KR100342627B1 - HMG-CoA리덕타제억제제및그의중간체의제조를위한효소적히드록실화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 히드록실화 공정을 촉매화할 수 있는 미생물, 상기 미생물 기원의 효소, 상기 미생물 기원의 효소의 구조를 갖는 효소률 사용함으로써, HMG-CoA 리덕타제 억제제로서, 및(또는) HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조시의 중간체로서 유용한 화합물의 제조를 위한 효소적 히드록시화 방법에 관한 것이다.

Description

HMG-CoA 리덕타제 억제제 및 그의 중간체의 제조를 위한 효소적 히드록실화방법
본 발명은 HMG-CoA 리덕타제 억제제 및(또는) HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조시 중간체로서 유용한 화합물의 제조를 위한 효소적 히드록실화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기 화학식 (Ⅱ)의 화합물, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 염을, 화학식 (Ⅱ)의 화합물의 히드록실화를 촉매하여 하기 화학식(I)의 화합물을 생성시킬 수 있는 미생물(여기서, 상기 미생물은 노카르디아, 아미콜라타, 사카로폴리스포라, 스트렙토미세스, 아미콜라톱시스, 사카로트릭스 또는 길베르텔라속 중에서 선택되며, 단 화학식 (Ⅱ)의 화합물이 콤팩틴인 경우, 상기 미생물은 아미콜라타, 노카르디아 또는 스트렙토미세스가 아님), 상기 미생물로부터 유래된 효소, 또는 상기 미생물로부터 유래된 효소의 구조를 갖는 효소와 접촉시켜 상기 히드록실화를 수행하는 단계로 이루어지는 하기 화학식화학식(I)의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
상기식에서,
R은 알킬 또는 아릴이고:
Z은 개쇄(open chain) 잔기또는 락톤이고:
R2는 수소, 알킬, 암모늄, 알킬암모늄 또는 알칼리 금속이다.
본 발명의 효소적 히드록실화 방법은, 그 자체로 HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 갖고(갖거나), 다른 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조시 중간체로서 사용될 수 있는 화학식(I)의 화합물을 얻는 데 효과적인 수단을 제공한다. 온화한 반응 조건하에서 수행될 수도 있는 본 발명의 히드록실화 방법을 사용함으로써, 부산물을 감소 또는 제거시킬 수 있다.
본 발명의 방법을 이하 더 기재한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "효소적 방법"은 효소 또는 미생물을 사용하는 방법을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬"은 단독 또는 다른 기의 일부로서, 정규사슬에 탄소 원자수 1 내지 12, 바람직하게는 탄소 원자수 1 내지 6 개를 함유하는 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 탄화수소를 의미하며, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸-펜틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 이들의 각종 분지쇄 이성질체 둥을 들 수 있다. 대표적인 치환체로는 할로(특히 클로로), 트리할로메틸, (예를 들면, 두 알콕시 치환기가 아세탈을 형성하는)알콕시, 미치환 아릴(예를 들면, 페닐), 알킬-아릴 또는 할로아릴과 같은 아릴, 미치환 시클로알킬 또는 알킬-시클로알킬과 같은 시클로알킬, 히드록시 또는 보호된 히드록시, 카르복실, 알킬옥시카르보닐, 알킬아미노, 디메틸아미노와 같은 디알킬아미노, 아세틸아미노와 같은 일킬카르보닐아미노, 아미노, 아릴카르보닐아미노, 니트로, 시아노, 티올, 또는 알킬티오 중에서 선택된 1 개 이상의 기를 들 수 있다. 바람직한 알킬 치환기는 히드록시기이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알케닐"은 단독 또는 다른 기의 일부로서, 탄소-탄소 이중 결합을 1 개 이상 더 함유하는, 상기 알킬에 대해 기재한 바와 같은 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 탄화 수소기를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시클로알킬"은 단독 또는 다른 기의 일부로서, 바람직하게는 1 내지 3 개의 고리, 및 고리 1 개 당 3 내지 12, 바람직하게는3 내지 8 개의 탄소 원자를 함유하는 임의로 치환된 포화 호모시클릭 탄소 고리계를 의미하며, 예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실, 및 아다만틸을 들 수 있다. 대표적인 임의의 치환기로는 상기한 1 개 이상의 알킬기, 또는 알킬 치환기로서 상기한 1 개 이상의 기를 들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아릴"은 고리 부분에 탄소원자 6 내지 12 개를 포함하는 모노시클릭 또는 비시클릭 치환 또는 미치환 방향족기를 의미하며, 예를 들면, 페닐, 비페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 비페닐 또는 치환된 나프틸을 들 수 있다. 대표적인 치환기(바람직하게는 3 개 이하)로는 미치환 알킬, 할로알킬 또는 시클로알킬과 같은 알킬, 할로겐, 미치환 알콕시 또는 할로알콕시와 같은 알콕시, 히드록시, 페닐 또는 할로페닐과 같은 아릴, 페녹시, 알킬카르보닐옥시 또는 아로일옥시와 같은 아릴옥시, 알릴, 시클로알킬, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬카르보닐아미노 또는 아릴카르보닐아미노와 같은 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 알케닐, 티올, 알킬카르보닐, 또는 아릴카르보닐, 또는 메틸렌디옥시[여기서, 메틸렌기는 저급 알킬기(들)(즉, 탄소 원자수 1 내지 6의 상기 알킬기), 아릴알케닐기(들), 및(또는) 알킬티오기(들)에 의해 치환쥘 수 있음]중 1개 이상의 기를 들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 염소, 불소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염"은 무기 및(또는) 유기 염기에 의해 형성된 산성 및(또는) 염기성 염을 가리킨다. 무독성인 제약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 대표적인 제약학적으로 허용되는 염으로는 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 아연 및 테트라메틸암모늄과 같은 양이온으로부터 형성된 염, 및 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질펜에틸아민, 1-p-클로로벤질-2-피롤리딘-1'-일-메틸벤즈이미다졸, 디에틸아민, 피페라진 및 트리스(히드록시메틸)아미노메탄과 같은 아민으로부터 형성된 염을 들 수 있다.
