorer kan de deaktivere overflatereseptore-ne ansvarlige for de forhøyede nivåene av intercellulær adhesjon. Mekanismen for denne deaktiveringen antas å være en protein kinase A-formidlet økning i intracellulære cAMP nivåer dannet av metabolitt/reseptor interaksjonen. Uten celle-cellebinding, ko-faktorer så som O2- og forskjellige degrative enzymer kan ikke bli frigjort, og vevsskade blir forhindret.

PGEi er blitt vist å være en potent inhibitor av både neutrofil og blodplateaggregasjon, samt binding av disse cellene til aktiverte vaskulære endotelceller. Arachidonsyre metabolitter så som PGE\ antas også å ha evnen til å både forhindre betennelse, og å stoppe denne når den er begynt. Det er blitt oppdaget at ekstracellulær frigjøring av neutrofiler til mediatorer for betennelse kan bli modulert ved forhøying eller deplesjon av intracellulære lagre av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP).

Det er blitt oppdaget at ekstracellulær frigjøring av neutrofilene til mediatorer for betennelse kan bli modulert ved forhøying eller tapping av ekstracellulære lagre av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) og cyklisk guanosinmonofosfat (cGMP). Forhøying av cAMP reduserer frigjøringen av mediatorer for betennelse, mens økninger i nivåer av cGMP forsterker utskillelse av mediatorene. cAMP blir noen ganger referert til som "universell bryter" på grunn av at økende intracellulære nivåer av cAMP kan stoppe betennelsen uansett faktoren som opprinnelig satte den i gang. Noen prostaglandiner så som PGEi forhøyer cAMP og tilveiebringer følgelig hensikten for anvendelse av PGEj som et anti-inflammatorisk middel. PGEj kan tenkes som et middel som kan aktivere den universale avbrytelsen. Det er blitt vist in vitro at PGEj inhiberer bindingen av neutrofiler og blodplater til seg selv, samt til endothelceller, ved å forhindre aktivering av reseptorer nødvendige for å formidle celle-celle adhesjonen. Denne inhibisjonen er i samsvar med forhøyning av intracellulært cAMP. Uten celle-celle binding kan kofak-torene så som O2- og forskjellige degradative enzymer ikke bli frigjort, og vevsskade blir følgelig eliminert. PGEj virker følgelig som et potent anti-inflammatorisk middeL Det kan både forhindre betennelse og stoppe dette uansett om den formidlende faktoren er EL-1, TNF, komplement, leukotriener eller andre.

Liposomer kan være spesielt fordelaktige bærere for levering av prostaglandiner til deres antatte virkningsseter. Uten å være bundet av noen spesiell teori eller mekanisme er det antatt at liposomene blir tiltrukket til de aktiverte cellene og adhererer til de aktiverte overflatene. Prostaglandin er deretter lett tilgjengelig ved skadestedet for å levere dets anti-cellulære adhesjonsvirkning. En teori for tiltrekking av liposomer til adhesjonsakti-verte celler er at liposomene er opsonisert ved fibronektin og vitronektin i blodet. Opso-nering er prosessen hvorved bakterier blir endret slik at de blir lettere og mere effektivt innesluttet av fagocyter. Opsoniserte liposomer blir lettere tiltrukket til aktiverte neutrofiler som uttrykker reseptorer for fibronektin og vitronektin for derved å levere assosiert prostaglandin til påvirkede seter.

Liposomale arachidonsyremetabolittformuleringer hvor metabolitten er assosiert med liposomen ved en pH gradient over liposomens lipidbilag kan være terapeutisk nyttig.

Liposomale formuleringer som har en indre syrevandig buffer, så som en sitronsyrebuffer, spesielt en pH 4,5 sitronsyrebuffer, er foretrukket for etablering av tranbilag pH gradienter. Arachidonsyremetabolitter assosiert med liposomene ved slike gradienter forblir assosiert med liposomen når pH gradienten blir opprettholdt. Når gradienten blir redusert i kroppen til dyrene hvortil det er blitt administrert liposom, og indre pH følgelig

øker, blir arachidonsyremetabolitten generelt uassosiert med liposomen. Det er da mere sannsynlig at metabolitten, enn når den er assosiert med en liposom, har evne til å reage-re med de tilsvarende overflate reseptorene på cellene, så som neutrofiler, som blir aktiverte og som deretter gjennomgår intercellulær adhesjon.

