KR100355247B1

KR100355247B1 - 다층라멜라리포좀성아라키돈산대사물질

Info

Publication number: KR100355247B1
Application number: KR1019960702298A
Authority: KR
Inventors: 로버트 피. 랭크; 미셀 엘. 톰쇼우; 로버트 엘. 슈디스; 로버트 제이. 클림쵸크; 앤드류 에스. 야노프; 샤르마 알. 민치; 마르크 제이. 오스트로
Original assignee: 더 리포좀 컴퍼니, 인코퍼레이티드
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2003-01-24
Also published as: AU687921B2; GR3033817T3; DE69423773T2; WO1995012389A1; WO1995012388A1; JPH09504793A; KR960705544A; KR100355246B1; AU8130894A; KR960705543A; EP0726764A1; DK0726764T3; ATE184785T1; ES2136271T3; NO961778D0; CA2175057A1; NO312809B1; EP0726763B1; NO961779L; NO312810B1

Abstract

본 발명은 아라키돈산 대사물질, 2개이상의 지질을 포함하는 이중층과 방출-저해성 완충액을 포함하는 2개이상의 수용성 격실을 포함하는 다층라멜라 리포좀을 제공한다. 적절한 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘 특히 PGE1 이다. 리포좀 조성물은 세포활성 과흡착, 염증 또는 독혈증을 특징으로 하는 질병을 프로스타글란딘에 의해 경감되는 동물 특히 사람을 치료하는 것을 특징으로 한다.

Description

다층라멜라 리포좀성 아라키돈산 대사물질{MULTILAMELLAR LIPOSOMAL ARACHIDONIC ACID METABOLITE FORMULATIONS}

제 1 도는 MLVs 에서 PGE₁의 방출을 나타낸다. 에그포스파티딜콜린(EPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)로 구성되고 50mM 시트레이트 완충액(pH 4.5)으로 형성되고, 지정된 시간동안 pH 7.1 완충액에서 실온배양한 다층라멜라 소포(MLVs)로부터 프로스타글란딘 E₁의 방출을 나타낸다. X축: 시간(분), y축:펠렛화된 리포좀에 보유된 PGE₁%.

제 2 도는 쥐에서 공기주머니 연구를 나타낸다. 리포좀성 PGE₁조성물은 혈관계로부터 쥐공기주머니로 백혈구 세포의 일출(침윤의 뜻 포함)를 저지한다. 숫컷 스프라우그-도우리 쥐에는 피하 공기주머니가 형성되어 있다. fMLP(2.15㎍)을 0시간에 공기주머니로 직접 주사하고 자유 또는 리포좀성 PGE₁은 정맥으로 동시에 주사하였다. 6시간후에, 공기주머니 삼출물을 수득하고, 공기주머니 총세포집단을 결정한다. 각 처리집단에서 n=4, X축:염콘트롤, 자유 PGE₁, 자유 15-M-PGE₁(15-메틸-PGE₁), C-53 PGB 조성물(단층라멜라 리포좀성 PGE₁), C-53 플라시보(PGE₁이 없는 리포좀), C-53 플라시보 리포좀 + 자유 PGE₁, PGE₁+MLVs(다층 라멜라 리포좀), MLV 플라시보 리포좀, MLV 플라시보 리포좀+자유 PGE₁; Y축; 세포/ml x 10,000 삼출물에서.

제 3 도는 백혈세포 서브세트 삼출물의 저해. 피하공기주머니는 숫컷 스프라우그-다우리 쥐에 형성되어 있다. fMLP(2.15㎍)을 0시간에 공기주머니로 직접 주사하고 자유 또는 리포좀성 PGE₁은 정맥으로 동시에 주사하였다. 6시간후에, 공기주머니 삼출물을 수득하고, 공기주머니 총세포집단을 결정한다. 도면은 프로스타글란딘에 대해 나타낸 것이다. 염콘트롤에서 이는 1.62x10⁶호중구/ml 이다. 각 처리집단에서 n=4 이다.

제1컬럼()은 폴리몰포뉴클레오사이트(PMNS)이고;

제2컬럼 ()은 혈소판이고;

제3컬럼 ()은 암파세포이고;

제4컬럼 ()은 단세포이다.

Y축은 세포수/삼출물 mlx10,000.

제 4 도는 백혈구세포 일출의 저해에 대한 약량반응이다.

숫컷 스프라우그-도우리 쥐에는 피하 공기주머니가 형성되어 있다. fMLP(2.15 ㎍)을 0시간에 공기주머니로 직접 주사하고 자유 또는 리포좀성 PEG 은 정맥으로 동시에 주사하였다. 6시간후에, 공기주머니 삼출물을 수득하고, 공기주머니 총세포집단을 결정한다. 도면은 프로스타글란딘에 대해 나타낸 것이다. 염콘트롤에서 호중구의 값은 사용된 눈금에서 제외시킨다. 이는 1.62x10⁶호중구/ml 이다. 각 처리집단에서 n=4 이다. X축:염 콘트롤, 자유 PGE₁, C-53, C-53 플라시보리포좀, C-53 플라시보 리포좀+자유 PGE₁, PGE₁-MLVs, MLV 플라시보 리포좀, MLV 플라시보 리포좀 + 자유 PGE₁; Y축: 세포수/삼출물 mlX10,000.

컬럼 25 ㎍/kg PGE 또는 플라시보 리포좀 등가량,

컬럼 50 ㎍/kg,컬럼 10 ㎍/kg.

제 5 도는 일출의 연장된 저지를 나타낸다. 숫컷 스프라우그-도우리쥐는 전술한 것과 같이 처리한다. 6과 24시간후에, 공기주머니 삼출물을 수득하고 공기주머니 총세포집단을 결정한다. 도면은 프로스타글란딘에 대해 나타낸 것이다. 6시간과 24시간 염콘트롤(200과 925)값은 도면에서 제외시킨다. 각 처리집단에서 n=4이다.

X축:염콘트롤, 자유 PGE , C-53 와 MLV-PGE₁,

Y축:세포/ml x 10,000

Z축:6시간() 과 24시간 ()처리.

제 6 도는 또다른 리포좀 조성물에 의한 일추의 저해를 나타낸다. 숫컷 스프라우그-도우리쥐는 전술한 것과 같이 처리하였다. 각 처리집단에서 n=4이다. X축: 염콘트롤, 자유 PGE₁, C-53, C-53 플라시보, MLV-PGE₁, MLV-플라시보, SPLV-PGE₁(안정한 다층 라멜라 소포(Lenk et al., U.S. Patent Nos. 4,522,803, 5,030,453 and5,169,637), SPLV 플라시보, SPLV 플라시보 + 자유 PGE₁, EPC/콜레스테롤(Chol)/POPE-GA(1-팔미토일-2-올레일-포스파티딜콜린-글라타르산)-PGE₁, EPC/Chol/ POPE-GA(PGE₁없음), EPC/Chol/POPE-GA/ DOPE-PGE₁(디올레일 포스파티딜에탄올아민이 PGE₁에 공유결합), EPC/Chol/DOPE-PGE₁, EPC/Chol/POPE-GA 플라시보 + 자유 PGE₁;

Y축; 세포/ml x 10,000.

제 7 도는 어쥬번트 관절염/자유 PGE₁. 숫컷 루이스쥐에 하기에서 상술하는 것과 같은 컴플리트 플루언츠 어쥬번트를 0일에 접종시켰다. 자유 PGE 는 0일에 10㎍/1kg 의 양으로 시작하여 쥐의 한집단에 주사하고 매 2일마다 주사를 반복하였다. 자유 PGE 또한 10일에 시작하여 10㎍/kg 양으로 또다른 집단에 주사하고 매 2일마다 주사를 반복하였다. 또한 어쥬번트 콘트롤(PGE₁없음)과 염콘트롤(어쥬번트 없음)도 투여하였다. 각 처리집단에서 n=6이다. X축: 시간(일), Y축: 턱크기에서 변화%.: 어쥬번트 콘트롤(PGE₁없음).

: 어쥬번트 PGE₁이 0일에 투여됨.

: 0일에 어쥬번트가, 10일에 PGE₁이 투여됨.

: 염 콘트롤(어쥬번트 없음).

제 8 도는 어쥬번트 관절염/자유 PGE_{1 .}숫컷 루이스쥐는 컴플리트 플루언츠어쥬번트와 PGE₁으로 전술한 것과 같이 처리한다. 처리동안에 동물의 체중은 매주 체크한다. 각 처리집단에서 n=6이다. X축: 어쥬번트 투여후 시간(일), Y축:체중%.

: 어쥬번트 콘트롤.

:어쥬번트 + PGE₁을 0일에 투여함.

: 어쥬번트 + PGE₁을 10일에 투여함.

: 염콘트롤.

제 9 도는 쥐 일반적인 건강/치사율. 루이스 숫컷쥐를 컴플리트 플루언츠 어쥬번트와 PGE₁으로 전술한 것과 같이 처리한다. 동물의 일반적인 건강, 활력 그리고 치사율을 처리기간 14일에 기록한다. 각 처리집단에서 n=6이다. X축: 어쥬번트 콘트롤, 어쥬번트 + PGE₁를 0일에 투여함, 어쥬번트 + PGE₁을 10일에 투여함, 어쥬번트 + PGE₁을 14일에 투여함, 염콘트롤(어쥬번트 없음), Y축: 개체수.