용어 "제약학적으로 허용되는 양이온"은 상기한 바와 같은 제약학적으로 허용되는 염을 형성하는 양(陽)의 반대이온을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ATCC"는 미생물 기탁 기관인 미합중국 20852메릴렌드주 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 기탁 번호를 가리킨다.
출발 물질
본 발명의 히드록실화 방법에서 사용되는 화학식 (Ⅱ)의 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제공될 수 있다. 상기 화합물은 예를 들떤 미합중국 특허 제4,450,171호에 기재되어 있다.
바람직한 화합물
하기 화학식 (Ia)호 표시되는 화학식 (I)의 화합물, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 알칼리 금속염이 바람직하다.
상기 식에서, R은 알킬이고, R2는 화학식(Ⅰ)에서 정의한 바와 동일하다.
특히 바람직한 예는 하기 화학식의 메틸 프라바스타틴, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 알칼리 금속염이다.
하기 화학식 (Ⅱa)로 표시되는 화학식 (Ⅱ)의 화합물, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 알칼리 금속염이 출발 물질로 사용하기에 바람직하다.
상기 식에서, R은 알킬이고, R2는 상기 화학식(Ⅱ)에서 정의한 바와 동일하다.
특히 바람직한 예는 하기 화학식의 메틸 콤팩틴, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체 또는 이들의 알칼리 금속염이다.
1 개 이상의 이중 결합이 없어진 화학식 (I)의 화합물 또는 본 명세서에서 기재된 모든 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 따라서, 상기 결합이 존재하는 대응 화합물을 수소화시킴으로써 얻을 수 있다.
본 방법에 따른 모든 생성물은 해당되는 경우 세포 또는 세포 물질의 여과 분리, 추출, 결정화, 박층 또는 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피등과 같은 공지의 방법에 의해 분리하고 정제할 수 있다.
메틸 콤팩틴 및 메틸 프라바스타틴에 대해 도시된 상기 구조는 본 명세서에서 이들 화합물의 산 형태로 지칭한다. 이들 화합물의 카르복시기가 알칼리 금속 염의 형태인 경우를 본 명세서에서 염 형태로 지칭한다.
이하 설명하는 바와 같이, 본 발명의 히드록실화 방법을 수행하는 데 있어서 수성 배지의 사용이 바람직하다. 따라서, Z가 상기한 바와 같이 개쇄 잔기인 화합물은 Z가 락톤 잔기인 대응 화합물보다 상대적으로 더 수용성이므로, Z가 개쇄 잔기인 화합물을 제조하거나, 출발 물질로 사용하는 것이 바람직하다. Z가 락톤 잔기인 화학식 (Ⅱ)의 화합물은 예를 들면 본 발명의 방법에서 사용하기 전에 개쇄 형태로 가수 분해시킬 수 있다.
효소 및 미생물
본 발명의 방법에서 사용되는 효소 또는 미생물은 그의 기원과 순도에 관계 없이, 본 명세서에 기재된 전환 반응을 촉매하는 능력을 지닌 모든 효소 및 미생물일 수 있다. 효소 촉매원으로 적합한 미생물 속은 노카르디아, 아미콜라타, 사카로폴리스포라, 스트렙토미세스, 아미콜라톱시스, 사카로트릭스 또는 길베르텔라속 등이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 대표적인 종으로는 ATCC 35204와 같은 아미콜라타 아우토트로피카(Amycolata autotrophica), ATCC 15436과 같은 스트렙토미세스 칼리포르니쿠스(Streptomyces californicus), ATCC 21411과 같은 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei), ATCC 31497과 같은 사카로트릭스아우스트랄렌시스(Saccharothrix australensis), ATCC 38591과 같은 길베르텔라 페르시카리아(Gilbertella persicaria), ATCC 27875, ATCC 27876 및 ATCC 20501과 같은 사카로폴리스포라 히르수타(Saccharopolyspora hirsuta), ATCC 11635와 같은 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea)를 들 수 있다. ATCC 35204와 같은 아미콜라타 아우토트로피카, 및 ATCC 20501과 같은 사카로폴리스포라 히르수타가 있다.
