KR100322398B1 - 교차-유동 여과에 의한 ｄｎａ의 정제 및/또는 농축방법, 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리방법 - Google Patents

교차-유동 여과에 의한 ｄｎａ의 정제 및/또는 농축방법, 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산을 함유하는 용액을 반투막에 접촉시키면서 한번 또는 여러번 통과시켜, 핵산분자는 멤브레인에 의해 보유되고, 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과 또는/및 멤브레인에 흡착될 수 있어서 정제 및/또는 농축된 핵산용액을 수득하는, 용액내에서의 핵산의 정제 또는/및 농축방법에 관한 것이다. 핵산제제로부터 엔도톡신을 분리하기 위하여 동일한 방법이 수행된다. 부가적으로 본 발명은 용액내에서의 핵산의 정제 또는/및 농축, 및 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리를 위한 교차-유동 여과 시스템의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 교차-유동 여과에 의해 정제 및/또는 농축된 핵산의 클로닝, 형질전환, 트란스펙션, 세포내로의 미세주입, 유전자 치료방법에서의 용도, DNA 백신화 또는/및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

교차-유동 여과에 의한 ＤＮＡ의 정제 및/또는 농축방법, 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리방법{PURIFICATION AND/OR CONCENTRATION OF DNA BY CROSS-FLOW FILTRATION, SEPARATION OF ENDOTOXINS FROM A NUCLEIC ACID PREPARATION}
핵산정제방법은 분자생물학 분야에서 통상적인 방법이다. 선행 기술에서 공지된 방법에서, E. coli 박테리아 세포와 같은 분리된 생물학적 물질은, 예를 들어 용균(통상적으로 리소자임 또는 초음파로 용균)한 후 원심분리하고 상청액을 페놀과 함께 흔들어 준다. 계속해서, 세슘 클로라이드 농도구배에 따라 초원심분리를 수행한다(BirnboimDoly, Nucl.Acid Res. 7 (1979) 1513-1523; Garger et al., Biochem.Biophys.Res.Comm. 117 (1983) 835-842). 그러나 이와같은 제제는 통상 불순물로서 박테리아성 엔도톡신, 페놀, 세슘 클로라이드 및/또는 에티듐 브로미드를 함유한다.
엔도톡신은 예를 들어, 살모넬라, 시겔라 및 E. coli와 같은 모든 엔테로박테리오케아애에서 발견되는 박테리아성 독소이다. 포유동물에서 엔도톡신은 발열성 물질로 작용하고, 열과 함께 기타 여러가지 병리학적 효과를 나타낸다. 구성성분 지방 A가 특히 엔도톡신의 독성효과를 일으킨다.
핵산을 정제하는 또 다른 방법이 퀴아젠(상품명:QIAGEN) 플라스미드 핸드북 (Qiagen Inc., Chatsworth, USA) 및 EP-B 0 268 946에 개시되어 있다. 이에 따르면, 통상적인 용균에 의해 수득되는 세포 용해물은 QIAGEN 수지(실리카겔을 기재로 하는 지지물질)를 함유하는 QIAGEN TIP상에서 크로마토그래프된다. 이 방법의 단점은 DNA 결합 단백질이 DNA로부터 완전히 분리되지 않아, 수득되는 플라스미드 제제가 단백질, 특히 엔도톡신(예를 들어 E. coli 세포의 세포막으로부터 유래)을 상당량 함유하는 것이다.
핵산을 정제하는 또 다른 방법에서는, 예를 들어 E. coli 세포와 같은 생물학적 물질의 알칼리용해 후, 원심분리 상청액을 고염도(high salt) 조건하, 음이온 교환 칼럼[예를 들어, 파마시아사제의 모노-Q, 솔스-Q, 바이오라드사제의 마크로프렙-Q, 페르스펙티브 바이오시스템사제의 포로스-Q, 또는 비오세프라사제의 하이퍼-DQ, 참고: Chandra et al., Analyt. Biochem. 203 (1992) 169-172; Dion et al., J.Chrom. 535 (1990) 127-147] 상에서 Birnboim ＆ Doly에 따라 크로마토그래프 한다. 플라스미드 제제는 본 정제단계 후에도 여전히 단백질 및 특히 상당량의 엔도톡신과 같은 불순물을 함유한다.