제 10 도는 어쥬번트 관절염/리포좀성 PGE₁. 숫컷 루이스 쥐는 컴플리트 플루언츠 어쥬번트와 PGE₁을 10㎍/㎏ 체중으로 전술한 것과 같이 처리한다. 쥐는 어쥬번트 단독(), 어쥬번트와 자유(포획안된) PGE₁(상측라인), 어쥬번트와 다층라멜라 리포좀성 PGE₁(, 하측라인) 그리고 염콘트롤(어쥬번트 없음)().

X축: 어쥬번트 처리후 시간(일)

Y축: 턱크기에서 변화 빈도

제 11 도는 어쥬번트 관절염/리포좀성 PGE₁. 숫컷 루이스쥐는 10㎍/㎏ 양으로 자유 또는 리포좀성 PGE₁으로 전술한 것과 같이 처리한다. 관절 직경은 매주 측정한다. 각 처리집단에서 n=6이다. 쥐에는 어쥬번트 콘트롤(PGE₁없음,), 어쥬번트 + 자유 PGE₁(), 어쥬번트 + C-53(), 어쥬번트 + PGE₁- MLVs(), 또는 염콘트롤 (어쥬번트 없음)을 투여한다.

X축: 어쥬번트 처리후에 시간(일)

Y축: 턱크기에서 변화빈도

제 12 도는 어쥬번트 관절염/리포좀성 PGE₁. 숫컷 루이스쥐는 10 ㎍/㎏ 의 양으로 자유 또는 리포좀성 PGE₁으로 전술한 것과 같이 처리한다. 동물의 일반적인 건강, 왕성함, 치사는 어쥬번트 처리후 14일에 기록한다. 각 처리집단에서 n=이다.

X축: 어쥬번트 콘트롤, 자유 PGE₁, C-53,

PGE₁-MLVs, 염콘트롤

Y축: 개체수

제 13 도는 쥐의 독혈증 모델이다. 각 126-150g 의 무게를 가지는 숫컷 스프라우그-도우리쥐를 음식과 물에 대해 2일간 환경적응을 시킨다. 0시간에 쥐집단(n=16)에 대장균 리포폴리사카라이드(LPS; 세로타입 0.55:B5)를 단일 알약으로 또는 염(LPS 없음) 콘트롤을 투여한다. 치사율은 LPS 투여후 지정시간대에 측정한다.

X축: LPS 투여후 시간(일)

Y축: 처리집단에서 생존율

: 염콘트롤 투여(0㎍/㎏ LPS)된 쥐.

: 10 ㎍/㎏ LPS 투여된 쥐.

: 15 ㎍/㎏ LPS

: 25 ㎍/㎏ LPS

: 50 ㎍/㎏ LPS

: 75 ㎍/㎏ LPS

: 100 ㎍/㎏ LPS

제 14 도는 쥐 독혈증 모델/리포좀성 프로스타글란딘 처리. 숫컷 스프라우그-도우리쥐에 0시간에 50 ㎍/㎏ LPS 를 투여하고 자유 또는 리포좀성 PGE₁(40 ㎍/㎏)을 동시에 i.v.로 투여한다. 처리집단(n=12 에서 생존율은 지정시간대에서 측정한다. X축: LPS 투여후 시간(일), Y축: 처리집단에서 생존율.

: 염콘트롤(LPS 없음)

: 자유 PGE₁

: C-53

: PGE₁- MLVs

: LPS 콘트롤(PGE 없음)

본 출원은 1993년 11월 16일 출원된 미국특허출원 08/152,852 의 연속출원의 일부이고 이는 1992년 1월 16일자 출원된 07/821,648의 연속출원의 일부이고 미국특허 5,262,168 이며, 이는 다시 1992년 4월 30일자 출원된 07/876,200의 연속출원이다.

본 출원은 아라키돈산 대사물질의 다층라멜라 리포좀 조성물에 관계하고 이 조성물은 세포활성과 흡착질환, 염증질환 또는 독혈증질환과 같은 병의 치료에 사용될 수 있다.

아리키돈산과 다른 20개 탄소 "필수" 지방산은 적어도 3개 이중결합을 가지는데 이는 프로스타글란딘을 만드는데 사용된다 (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(A. Goodman Gilman et al., eds.), Pergamon Press, New York (1990), pp. 600-611); L. Stryer, Biochemistry(2nd edition), W. H. Freeman and Co., New York (1981), pp. 853-854)). 다양한 프로스타글란딘은 몇가지 집단(A-1)으로 분류할 수 있는데 이는 프로스타글란딘 합성동안에 20개 탄소 지방산 저구체내로 유입되는 5개 탄소고리에 다양한 치환체로 구분된다. 이들 집단은 또한 프로스타글란딘의 탄소사슬에 이중결합의 수와 위치에 따라 또한 세분될 수 있다. 프로스타글란딘은 세포표면 수용체에 의해 이들의 표적세포에 활동하는 것으로 보여지는데 이들 수용체들은 프로스타글란딘 활동을 중재하는 제 2 메신저 시스템과 결합되어 있는 것으로 보인다. 프로스타글란딘은 광범위한 생물학적 활성을 가진다. 이들은 연맥관 근육에 작용하여 강력한 기관지 확대제가 되고; 프로스타글란딘은 또한 혈액세포 특히 호중구와 혈소판의 기능에 영향을 준다. 자궁 수축은 프로스타글란딘 작용에 의해 영향을 받는데 이는 신장, 중추신경계와 신경기능에 영향을 준다. 다양한 엔도크린 조적이 프로스타글란딘에 반응한다. 또한, 프로스타글란딘은 동물에서 염증상황을 조절한다.

채내에 있는 효소는 프로스타글란딘을 신속히 비활성화시킨다. 이는 일반적으로 혈청내에 치료요법적으로 효과적인 수준을 유지시키기 위해 다량의 화합물을 빈번히 투여하는 것이 요구되고 따라서 프로스타글란딘 치료비용이 증가하고 원하지 않는 부작용의 가능성도 유도한다. 또한, 프로스타글란딘의 비활성화는 혈액이 폐를 통과할때 주로 발생하므로 화합물은 일반적으로 동맥내 투여될 수 있다.

리포좀성 조성물은 프로스타글란딘과 같은 아라키돈산 대사물질의 순환 반감기를 연장시킬 수 있고 폐에서 이들의 비활성화를 피하는 것을 도울 수 있다. 따라서 이와 같은 리포좀성 조성물이 또다른 치료요법적 용도를 제공할 수도 있다. Mizishuma et al.(J. Rheumatol. 14:97(1987)) and Hoshi et al.(Drugs. Exptl. Clin. Res. 12(8):681(1986))는 프로스타글란딘 E₁(PGE₁)을 포함하는 지질소포에 대해 상술하였다. 그러나 Mizishuma et al.(U.S. Patent No. 4,493,847)와 Imagawa et al.(U.S. Patent No. 4,684,633)에서 상술한 것과 같이 이들 "소포"는 실제 프로스타글란딘을 포함하는 지질유액이고 이는 리포좀이 아니다. 따라서 여기에서 제시하는 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물과 같은 동일한 성질이나 동일한 장점을 가지지 않는다. Shell and See(U.S. Patent Nos. 4,820,732 and 4,955,878)에서는 환자에 프로스타글란딘-함유 조성물을 투여하는 것과 관계하는 맥관형성 과정동안에 기능이상을 감소시키는 치료에 대해 상술하였다. 이들 조성물은 또한 담체를 포함할 수도 있다. 그러나 탈수된 알코올과 염용액과 같이 여기에서 상술한 지질담체는 일반적으로 아라키돈산 대사물질의 지연방출을 제공하지는 않는다. 상술된 지방을 실은 소포 담체는 직경이 적어도 7 미크론이 되는 적혈구 세포와 같이 크거나 더 클수도 있다. 동물에 이와 같은 큰 크기의 입자투여는 소포가 폐모세혈관과 같은 작은 혈관벽에 엉겨붙기 때문에 어려움이 있다.

리포좀은 양쪽성 지질분자의 하나이상의 이중층으로 구성된 자체-결합하는 구조로 이들 각 이중층내에는 수용성 부분이 있다. 단층라멜라 리포좀은 하나의 지질 이중층이다. 다층라멜라 리포좀은 2개 이상의 지질이중층을 가진다. 리포좀은 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다(Cullis et al., in: Liposomes, From Biophvsics to Therapeutics(M. J. Ostro, ed.), Marcel Dekker, pp. 39-72(1987).

약물을 리포좀에 넣는 것은 약물의 독성을 감소시키고 이의 효과를 증가시킴으로써 치료요법을 강화시킬 수도 있다. 또한 리포좀은 순환계에 다른 특정물질과 같이 타원형 모세혈관을 가지는 조직에서 망상 내피세포 시스템의 식세포에 의해 일반적으로 포획된 다음 세포내 감염부위로 직접 가기도 한다.

리포좀에 포획된 약물의 효과를 최대화 하기 위해서는 각 개체에 제공되는지질양을 최소로 하고, 가치있는 약물 생성물의 소비를 최소화 해야 한다. 리포좀으로부터 방출되는 화합물의 방출은 이들의 포획에서 최대의 이익을 얻도록 유도되는데 방해될 수도 있다. 또한 안정하게 저장될 수 있는 리포좀의 제공이 이로 유도되는 치료효과를 증가시킬 수도 있다.