미생물의 사용에 있어서, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 전환 반응을 촉매하는 능력을 지닌 임의의 미생물 세포 물질을 사용하여 수행할 수 있다. 세포는 무손상 습윤 세포, 또는 동결 건조, 분무 건조 또는 가열 건조된 세포와 같은 건조 세포 형태로 사용될 수 있다. 또한, 세포는 파열된 세포 또는 세포 추출물과 같은 처리된 세포 물질 형태로 사용될 수도 있다. 단리된 곰팡이 균사와 같은 세포 또는 세포 물질은 유리된 상태, 또는 물리 흡착 또는 포집 등에 의해 지지체에 고정된 형태로 사용될 수 있다. 본 발명을 수행하는 데 있어서, 1종 이상의 미생물을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 사용되는 미생물의 배양 후에, 예를 들면 출발 물질인 화학식 (Ⅱ)의 화합물의 존재 또는 부재하에 미생물(들)을 증식시키고, 수확하고, 바람직하게는 미생물 물질을 (예를 들면 물로) 세척하고, 이어서, 수득한 미생물 물질을 출발 물질인 화학식 (Ⅱ)의 화합물과 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 직접(in situ) 발효 및 반응, 즉 활동적으로 성장하는 미생물 존재하의 반응에 의해 수행될 수 있다.
반응은 무활동(정적) 상태 하에서, 또는 교반하면서 수행될 수 있다. 진동-플라스크 배양, 또는 통기 및 교반과 같은 교반은 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물을 활동적으로 증식하는 배양물에 첨가하는 경우 바람직하게 사용된다. 이 경우, 소포제가 사용될 수 있다.
미생물의 증식은, 예를 들면 탄소 및 질소원과 같은 영양분 및 미량 원소를 포함하는 적절한 배지를 사용함으로써, 당업자에 의해 수행될 수 있다. 대표적인 동화성 탄소원으로는 글루코오스, 글리세롤, 말토오스, 덱스트린, 전분, 락토오스, 수크로오스, 당밀, 대두유, 면실유 등을 들 수 있다. 대표적인 동화성 질소원으로는 콩 가루(soybean meal), 땅콩 가루, 면실 가루, 생선 가루, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 펩톤, 쌀기울, 육(肉)추출물, 효모, 효모 추출물, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 황산 암모늄 등을 들 수 있다. 염화나트륨, 인산염, 탄산칼슘 등과 같은 무기염도 배양 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 소량의 금속염 또는 중금속도 첨가될 수 있다.
동일 또는 상이한 배지가 미생물의 다양한 배양 단계에서 사용될 수 있다. 바람직한 미생물 배양용 배지는 본 명세서의 실시예에 기재되는 배지이며, 이들 배지는 본 발명의 방법에서 사용하는 모든 미생물의 배양을 위해서 사용될 수 있다.
효소가 사용되는 경우, 이들은 바람직하게는 전술한 미생물에서 유래되거나 합성적으로 또는 기타 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 효소는 유전 공학적으로 변형된 숙주 세포로부터 유래될 수 있다. 상기 인용된 미생물 속으로부터 유래된 효소의 구조를 갖는 효소를 생성할 수 있는 유전 공학적으로 변형된 숙주세포 그 자체, 또는 달리 변형된 세포의 사용도 고려될 수 있다.
반응 조건
본 발명의 방법은 완충 수성 배지와 같은 수성 배지에서 수행될 수 있다. 수상은 편리하게는 물, 바람직하게는 탈이온수, 또는 적합한 수성 완충 용액, 특히 바람직하게는 인산염 완충 용액이다. 본 히드록실화 방법에 있어서, 수성 배지의 사용이 바람직하다.
또한, 본 발명의 반응은 유기성 배지, 또는 유기성 배지와 수성 배지와의 혼합 배지에서 수행될 수 있다. 유기성, 또는 유기성/수성 배지의 사용은 Z가 락톤 잔기인 화합물과 같은, 덜 수용성인 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물의 용해성을 증가시킬 수 있다. 덜 수용성인 출발 물질은 예를 들면 메틸 또는 에틸 알콜과 같은 유기 용매중에 용해되고, 이 용액을 전환을 위해 수성 배지에 가할 수 있다. 상기 유기성 배지를 형성하는 액체는 수불혼화성일 수 있지만, 바람직하게는 수혼화성이다. 대표적인 유기성 배지로는 톨루엔, 헥산, 벤젠, 아세톤, 디메틸술폭시드, 시클로헥산, 크실렌, 트리클로로트리플루오로에탄, 알칸올(예를 들면, 메틸 또는 에틸 알코올, 또는 부탄올) 등을 들 수 있다.