Unilamellæreliposomer anvendt i henhold til utførelsen av denne oppfinnelsen kan omfatte et tørkebeskyttélsesmiddel, som er generelt en hydrofil forbindelse, så som saccharid, urea, dekstran, aibumin eller polyvinyialkohol, som har evne til å forhindre rear-rangering av lipidene i liposomene, slik at når liposomene er rekonstituert etter dehydrering blir en vesentlig del av innholdet som opprinnelig er innesluttet i liposomene igjen deri. Tørkebeskyttelsesmidler er generelt sterke hydrogenbindingsakseptorer, og har vanligvis stereokjemiske trekk som er gunstige for å bevare det intramolekylære rommet til bilagsbestanddelene. Saccharider, så som mannose, galaktose, trehalose, raffinose, maltose, sukrose, laktose eller dekstrose er foretrukne tørkebeskyttelsesmidler. Maltose er spesielt foretrukket.

Saccharider blir vanligvis anvendt som tørkebeskyttelsesmidler i konsentrasjoner på fra omtrent 5 til omtrent 20%, fortrinnsvis med omtrent 10 vekt-% av vandig fase anvendt for å danne liposomene. Mannitol kan bli anvendt sammen med hvilke som helst av saccharidene, men det er overraskende blitt oppdaget at når den blir anvendt alene opp-rettholder mannitol ikke liposomstørrelsen. Mannitol kan bli anvendt sammen med saccharidene i omtrent en 0-2% konsentrasjon, fortrinnsvis en 1% konsentrasjon. Den tota-le konsentrasjonen av saccharid som blir anvendt varierer fra omtrent 5% til omtrent

20%, fortrinnsvis 10% til 12%, mest foretrukket er omtrent 10%. Ytterligere konserve-ringsmidler så som BHT eller EDTA i formuleringer ved for eksempel 5 mg BHT pr ml etanol, og for eksempel 0,01% EDTA i 10% dekstrose kan også bli innbefattet.

Liposomal dehydrering muliggjør at liposomene blir lagret i lengre tidsperioder. De kan deretter bli gjenopprettet etter behov for administrering til individer. Dehydreringen blir fortrinnsvis utført ved anvendelse av et tørkebeskyttelsesmiddel i sammenheng med liposomene, i henhold til prosedyren til Schneider et al. (US-PS 4.229.360) og Janoff et al., (US-PS 4.880.635); innholdet er innkorporert heri som referanse). Alternativt kan tørkebeskyttelsesmiddelet bli utelatt dersom dehydreringen blir utført uten forhåndstørk-ing og tilstrekkelig vann blir igjen i det liposomale preparatet for å opprettholde integri-teten til en vesentlig del av liposomale bilag gjennom dehydrerings-rehydreringsproses-sen.

Lyofiliserte prostaglandin-liposom formuleringer kan være stabile i minst 1 år når lagret ved 60°C eller 25°C. Innskudd av arachidonsyremetabolitt i liposommembranen, etterfulgt av lyofilisering, antas å verne metabolitten fra vann, og derved å inhibere hydroly-se. Stabilitetsstudier ved anvendelse av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) analyser av formuleringen har vist at etter lagring ved 60°C i 1 år var ingen degraderingsproduk-ter av PGEj tilstede. Når lyofiliserte liposomer skal bli anvendt blir rehydrering oppnådd ved tilsetning av en vandig oppløsning, for eksempel destillert vann, vann for injeksjon (WFI) eller buffer eller vandig oppløsning med hensiktsmessig pH, som beskrevet ovenfor, til liposomene. Liposomene kan deretter bli resuspendert inn i den vandige oppløsningen ved forsiktig blanding. Rehydrering kan bli utført ved omtrent 25°C.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte administrering av et ytterligere bioaktivt middel til dyret, dvs. et bioaktivt middel i tilegg til arachidonsyremetabolitten som liposomen er assoisert med. "Bioaktivt middel" som anvendt heri angir en hvilke som helst forbindelse eller sammensetning som kan bli administrert til dyr. Disse innbefatter midler som har biologisk aktivitet i dyr, samt de som er nyttige for billeddannelse av andre former for diagnostikk. Bioaktive midler innbefatter, men er ikke begrenset til: antivirale, antibakterielle, antisopp, antiparasittiske, antimetabolitiske, antiglaukomiske, antiinflammatoriske eller antineoplastiske forbindelser, steroler, karbohydrater, amino-syrer, peptider, proteiner, immunoglobuliner, immunomodulatorer, farvestoffer, toksiner, enzymer, hormoner, neurotransmittere, glykoproteiner, radiomarkører, radiopaque forbindelser, fluorescens forbindelser, cellereseptorproteiner, cellereseptorligander, mydriatiske forbindelser, bronkodilatorer, lokale anestesimidler, vekstfremmende midler, regenerative midler og lignende. Ytterligere bioaktive midler blir valgt for spesielle indikasjoner ifølge kriterier, for eksempel, behovet for å behandle andre tilstander i dyr, velkjente for fagfolk innenfor dette området i lys av denne oppfinnelsen. Det ytterligere bioaktive middelet kan være en ytterligere arachidonsyremetabolitt.