본 발명에서 이용된 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물은 프로스타글란딘으로 치료될 수 있는 질병의 치료와 예방에 유용한데 이와 같은 질병에는 독혈증 질환, 염증성 질환과 같은 질병 또는 질환과 세포활성 그리고 흡착성 질환과 같은 것을 예방 또는 제거하는데 유용하다.

발명의 요약

본 발명은 아라키돈산 대사물질로 구성된 다층라멜라 리포좀을 제공하는데 2개 또는 그이상의 지질 이중층은 방출-저해 완충액으로 구성된 수용성 격실과 지질로 구성된다.

적절하게는 다층라멜라 리포좀은 수용성 격질내에 포획된 용질로 구성되는데 다층라멜라 리포좀의 수용성 격질에 각각 있는 용질의 농도는 실제 동일하고 즉 본 발명의 다층라멜라 리포좀은 실제 라벨라간 용질분포가 균일하다.

적절하게는 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘이다. 적절하게는 프로스타글란딘은 E 시리즈 또는 I 시리즈 프로스타글란딘이다. 가장 적절하게는 대사물질은 프로스타글란딘 E1((PGE1)이다.

적절하게는 지질은 포화된 아실 사슬이다. 본 발명의 한 구체예에서 포화된 아실 아슬지질은 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이다. 적절하게는 방출-저해 완충액은 시트르산 완충액 좀더 적절하게는 pH4.5인 시트르산 완충액이 된다.

다층라멜라 리포좀은 건조보호제로 구성된다. 적절하게는 건조보호제는 당 예로써, 말토즈, 덱스트로즈, 갈락토즈, 락토즈, 라피노즈 또는 트레할로즈이다. 적절하게는 당은 말토즈이다.

따라서, 본 발명에 따른 적절한 구체예에서 다층라멜라 리포좀은 프로스타글란딘 E1, DPPC 로 구성된 2개이상의 지질이중층 그리고 pH4.5인 시트르산 완충액으로 구성된 2개 이상의 수용성 격실로 구성된다. 적절한 다층라멜라 리포좀은 이의 수용성 격실내에 포획된 용질로 구성되고 다층라멜라 리포좀의 수용성 격실내에 용질 농도는 실제 균일하고 건조보호제로 구성될 수도 있다.

본 발명의 다층라멜라 리포좀은 추가의 생활성제로 구성되는데 예로써 아라키돈산 대사물질에 추가된 생활성제. 다층라멜라 리포좀은 또한 머리기 수정된 지질을 포함할 수 있다.

여기에서는 또한 본 발명의 다층라멜라 리포좀과 제약학적 수용가능한 담체로 구성된 제약학적 조성물을 제공한다. 또한 아라키돈산 대사물질과 2개 이상의 지질이중층으로 구성된 탈수된 다층라멜라 리포좀을 제공한다. 또한 수용액과 탈수된 리포좀으로 구성된 2성분 시스템을 구성하는데 이때 탈수된 다층라멜라 리포좀과 수용액은 탈수된 리포좀을 재수화 시키기 위해 복합될 수도 있다.

본 발명은 동물에 아라키돈산 대사물질을 투여하는 방법을 제공하는데 이는 대사물질, 지질로 구성된 2개이상의 지질이중층과 수용성 방출 저해성 완충액으로 구성된 2개이상의 격실로 이루어진 다층라멜라 리포좀을 동물에 투여하는 것이다.적절한 투여경로는 정맥 투여한다. 동물로는 사람이 적절하다. 적절하게는 아라키돈산 대사물질은 프로스타글란딘 E1 이다. 적절하게는 지질은 포화된 아실 사슬지질이다. 적절하게는 완충액은 pH4.5 인 시트르산 완충액이다. 리포좀은 적절하게는 수용성 격실내에 포획된 용질로 구성되는데 각 격실에 용질농도는 실제 동일하다.

동물은 세포활성, 흡착, 염증 그리고/또는 독성에 의한 질환으로 고통을 받고 이들중 하나이상의 현상이 동물에서 일어나는데 본 발명의 리포좀성 조성물의 치료대상이 된다. 본 발명의 방법은 아라키돈산 대사물질의 항-질환 효과량으로 구성된 리포좀을 동물에 투여하는 것으로 구성된다.

이와 같은 질병에는 재환류 손상, 심근경색, 혈관-폐쇄질환, 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 맥관염, 외상후 쇼크, 화상, 혈관-폐쇄질환, 관절염 질환 예로써 통풍, 류마티스 관절염 또는 필라리 아트리스 그리고 자가면역질환 예로써 전신 흥반성 낭창, 청소년 당뇨, 다발성 경화증 또는 하시모토 갑상선염을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 특별히 적절하게는 ARDS 와 SIRS 이다.

일반적으로, 대사물질의 항-질환 효과량은 동물체중 ㎏당 대사물질 10^-12g 이고 일반적으로 ㎏당 10^-12g 내지 10^-3g이 된다. 바람직하게는 대사물질의 효과량은 체중당(㎏) 10^-8g 내지 10^-4g 이 된다. 더욱 바람직하게는 아라키돈산 대사물질의 효과량은 체중당 10^-6g이 된다.

본 발명의 방법은 동물에 추가의 생활성제 예로써 항균제 또는 항 염증제를 투여하는 것으로 구성되는데 이 추가의 물질은 본 기술분야에 숙지된 자에게 잘 공지된 수단, 방법에 의해 선택될 수 있다. 추가의 생활성제는 추가의 아라키돈산 대사물질이 될 수도 있다.

본 발명의 상술

본 발명은 아라키돈산 대사물질, 지질로 이루어진 2개이상의 지질이중층 그리고 방출-저해성 수용성 완충액으로 구성된 2개이상의 격실로 구성된 다층라멜라 리포좀을 제공한다.

리포좀은 양쪽성 지질분자의 하나이상의 지질이중층으로 구성된 자체-결합구조로 각 이중층에는 내부격실이 있다. 지질이중층을 이루는 양쪽성 지질분자는 하나 또는 2개 비극성(소수성) 아실사슬에 공유결합된 극성(친수성) 머리기 부분으로 구성된다. 소수성 아실사슬과 수용성 매체사이에 에너지상으로 우호적이지 못한 접촉은 지질분자의 재배열을 유도하게 되어 극성 머리기는 수용성 매체쪽으로 향하고 아실사슬은 수용성 매체와의 접촉에서 효과적으로 차단되어 에너지상으로 안정한 구조가 된다. 단층 라멜라 리포좀은 단일 지질 이중층이다.

다층라멜라 리포좀은 2개이상의 지질이중층을 가진다. 다층지질이중층은 리포좀으로부터 외부환경으로 아라키돈산 대사물질이 누수되기 위해서는 통과해야할 다수의 장벽을 제공한다. 또한 다수의 지질이중층은 단일지질이중층보다 더 오랜 시간동안 리포좀의 내부 pH 를 유지시킬 수 있고 내부 pH 는 리포좀과 아라키돈산 대사물질의 연합하는 시간의 길이를 결정하는 인자가 될 수 있다.

다층라멜라 리포좀은 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다 (Cullis et al., in: Liposomes, From Biophysics to Therapeutics (M.J. Ostro, ed.), Marcel Dekker, pp. 39-72(1987)). Bangham's procedure(J. Mol. Biol. 13:238(1965)) produces "ordinary" multilamellar vesicles(MLVs). 이 과정에는 하나이상의 유기용매에 하나이상의 양쪽성 지질을 용해시키는 것과 관련된다. 지질은 그다음 건조시키고, 건조된 지질은 MLVs 를 형성시키기 위해 수용액으로 재수화시킨다. 이들 "보통"의 MLVs 는 일반적으로 이들의 수용성 격실내에 균일하지 못한 용질의 분포를 갖는다. Lenk et al.(U.S. Patent Nos. 4,522,803, 5,030,453 and 5,169,637), Fountain et al.(U.S. Patent No. 4,588,578) and Cullis et al.(U.S. Patent No. 4,975,282)에서는 이들의 수용성 격실에 포획된 용질을 갖는 다층라멜라 리포좀을 생산하는 방법에 대해 상술하는데 각 격실에 용질의 분포는 균일하다. 실제 균일한 라멜라간 용질분포의 의미는 "보통" MLVs 보다 이들 다층라멜라 리포좀에서 삼투압이 적은 것을 의미한다. 본 발명의 다층라멜라 리포좀은 라멜라간 용질분포가 균일하다.

본 발명의 다층라멜라 리포좀은 일반적으로 직경이 5미크론 이하이고 적절하게는 1미크론 이하이다. 가장 적절하게는 리포좀은 직경이 500nm 내지 1미크론이 된다. 리포좀은 본 기술에 숙지된 자에 공지인 다수의 방법에 의해 크기를 줄일 수 있는데 예로써 일정크기의 구멍을 가지는 필터를 통하여 2회이상 압력하에 밀어내는 것이다(Cullis et al., U.S. Patent No. 5,008,050; and Loughrey et al.(U.S. Patent No. 5,059,421). 리포좀 크기는 다수의 방법에 의해 알 수 있는데 예로써리포좀의 냉동-분절된 전가 현미경 검사와 콰시-전자 광 분산등이 된다.

리포좀은 수용성 물질의 경우에는 리포좀이 형성된 매체에 분자를 용해시킴으로써 생활성제를 부하시킬 수 있는데 또는 리포좀이 만들어진 용액에 지질-용해성 물질의 첨가에 의해 이루어질 수 있다. 이온화 가능한 생활성제는 리포좀막을 통한 전기화학적 전위차를 만들어 리포좀의 외부매체에 물질을 첨가하여 리포좀내에 넣을 수 있다.