핵산을 정제하는 또 다른 방법에서는, 알칼리용해 및 이어서 페놀-클로로포름 추출을 한 후, 겔 여과에 의해 크로마토그래피를 수행한다[McClung ＆ Gonzales, Anal.Biochem. 177 (1989) 378-382; Raymond et al., Analyt. Biochem. 173 (1988) 124-133]. 이러한 정제방법 또한 플라스미드 제제로부터 불순물을 완전히 제거할 수 없다.
상기 정제방법은 모두 최종 탈염 및 농축단계를 포함한다. 이것은 통상 원심분리 및 핵산 펠렛을 완충액 내에 재현탁시키는 공정으로 이어지는 핵산의 이소프로판올/에탄올 침전을 함유한다[참고: 예를 들어 Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbar Laboratory Press]. 상기 공정에서, DNA 용액을 예를 들어 1/10 부피 4 M LiCl 및 이어서 0.7 부피 이소프로판올과 상온에서 부가혼합한다. 이어서 핵산을 형성하는 침전물을 원심분리하고 상청액을 버린다. 다음 단계에서 핵산을 함유하는 펠렛을 70 % 에탄올에 취하고, 다시 원심분리하여 상징액을 버리고, 펠렛을 건조시킨 후 바람직한 완충액내에 재현탁시킨다. 그러나, 이소프로판올/에탄올 침전법은 상대적으로 적은 부피가 사용되는 실험실에서의 이용에만 실용적이다.
적은 부피의 한계외에도, 상기 이소프로판올/에탄올 침전법은 기타 심각한 단점이 있다. 조작상 안전성 및 환경보호상 이유 때문에, 산업상 공정 규모에서 요구되는 이소프로판올/에탄올 부피를 사용하는 것은 매우 바람직하지 않다. 게다가 핵산용액내에 함유된 엔도톡신은 이 방법에 의해서는 완전히 제거될 수 없으므로, 이소프로판올/에탄올 침전법은 치료용으로 사용가능한 핵산의 제조를 위한 기술 요건을 충족하지 못한다.
본질적으로 원심분리, 여과, 친화성 크로마토그라피 또는 무기성 크로마토그라피성 물질에의한 크로마토그라피 및 이온교환기 상의 크로마토그라피로 정제하는 유전자 치료에 사용되는 핵산의 분리 및 정제방법이 WO 95/21177에 개시되어 있다. 엔도톡신을 제거하기위해 핵산을 10 % 트리톤RX100 및 40 mmol/l MOPS 완충액(3-모르폴리노-1-프로판 술포네이트)을 함유하는 엔도톡신 제거 완충액으로 처리한다. 이 방법의 단점은 이 방법에 의해 정제된 핵산이 약리학적으로 안전하지 못한 물질인 트리톤R및 MOPS에 오염된다는 것이다. 게다가 엔도톡신을 약 100 EU/mg DNA (QIAGEN News 1-96, 3-5) 함량까지 제거하는 것은 가능하나, 더 이상 강력한 엔도톡신 제거는 불가능하다. 그러나 예를들어 유전자 치료와 같이, 가능한 모든 불순물이 없어야 하는(특히 실질적으로 엔도톡신이 없어야 함) 치료용으로 적용하려면 보다 고순도의 핵산제제가 필요하다. 예를 들어 문헌 [ Cotten et al., Gene Therapy 1 (1994) 239-246] 에서 기재한바와 같이 상기 모든 플라스미드 DNA 제제의 엔도톡신 함량은 이제까지 풀리지 않은 문제였다.