출발 물질은 반응 배지에 첨가하기 전에, 물 또는 알코올 등에 용해시키는 것이 바람직하다.
반응 배지는 바람직하게는 액체 배지 1ml 당 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물 약 0.5 내지 약 3 mg을 함유한다. 반응 배지의 pH는 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5이다.
본 발명의 히드록실화 반응을 수행하기 위해서, 물 또는 유기 알코올, 예를 들면 메틸 또는 에틸 알코올과 같은 알칸올을 첨가할 수 있다. 상기 물질들은 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물을 기준으로 몰 과량, 바람직하게는 상당한 몰 과량을 제공하는 양으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서 미생물 세포가 사용되는 경우, 첨가되는 미생물 세포의 양은 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물 1 mg 당 약 10 내지 약 1,000 mg의 양이다. 본 발명의 방법에서 효소가 사용되는 경우, 첨가되는 효소의 양은 바람직하게는 화학식 (Ⅱ)의 출발 물질 화합물 1 mg 당 약 1 내지 약 100 mg의 양이다.
반응 배지를 바람직하게는 약 27 ℃ 내지 40 ℃, 가장 바람직하게는 약 28 ℃ 내지 약 34 ℃로 유지한다. 반응 시간은 미생물 세포에 의해 생성되는, 또는 그 자체로 사용되는 효소의 양, 및 그의 비(比)활성에 따라 적당하게 변화될 수 있다. 전형적인 반응 시간은 약 2시간 30분 내지 약 72 시간이다. 반응 시간은 반응 온도를 상승시키고(거나) 반응 용액에 첨가되는 효소의 양을 증가시킴으로써 감소될 수 있다.
HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조
HMG-CoA 리덕타제(3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제, EC 1.1.1.34)는 콜레스테롤 생합성시 핵심 효소이다. 이 효소의 억제제는 항콜레스테롤혈증제로서, 즉 혈장 콜레스테롤 농도를 저하시키고 유지하는 데 유용함이 밝혀졌다. 과콜레스테롤혈증의 치료 및 예방 외에, HMG-CoA 리덕타제 억제제는 아테롬성 동맥경화증, 과지단백질혈증, 및(또는) 과지질혈증의 치료 및 예방에 유용함이 밝혀졌다.
상기한 화학식 (Ⅱ)의 화합물은 그 자체(예를 들면, 메틸 콤팩틴)로 HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 나타내고(거나), HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 지닌 다른 화합물의 제조시에 중간체로서 사용될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명은, 히드록실화를 본 발명의 상기 방법에 따라 수행하고, 후속적으로 형성된 히드록실화 생성물을 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조에 사용하는 방법(예를 들면, 기들이 생성물 상에서 탈보호되거나, 첨가되거나, 달리 변형됨)을 제공한다. 바람직하게는, 이와 같이 제조된 억제제는 억제제를 제조하는 히드록실화 생성물이 가질 수 있는 활성에 비해 증강된 HMG-CoA 리덕타제 억제 활성을 가진다.
본 발명의 방법에 따라 얻어지는 HMG-CoA 리덕타제 억제제는, 예를 들면 당업자에게 공지된 방법에 따라 선택되는 방식 및 복용량에 의해 포유 동물, 특히 사람에게 투여될 수 있다.
본 발명의 HMG-CoA 리덕타제 억제제 제조에 특히 바람직한 방법은,
(A) 화학식 (Ⅱa)의 화합물(식 중, R은이고, R2는 H임), 또는 그의 염을 아미콜라타 아우토트로피카(Amycolata autotrophica)(ATCC 35204) 또는 사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(Saccharopolyspora hirsuta subspecies kobensis)(ATCC 20501)로 히드록실화시켜 하기 화학식의 구조를 갖는 메틸 프라바스타틴, 또는 그의 알칼리 금속염, 특히 나트륨 또는 리튬염을 제공하는 단계로 이루어진다.
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 태양을 예시한 것이며, 본 발명의 특허 청구 범위의 범위와 정신을 제한하는 것은 아니다. 이들 실시예에서 사용되는 배지의 성분은 다음과 같다.