프로스타글란딘은 5개 탄소고리와 7개, 8개 탄소사슬을 포함하는 20개 탄소지방산기이다. 프로스타글란딘은 적어도 3개 이중결합을 가지는 다른 20개 탄소 지방산에서 일반적으로 만들어지는데 예로써 필수지방산(예로 8,11,14-에이코사테트라논산 또는 5,8,11,14,17-에이코사펜타논산; Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, supra). 아라키돈산은 사람에서 이들 20개 탄소 프로스타글란딘 전구체중 가장 풍부한 것이다.

프로스타논산과 같은 중간생성물은 이들 전구물질이 프로스타글란딘으로 전이하는 동안에 일반적으로 형성된다. 루코트리엔, 트롬복산, 리폭신과 프로스타사이클린과 같은 화합물은 프로스타글란딘과 기능적으로 연관되는데 20개 탄소 필수지방산 프로스타글란딘에서 유도될 수 있고 이들은 에코사노이드가 될 수도 있다. 프로스타글란딘, 프로스타글란딘 전구물질, 프로스타글란딘 합성동안에 사용된 중간생성물, 프로스타글란딘 관련 화학물과 에이코사노이드가 "아라키돈산 대사물질"이다.

프로스타글란딘이 적절한 아라키돈산 대사물질이다. 다양한 프로스타글란딘은 5개 탄소고리에 치환체의 배열에 따라 몇가지 주요기(A-I)로 분류되는데 이들 집단은 다시 프로스타글란딘에서 이중결합의 수와 위치에 따라 세분될 수도 있다. 프로스타글란딘 적절하게는 E 또는 I 시리즈 프로스타글란딘이고 가장 적절하게는 프로스타글란딘 E1 이다.

리포좀과 아라키돈산 대사물질의 "연합"은 일반적으로 리포좀 수용성 격실내에 대사물질이 포획되거나 또는 리포좀 이중층중 내측 또는 외층 단층과 연합하는데 이는 대사물질과 단층 성분 양쪽성 지질의 머리기 사이에 정전기적 상호작용에 의한 것이다.

본 발명의 방법에 사용된 단층라멜라 리포좀은 대사물질, 지질 그리고 방출 저해성 수용성 완충액으로 구성된다. 지질은 적절하게는 대사물질-지질 상호관계를 강화시키고 따라서 리포좀에서부터 대사물질의 방출을 저해시킨다. 이와 같은 지질이 "방출-저해지질"이다. 프로스타글란딘-지질 상호작용을 강화시키는 경향이 있는 지질의 인자는 다른 작은분자에 침투성이 적은 지질 이중층을 만드는 경향이 있는 인자 예로써 반데르 발스, 쌍극자-쌍극자 그리고 아실사슬사이의 다른 상호작용 즉 아실사슬이 이중층에 좀더 근접하게 하는 등의 증가시키는 인자등이 포함되나 이에 한정시키지는 않는다. 예로써 이중층의 아실사슬에서 이중결합의 수는 이중층에서 서로에 대해 사슬배열에 영향을 줄 수도 있다. 이중결합의 수가 적을수록 아실사슬이 좀더 근접하게 포개어질 수 있어 층에 프로스타글란딘 전이에 대한 장벽이 될 수 있다. 따라서, 적절한 지질은 포화된 아실사슬이다. 포화된 아실사슬과 적절한 지질은 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이다. 그러나, 다른 포화된 사슬지질이 이용될 수도 있다.

리포좀에서 수용성 완충액은 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질의 방출을 저해하거나 또는 막을 수 있다. 이와같은 수용성 완충액이 "방출-저해성 수용성 완충액"이다. 적절한 방출-저해 완충액의 특징은 대사물질과 정전기적 척력을 만들거나 또는 대사물질-지질 상호작용을 강화시키는 것을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한 더큰 완충성 능력의 완충액과 따라서 소요의 pH를 유지하는데 능력이 큰것이 방출-저해 완충액이 된다. 적절한 방출-저해성 완충액은 시트로산 완충액이고 특히 pH4.5인 시트르산이 된다.

본발명에 따라 사용된 다층라멜라 리포좀에는 리포좀에서의 지질의 재배열을 방해하지 않는 사카라이드, 요소, 덱스트란, 알부민과 폴리비닐알코올과 같은 일반적으로 친수성 화합물인 건조보호제로 구성될 수 있고, 리포좀이 탈수되어 재구성 될때 리포좀내에 포획된 고유의 내용물은 그 내부에 유지된다. 건조보호제는 일반적으로 강력한 수소결합 수용체인데 일반적으로 이중층 구조의 분자간 공간을 유지시키는 화학적 공간구조 특징을 보유한다. 만노스, 갈락토즈, 트레할로즈 라파노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토즈 또는 덱스트로즈와 같은 사카라이드는 적절한 건조 보호제이다. 말토즈가 특별히 적합하다.

사카라이드는 리포좀을 준비할때 사용되는 수용상의 중량에 대해 약 5 내지 10wt% 적절하게는 10wt% 농도에서 건조보호제로 사용된다. 만니틀이 임의의 사카라이드와 결합되어 사용될 수도 있으나 단독으로 사용되었을때는 만니틀은 리포좀크기를 유지시키는데 실패함을 알 수 있었다. 만니틀은 0~2%농도에서 사카라이드와연합하여 사용될 수 있는데 약 1%농도가 적합하다. 사카라이드의 총농도는 약 5%내지 20% 적절하게는 10%내지 12% 가장 적합하게는 약 10% 범위에서 사용된다. 10% 덱스트로즈에 0.01%EDTA와 에탄올 ml당 5mg BHT에서 조성물에 BHT 또는 EDTA와 같은 추가의 보호제가 포함될 수도 있다.

본 발명의 다층라멜라 리포좀은 PGE, 방출-저해 지질로 구성된 2개 또는 그이상의 지질이중층, pH가 4.5인 스트르산 완충액으로 구성된 2개 또는 그이사의 수용성 격질로 구성된다. 특히, 적절한 다층 라멜라리포좀은 말토즈와같은 건조 보호제로 구성된다.

본 발명의 다층라멜라 리포좀은 동물에 추가의 생활성제를 투여하는 것으로 구성되는데 예로써 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질에 생활성제를 추가하는 것이다. 여기에서 사용되는 "생활성제"는 동물에 투여될 물질의 조성물 또는 화합물을 의미한다. 여기에는 동물에서 생물학적 활성을 가지는 물질과 진단의형 또는 상형성에 필요한 물질을 포함한다. 생활성제에는 항-바이러스성, 항-박테리아성, 항-곰팡이성, 항-기생충성 화합물, 항-대사물성, 항-글루코닌성, 항-염증성 또는 항신조직 형성 화합물, 스테롤, 탄수화물, 아미노산, 펩티드, 단백질 이뮤노글로블린, 면역조절제, 염료, 독소, 효소, 호르몬, 신경전달물질, 당단백질, 방사능라벨, 방사불투성 화합물, 형광성 화합물, 세포수용체 단백질, 세포수용체 리간드, 산동제 화합물, 기관지확대제, 국소마취제, 성장촉진제, 재생물질 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 추가의 활성물질은 본 발명의 기술에 숙지된 자에게 공지된 동물에 영향을 주는 다른 질환의 치료에 필요한 기준에 따라 특정지시에 의해 선택될 수 있다. 추가의 생활성제는 추가의 아라키돈산 대사물질이 될 수도 있다.

본 발명의 다층라멜라 리포좀은 머리기-수정된 지질로 구성된다. 리포좀은 고정된 그리고 순환하는 대식세포로 구성된 망상내피세포 시스템(RES)에 의해 동물의 체내로부터 제거될 수 있다. RES 제거를 피하면 리포좀은 순환계에 더 오래 머무를 수 있고 이는 소요의 혈청수준을 이루는데 약물의 투여량이 적게 된다는 것을 의미한다. 강화된 순환시간은 비-RES 함유조직에 리포좀을 표적화시키는 것도 허용한다. 리포좀의 표면은 동물에 투여될때 혈청 단백질로 피복된다. RES 에 의한 제거율은 이와 같은 단백질 피복속도와 수준에 관계하여 제거는 리포좀의 외표면의 수정에 의해 저해되고 혈청단백질의 결합도 저지된다. 이는 표면의 음전하를 최소화하거나 차단하는데 음전하는 단백질 결합을 촉진시키는데 또는 혈청단백질의 결합을 공간적 방해에 의해 일어날 수도 있다.

효과적인 표면수정, 즉 리포좀의 외표면에 변하는 RES 에 의한 포획을 저해시키게 되는데 이는 리포좀의 이중층내로 머리기 수정된 지질의 결합에 의해 이루어진다. 여기에서 사용되는 "머리기-수정된 지질"는 양쪽성 지질로써 이의 머리기가 화학적 부분 예로써 폴리에틸렌 글리콜, 폴리알킬에테르, 강글리오사이드, 유기 디카르복실산 예로써 글루타르산 등의 부착에 의해 유도되는데 이는 리포좀에 혈청단백질의 결합을 저지하고, 동물의 순환계에서 소포체의 약리학적 특징을 변화시킨다(Blume et al., Biochim. Biophys. Acta. 1149:180(1993); Gabizon et al., Pharm. Res. 10(5):703 (1993); Park et al. Biochim, B Acta. 1108:257); Woodle et al., S. Patent No. 5,6; Allen et al., U. Patent Nos. 4,8 and 4,920,016).