ansgjs [K.-G. Wahlund 및 A. Litzen, Journal of Chromatography, 461 (1989), 73-87; 476 (1989), 413-421] 에는 일명 "장 흐름 분획법(FFF)"인, 각각의 분자량에 따른 단백질 혼합물 및 플라스미드의 분리를 위한, 분석적이고 미세조제의 용도에 적당한 방법이 개시되어 있다. 초여과 멤브레인에 도달하는 유동은 교차-유동 여과에서와 같이 접촉하나, 분리는 교차-유동 여과에서와는 달리 담체 유동액의 흐름내에서의 분자이동의 차이에 기초한다. 따라서, 분리되는 분자의 용리는, 분자크기 및 상응하는 확산계수에 달려있다. 분리는 연속적이지 않고, 즉 분리되는 분자는 분리공정 중 한번만 멤브레인 상을 흐른다.
문헌 [F.M. Fernandez, J.M. Romano 및 M.A. Otero, Acta Biotechnol. 12 (1992) 1, 49-56] 에는 중공섬유 멤브레인을 이용한 교차-유동 여과 방법에서, 용액내에서의 RNA의 농축이 개시되어 있다. 그러나, DNA 또는 플라스마 DNA의 정제는 개시되거나 밝혀져 있지 않다.
문헌 [G.W. Rembhotkar 및 G.S. Khatri, Analytical Biochemistry, 176, 337-374 (1989)] 에는 접촉유동여과에 의한 λ 파지 용균물의 정제가 개시되어 있다. 클로로포름, 페놀-클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 이용하는 통상적인 방법에 의해 계속적인 λ 파지 DNA 제조를 수행한다.
대규모로 제조되는 미생물로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 정제방법이 WO 96/36706 및 96/02658 A1에 개시되어 있다. 용균용액의 첨가 및 유동 열 교환기내에서 70 ℃ 내지 100℃ 로 가열함으로써 세포를 용해시키고, 이어서 배치-와이즈 원심분리 및 디아필트레이션(diafiltration)에 의해 맑은 상징액을 수득한다. 디아필트레이션은 교차-유동 분획법에 따른 멤브레인과 접촉하는 유동이 아니라, 말단이 막힌 모두스내에서 수행된다. 그 후, 음이온 교환 크로마토그라피 및 역상 HPLC에 의해 더 정제한다. 본 방법에서는 세포 용해만이 연속적인 공정 단계로 수행되고, 플라스미드 DNA를 더 정제하는것은 통상적인 원심분리 및 디아필트레이션 장치내에서 회분법에 의해 수행된다. EP-A 96 101 628.4 에는 에티듐 브로미드, 페놀, 세슘 클로리드 및 세제와 같은 불순물이 없고 실질적으로 엔도톡신이 없는, 단백질 함량이 0.1 % 미만인 핵산용액을 수득하기 위해, 고염농도구배를 이용하는 음이온교환기에 의한 핵산제제의 정제가 제안되어 있다.
따라서, 선행기술에서는, 대량의 핵산을 정제 또는 농축하는 것이 가능한 방법 또는 대량 및 고순도 형태, 특히 치료에 적용하기에 적합한 엔도톡신이 없는 핵산을 제조하기에 적합한 방법이 알려져 있지 않다.
본 발명은 용액내에서 핵산의 정제 또는/및 농축방법, 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리방법, 및 용액내에서 핵산의 정제 또는/및 농축과 핵산제제로부터 엔도톡신의 분리에 사용되는 교차-유동 여과 시스템의 용도에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 목적은, 대량의 핵산을 간단한 방법으로 정제하는 것이 가능한 정제 및 농축방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 핵산제제 중 엔도톡신의 농도를 치료용으로 사용하기에 적합할 정도까지 감소시키는 것이다.