Oppfinnelsen vil bli mer fullstendig beskrevet i følgende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Preparering av liposom

En 1500 ml batch av liposomal PGEi ble dannet av følgende komponenter:

Fremstilling:

1350 ml vann for injeksjon ble tilsatt til en beholder og innstilt med nitrogenspyling i minst 30 minutter. 150 g maltose (J.T. Baker, Phillipsburg NJ) ble tilsatt til vannet og

blandet helt til dette var oppløst i det nitrogenspylingen fortsatte. Dette produserte 1440 ml blanding ved en pH på 4,81.

I en annen beholder ble 7,06 g egg fosfatidylcholin (EPC) (Nippon Oil and Fats, Hyogo, Japan) kombinert med 6 ml etanol (vannfri) og blandet helt til dette var oppløst, og 45

mg BHT ble tilsatt og blandet helt til dette var oppløst. Til denne blandingen ble 15 mg PGEi tilsatt og blandet helt til oppløst og gjenværende 2,37 ml etanol ble anvendt for å skylle gjenværende PGEi i veiebeholderen inn i blandingen.

Etanoloppløsningen ble trukket inn i en 10 ml glassprøyte og injisert gjennom en 14 gouge kanyle, sakte over en periode på 11 minutter inn i maltoseoppløsningen med hurtig blanding og fortsatt nitrogenspyling. Ved tilsetning av etanol/lipidblandingen ble oppløsningen sløret og indikerte dannelse av liposomer. Suspensjonen ble deretter for-tynnet til et sluttvolum på 1500 ml med gjenværende vann for injeksjon.

Liposomdispersjonen ble deretter ekstrudert 3 ganger gjennom et 0,2 um porestørrelse Nucleopore polykarbonat rett gjennom et stykke typefilter (Nucleopore, Pleasanton CA), etterfulgt av 5 ekstrusjoner gjennom et tilsvarende 0,1 um filter. Partikkelstørrelsen til resulterende liposomer ble bestemt å være 0,169 um (S.D. 0,041 um) ved anvendelse av kvasi-elastisk lysspredning (QLS) (Nicomp Particle Sizer). Liposomdispersjonen ble deretter sendt gjennom et 0,22 um Millipak steriliseirngsfilter. Til slutt ble 10,5 ml ali-kvoter av dispersjonen fylt inn i beholdere og lyofilisert ifølge prosedyrene angitt i eksempel 2 for å danne et lyofilisert produkt, som kan bli anvendt øyeblikkelig eller lagret for fremtidig bruk.

Det lyofiliserte produktet ble rehydrert med 10 ml 0,01 M acetatbuffer (pH 4,3), idet den resulterende suspensjonen har pH på omtrent 4,3. Inneslutning av PGEj i liposomene ble bestemt ved HPLC, og det ble oppdaget at minst 98% av tilgjengelig PGEj var innesluttet i liposomene, i en konsentrasjon på omtrent 9,0 ug PGEi Pr m^ rehydrert suspen-sjon.

L<y>ofiliseirngsprosess

Splitt-topp, butyl-gummikork, flint lyofiliseringsbeholdere med kapasitet på 50 ml ble fylt med 10,5 ml vandige-suspenderte liposomer, inneholdende PGEj. Disse beholderne ble plassert på hyller i lyofiliseringsapparatet (PV-24 Stokes Lyophilizer). Beholderene ble oppbevart ved 0°C i 1,5 timer. Hylletemperaturen ble deretter øket til -45°C i en rate på 0,8°C pr minutt og holdt i 1 time hvoretter et vakuum på 100 um Hg ble påført. Hylletemperaturen ble deretter øket til -28°C i en rate på 0,5°C pr minutt, med et kontinuerlig vakuum ved 100 \ ig Hg.