실시예 1
아미콜라타 아우토트로피카(Amycolata autotrophica)(ATCC 35204) 냉동 바이얼 1 병 및 사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(Saccharopolyspora hirsuta subspecies kobensis)(ATCC 20501) 냉동 바이얼 1 병을 해동시켜, 각각 배지 F4 100 ml를 함유하는 별개의 500 ml들이 플라스크에 접종시켰다. 각 플라스크롤 25 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 놓고 72시간 동안 진탕시켰다. 72시간 동안 진탕된 아미콜라타 아우토트로피카 배양 브로쓰의 분취량 2.5 ml씩을 사용하여 배지 F7 50 ml를 함유하는 6 개의 250 ml들이 플라스크 및 배지 K28 50 ml를 함유하는 6 개의 250 ml들이 플라스크에 접종시켰다. 마찬가지로, 72시간 동안 진탕된 사카로폴리스포라 히르수타 배양 브로쓰의 분취량 2.5 ml씩을 사용하여 배지 F7 50 ml를 함유하는 6 개의 250 ml들이 플라스크 및 배지 K28 50 ml를 함유하는 6 개의 250 ml들이 플라스크에 접종시켰다. 따라서, 총 24 개의 플라스크가 존재하였다. 24 개의 플라스크 전부를 진탕기 상에 위치시켜 25 ℃에서 약 280 rpm의 속도로 진탕시켰다.
24 시간 진탕시킨 후, 여과 멸균된 5 mg/ml의 메틸 콤팩틴염 용액 1 ml를 각 미생물마다 3 개의 F7 플라스크 및 3 개의 K28 플라스크에 무균적으로 첨가하였다. (염 용액은 락톤을 최소 용적의 에탄올 중에 용해시키고, 약 15 ml의 물을 첨가하고[약간의 침전물이 형성됨], pH를 약 11.8로 조정하고, 침전물이 용해될 때까지 65 ℃의 수조에서 항온처리하고, 조심스럽게 pH를 7.5로 낮춤으로써 락톤으로부터 제조하였다. 증류수를 산출 농도가 5 mg/ml될 때까지 첨가하였다) 이때, 각 배지의 1 개의 비접종 플라스크에 염을 첨가함으로써, 비생물학적 변형에 해당하는 대조군으로서 2 개의 새 플라스크를 추가하였다. 이후, 이들 플라스크를 접종된 플라스크와 동일하게 취급하였다.
마찬가지로. 멸균된 500+㎍/ml 함량의 콤팩틴을 각 미생물마다. 3 개의 F7 및 3 개의 K28 플라스크에 첨가하였다. 또한, 각 배지의 1 개의 비접종 플라스크에 콤팩틴을 첨가함으로써, 2 개의 새 플라스크를 더 추가하였다. (접종된 콤팩틴 플라스크의 목적은 콤팩틴의 히드록실화가 정상적으로 일어남을 나타내는 양성 대조군으로 제공하기 위함이다. 비접종 플라스크는 기질의 가능한 비생물학적 변형에 해당하는 대조군으로 제공된다.)
진탕을 24 시간 더 계속하였다. 이어서, 모든 플라스크에 대해 이전에 첨가되었던 것과 동일한 염을 다시 첨가하였다. 진탕을 24 시간 동안 더 지속한 후, 각 배양물-배지-기질 조합용 플라스크 1 개를 포함하여, 8 개의 플라스크를 (시간 T1에서) 회수하였다. 회수된 플라스크에서 나온 브로쓰를 기질 및 히드록실화 생성물의 분석을 위해 사용하였다.
24 시간 더 진탕한 후, 10 개의 메틸 콤팩틴 염 시료 및 10 개의 콤팩틴 시료를 포함하는 나머지 20 개의 플라스크를 (시간 T2에서) 회수하였다. 이 브로쓰를 적합한 기질-생성물 분석을 위해 사용하였다.
결과를 다음 표로 나타내었다.
실시예 2
사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(Saccharopolyspora hirsuta subspecies kobensis) (ATCC 20501) 냉동 바이얼 1 병을 해동시켜, 배지 F4 100 ml를 함유하는 500 ml들이 플라스크에 접종시키기 위해 사용하였다. 플라스크를 25℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켜 72시간 동안 진탕시켰다.
72시간 동안 진탕된 브로쓰의 분취량을 배지 K4 45 ml를 함유하는 2 개의 250 ml들이 플라스크에 접종시키기 위해 사용하였다. 두 플라스크를 진탕기 상에 위치시켜 25 ℃에서 약 280 rpm의 속도로 진탕시켰다.
24 시간 진탕시킨 후, 메틸 콤팩틴염을 물 중에 용해시키고, 용액을 여과 멸균시켰다. 이 용액의 일부를 K28 플라스크중 하나에 첨가하였다. 6 시간 후, 동량을 동일한 플라스크에 첨가하였다. 두번째 K28 플라스크에 세번째 비접종 K28 플라스크와 마찬가지로 일정량을 넣었다. 세 플라스크 모두 진탕기 상에 위치시키고, 18 시간 동안 다시 진탕하였다.
이어서, 첫번째 플라스크에 세번째 첨가량을 첨가하였다. 6 시간 후, 첫번째 플라스크에 네번째(최종) 첨가량을 첨가하고; 두번째 플라스크에 두번째(최종) 첨가량을 첨가하고: 비접종 플라스크에 두번째(최종) 첨가량을 첨가하였다.