본 발명은 첫째, 핵산을 함유하는 용액을 반투막에 접촉시키면서 한번 또는 여러번 통과시켜, 핵산분자는 멤브레인에 의해 보유되고, 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과하여 정제 또는/및 농축된 핵산용액을 수득하는것에 특징이 있는 용액내에서의 핵산의 정제 또는/및 농축방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은, 핵산 함유 제제를 반투막에 접촉시키면서 한번 또는 여러번 통과시켜 핵산분자는 멤브레인에 의해 보유되고, 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과 또는/및 멤브레인에 흡착될 수 있어서 본질적으로 엔도톡신이 없는 핵산용액을 수득하는 것에 특징이 있는, 핵산제제로부터 엔도톡신을 분리하는 방법에 관한 것이다.
핵산용액은 교차-유동 여과 시스템을 이용하는 본 발명의 방법으로 정제 및 농축될 수 있음이 밝혀 졌다. 이와 관련하여 놀랍고도 새로운 사실은, 핵산이 교차-유동 여과(cross-flow filtration; CFF)에 의해 손상되지 않는다는 것이다. CFF 중 발생하는 전단력이 핵산의 손상, 특히 가닥 절단을 초래할 것이라고 늘 추측되어 왔다. 따라서 이전에는 CFF는 단지 단백질의 농축 및 디아필트레이션에만 이용되었다. 게다가 본 발명의 방법에 따라 핵산을 대량 및 목적하는 순도로 수득 가능할 뿐 아니라, 본 발명의 방법은 유기용매의 사용을 피할 수 있는, 안전성 및 환경적 측면에서 뿐 아니라 독성학적으로도 주요한 장점이 있다.
놀랍게도 또한, 실질적으로 불순물, 특히 엔도톡신이 없어 치료 방법 또는 적용에 사용될 수 있는 핵산제제 또한 본 발명의 방법에 의해 수득 가능함을 발견하였다. 따라서 본 발명은 치료적으로 사용가능한 핵산 및 특히 장래에는 더 늘어날 것으로 기대되는 치료적으로 사용가능한 DNA의 폭발적으로 증가하는 양의 요구에 따라 발생된 문제를 해결한다.
본 발명의 방법은 선상 또는 환상 핵산, 바람직하게는 플라스미드 DNA 및 가장 바람직하게는 환상 플라스미드 DNA의 정제 또는/및 농축에 사용된다. 여기서, 핵산의 크기는 ≥ 150 염기쌍의 범위내가 바람직하고, 1 kbp - 200 kbp 범위내가 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에서 핵산은 배치-와이즈에 의해 정제 또는/및 농축될 수 있으나 방법을 연속적으로 수행하는 것이 바람직하다. 어떤 부피크기라도 처리 가능하나, 1 내지 10,000 l 의 용액을 처리하는 것이 바람직하고, 1 내지 100 l 의 용액을 처리하는 것이 특히 바람직하다. 교차-유동 압력이 바람직하게는 막통과압보다 큰 적당한 압력조건하에서, 핵산을 함유하는 용액을 멤브레인(들)을 통과시킨다. 0.2 내지 3.0 bar 의 막통과압에서 조작하는 것이 특히 바람직하고, 교차-유동 압력이 막통과압보다 큰 경우인 0.8 내지 1.5 bar 에서가 가장 바람직하다. 투석유물 유속(RF)은 넓은 범위에서 변화시킬 수 있고, 100 l/시간·m2내지 4,000 l/시간·m2의 유속으로 조작하는 것이 바람직하다. 공정은 또한 다양한 온도에서 수행가능하고, 4 ℃ 내지 25 ℃ 온도범위에서 작업하는 것이 바람직하다.