Beholderene ble oppbevart ved -28°C i 50 timer ved 100 um Hg vakuum. Hylletemperaturen ble deretter øket til +25°C i en rate på 0,5°C/min. og holdt i 22 timer. Beholderene ble deretter satt lokk på under delvakuum.

Akutt hjerteinfarkt/ in vivo test av liposomal PGEj

Rehydrerte liposomer ifølge eksempel 1 ble testet in vivo som et middel for redusering av reperfusjonsskade ved behandling av hjerteinfarkt som er et resultat fra tilstoppede blodårer. Totalt 53 kondisjonerte 25-35 kg hunder ble studert i dose-rangeringsforsøk og infarktstudier. Hundene ble ekskludert fra analysene av følgende årsaker: omfattende kollateralisering til infarktsone (4), hjerteormer ved nekropsi (1) og hjertestans i løpet av okklusjon (1). 40 hunder overlevde hvor 27 var egnet for analyser; 7 hunder i kontrol-len, liposomal PGEi (LUV-PGE\) og liposom-kontroll (tom, eller "vanlig", liposomer) grupper og 6 hunder i PGEi-kontroll (fri PGEj) gruppe.

Dose-rangeringsforsøkene ble utført for å bestemme en egnet dosering som kan anvendes i hjerteinfarktstudiene. Deldoser av liposomalt PGEi ble gitt mens hjerteråte, gjennomsnittlig arterielt trykk, hjertebelastning og lungekapillær trykk ble målt. Blodprøve-ne ble også tatt i intervaller for blodplateaggregasjonsstudier (figur 1). Doser høyere enn 2,0 ug/kg levert som en bolus over 10 til 20 minutter produserte en betydelig tachykardia og forbigående hypotensjon med en betydelig økning (dobling) i hjertebelastningen. Blodplateaggregasjonen ble delvis inhibert ved 0,1 ug/kg og ble totalt inhibert ved 0,6 Hg/kg. En dose på 0,5 ug/kg levert over 10 minutter så ut til å øke hjerteraten og hjertebelastningen i liten grad. For å optimalisere de potensielle resultatene ble det valgt for å oppnå to doser av liposomal PGEj med hver 0,5 ug/kg. En injeksjon ble administrert like etter okklusjon av infarkt-relaterte arterier og den andre like før reperfusjonen. Dette regimet forsikrer en effekt i løpet av ischemi perioden og den innledende reperfu-sjonsperioden. Effekten av liposomal PGEj så ut til å være vedvarende en viss tid etter administreringen. Denne observasjonen er betydelig for reokklusjon etter reperfusjon og restenose etter angioplasti som er direkte relatert til blodplateaggregasjon og adherering til endothelceller og ekstracellulær matrise.

Virkninger av liposomal PGEj, fri PGEi, tomme liposomer og en kontrollgruppe på hjerteraten ble studert. Forsøkshundene ble bedøvd med natriumpentobarbital og opprettholdt med intravenøs pentobarbital og Inovar (droperidol/fentanyl). Arteriell okklusjon ble simulert ved ligering av venstre utgående aortaarterie. 10 minutter etter okklu=^ sjon ble 0,5 ug/kg liposom-bundet PGEi administrert intravenøst over 10 minutter inn i en første gruppe av hunder og en andre gruppe av kontroUdyr ble beholdt uten behandling. Liposominfusjonen forårsaket en økning i hjerteraten som delvis ble motvirket av administrasjon av små mengder ytterligere inovar. Testene viste ingen vesentlige forskjeller i hjerteråte i løpet av eksperimentet mellom kontroll og behandlede dyr. 100 minutter etter okklusjon ble en annen dose på 0,5 ug/kg administrert over 10 minutter. Etter 2 timer ble ligaturen fjernet og forårsaket en akutt reperfusjon av blodåren. 2 timer senere ble hunden avlivet og hjertet ble undersøkt for hjerteinfarktskade. Resultatene er oppsummert i figur 2. Gruppen som mottok fri PGE^ utviste en betydelig økning i hjerteråte etter at den opprinnelige doseringen og fortsatte helt til reperfusjonen. Denne øk-ningen var ikke tilstede i noen av de gjenværende tre gruppene av dyrene. Denne øk-ningen er forårsaket av kompensatorisk tachykardia på grunn av vasodilasjon.