본 발명의 리포좀은 또한 머리기-수정된 지질로 구성되는데 리포좀의 이중층에서 이의 농도는 본 기술에 숙지된 자에 공지된 인자들에 따라 달라질 수 있다. 여기에는 리포좀 형과 크기, 리포좀 조성물의 요법적 용도 등이다. 일반적으로 머리기 수정된 지질의 농도는 적어도 5몰% 적절하게는 10몰% 이다.

또한, 본 발명에서는 아라키돈산 대사물질과 지질로 구성된 2개이상의 지질 이중층으로 구성된 탈수된 다층라멜라 리포좀을 제공한다. 리포좀의 탈수는 리포좀을 상당기간 저장할 수 있게 하는데 이들 리포좀은 개체에 투여될 필요가 있을때 재구성될 수도 있다. 리포좀은 표준냉동-건조장비를 이용하여 탈수화될 수 있다. 냉동건조는 적절하게는 Schneider et al(U.S. Patent No. 4,229,360)와 Janoff et al., (U.S. Patent no. 4,880,635)의 과정에 따라 리포좀 준비물내로 당과 같은 일반적으로 친수성 화합물인 하나이상의 건조보호제를 결합시켜 실행할 수 있다. 보호당 예로써 말토즈, 슈크로즈, 덱스트로즈, 라피노즈, 트레할로즈, 락토즈 또는 갈락토즈 적절하게는 말토즈는 탈수가 냉동없이 실행되어 탈수-재수화 과정을 통하여 리포좀 이중층의 일체 통합성을 유지하기 위해 리포좀에 충분한 물이 남아 있는 경우에 생략될 수도 있다. 탈수화된 다층라멜라 리포좀은 건조보호제로 구성될 수 도 있다.

본 발명은 아라키돈산과 지질로 구성된 2개이상의 지질이중층으로 구성된 탈수된 다층라멜라 리포좀과 수용액으로 구성된 2-성분 시스템을 제공한다. 수용액과 탈수된 다층라멜라 리포좀은 탈수된 리포좀을 재구성하기 위해 복합된다. 수용액은 수용성 완충액과 같은 제약학적 수용가능한 담체를 포함한 다수의 용액이 될 수도있다. 성분은 바이알 또는 다른 용기에 제공되고 이들은 저장과 성분의 복합에 편의적인 것이다.

여기에서 사용되는 "제약학적 수용가능한 담체"는 동물 특히 사람에게 생활성제의 투여와 연관하여 일반적으로 사용하는 표준담체, 희석제, 부형제 등을 말한다. 이와 같은 담체는 본 기술분야에 공지의 것이고 통상의 기술을 잘 숙지한 자에게 공지된 투여경로와 사용된 특정약물과 같은 다수의 인자에 의해 일반적으로 선택될 수 있는데 실험없이 결정할 수도 있다. 적절한 담체에는 생리학적 용액 수용성 덱스트로즈 용액 예로 D5W 등을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 제약학적 조성물은 방부제, 항-산화제와 같은 부형제가 추가로 포함될 수 있고 이는 본 기술에 숙지된 자에게 공지이다.

본 발명은 동물에 아라키돈산 대사물질을 동물 특히 사람에 투여하는 방법을 제공한다. 방법은 대사물질로 구성된 다층라멜라 리포좀과 제약학적 담체로 구성된 조성물을 투여하는 것이다. 대사물질은 적절하게는 PGE¹이다. 리포좀은 지질로 구성된 적절하게는 포화된 아실사슬 지질로 구성된 2개이상의 이중층으로 구성되고 2개이상의 격실에는 수용성 방출-저해 완충액으로 구성되는데 적절하게는 pH4.5 인 시트르산 완충액이다. 적합하게는 리포좀은 라멜라간 용질분포가 균일하다. 리포좀-포함 조성물은 정맥내 투여될 수 있다.

본 발명은 세포활성과 흡착, 염증 또는 독혈증을 특징으로 하는 질환이 있는 동물의 치료에 사용될 수 있다. 즉, 병에 걸린 동물에 본 발명의 조성물을 투여함으로써 이들 현상의 하나 이상이 제거되거나, 경감되거나, 감쇠되거나 저해되거나 예방될 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 질병은 재환류 손상, 전신 염증 반응증후군(SIRS), 성인 호흡곤란 증후군(ARDS), 심근경색, 맥관염, 화상, 외상후 쇼크, 맥관-차단질환, 류마티스 관절염, 통풍과 팔라리 관절염과 같은 관절염 그리고 전신 흥반성 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경화증과 하시모토 갑상선염을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

특정 질환은 세포 예로써 혈액에서 혈소판과 호중구의 비정상적 활성화와 이들의 결과적인 흡착 또는 주변 맥관 내피에 활성화된 세포의 흡착을 특징으로 한다. 이와 같은 활성화의 흡착 질환은 의료질병의 다양한 범주에서 문제가 된다. 예로써 내피세포, 맥관, 프루랄, 심막 또는 복막 내피세포등 인터루킨-1(IL-1)와 같은 사이토킨, 종양 괴사인자-알파(TNF-α) 또는 박테리아성 내독소에 의해 활성화될 수 있다. 유사방식으로 혈액세포, 특히 호중구와 혈소판은 GM-CSF, 박테리아성 내독소, 박테리아성 화학물질, TNF-α와 상보적인 C5a 성분과 같은 물질에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 세포는 서로 부착될 수 있는 이들의 표면에 흡착부위를 가진다. 활성화된 그리고 부착된 세포는 덩어리를 형성하고 폐와 심장과 같은데서 볼 수 있는 작은 혈관에 엉겨붙어 주변조직으로 혈액의 흐름을 감소시킨다. 활성화된 세포는 활성화된 맥관 내피세포에 흡착할 수 있고 이와 같은 흡착은 맥관 내피의 연속적인 알갱이 분해를 유도하거나 또는 세포손상을 시키는 중간물질 예로 슈퍼옥사이드 음이온(O2^-)와 단백질 분해성 효소등의 방출을 유도한다.

재환류 질환은 폐쇄된 혈관벽의 재환류에 관계하거나 또는 혈액이 일시적으로 중단되는 외과술이다(Seewaldt-Becker et al., "Effect of Anti-Adhesive Antibodies on Reperfusion Injury," in: Leukocyte Adhesion Molecules, Springer-Verlag, New York(1990) pp. 138-148; and "Adhesion Molecules, Springer-Verlag, New York.(1990), pp. 85-156). 혈관벽에 차단이 있을 경우에 주변 내피세포와 하류 허혈 조직이 손상받을 수 있다. 차단이 제거되었을때 내피세포가 추가로 손상될 수도 있다. 이와 같은 손상은 혈액흐름이 손상된 지역에서 복구후에 호중구와 혈소판의 활성화를 유도한다.

환자가 쇼크, 화상, 폐혈증, 흡인호흡과 식용이상항진과 같은 ARDS 로 유도되는 경우에 있게될때 신체에서 폐보다는 다른 많은 기관이 영향을 받게 된다. 이와 같은 상태의 원인과 임상적 과정은 매우 다양하다. 가령, 심각한 감염성이 있는 환자에서는 엔도특신이 세균 세포벽으로부터 방출되고, 염증성 과정이 시작되어 폐혈증 쇼크가 된다.

맥관형성술은 기구를 폐쇄된 동맥내에 삽입시키고 팽창시켜 차단된 혈관을 개방시키는 기술에 관계한다. 이 기술이 관상동맥 질병의 조절에 매우 일상적이기는 하지만 이과정 이후에 6개월간 치료받은 환자의 33% 이상이 이미 개방된 혈관의 재폐쇄를 경험하게 된다. 이 상태는 기구과정으로 인한 맥관 내피세포에서의 손상으로 개시되는 것으로 보인다. 노출된 세포의 매트릭스는 활성화된 혈소판의 몇개층에 신속히 결합하게 된다. 일단 혈소판이 결합하면, 다양한 성장인자를 방출하게 되고 이로써 혈관이 다시 차단될 위치의 혈관아래에 있는 연근세포의 증상을 초래하게 된다. 혈소판이 세포의 매질에 결합되는 것을 방지함으로써, 재폐쇄를 유도하는 일련의 과정을 차단할 수 있다. 따라서, 맥관형성과정에 흡착을 막는 약물의 급속한 투여는 재차단을 방지하게 된다.

최근에 De Servi et al., European Heart Journal, "Prostaglandin E administration in unstable angina patients undergoing PTCA; preliminary results", August 1990. 는 맥관 형성술전에 관상동맥내로 PGE₁을 투여한 불안정한 안기나[인후. 편도선의 염증] 환자의 임상적 시도 결과에 대해 발표하였다. 약물은 24시간동안 주입되었다. 이 연구결과에서 PGE₁-처리집단에서 맥관형성술이후 6개월간 재협착증 발생율은 처리안된 집단보다 약 50% 가 감소되었다. 단 PGE₁처리는 24시간만 지속되었다.

급성 심근경색(좀더 일상적인 말로는 심장마비)은 응혈에 의해 심장근육에 혈액공급이 차단됨을 말한다. 혈액이 장시간 심장에 도달하지 못하는 경우 환자는 죽게 된다. 관상동맥 차단이 일어날때 환자는 조직 플라시미노겐 활성인자(tPA) 또는 스트렙토키나제와 같은 섬유분해제로 처리하여 응혈을 녹이고 차단은 자체 해결될 수 있다. 이 두경우에, 혈류는 심장의 허혈(산소-결핍된) 부위에 재공급된다. 심장으로의 혈액의 재흐름이 재환류라 한다. 재환류는 환자의 삶을 구하는데 필수적이나 심장근육에 추가손상 즉 재환류 손상이 있을 수 있다.