저분자의 불순물 및 특히 엔도톡신으로부터 핵산 함유 용액을 분리하기 위해, 폴리에테르 술폰(PES), 변형 PES, 폴리비닐리덴 디플루오리드(PVDF), 셀룰로오스 트리아세테이트 또는 재생 셀룰로오스로 만든 멤브레인과 같은 통상적인 멤브레인을 사용한다. 중공섬유 코일 모듈이 또한 본 발명에 따른 방법에 적합하다. 배출크기 1 내지 1000 킬로달톤(kD)인 멤브레인을 사용하는 것이 바람직하고, 10 내지 300 kD이 보다 바람직하고, 10 내지 100 kD 가 가장 바람직하다. 본 발명에서 수득되는 엔도톡신 고갈 인자(교차-유동 여과 후의 핵산용액의 엔도톡신 함량에 대한 교차-유동 여과 전의 핵산제제의 엔도톡신 함량의 비)는 최소한 10 : 1, 바람직하게는 최소한 200 : 1이다. 용액의 엔도톡신 함량은 교차-유동 여과 후 매우 낮고, 바람직하게는 〈 0.1 EU/mg 핵산이다. 본 발명에서 수득되는 핵산은 본질적으로 손상되지 않고 본질적으로 단일가닥 또는 이중가닥 절단이 없다.
특히 본 발명에 따라 정제되는 플라스미드 DNA는 겔 전기영동 분리후 "공유결합 폐쇄 환상(covalent closed circle)" 형태에 상응하는 단지 하나의 우세한 밴드만을 나타낸다. 게다가, 소량의 개환상 및 선환상 형태외에 다른 밴드는 나타나지 않았다.
본 발명의 또 다른 면은, 용액내에서 핵산의 정제 또는/및 농축을 위한 교차-유동 여과 시스템의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은, 핵산제제로부터의 엔도톡신 분리를 위한 교차-유동 여과 시스템의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은, 교차-유동 여과에 의해 정제 또는/및 농축된 핵산의 클로닝, 형질전환, 트란스펙션, 세포내로의 미세주입, 유전자 치료방법에서의 용도, DNA 백신화 또는/및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 용도에 관한 것이다.
하기 실험에서, 필트론사 제품인 변형된 폴리에테르 술폰으로 만든 OMEGA 종류의 멤브레인(주문번호 δS 100CO1 배출크기 100 kD), 사르토리우스사 제품인 셀룰로오스 아세테이트로 만든 멤브레인 또는 밀리포어사 제품인 PVDF 멤브레인을 사용했다. 특히 엔도톡신의 분리를 위해 100 킬로달톤의 배출한계를 가지는 멤브레인을 사용했다. 엔도톡신의 분리를 확인하기 위해, 소량첨가 용액으로 시그마사 제품인 E-톡세이트R(주문번호 210)를 사용했다. 엔도톡신을 함유하는 용액을 리물루스 아메보사이트 리세이트 용액(limulus amoebocyte lysate solution; LAL 용액)에 가하면 혼합물의 겔 형성이 유도되면 고체 겔 방법으로 엔도톡신을 시험한다. 겔의 형성은 다단계로 일어나는 단계적인 응집에 기인한다.
1. 플라스미드 DNA 용액의 교차-유동 여과(CFF)
플라스미드 DNA의 농축 방법으로서 CFF를 시험하기 위해, 2000 g E. 콜리 바이오매스의 생성 제제를 알칼리 용균으로 용해시키고, Q-세파로스 및 히드록실아파티트 크로마토그라피를 행하고, 수득한 플라스미드 DNA 용액을 CFF에서 출발용액으로 사용한다.
1.1 출발용액의 제조
발효기에서 젖은 E. 콜리 바이오매스 2000 g을 취해 디피로겐화된 원심분리 비이커에 충진한다. 재현탁 완충액 22.5 l(50 mmol/l 트리스-HCl, 10 mmol/l EDTA-Na2, pH 8±0.2) 를 가하고, 바이오매스가 완전히 현탁될 때 까지 5±4 ℃에서 24 시간 이상 천천히 교반한다(약 35 rpm). 상기 공정에서 현탁액의 온도를 25 ℃까지 서서히 올려준다.
22.5 l의 0.2 몰/l NaOH, 1 % SDS를 약 80 rpm 에서 교반하면서 현탁액에 가하고, 25 ℃에서 5 분간 항온배양한다. 칼륨 아세테이트 완충액 22.5 l(3 몰/l 칼륨 아세테이트 완충액 pH 5.5)를 교반하면서 가하고, 바이오매스의 온도를 가능한 빨리 4 ℃로 낮춘다. 바이오매스를 26,000×g 및 4 ℃에서 30 분간 원심분리한다. 플라스미드 DNA 를 함유하는 상청액을 분리 및 5 ㎛ 캔들 필터상에서 여과하여 정제한다.