Totalt 7 hunder ble innbefattet i kontrollgruppen, og 7 hunder ble behandlet med liposomal PGEj. I løpet av testperioden forble gjennomsnittlig aortatrykk relativt konstant, og det var ingen betydelig forskjell mellom kontroll og behandlede grupper. Gjennomsnittlig arterielt trykk økte i hver gruppe etter okklusjon, men det var ingen betydelige forskjeller mellom gruppene. Resultatene er oppsummert i figur 3.

Hjerteblodstrømningen, målt ved 15 um radioaktive mikrosfærer, demonstrerte en betydelig økning i alle grupper av dyr etter okklusjon. Det var ingen betydelig forbedring i kolateral blodstrømning etter liposomal PGEj infusjon i testdyrene og dette tyder på at de mikrovaskulære vasodilatoriske effektene til liposomal PGEj var minimale.

Med reperfusjon økte blodstrømningen betydelig høyere i behandlede hunder sammenlignet med kontrolldyrene. Undersøkelse av hjertene viste at størrelsen på hjerteinfarktet uttrykt som en prosent av risikoregionen (dvs. område med lav strømning i løpet av ischemi), så ut til å være redusert med omtrent 50% i hunder behandlet med liposomal PGEi, sammenlignet med ubehandlede kontrollhunder. I tillegg resulterte administrering av liposomal PGEj i en nesten total inhibisjon av blodplateaggregasjonen i blodet.

Figur 4 oppsummerer resultatene i de fire hundegruppene som mottok enten liposomal PGEi, f" PGEi, tunge liposomer eller saltvannskontroll. Liposomal PGEi ble gitt i to 0,5 ug/kg infusjoner over 10 minutter hver i en total dosering på 1,0 ug/kg. Fri PGEi ble kontinuerlig infusert over 90 minutter med .1 [ig/kg/minutt eller en total dosering på 9 ug/kg.

Testene ble også utført for å måle infiltrering av hvite blodceller inn i ischemisk hjerte-vev. Rett etter ekstrahering av hjertet fra dyrene ble prøvene oppnådd fra 1) infarktsone, 2) grensesonen til infarktsone innenfor risikoregionen 3) risiko (ischemisk) sone og 4) kontrollsone utenfor risikoregionen. (Risikoregionen var den delen av hjertet som blir tilført av den okkluderte blodåren). Vevet ble flammefrosset ved anvendelse av flytende nitrogen og oppbevart ved -70°C helt til det ble analysert. Myeloperoksidase (et enzym som bare finnes i neutrofiler) aktiviteten ble deretter analysert for hver av de fire sonene i hvert dyrehjerte. Innledningsvis ble 6 kontrolldyr testet på denne måten til tross for at en av disse (CONT 4 i tabellen) ble betraktet som varierende i løpet av testen, men ble inkludert i tabuleringen for å oppnå en helhet. Bare 4 av dyrene behandlet med liposomal PGEj (LIPO 1-4) ble inkludert i denne delen av studien. Resultatene er presentert i tabulær form i tabell 1 hvor nivået av myeloperoksidase uttrykt i tilfeldige enzymenheter for sammenlignende formål:

Ytterligere hunder ble testet i hver gruppe. Figur 5 oppsummerer resultatene av alle hunder egnet for analyser i hver av de fire testede gruppene.

I ovennevnte tabell indikerer en strek at ingen måling ble utført ved den bestemte Verdi-en.

Eksempel 3

In vivo tester for ARDS profylakse:

Respiratorisk distressyndrom i voksne (ARDS) er en tilstand som er sekundær overfor forskjellige forekomster inkludert, men ikke begrenset til, traumer, brannaspirasjon og hyperoksia. Tilstanden er kjennetegnet ved interstitiell ødemdød til kapillær skade. Når lungene blir fylt med væske blir pusting vanskelig og 5-60& av pasientene dør. Hendel-sene som fører til denne katastrofale konklusjonen kan variere avhengig av naturen til den innledende heneldsen. Faktorer så som C3a, C5a, EL-1 og TNF aktiverer neutrofilene. Virkningsmåten til PGEi er avhengig av mekanismene for cellulær aktivering. I nærvær av PGEi kan ikke neutrofllene bli aktivert, og dersom de allerede er aktivert vil de bli stoppet og derved forhindre sykdom.

Studiene ble utført på gangermodeller for ARDS hvor lungeskaden var blitt indusert ved enten termisk skade eller ved direkte intratracheal injeksjon av IL-1. Som angitt i følg-ende eksempler forhindrer doser av liposomal PGEj lekkasje av væske inn i lungene og reduserer betydelig influks av neutrofiler inn i lungene.