재환류 손상은 염증성 카스케이드의 최종결과로 공지되어 있다.

응혈제거후에 재환류 손상에 추가하여 심근경색으로 고통받는 환자는 다른 2차 문제로 고통을 받을 수 있다. 예로써, 정상적인 혈류를 심장으로 복원한 후에 호중구와 혈소판이 모두 활성화된다. 활성화된 혈소판은 서로 흡착되고 관상동맥을 재차단하게 되어 심장으로의 혈류속도가 시간이 지남에 따라 감소되는 상황이 된다. 일부 경우에 완전한 재차단이 일어날 수 있다.

Sharma et al., The American Journal of Cardiology, "Intracoronary Prostagiandin E Plus Streptokinase in Acute Myocardial Infarction", page 1161, Dec. 1986, vol. 58 는 급성 심근경색의 임상적 세팅에서 관성동맥내 스트렙토키나제와 함께 서서히 관상동맥 주입에 의해 자유 PGE1 의 투여는 관상동맥내 스트렙토키나제 단독만의 콘트롤 집단과 비교하였을때 양성의 임상적 결과를 제공한다. 이 결과에서 재환류까지 시간이 감소되었고, 요구되는 스트렙토키나제의 약량이 감소되고, 10일후에 혈관환자의 %가 증가된 것으로 나타났다. 이 연구에서의 단점은 서서히 관상동맥으로 약물주입이 매우 성가시고 특별한 기술도구와 숙달된 조수가 요구된다. 이 방식에는 혈압이 상당히 떨어지는 것을 볼 수 있기 때문에 PGE¹의 신중한 적정량이 요구된다.

염증반응은 국소반응이고 그 결과로 형태학적 변화, 파고 또는 손상물질의 제거와 재생기작의 활성화가 된다. 염증은 동물이 자체로 치료하는 과정의 일부가 된다. 그러나, 염증은 비정상적인 생리학적 자극에 반응하여 발생될 수도 있고 체내에 문제를 일으킬 수도 있다. 예로써 관절은 통풍, 필라리 관절염, 류마티스 관절염과 림 질환과 같은 관절 질환에 의해 염증을 일으킬 수 있다(Stedman'sMedical Dictionary(lllustrated), supra at pages 123-124). 이 상태는 주변에서 세포가 염증지역으로 들어가는 세포의 일혈을 특징으로 한다.

독혈증(중독증)은 숙주동물에 독소와 다른 독성물질을 포함하는 미생물과 같은 감염성 물질의 감염과정 동안에 관찰될 수 있는 임상적인 상황이다. 가령, 대장균과 같은 특정 그람-음성 박테리아에 의한 감염동안에 리포폴리사카라이드(LPS)가 세포벽으로부터 방출되어 세포벽이 파괴된다. 그 다음 LPS 는 숙주동물에 세포의 죽음을 유도한다. 동물에서 중독증 상태가 발생되는데 LPS과 같은 독소는 폐혈증 또는 순환계에서 미생물의 조작에 의한 전신계 질환에 이용될 수 있다(Stedman's Medical Dictionary (lllustrated), supra at pages 1274-1275 and 1464). 독혈증은 외상자극 예로 물리적 또는 화학적 외상에 동물이 노출된 경우에도 일어날 수 있다.

그러나 폐혈증/외상증상은 감염에 한정되지는 않고 내독소가 연관되지 않을 수도 있다. 그럼에도 불구하고 TNF, IL-1, 상보요소, 루코트리엔과 같은 인자의 방출이 촉진될 수 있다.

전신 흥반성 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경색증과 하시모토 갑상선염과 같은 "자가-면역 질환"은 고유조직을 동물의 면역시스템이 공격함으로써 일어나는 것을 특징으로 한다.

이들 질병의 치료는 아라키돈산 대사물질의 항-질병 효과량으로 구성된 본 발명의 다층라멜라 리포좀의 효과량을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 아라키돈산 대사물질의 "항-질환 효과량은 세포활성과 흡착, 염증, 독혈청 또는 치료될 질환과 연관된 증상을 제거하거나, 저지하거나 또는 막는 효과량이 된다. 일반적으로 대사물질의 항-질환 효과량은 동출체중 kg당 대사물질 10^-12kg 이고 일반적으로 kg당 10^-12g 내지 10^-3g 이 된다. 바람직하게는 대사물질의 효과량은 체중당(kg) 10^-8g 내지 10^-4g 이 된다. 더욱 바람직하게는 아라키돈산 대사물질의 효과량은 체중당 10^-6g 이 된다.

활성화되고 연속하여 세포간 흡착이 되는 세포는 아라키돈산 대사물질에 대한 표면수용체를 가진다. 이론에 제한됨이 없이 이들 수용체에 아라키돈산 대사물질의 결합은 세포간 흡착의 상승된 수준에 책임이 있는 세포표면 수용체를 비활성화 함으로써 활성과 흡착관련 손상을 감소시킬 수 있다. 예로써 PGE₁은 호중구와 혈소판응집 그리고 활성화된 맥관 내피세포에 이들의 결합에 대한 강력한 저해물질로 보인다. 세포-세포결합없이 O2^-와 같은 공인자와 다양한 분해성 효소는 방출되지 않고 조직손상도 감소된다. 비활성화는 대사물질/수용체 상호작용에 의해 개시되는 세포내 cAMP 수준에 단백질 키나제 A-중개된 증가에 의해 유도될 수도 있다.

PGE1 와 같은 아라키돈산 대사물질 PGE1 과 같은 아라키돈산 대사물질은 염증을 저해하고, 일단 개시된 것도 저해시킬 수 있는 능력을 가진 것으로 보인다. 염증 중개자인 호중구의 세포의 방출은 사이클릭 이데노신 모노포스페이트(cAMP)와 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)의 세포내 저장의 상승 또는 제거에 의해 조절될 수 있는 것으로 보인다. cAMP 의 상승은 염증 중개물질의 방출을 감소시키는 반면 cGMP의 상승의 이들 중개 물질의 방출을 강화시킨다. cAMP 는 이들의 세포내 수준이 일단 증가하면 초기에 이들을 개시하는 인자에 무관하게 염증을 종료시키기 때문에 때때로 "초우주적인 종료 스위치"로 불린다.

일반적으로, 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물은 치료요법적 투여에 상당한 장점을 제공하는데 예로써, 자유형의 대사물질 투여와 비교하면 소요의 효과를 얻는데 낮은 약량이 요구되어 부작용을 감소시키게 된다. 자유 예로써 비-리포좀성 PGE1 과 PGE2는 관상동맥의 주변에 차단자 종이제거하는 기구를 배치시킴으로써 심근경색의 시뮬레이션후에 재환류되는 개에서 경색크기를 감소시키는데 효과가 부족한 것으로 보인다(Jugdutt et al., "Dissimilacts of Prostacycn, Prostaglandin E Prostaglandin Myocardial Infarct ze after Coronarusion in Conscious," Circulation CH, 49(3):685-700 981). 보고된 테스트에서 프로스타글란딘은 6시간이상 연속적으로 동맥주입을 통하여 투여되고 따라서 개에서 상대적으로 많은 양의 약량이 투여된다.

폐에서 이들이 신속하게 비활성화 되기때문에 자유프로스타글란딘의 반감기는 생체내에서 짧아서 연속주입이 요구되는 것으로 보인다. 또한, 생체내에서 PGE¹의 다량 분포는 저혈압, 빈박증과 설사와 같은 전신에 효과를 유도한다. 이와 같은 부작용은 일반적으로 투여되는 자유형 대사물질의 양을 제한하게 된다.

본 발명의 리포좀성 조성물의 이용의 일반적으로 부작용은 감소시키면서 투여된 아라키돈산 대사물질의 순환 반감기는 증가시킨다.

또한 리포좀은 이들의 작용이 필요한 부위로 프로스타글란딘의 수송을 위한 유익한 담체가 된다. 특정이론 또는 기작에 한정됨이 없이, 리포좀은 활성화된 세포에 끌리거나 활성화된 표면에 흡착될 수 있다. 그다음 프로스타글란딘은 항-세포 흡착 작용에 이의 수송을 위해 손상부위에서 이용될 수 있다. 활성화된 세포에 흡착되도록 리포좀의 끌림에 대한 한가지 이론은 리포좀이 혈액에서 피브로넥틴과 비트로넥틴에 의해 옵소[혈액속에 있으면서 백혈구의 식균작용을 돕는 일]화 된다는 것이다. 옵소닌 작용은 세균들이 대식세포에 의해 효과적으로 신속하게 섭최되도록 하기 위해 박테리아를 변형시키는 과정이다. 따라서, 옵소닌화된 리포좀은 피브로넥틴과 비트로넥틴에 대한 수용체를 발현하기 위해 활성화된 호중구에 즉시 끌려갈 수 있고 따라서 감염부위로 연합된 프로스타글란딘을 수송할 수 있다.