다음단계로, Q-세파로스상에서 크로마토그라피를 수행한다. 따라낸 원심분리 상청액에 TE 완충액(10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA pH 8.5±0.2) 를 가하여 49-50 mS/cm 의 전도도로 맞추고, 5±4 ℃로 냉각한다. 전체적인 크로마토그라피는 이 온도에서 수행한다. 원심분리 상청액을 평형화된 칼럼에 흡수시킨다. 계속해서 칼럼을 약 8 CV 10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.65 mol/l NaCl pH 8.5±0.2로 세척한다.
용출을 위해, 농도구배(5 CV 완충액 A(10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.65 mmol/l NaCl, pH 8±0.2), 5 CV 완충액 B(10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, 0.85 mmol/l NaCl, pH 8±0.2))를 칼럼에 적용하고, 5 내지 8 CV/시간의 유속에서 용출액을 분별하고, 254 nm에서 검출을 수행한다. 상승플랑크에서 출발하는 분리용기내에 주피크를 수집함으로써 예비피크(불순물)를 주피크(플라스미드 DNA)로부터 분리한다.
계속해서 히드록실아파티트상에서의 크로마토그라피를 5±4℃ 에서 수행한다.
평형 완충액: 0.1 몰/l 인산칼륨, 6 몰/l 우레아 pH 7.0±0.2.
세척 완충액 1: 0.15 몰/l 인산칼륨, 6 몰/l 우레아 pH 7.0±0.2.
세척 완충액 2: 0.02 몰/l 인산칼륨 완충액 pH 7.0±0.2.
용출 완충액: 0.5 몰/l 인산칼륨 pH 7.0±0.2.
UV 검출기/기록기 장치를 이용하여 254 nm에서 검출을 수행한다. 보정된 광도계로 측정된 보정용액으로 1 % 생성물용액(플라스미드 DNA)을 사용한다.
Q-세파로스 풀을 최종농도 1.1 mmol/l 염화칼슘으로 맞추고 평형화된 칼럼에 흡수시킨다.
그후, 칼럼을 하기를 이용하여, 유속 5-8 CV/시간으로 연속적으로 세척한다:
1. 검출기에서 흡광도가 더 이상 검출되지 않을 때까지 0.1 몰/l 인산칼륨, 6 몰/l 우레아 pH 7.0±0.2를 사용하여 세척.
2. 2-4 CV, 0.15 몰/l 인산칼륨, 6 몰/l 우레아 pH 7.0±0.2를 사용하여 세척.
3. 5 CV, 0.02 몰/l 인산칼륨 pH 7.0±0.2를 사용하여 세척.
세척 단계후, 0.5 몰/l 인산칼륨 완충액 pH 7.0±0.1을 사용하여 용출한다.
피크를 수집하여 CFF에서 플라스미드 DNA 출발용액으로 사용한다.
1.2 유동-교차 여과
플라스미드 DNA 출발용액은 약 200 ㎍/ml의 플라스미드 DNA 농도 및 약 3750 ml의 부피를 가진다. CFF 는 투석유물 유속 100-200 l/시간·m2, 막 투과압 약 0.8 bar 및 교차-유동압 약 1.2 bar에서 수행된다. CFF에 의해 부피를 약 50 ml로 농축하고, 이어서 투석유물 및 TE 완충액의 pH 값 및 전도도가 일치할때까지 투석유물을 TE 완충액(10 mmol/l 트리스-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8.0)에 대하여 디아필트레이션(diafiltration)한다. 디아필트레이션 과정을 완료한 후, 디아필트레이션 완충액으로 희석하므로써 투석유물을 1 mg/ml 의 플라스미드 DNA 농도로 맞춘다. 제조한 플라스미드 DNA 용액 샘플을 취하여, 하기 종목 3.1에 기재된 바와 같이 분석한다.