Rehydrert liposomal PGEi ifølge eksempel 1 ble testet in vivo som et profylaktisk middel for forløpet av respiratorisk distressyndrom i voksne (ARDS). Testrottene ble delt inn i 3 grupper inneholdende 7 eller 8 dyr hver og behandlet med enten 8 ug/kg liposomal PGEi eller saltvann samtidig med og en etter termisk skade (ved nedsenkning i 70°C vann i 45 sekunder). Den første gruppen ble behandlet med liposomal PGEi °8 den andre gruppen ble ikke behandlet med liposomal PGEi, men ble utsatt for de samme traumene og en tredje gruppe ble hverken behandlet eller traumatisert. En time før ofring av rottene ble 125 1-albumin injisert intravenøst som en markør for væskelekkasje inn i lungen. 4 timer etter termisk skade ble dyrene ofret. Resultatene av studien er oppsummert i figur 6.

En effekt av en slik traumatisering er kjent for å være begynnelsen av ARDS og viser ved et øket nivå av albumin i lungene til påvirkede dyr. Ubehandlede traumatiserte dyr utviste alle forhøyede nivåer av albumin i lungene. 6 av disse 7 testede dyrene døde. Albuminnivået i dyrene behandlet med liposomal PGEi ble funnet å være så lav, eller til og med lavere enn nivåene i den utraumatiserte kontrollgruppen. Ingen av de 7 PGEi behandlede dyrene døde som et resultat av traume. Disse resultatene viser effektiviteten til liposomal PGEi som et profylaktisk middel på forløpet av ARDS.

In vivo tester for behandling av ARDS indusert ved intratracheal injeksjon av EL- 1: Intratracheal instillasjon av rekombinant IL-1 induserer en neutrofil influks og lungeskade i rotter (figur 7). Liposomal PGE-1 behandling vil redusere EL-1 indusert lungeskade og neutrofil influks. 50 ng kommersielt tilgjengelig interleukin 1 (IL-1) eller saltvann (i kontrollgruppen) ble ført inn i luftrøret til rottene og induserte neutrofil infiltrering i lungene og lekkasje av væske inn i alveoli. Intravenøs behandling av 6 ug/kg av enten rehydrert liposomal PGEi ifølge eksempel 1, fri PGEi eller tomme liposomer ble administrert 2,5 timer etter IL-1 tilførsel i rotter som hadde mottatt IL-1. Av de analyser-te rottene mottok 40 bare saltvann, 54 mottok IL-1 og var ubehandlede, 6 mottok IL-1 og ble behandlet med liposomal PGEi, 6 mottok IL-1 og ble behandlet med tomme liposomer, og 6 mottok IL-1 og ble behandlet med fri PGEi. 4 1/2 time etter at EL-1 ble gitt, etter at mange neutrofiler allerede hadde blitt infiltrert inn i vevet ble rottene injisert med 125 1 albumin som en markør inn i blodstrømmen. En halv time etter at albumin var injisert ble dyrene ofret, lungen fjernet og lekkasje av væske inn i lungen ble kvantifisert ved å bestemme mengden av isotopen i Vevet. En lungelekkasje indeks ble beregnet basert på tellinger pr minutt (cpm) av merket 125 1-albumin i lungen delt på mengden av merket 125 1-albumin i blodstrømmen. Lungelek-kasjen blir uttrykt på y-aksen i figur 7. Som angitt i figur 7 forårsaker tilførsel av IL-1 uten behandling en 2,5-ganger økning av lungelekkasje over narregruppen eller dyr gitt saltvann. Når liposomal PGEi behandling ble gitt etter innførsel av IL-1 var lungelek-kasjeindeksen lik det som fremkom i narrekontrollen. Behandling med hverken fri PGEi eller tomme liposomer hadde virkning på lungelekkasje.

Denne sekvensen av heneldser representerer det som kan oppstå i et klinisk oppsett. Skade ble indusert og behandlingen ble initiert ved et senere tidspunkt etter at hensikts-messig diagnose ble utført.