리포좀의 지질이중층을 가로질러 pH 농도차에 의해 대사물질이 리포좀에 연합된 리포좀성 아라키돈산 대사물질 조성물이 치료요법적으로 유용하다. pH 4.5 시트르산 완충액과 같은 산성 수용성 완충액을 내재하는 리포좀성 조성물이 막을 가로지르는 pH 농도차를 만드는데 적합하다. 이와 같은 농도차에 의한 리포좀과 연합된 아라키돈산 대사물질은 pH 농도차가 유지되는한 리포좀과 연합되어 남아있는 경향이 있다. 그러나 리포좀이 투여될때 동물체내에서 농도차가 붕괴되면 아라키돈산 대사물질이 점진적으로 리포좀과 분리되게 된다. 그다음, 대사물질은, 리포좀과 연합했을때보다는 호중구와 같은 세포에 있는 이에 상응하는 표면수용체와 상호작용이 더 잘되게 따라서 활성화되어 세포간 흡착이 이루어지게 된다.

아라키돈산 대사물질의 "항-질병 효과량"은 본 발명의 방법에 따라 치료되는질환과 연관하여 세포활성과 흡착, 염증, 독혈증 또는 다른 질병의 제거, 저해 또는 예방에 효과가 있는 양을 의미한다. 일반적으로 대사물질의 효과량은 동물 체중당(kg) 10^-12g 대사물질 바람직하게는 10^-12g 내지 10^-3/kg 이다. 좀더 바람직하게는 대사물질의 효과량은 10^-8g 내지 10^-4g/kg 이다. 가장 바람직하게는 효과량은 아라키돈산 대사물질이 동물체중 kg당 10^-6g 이 된다.

본 발명의 방법은 투여될 아라키돈산 대사물질에 추가하여 동물에 항균 또는 항-염증제와 같은 생활성제를 투여하는 것으로 구성한다. 추가의 생활성제는 추가의 아라키돈산 대사물질의 될 수도 있다.

본 발명은 다음의 실시예에서 추가로 상술한다. 그러나 본 기술분야에 숙지된 자는 다음의 청구범위에서 정의된 바와 같이 이들 실시예가 단순한 설명임을 인지할 것이다.

실시예

실시예 1

PGE1 을 포함하는 다층라멜라 리포좀(MLVs) 준비

EPC-포함하는 PGE1 MLVs의 준비

에그 포스파티딜콜린(EPC) 원액(20mg/ml 에탄올)을 다음과 같이 준비한다. 1g 건조 EPC 를 순수 알코올 50ml 에 넣고 가볍게 흔들면서 용해시키고 50ml 갈색병에 뚜껑을 덮어둔다. 생성용액은 20℃ 에 저장한다. PGE1 원액(1mg/ml 에탄올)은 다음과 같이 준비한다. 20mg 건조 PGE1 은 20ml 바이알에 옮기고 20ml 알코올을 첨가한다. PGB1은 가볍게 흔들면서 에탄올에 녹이고 생성용액은 -20℃에 저장한다.

EPC 원액(9.75ml)와 PGE¹원액(0.5ml)을 500ml 밑-둥근 플라스크에서 복합시키고 에탄올은 30℃에서 적어도 2시간동안 회전증발에 의해 제거한다. 건조된 EPC/PGE¹은 리포좀 현탁액을 형성하기 위해 pH 4.5 완충액(예로써 50mM 아세테이트, 150mM NaCl, pH-4.5(NaOH 로 조정): 유리 비드는 건조 EPC/PGE₁의 재현탁에 도움이 된다)에서 재현탁시킨다. 이 현탁액은 4℃에서 저장한다.

DPPC-포함하는 PGE₁MLVS의 준비

DPPC 원액은 메틸렌클로라이드에 용해된 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 1.035g 을 이용하여 전술한 것과 같이 준비할 수 있다. 건조된 DPPC/PGE1 혼합물의 재수화는 약 52℃에서 3-5분간 흔들면서 욕조에서 가열하면 된다.

표.1 PGE1 조성물

결합 그리고 또는 포획된 %

* 괄호안의 숫자는 pH 4.6 에서 포획된 또는 결합된 프로스타글란딘이 pH 7.1에서 남아있는 빈도를 나타낸다.

데이타(상기 표 1, 하기 표 2)에서는 리포좀을 만들기 위해 프로스타글란딘 함유 시트레이트 완충액 pH4.6 이 건조된 지질을 재수화하는데 사용되는 경우에 이용가능한 프로스타글란딘의 약 98%가 EPC 다층라멜라 소포와 연합한다는 것을 볼 수 있다. 이들 동일한 리포좀을 pH 7.1 완충액으로 옮기면 약 30분후에 이용 가능한 프로스타글란딘의 약 54-61% 만이 리포좀과 연합되어 남아 있게 된다. DPPC 가 다층라멜라 소포를 만드는데 이용될때 이용 가능한 프로스타글란딘의 약 53-60% 가 pH4.6 완충액으로 구성된 리포좀내에 포획된다. 이들 리포좀을 pH 7.1 완충액으로 옮기면 이용가능한 프로스타글란딘의 약 35-42% 가 30분뒤에 리포좀내에 남아 있게 된다.

표. 2 PGE1 조성물

결합 그리고 또는 포획된 %

* 괄호안의 숫자는 pH 4.6에서

포획된 또는 결합된 프로스타글란딘이 pH 7.1 에서 남아있는 빈도를 나타낸다.

실시예 2

쥐 공기주머니 연구

말초혈관계에서 염증부위로 백혈구 세포의 일출과 급성 염증에 대한 모델로 쥐 피하 공기주머니(Tate, et al., Laboratory Investigation 59:192(1988)가 fMLP 유도된 fMLP 염증을 조절하는데 조직적인 PGE 리포좀의 효과연구에 사용되었다.

숫컷 스프라우그-도우리 쥐, 126-150g 를 Charles River Laboratories 에서 얻었다. 수령시에 쥐는 2일간 동물능력에 대해 새로 길들여져 있었다. 실험동안에 쥐는 물과 음식을 공급받았다. 공기주머니 형성을 위해 쥐는 흡입을 통해 마취시키고, 등에 털을 깎고 에틸알코올로 닦아낸다. 대기중 공기 20cc 를 동물의 등으로 피하내 주사하여 공기주머니를 형성시키고 다시 우리로 되돌려 보낸다. 공기주머니는 일체성을 결정하기 위해 모니터되고 보증이 필요한 경우 추가의 공기를 주입시킨다. 공기주머니 형성후 6일째에 공기주머니에 염증은 주머니내에 2.15㎍ fMLP 의 직접 주사에 의해 유도된다. 자유 프로스타글란딘 E1 또는 PGE 리포좀 조성물은 꼬리정맥을 통하여 동시에 iv 로 주사하고 동물은 다시 우리로 되돌려보낸다. 시뮬레이션후 6시간째에 쥐는 CO²흡입에 의해 희생시키고 주사기를 통해 공기주머니로부터 모든 삼출액을 회수한다. 이실험 결과는 제 2-6 도에 나타내었다.

자극후 공기주머니 라이닝의 시각검사에서 콘트롤 동물과 비교 하였을때 fMLP 는 라이닝의 두께와 침투성 백혈구 세포에 영향을 주는 것으로 보이는데 콘트롤은 염단독으로 공기주머니에 주입된 것을 말한다. 자유 PGE₁으로의 처리는 맥관활성이 상당히 감소되고 주머니 라이닝으로 침투하는 백혈구수도 동시에 감소되었다. 라이닝에서 호중구 집단의 증거는 일시적인 것으로 백혈구 세포는 혈관계에서 공기주머니의 관강/삼출액으로의 일출의 과정에 있다. 백혈구 세포가 일시적으로 공기주머니 라이닝으로 통과함으로써 백혈구 세포침투의 감소에 리포좀성 프로스타글란딘 조성물의 연속적인 분석은 흡입된 삼출액에 있는 이들 세포를 제한한다.

실험은 공기주머니에서 세포유입을 조절하는데 PGE¹리포좀의 효과를 평가하기 위해 실시되었다. 이들 실험은 C-53(단층라멜라 리포좀성 PGE¹)와 MLV-PGE (다층라멜라 리포좀성 PGE¹)와 자유 PGE¹을 비교하였다. 자유 안정한 프로스타글란딘 아날로그 15-메틸-PGE¹은 자유 PGE¹의 생체이용성 <15분과 비교하였을때 더긴 생체 이용능력 ≥8시간 때문에 이들 실험에 포함된다.

제 2 도에서 볼 수 있는 것과 같이 C-53 와 MLV-PGE¹은 자유 PGE¹보다 더 효과적으로 세포의 공기주머니내로의 유입을 지지한다. MLV-PGE¹은 C-53 보다 더 저해성이 크다. C-53 와 MLV, 플라시보 리포좀은 PGE₁이 없을때 세포간 일출을 저지한다. 이때 플라시보 저지는 플라시보에 자유 PGE₁의 추가로 증가될 수 있다.

공기주머니 삼출액에서 백혈구 세포 일련의 분포를 결정하고 이는 제 3 도에서 볼 수 있다. 모든 백혈구 세포 부집단은 자유 PGE1 과 비교하였을때 PGE1 리포좀 성분물에 의해 더욱 적절하게 저해된다. fMLP 에 반응하여 공기주머니내로 일출하는 우세한 백혈구 소집단은 호중구이다. 이들 호중구 집단에서 최대의 저해를 볼수 있다. 공기주머니로 단세포의 유입은 리포좀성 PGE1 에 의해서는 완전히 제거되나 자유 PGE1 에 의해서는 아니다.