2. CFF 에 의한 엔도톡신의 고갈 측정
플라스미드 DNA 용액 100 ml에 E-톡세이트R엔도톡신 표준용액 1000 EU를 추가공급하여 10 EU/ml로 한 후, 실험에서 출발용액으로 사용한다. 용액을 TE 완충액으로 1000 ml 까지 희석한 후, CFF에 의해 다시 초기부피 100 ml로 농축한다(농축물 1). 희석 및 농축 단계를 연속해서 4 회 반복한다. 각각의 농축 단계 후 각 농축물로부터 샘플(농축물 2,3,4,5)을 취하여 LAL(limulus-amoebocyte lysate)법으로 샘플의 엔도톡신 농도를 분석한다.
3. 결과
3.1 플라스미드 DNA 용액의 CFF
CFF를 이용하여 플라스미드 DNA 용액을 어려움 없이 농축 및 디아필트레이션 할 수 있다. 실험결과를 요약하여 하기 표에 나타내었다.
파라미터 플라스미드 DNA초기용액(HA 풀) 플라스미드 DNACFF 후 전여과완충액(TE): 10mmol/l 트리스-HCl,1mmol/l EDTA, pH 8.0
부피(ml) 3750 505 -
OD260/280 1.89 1.90 -
전도도(mS/cm) 26.5 1.11 1.11
pH 6.99 7.93 7.98
수율(mg) 763 666 -
CFF를 끝낸 후, 플라스미드 DNA의 분량을 다양한 농도로 아가로스 겔에 적용한다. 나타낸 아가로스 겔은 레인 1 및 10 에서 DNA 길이 표준 번호 II(단편 크기:125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp) 및 레인 2 및 9 에서 DNA 길이 표준 번호 III(단편 크기:125, 564, 831, 647, 1375, 1584, 1904, 2027, 3530, 4268, 4973, 5148, 21226 bp)를 나타낸다. 레인 3에서 pBR322 (4162 bp)는 통상적인 세슘 클로리드 농도구배법에 의해 정제되는 대조 플라스미드로 사용된다. 본 방법에 의해 정제되는 플라스미드 DNA가 본질적으로, 공유결합 폐쇄 환상 형태(우세한 초나선 밴드)에 상응하는 플라스미드 DNA를 함유한다는 것이 공지되어 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 정제된 플라스미드 DNA(pCMV-CAT)는 레인 4, 5, 및 6 에서, 상이한 량으로 사용된다. 본 발명에 따라 정제된 플라스미드 DNA는, 대조 플라스미드 DNA(레인 3)와 마찬가지로, 본질적으로 우세한 밴드를 나타낸다. 본 플라스미드 DNA 밴드는 공유결합 폐쇄 환상 형태(우세한 초나선 밴드)에 상응한다. 이는 본 발명에 따라 분리된 플라스미드 DNA는 손상되지 않고 본래의 형태를 유지함을 나타낸다. 따라서 이는, CFF 도중 플라스미드 DNA가 단편화되거나 목적하지 않는 플라스미드 DNA 형태로 전환될 가능성을 배재한다.
일러두기:
1 % 아가로스 겔
레인 1: DNA 길이 표준 II(베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 236250)
레인 2: DNA 길이 표준 III(베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 528552)
레인 3: pBR322 (베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 481238)(0.4㎍)
레인 4: CFF 후 pCMV-CAT, 0.19 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)
레인 5: CFF 후 pCMV-CAT, 0.45 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)
레인 6: CFF 후 pCMV-CAT, 0.71 ㎍ (벌크 활성 물질 용액)
레인 7: TE 완충액
레인 8: pBR322 (베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 481238)(0.4㎍)
레인 9: DNA 길이 표준 III(베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 528552)
레인 10: DNA 길이 표준 II(베링거 만하임 GmbH, Cat. 번호 236250)
3.2 CFF에 의한 엔도톡신 고갈
하기표는 엔도톡신이 첫번째 농축단계 후 이미 실질적으로 제거되었음을 나타낸다. 부가적인 CFF는 엔도톡신 농도를 시험방법의 검출한계까지 낮춘다.