Eksempel 4

Endotoksemi studier i rotter

Preparering av EPC- inneholdende PGEi MLV

En egg fosfatidylcholin (EPC) stamoppløsning (20 mg/ml i etanol) ble dannet som føl-ger: 1 g tørket EPC ble løst opp i 50 ml absolutt etanol med forsiktig omrøring, i en 50 ml brun flaske med et teflon-belagt lokk. Den resulterende oppløsningen ble lagret ved -20°C. En PGEi stamoppløsning (1 mg/ml i etanol) ble preparert som følger: 20 mg tørket PGEi ble overført til 20 ml beholder hvortil det ble tilsatt 20 ml absolutt etanol. PGEi ble løst opp i etanol med forsiktig omrøring og den resulterende oppløsningen ble lagret ved -20°C.

En alikvot av EPC stamoppløsningen (9,75 ml) og en alikvot PGEi stamoppløsning (0,5 ml) ble kombinert i en 500 ml rundbunnet flaske. Etanol ble fjernet ved rotoavdamp-ning ved omtrent 30°C i minst 2 timer. Tørket EPC/PGEi ble resuspendert i en pH 4,5 buffer (for eksempel 50 mM acetat, 150 mM NaCl, pH bragt til 4,5 med 10N NaOH; glasskulene var behjelpelig med resuspensjon av tørket EPC/PGEi (for å danne en lipo-somsuspensjon. Denne suspensjonen ble lagret ved 4°C.

Preparering av DPPC- inneholdende PGEi MLV

En DPPC stamoppløsning ble dannet som beskrevet ovenfor ved anvendelse av 1,035 g dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) oppløst i metylenklorid. Rehydrering av tørket DPPC/PGEi blandingen krevde oppvarming i et vannbad, med omdreining, ved omtrent 52°C, i omtrent 3-5 minutter.

Endotoksemi modell i rotte

Feber, hypotensjon, forandringer i leukocyt antall og diaré er symptomer på gram-nega-tive bakterielle infeksjoner. Disse infeksjonene kan føre til disseminert intravaskulær koagulasjon og irreversibelt sjokk. Et stort volum litteratur indikerer involvering av leu-kocytavledet EL-1, EL-6 og TNF-a i formidling av progresjonen av endotoksisk sjokk. På grunn av at in vitro dataene heri indikerer en inhibisjon av disse cytokinene fra dyrkede monocyter er det blitt utviklet heri en in vivo modell for rotteendotoksemi ved anven-deise av dødelighet som et sluttpunkt, for å vurdere effektiviteten til PGEi °8 partikkel-formige formuleringer ved attenuering av LPS-indusert død.

Eksperimenter ble konstruert for å bestemme LD50 for E. coli LPS (lipopolysaccharid: serotype 055.B5) i Sprague-Dawley rotter. Data fra disse eksperimentene er vist i figur 8 og indikerer at LD50 er på 50 ug/kg. Denne LPS doseringen ble anvendt i påfølgende eksperimenter dersom ikke annet er angitt.

Sprague-Dawley hannrotter med vekt på 126-150 g ble akklimatisert i 2 dager i et dyre-bur med mat og vann etter behov. Ved tid 0 ble grupper av rotter (n=16) injisert i.v. med enten E. coli lipo polysaccharid som en enkelt bolus, eller med en saltvanns- (uten LPS) kontroll. Dødeligheten ble vurdert ved forskjellige tidspunkter (dager) post-LPS administrasjon.

Inhibision av tumornekrosefaktor alfa ( TNF- q) og interleukin- 1 beta ( IL- IB) syntese i repons til lipopolysaccharid ( LPS) og PGEi

Adherente humane monocyter ble stimulert med LPS (1 ug/ml/l0<*>> celler) ved tid 0. Fri PGEi (ikke innesluttet i liposomer), LUV-PGE 1 (store unilamellære liposomer (LUV) fremstilt i henhold til prosedyrene beskrevet i dette eksempelet), LUV-PGE 1 "placeboliposomer (LUV som inneholder PGEi), LUV placeboliposomer pluss frie PGEi, placeboliposomer eller en saltvannskontroU (uten PGEi) ble injisert samtidig (10 nm PGEi). Utskilt TNFa og EL-1B ble analysert i 3 timer. Resultater for disse eksperimentene er presentert i figur 9, aB.