42 시간 더 진탕한 후, 3 개의 플라스크를 회수하고, 모든 브로쓰를 메틸 콤팩틴 및 메틸 프라바스타틴 분석을 위해 사용하였다. 결과는 아래와 같다.
실시예 3
아미콜라타 아우토트로피카(ATCC 35204), 스트렙토미세스 칼리포르니쿠스(ATCC 15436), 아미콜라타 히드로카르본옥시단스(Amycolata hydrocarbonoxydans)(ATCC 15104), 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei)(ATCC 21411), 아미콜라톱시스 파스티디오사(Amycolatopsis fastidiosa)(ATCC 31181) 및 사카로 폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(ATCC 20501) 각각의 냉동 바이얼 1 병을 해동시키고, 배지 F7 100 ml를 함유하는 500 ml들이 발아 플라스크에 접종시키기 위해 사용하였다. 모든 플라스크를 25 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켜 72 시간 동안 진탕시켰다.
각 발아 플라스크로부터 분취액 10 ml을 각각 배지 K28 120 ml를 함유하는 별개의 플라스크에 접종시키기 위해 사용하였다. 이어서, 모든 플라스크를 진탕기로 진탕하였다.
24 시간 후, 500 ㎍/ml의 여과 멸균된 콤팩틴(산 형태)을 각 플라스크에 첨가하였다. 재차, 플라스크를 진탕기로 진탕하였다.
24 시간 후, 분취액 15 ml를 각 플라스크로부터 제거하여 후기 분석(T1)을 위하여 동결시켰다. 멸균된 산 형태 콤팩틴의 두번째 첨가량 500 ㎍/ml를 각 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 진탕기로 진탕하였다.
24 시간 경과후, 두번째 분취 시료 15 ml를 각 플라스크로부터 제거하여 후 기 분석(T2)을 위하여 동결시켰다. 그 후 24 시간 경과 후, 최종 분취 시료 15 ml를각 플라스크로부터 제거하여 후기 분석(T3)을 위하여 동결시켰다.
모든 시료를 해동시켜 분석을 위해 사용하였다. 결과를 다음 표에 나타내었다.
실시예 4
사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(ATCC 20501)(28 ℃에서 성장) 및 아미콜라타 아우토트로피카(ATCC 35204)(25 ℃에서 성장)의 46 시간 배양물을 다양한 배지의 플라스크(50 ml 배지/250 ml 플라스크)에 접종하기 위해 사용하였다.
플라스크 1개 당 접종액 5 ml를 사용하였다.
사카로폴리스포라 히르수타를 F7, F46, K28, M124, 뮐러 힌톤, 트립카제 소이 브로쓰(TSB) 및 Y17의 각 배지의 별개의 두 플라스크에 접종하였다. 각 배지의 한 플라스크를 25 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시키고, 각 배지의 또 다른 플라스크를 28 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켰다. 각각 F7 배지 및 K28 배지의 추가 플라스크를 접종시키고, 32 ℃ 에서, 수조 진탕기에 위치시켰다.
아미콜라타 아우토트로피카를 각각 F7 배지 및 K28 배지의 별개의 두 플라스크에 접종하였다. 각 배지의 접종된 1 개의 플라스크를 25 ℃에서, 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시키고, 각 배지의 접종된 1 개의 플라스크를 28 ℃에서, 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켰다.
24 시간 후, 여과 멸균된 콤팩틴(산 형태) 500 ㎍/g을 각 플라스크에 첨가하였다. 동일 온도에서, 이 플라스크를 진탕기로 진탕하였다.
24 시간 후, 분취액 10 ml를 각 플라스크로부터 수거하여 후기 분석(T1)을 위하여 동결시켰다. 멸균된 산 형태 콤팩틴의 두번째 첨가량 500 ㎍/g를 각 플라스크에 첨가하고, 재차, 동일 온도에서 플라스크를 진탕기로 진탕하였다.
48 시간 더 경과된 후, 두번째 분취액(T2) 10 ml를 취하였다. T1시료를 해동시키고, T2시료를 분석을 위해 사용하였다. 결과를 다음 표에 나타내었다.
실시예 5
25 ℃의 F4 배지에서 성장한 각종 미생물의 67 시간 배양물을 사용하여 배지 F7 50 ml를 함유하는 250 ml들이 플라스크 및 배지 K28 50 ml를 함유하는 250 ml 들이 플라스크에 접종시켰다. 플라스크 1개 당 접종액 5 ml를 사용하였다. 사용된 미생물은 셀룰로모나스 셀루란스(Cellulomonas cellulans)(ATCC 12830), 오에르스코비아 크산티네오리티카(Oerskovia xanthineolytica)(ATCC 27402), 프로미크로모노스포라 시트레아(Promicromonospora citrea)(ATCC 15908), 사카로모노스포라 비리디스(Saccharomonospora viridis)(ATCC 15736), 사카로폴리스포라 히르수타(Saccharopolyspora hirsuta)(ATCC 27875), 사카로트릭스 아우스트랄렌시스(Saccharothrix australensis)(ATCC 31497), 및 스트렙토미세스 할스테디이(Streptomyces halstedii)(ATCC 13449)이었다.