제 4 도에서는 자유 PGE1 와 리포좀성 PGE1 에 반응하여 백혈구 세포 일출의저해에 대한 약량반응을 나타낸 것이다. 보는 바와 같이, 공기주머니로 백혈구의 유입의 저해는 PGE1 리포좀에 의한 약량-의존성 저해가 된다. 최대저해는 10.0㎍/㎏ 이고 더 많은 농도에서도 추가의 효과는 없다. 백혈구 세포 소집단이 자유 PGE¹과 비교하였을때 PGE¹리포좀성 조성물에 의해 더욱 적절하게 저해된다. 최대 저해는 호중구 집단에서 볼 수 있고 공기주머니내로의 단세포 유입은 리포좀성 PGE¹에 의해서는 완전하게 제거되나 자유 PGE₁에 의해서는 아니다. 전술한 데이타에서는 PGE₁-MLVs 는 C-53 보다 공기주머니 일출에 약간 더큰 저해성 반응을 가진다. 이들 두 조성물에 반응을 분리하기 위해 6과 24 시간에서 공기주머니 백혈구 집단을 평가하였다. 이 데이타는 제 5 도에 나타낸 바와 같다.

이들 실험에서 백혈구 소집단의 분포는 제 3 도와 4 도에서의 것과 유사하다: a) 공기주머니 내로의 침윤하는 우세한 백혈구 세포 집단은 호중구로 구성되고; 그리고 b) 모든 백혈구 세포 소집단은 자유 PGE1 과 비교하였을때 PGE1 리포좀 조성물에 의해 더욱 적절히 저해된다. 단세포는 6시간에는 없으나 24시간에는 소수 있다(24시간 염콘트롤에서 7.8x10⁴과 비교하였을때 모든 처리집단에서 24x10⁴이 된다).

쥐 공기주머니로 백혈구 세포의 일출을 조절하는 또다른 PGE 리포좀의 효과를 측정하였다. 측정된 특정 조성, 이들의 특징을 표 3 에 나타내고 제 6 도에서는 이들 실험의 데이타를 제시한다.

표 3

또다른 PGE1 리포좀 조성물

지적한 데이타에서와 같이 모든 PGE₁리포좀 조성물은 공기주머니에로 백혈구 일출을 저지하는데 있어서 자유 PGE₁보다 더 효과가 있다. 이들 실험에서 백혈구 소집단분포는 제 4 도와 5 도에서와 유사하다. a) 공기주머니 내로의 침윤하는 우세한 백혈구 세포 집단은 호중구로 구성되고; 그리고 b) 모든 백혈구 세포 소집단은 자유 PGE₁과 비교하였을때 PGE₁리포좀 조성물에 의해 더욱 적절히 저해된다.단세포는 모든 리포좀성 PGE₁처리집단에 없었다.

실시예 3

어쥬번트 관절염

126-150g 이 나가는 숫컷 루이스쥐를 Charles River Laboratories 에서 얻었다. 수령시에 쥐는 2일간 새로운 환경에 적응시켰다. 실험을 통하여 쥐는 물과 음식을 제한시킨다. 만성적인 양측 관절염이 꼬리에 컴플리트 어쥬번트 주사를 i.d.에 함으로써 유도되었다. 관절염의 개시는 플루언츠 유도된 동물에 10 내지 14일 사이에 발생시킴으로써 중단시킨다. 처리안된 콘트롤 동물에 의해 나타나는 증상은 가장 활동적인 관절에서 촉각에 의해 나타날 수 있는데; 대칭적인 육종이 발관절, 발목, 무릎, 앞발의 유연성 관절에 관계하고 불쾌감과 체중감소는 통증과 운동성의 감소로 인한 음식 공급물에 접근이 감소하고 일차적인 질병에 기인한 것이다.

실험은 어쥬번트 관절염의 진행을 조절하는데 있어서 자유 PGE1 의 효과를 평가하기 위해 실시한다. 이들 실험에서의 변수는 휘기 무릎에서 측정된 관절크기, 체중변화, 일반적인 건강, 왕성함과 치사율의 기록등이다. 이 실험에서의 결과를 제 7-12도에 나타내었다.

제 7, 8, 9 도의 데이타에서 자유 PGE1 은 어쥬번트 관절염의 진행을 감쇠시키는데 암체중증가와 관절육종을 저해시키는 것을 유지함으로써 결정된다. 기록에서는 PGE₁-처리된 동물에서 일반적인 건강과 치사율이 유지됨을 나타낸다. 쥐는 어쥬번트 투여후 10일까지 치료될 수 있고 관절염 진행의 저지가 0일에 시작된 PGE₁처리를 받은 동물에서와 같이 뚜렷하지는 않으나 질병진행에서 여전히 보호를 받고 있다.

관절염을 감소시키는데 자유 PGE₁의 보호성 효과때문에 그다음에는 자유 PGE₁과 비교하였을때 리포좀성 PGE₁이 효과가 있는지에 의문을 가지게 되었다. 이 실험에는 기존실험에서와 같이 동일한 변수와 기록을 포함하고 C-53 PGE1 함유 리포좀과 자유 PGE1 을 비교한다. 이들 실험에서의 데이타는 제 10, 11, 12 도에 나타내는데 쥐 어쥬번트 유도된 관절염의 진행을 감소시키는 데에서 자유 PGE1 보다는 리포좀성이 더 효과가 큼을 나타낸다.

테스트된 최적의 조성물은 누출율이 적어서 PGE¹의 생체 이용능이 더긴 PGE¹-함유 MLVs 이다. MLVs 조성물은 질병 출현과 진행의 거의 완전한 저해에 영향을 준다.

실시예 4

쥐 내독혈증 모델

그람-음성 박테리아의 감염으로 열, 저혈압, 백혈구의 수변화와 설사와 같은 증상이 있다. 이와 같은 감염은 혈관내 응집을 분해시키고 비가역적 쇼크를 유발한다. 상당량의 문헌에서 내독성 쇼크의 과정의 중재에 백혈구의 세포연관으로 IL-1, IL-6 와 TNF α를 유도함을 나타내었다. 우리의 시험관 데이타에서 배양된 단세포로부터 이들 사이토킨의 저해를 나타내었기 때문에 LPS- 유도된 죽음의 감쇠에 PGE₁와 특정 조성물의 효과를 평가하기 위해 치사율을 이용하여 쥐 내독혈증의 모델을 개발하였다.

실험은 스프라그-도웨리 쥐에서 대장균 LPS(리포폴리사카라이드)에 대한 LD50 을 만들도록 고안되었다. 이들 실험으로부터의 데이타는 제 8 도에 나타내었고 이는 LD 50 이 50㎍/㎏ 임을 나타낸다. LPS 약량은 다른 말이 없는한 연속 실험에 사용되었다.

실험은 LPS-유도된 치사율을 조절하는데 있어서, 자유와 리포좀성 PGE¹에 효과를 평가하도록 고안되어 있다. 이들 실험에서의 결과를 제 14 도에 나타내고 자유 PGE¹은 LPS 유도된 치사율의 속도와 정도에 모두 증가시키는 것으로 된다. 대조적으로 C-53 은 LPS-유도된 질병에 대해 거의 완전한 보호에 영향을 준다. PGE¹함유 MLVs 는 또한 보호를 한다. LPS 를 수용하는 모든 동물에는 화농성 격막염, 심각한 설사와 기면증세는 나타나지 않았다. 이들 증세는 LPS 투여한 처음 2시간내에 명확해지고 실험동안에 지속한다. 동물의 사망은 가사와 쇼크를 나타낸다.

Claims

세포 활성, 염증 또는 독혈증을 특징으로 하는 질병을 가진 동물을 치료하기 위한 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체와 다층 라멜라 리포좀으로 구성되며 이때, 리포좀은 아라키돈산 대사물질, 지질로 구성된 2개이상의 지질 이중층, 방출-저해성 수용성 완충액으로 구성된 2개 이상의 수용성 격실로 구성되고, 이때 방출-저해성 수용성 완충액이란 프로스타글란딘과 전기적인 척력을 형성시켜, 프로스타글란딘-지질 상호작용을 증가시킴으로써, 리포좀으로부터 프로스타글란딘이 유출되지 않도록 리포좀 내에 원하는 pH 값을 유지시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 조성물은 정맥투여용인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 동물은 사람인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 질환은 재환류손상, 조직적 염증 반응 증후군, 심근경색, 성인호흡곤란증후군, 맥관염, 화상, 외상후 쇼크, 맥관-차단질환 또는 관절염과 자가면역질환으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 관절염은 류마티스 관절염, 통풍 또는 필라리 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 4 항에 있어서, 자가면역질환은 조직적 흥반성, 낭창, 청소년 당뇨병, 다발성 경화증, 또는 하시모토 갑상선염인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 질환은 조직적 염증 반응 증후군 또는 성인 호흡곤란 증후군인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 ㎏당 대사물질 10^-12g 이상인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 8 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 ㎏당 대사물질 10^-12g 내지 10^-3g 이상인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 ㎏당 대사물질 10^-8g 내지 10^-4g 이상인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 10 항에 있어서, 대사물질의 효과량은 동물체중 ㎏당 대사물질 10^-6g 이상인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 3 항에 있어서, 동물에 생활성제를 추가 포함하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 추가 포함되는 생활성제는 항균제, 항-염증제 또는 기관지 확장제인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.
제 13 항에 있어서, 추가 포함되는 생활성제가 아라키돈산 대사물질인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조 방법.