Attenuering av LPS- indusert dødelighet

Hann Sprague-Dawley rotter ble injisert i.v. med 50 ug LPS/kg kroppsvekt ved tid 0. Fri PGEi, LUV-PGE 1 (40 ug/kg PGEi), placebo LUV (LUV som ikke inneholder PGÉf; ekvivalente partikkelantall til antall liposomer gitt med 40 ug/kg PGE-LUV-PGEi dosen) eller placebo LUV (40 ug/kg lipid ekvivalens) pluss fri PGEi (40 ug/kg). Det var 12 rotter i hver behandlingsgruppe. Overlevelsen ble vurdert i hver gruppe 6, 12, 18 og

24 dager post-LPS administrasjon. Resultatene er presentert i figur 10.

Eliminering av fri PGEi- indusert dødeli<g>het

hann Sprague-Dawley rotter ble injisert i.v. med 50 ug/kg LPS ved tid 0. Fri PGEi (40 Hg/kg), LUV-PGEi (40 ug/kg PGEi), placebo LUV (40 ug/kg lipid ekvivalens, dvs. antall placebo LUV var lik antall LUV tilstede i sammenheng med en dose på 40 mikro-

gram prostaglandin El pr kg kroppsvekt), lateks mikrosfære (antall ekvivalent med antall placebo LUV) eller lateks mikrosfære pluss fri PGEj samtidig injisert i.v. Overlevelsen i behandlingsgruppen (16 rotter) ble vurdert i 24 timer. Resultatene er presentert i figur 11.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en sykdom kjennetegnet ved celleaktivering og adhesjon, inflammasjon eller toksemi, karakterisert ved at den omfatter formuleringen: (a) en farmasøytisk akseptabel bærer; og (b) et unilamellært liposom som omfatter: (i) et lipid; (ii) en frigjøringsinhiberende vandig buffer; (iii) en antisykdomseffektiv mengde av en arachidoninsyremetabolitt som er minst omtrent IO"<12> g av metabolitten pr. kg. kroppsvekt av dyret som skal behandles, hvori nevnte fngjøringsinhiberende buffer øker styrken av metabolittlipidinteraksjoner eller etablerer elektrostatiske repulsjoner med metabolitten.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteiisert v e d at den er egnet for intravenøs administrering.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det unilamellære liposomet er et stort unilamellært liposom som har en diameter på omtrent 100 nm.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atara-chidoninsyremetabolitten er et prostaglandin.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at prostaglandinet er prostaglandin El.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, k aråkterisert ved at lipidet er et mettet acylkj edelipid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det mettede acylkj edelipidet er dipalmitoylfosfatidylkolin.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er en sitronsyrebuffer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved atsi-tronsyrebufferen har en pH på omtrent 4,5.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at sykdommen omfatter reperfusjonskade, systemisk inflammatorisk responssyndrom, myo-kardialt infarkt, voksent respiratorisk "distress"-syndrom, vaskulititt, branhsårskade, post-traumatisk sjokk, en vaso-okklusiv sykdom, en artrittsykdom eller en autoimmun-sykdom.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved atar-trittsykdommen er reumatoid artritt, gikt eller filarartritt.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at den autoimmune sykdommen er systemisk lupus erythematosus, juvenil diabetes, multippel^ sklerose eller Hashimoto's tyroiditt.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at sykdommen omfatter systemisk inflammatorisk responssyndrom eller voksent respiratorisk "distress"-syndrom.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den effektive mengden av metabolitten er fra omtrent 10" g metabolitt pr. kg. kroppsvekt av dyret til omtrent 10" g pr. kg.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den effektive mengden av metabolitten er fra omtrent 10" Q g metabolitt pr. kg kroppsvekt av dyret til omtrent 10^ pr. kg.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at den effektive mengden av metabolitten er omtrent IO"<6> g metabolitt pr. kg av kroppsvekten til dyret.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atlipo-somet omfatter et tørkingsbeskyttelsesmiddel.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at tørkingsbeskyttelsesmidlet er et sakkarid.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved atsak-karidet er maltose, laktose, dekstrose, trehalose, raffinose eller sukrose.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved atsak-karidet er maltose.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter et ytterligere bioaktivt middel.

22. Anvendelse av en sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og et unilamellært liposom som omfatter en arachidoninsyrematabolitt, et lipid og en fri-gjørelsesinhiberende vandig buffer, hvori nevnte frigjøringsinhiberende buffer øker styrken av metabolittlipidinteraksjoner eller etablerer elektrostatiske repulsjoner med metabolitten for fremstilling av en sammensetning for behandling av et dyr som lider av en sykdom kjennetegnet ved celleaktivering og adhesjon, inflammasjon eller toksemi.

23. Anvendelse ifølge krav 22, hvori dyret er et menneske.