사카로모노스포라 비리디스 및 사카로폴리스포라 히르수타(ATCC 27875)의 전환용 플라스크를 28 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시키고, 다른 배양물을 25 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켰다. 사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(ATCC 20501) 대조군을 25 ℃ 및 28 ℃ 모두에 대해서 사용하였다.
24 시간 후, 콤팩틴 500 ㎍/g을 각 플라스크에 첨가하였다.
24 시간 후, 콘팩틴 두번째 500 ㎍/g을 각 플라스크에 첨가하였다.
96 시간 후, 분취액 15 ml를 각 플라스크로부터 취하고, 후기 분석을 위하여 50 ℃ 로 동결시켰다.
시료를 해동시켜 분석을 위해 사용하였다. 결과를 다음 표에 나타내었다.
실시예 6
8종의 ATCC 무코랄레스(Mucorales) 곰팡이류와 1종의 스타우로포마(Staurophoma)종(ATCC 14288)을, 양호하게 성장한 슬랜트로부터 배지 F4의 발아 플라스크(F4 100 ml /500 ml 플라스크)로 접종하고, 25 ℃에서 저속의 진탕기(약 200 rpm) 상에 위치시켰다. 8종의 무코랄레스 곰팡이류는 압시디아 라모사(Absidia ramosa)(ATCC l1613), 시르시넬라 무스카에(Circinella muscae)(ATCC 16008), 쿠닝하멜라 에치눌라타 변종 에치눌라타(Cunninghamella echinulata var. echinulata)(ATCC 36190), 쿠닝하멜라 에치눌라타 변종 엘레간스(Cunninghamella echinulata var. elegans)(ATCC 8688A), 길베르텔라 페르시카리아(Gilbertella persicaria)(ATCC 38591), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei)(ATCC 26912), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus)(ATCC 22959) 및 리조푸스 스톨로니퍼(Rhizopus stolonifer)(ATCC 14037)이었다.
72시간 동안 진탕시킨 후, 모든 발아 플라스크에서의 성장은 1 개의 큰 고형곰팡이 덩어리인 쿠닝하멜라 에치눌라타 변종 에치눌라타를 제외하고는 양호하게 보였다. 이 곰팡이 덩어리를 버렸다. 나머지 7개의 무코랄레스 플라스크와 1개의 스타우로포마(Staurophoma) 플라스크를 배지 F7 및 배지 K28의 생전환용 플라스크(250 ml 플라스크 당 배지 50 ml를 함유함)를 접종하기 위해 사용하였다. 플라스크 당 접종액 2 ml를 사용하였다. 모든 플라스크를 25 ℃에서 정규 속도(약 280 rpm)의 진탕기 상에 위치시켰다.
24 시간 후, 각각 배지 F7 및 배지 K28의 두 비접종된 플라스크를 포함하여,모든 플라스크에 콤팩틴 500 ㎍/ml를 첨가하였다. 모든 플라스크를 25 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켜 진탕시켰다.
24 시간이 더 경과된 후, 모든 플라스크에 콤팩틴 두번째 500 ㎍/ml 을 첨가한 후, 진탕기 상에 위치시켜 진탕시켰다.
48 시간 후, 시료 15 내지 20 ml를 각 플라스크로부터 취하여 분석하였다. 결과는, 길베르텔라 페르시카리아 F7 - 콤팩틴 621 ㎍/g; 프라바스타틴 274 ㎍/g; 프라바스타틴:부산물의 비가 2.3:1 : 및 K28 - 콤팩틴 822 ㎍/g: 프라바스타틴 54 ㎍/g; 프라바스타틴:부산물의 비가 3.4:1 이었다.
다른 배양물중 2 개(압시디아 및 리조푸스 올리고스포루스)는 미량 이하의 프라바스타틴을 보였다. 다른 모든 배양물은 프라바스타틴에 음성이었다.
실시예 7
F4 배지(500 ml 플라스크 당 F4 100 ml, 각각 냉동 바이얼로 접종함)에서 2일, 3일 및 4일된 사카로폴리스포라 히르수타 아종 코벤시스(ATCC 20501) 접종액을 배지 K28의 생전활용 플라스크(250 ml 플라스크 당 K28 50 ml)에 접종하기 위해 사용하였다. 배지 K28의 플라스크를 각 발아 플라스크로부터 5 ml의 접종액을 사용하여 접종하였다. 또한, 3 일된 발아 플라스크로부터의 접종액을 사용하여 상이한 부피로 K28 배지 플라스크 3 개에 접종하였다. 구체적으로, 0.25 ml, 1.0 ml, 2.5 ml, 7.5 ml 및 10 ml의 부피를 사용하였다. 모든 플라스크를 28 ℃에서 약 280 rpm의 진탕기 상에 위치시켜 진탕시켰다.