샘플 투석유물 부피[ml] 측정된 투석유물 내 엔도톡신 농도[EU/ml]
초기 용액 100 6 - 12
농축물 1 100 0.06 -0.60
농축물 2 100 0.06 -0.60
농축물 3 100 0.06 -0.60
농축물 4 100 0.06 -0.60
농축물 5 100 < 0.06
디아필트레이션 완충액 - < 0.06

Claims (23)

  1. 플라스미드 DNA를 함유하는 용액을 반투막에 접촉시키면서, 연속적인 공정 으로 한번 또는 여러번 통과시켜, 플라스미드 DNA 분자는 멤브레인에 의해 보유되고, 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과하여 정제 또는/및 농축된 플라스미드 DNA 용액을 수득하는 것에 특징이 있는 용액내에서의 플라스미드 DNA의 정제 또는/및 농축방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 핵산이 ≥ 150 염기쌍의 크기를 갖는 방법.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 1 내지 10,000 l 부피의 용액이 처리되는 방법.
  4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 1 내지 100 l 부피의 용액이 처리되는 방법.
  5. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 교차-유동압이 막통과압보다 큰 압력하에서 용액이 멤브레인(들)을 통과하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 0.2 내지 3.0 bar 의 막통과압이 사용되는 방법.
  7. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 100 내지 4,000 l/시간·m2의 투석유물 유속이 사용되는 방법.
  8. 핵산 함유 제제를 반투막에 접촉시키면서, 연속적인 공정으로 한번 또는 여러번 통과시켜, 핵산분자는 멤브레인에 의해 보유되고, 더 낮은 분자량을 갖는 물질은 멤브레인을 통과 또는/및 멤브레인에 흡착될 수 있어서 본질적으로 엔도톡신이 없는 핵산용액을 수득하는 것에 특징이 있는, 핵산제제로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 멤브레인(들)의 배출크기가 1 내지 1000 kD인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 멤브레인(들)의 배출크기가 10 내지 100 kD인 방법.
  11. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 연속적으로 수행되는 방법.
  12. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 부피 1 내지 10,000 l의 제제가 처리되는 방법.
  13. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 엔도톡신 고갈 인자 즉, 교차-유동 여과(CFF) 후의 엔도톡신 함량에 대한 교차-유동 여과 전의 제제의 엔도톡신 함량이 최소한 10 : 1인 방법.
  14. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 엔도톡신 고갈 인자가 최소한 200 : 1인 방법.
  15. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 교차-유동 여과 후 용액의 엔도톡신 함량이 < 0.1 EU/mg 핵산인 방법.
  16. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 수득된 핵산이 본질적으로 가닥 절단이 없는 방법.
  17. 용액내에서 플라스미드 DNA를 정제 또는/및 농축하기 위해 사용되는 교차-유동 여과 시스템.
  18. 핵산제제로부터 엔도톡신을 분리하기 위해 사용되는 교차-유동 여과 시스템.
  19. 제 1 항 내지 16 항중 어느 한 항에 따라 정제 또는/및 농축된 핵산을, 클로닝, 형질전환, 트란스펙션, 세포내로의 미세주입, 유전자 치료방법, DNA 백신화 또는/및 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 사용하는 방법.
  20. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 멤브레인(들)의 배출크기가 1 내지 1000 kD인 방법.
  21. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 멤브레인(들)의 배출크기가 10 내지 100 kD인 방법.
  22. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 수득된 핵산이 본질적으로 가닥 절단이 없는 방법.
  23. 제 8 항 내지 10 항중 어느 한 항에 있어서, 부피 1 내지 100 l의 제제가 처리되는 방법.
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