24 시간 후, 각 플라스크에 콤팩틴 나트륨염 500 ㎍/ml를 첨가하였다.
24 시간이 더 경과된 후, 각 플라스크에 콤팩틴 나트륨염 1,000 ㎍/ml를 첨가하였다.
48 시간이 경과된 후, 25 개의 플라스크를 회수한 후, 분석하였다. 결과는 다음과 같았다.
* 콤팩틴 672 ㎍/g를 포함하는 1 개의 플라스크와 콤팩틴 미량을 포함하는 2 개의 플라스크를 평균한 값
** 2 개 플라스크의 평균: 오염 가능성 있는 세번째 플라스크는 무시함.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 (Ⅱ)의 화합물, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체 또는 이들의 염을, 화학식 (Ⅱ)의 화합물 또는 그의 염의 히드록실화를 촉매하여 하기 화학식(I)의 화합물 또는 그의 염을 생성시킬 수 있는 미생물, 상기 미생물로부터 유래된 효소, 또는 상기 미생물로부터 유래된 효소의 구조를 갖는 효소와 접촉시켜 상기 히드록실화를 수행하는 단계로 이루어지며, 상기 미생물이 노카르디아, 아미콜라타, 사카로폴리스포라, 스트렙토미세스, 아미콜라톱시스, 사카로트릭스 또는 길베르텔라 속 중에서 선택되고, 단 화학식 (Ⅱ)의 화합물이 콤팩틴인 경우, 상기 미생물은 아미콜라타, 노카르디아 또는 스트렙토미세스가 아닌 것을 특징으로 하는 하기 화학식(I)의 화합물, 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 염의 제조 방법.
    상기 식에서,
    R은 알킬 또는 아릴이고:
    Z은 개쇄 잔기또는 락톤이고:
    R2는 수소, 알킬, 암모늄, 알킬암모늄 또는 알칼리 금속이다.
  2. 제 1항에 있어서, Z가 상기 개쇄 잔기인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, R이 알킬인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 부분적으로 또는 완전히 수소화된 유사체, 또는 이들의 알칼리 금속염을 제조하는 것인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 화합물을 미생물과 접촉시키는 것인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 미생물이 아미콜라타 아우토트로피카(Amycolata autotrophica) ATCC 35204, 스트렙토미세스 칼리포르니쿠스(Streptomyces californicus) ATCC 15436, 아미콜라톱시스 메디테라네이(Amycolatopsis mediterranei) ATCC 21411, 사카로트릭스 아우스트랄렌시스(Saccharothrix australensis) ATCC 31497, 길베르텔라 페르시카리아(Gilbertella persicaria) ATCC 38591, 사카로폴리스포라 히르수타(Saccharopolyspora hirsuta) ATCC 27875, 사카로폴리스포라 히르수타 ATCC 27876, 사카로폴리스포라 히르수타 ATCC 20501 또는 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea) ATCC 11635인 것 인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 미생물이 아미콜라타 아우토트로피카 ATCC 35204 또는 사카로폴리스포라 히르수타 ATCC 20501인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 화합물을 미생물 또는 효소와 접촉시키기 전에 물 또는 알코올에 용해시키는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 화합물을 미생물 또는 효소와 접촉시키는 단계를 수성 배지에서 수행하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 수성 배지 각 1 ml에 화학식(Ⅱ)의 화합물 0.5 내지 3 mg이 함유되는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 수성 배지의 pH가 6.0 내지 7.5인 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 수성 배지의 온도가 27 ℃ 내지 40 ℃인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 수성 배지의 온도가 28 ℃ 내지 34 ℃인 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 화합물을 미생물 또는 효소와 접촉시키기는 단계를 2 시간 30 분 내지 72 시간 동안 지속하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서 Z가 락톤인 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 화학식(Ⅱ)의 화합물을 미생물 또는 효소와 접촉시키기 전에 가수분해시키는 방법.
  17. 제 1항에서 정의된 화학식(I)의 화합물을 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조에 사용하는 방법.
  18. 제1항에서 정의된 화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 그의 염을 제 1항의 방법에 따라 히드록실화시켜 제1항에서 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 염을 얻는 단계를 포함하는, HMG-CoA 리덕타제 억제제의 제조 방법.
  19. 혈장 콜레스테롤 수준을 저하 또는 유지시키는 데 유효한 양의 제 1항의 방법에 따라 제조된 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는, 혈장 콜레스테롤 수준을 저하 또는 유지시키기 위한 제약 조성물.
  20. 아테롬성 동맥 경화증을 치료하는데 유효한 양의 제 1항의 방법에 따라 제조된 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는, 아테롬성 동맥 경화증의 치료용 제약 조성물.
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