KR100300765B1

KR100300765B1 - 줄기 기저부 배양에 의한 호접란 영양개체의 대량 증식방법

Info

Publication number: KR100300765B1
Application number: KR1019980043052A
Authority: KR
Inventors: 빈철구; 이동우; 신원교
Original assignee: 김혁규; 경상남도
Priority date: 1998-10-14
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2001-12-17
Also published as: KR20000025820A

Abstract

본 발명은 호접란 클론묘 생산을 위해 즐기기저부 배양을 통한 원괴체 유도생산에 관한 것으로서 기존에 널리 사용되고 있는 잎, 뿌리, 화경절편, 액아를 이용치상하는 방법보다 원괴체유도 성공율이 높아 농가에서도 쉽게 적용하여 클론묘를 생산할 수 있는 방법이다. 본 기술은 생장점조직만을 현미경하에서 잘라내는 기존의 방법과 달리 생장점조직을 포함하는 기저부 줄기조직을 취해 원괴체를 유도하는 조작이 매우 간단한 방법이다. 본 발명의 즐기배양방법은 호접란 영양번식부분에서 여러 다른 형태로 응용될 수 있다. 즉 식물개체를 그대로 살려둔 채로 생장점부의 롤 송곳으로 찔러 고사시키고 식물체 줄기 측면에서 액아를 유도, 그 액아에서 유도된 작은 유식물체를 채취, 생장점이 포함된 줄기조직을 취함으로써 원래 개체는 그대로 유지하면서 증식에 활용할 수 있다. 또한 본 발명은 구입한 플라스크묘의 즐지조직을 이용하여 원괴체를 유도할 수 있어 플라스크묘의 계속적인 구입을 피할수 있고 특정개체의 대량증식에 응용할 수 있는 유용한 방법이다. 또한 화경배양을 통해 얻어진 화경액아유래의 유식물체에서도 이 방법을 응용할 수 있다. 즉 분화율이 낮은 화경엽절편을 이용하는 것이 아니라 화경배양에서 다신초를 유도하여 얻어낸 유식물체의 줄기기저부를 이용해 원괴체를 유도하여 대량증식하는 데 이 줄기배양기술을 활용할 수 있다.

Description

줄기 기저부배양에 의한 호접란 영양개체의 대량증식방법

본 발명은 호접란 클론묘 생산을 위해 줄기 기저부 배양을 통한 원괴체 유도생산에 관한 것이다. 호접란 육종을 통하여 우수한 형질을 가진 개체가 선발될 경우 이 개체의 형질을 그대로 가진 영양개체를 만들어내기 위해 성숙한 개체의 잎(Tanaka and, Sakanishi, Bull. Univ, Osaka pref. Ser. B37:1-4, 1985), 뿌리 (Tanaka등, Am. Orchid Soc. Bull. 45:1022-1024, 1976), 화경옆절편(Pieper and Zimmerman, Acta Horticulturae 64;21-23 1976), 액아(Zimmerman and Pieper, Orchid Rev. 86:223-227, 1978), 화경절간 절편체(Lin, Lindleyana, :58-65, 1986) 등을 이용한 조직배양이 응용되고 있다. 그러나 잎과 뿌리조직을 이용하는 경우에는 원괴체(PLB) 유도 성공율이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 조직자체의 오염과 다량의 갈변물질의 발생으로 대량증식에 어려움이 많다(Arditti등, Orchid Rev. 89:49-52, 1981). 그 외 화경절간 절편체와 화경액아 배양의 방법은 원괴체 성공률이 비교적 높은 것으로 알려져 있으나(Ichihashi, Phalaenopsis, 68-94, 1993) 이들은 주로 어린 화경을 이용하는 것이 성공율이 높은데 우수한 개체를 선발시에 개화를 완전히 시켜 표현형을 관찰하고 액아와 화경을 채취해야 하므로 역시 시간적 제약과 항상 다량의 시료를 공급받을 수 없다는 것이 문제점으로 지적된다.

일반적으로 다른 난에서는 생장점배양을 통해서 대량증식을 하고 있지만 단경성 란인 호접란 경우는 생장점배양이 실패할 경우는 그 식물체가 없어짐을 의미하여 생장점배양 대신 위에서 언급한 다양한 조직을 이용하여 원괴체 유도에 응용하고 있다. 생장점 배양은 현미경하에서 아주 작은 생장점만을 떼어내는 숙련된 기술이 필요하며 더욱이 호접란 생장점배양의 경우에는 성공률이 매우 낮아 실제로는 거의 쓰이지 않고 있다(Arditti and Ernst, Micropropagation of Orchids, 467-520, 1993). 생장점배양 대신 엽원기를 붙인 Shoot tip(생장점 선단조직)을 이용한 원괴체유도 방식(Intuwong and Sagawa, Am. Orchid Soc. Bull. 43:893-895, 1974)이 개발되기도 했지만 엽원기를 포함한 생장점 부위를 떼내기 위해 여전히 번거로운 절차를 거쳐야 하는 제한점이 있어 많이 응용되지 않고 있다.

그러므로, 보다 쉽고 PLB유도 성공율이 높은 새로운 방법의 개발과 PLB유도에서 또 다른 장애요소가 되는 조직배양시 발현되는 페놀성 유해물질의 발생과 축적을 완화시킬 수 있는 배지와 배양방법의 개발이 필요하다.

본 발명은 상기에서 언급한 현재 통용되고 있는 방법들의 문제점을 해결하기 위하여 보다 간단하며 성공율이 높은 원괴체유도 방법으로써 호접란 대량증식방법을 제공하는데 있다. 즉 우수한 형질을 가진 개체가 선발되었을 때 그 개체의 형질을 그대로 지닌 개체를 얻기 위해 자가수분을 할 경우 또는 양친간 교배시 얻어지는 후대의 개체에서 형질의 분리가 일어나 우수한 형질을 가진 묘를 육성할 수 없어 형질을 그대로 지닌 조직배양묘 보다 가격경쟁력에 불리하다. 그러므로 조직배양묘 생산기술의 개발은 매우 중요하며 본 발명은 기존의 조직배양기술보다 간편하고 성공율이 높은 실용적인 조직배양방법을 제공하는데 있다.

제1도는 유식물체에서 줄기기저부만을 절취하여 원괴체의 유도, 증식 및 클론묘를 연속적으로 생산하는 과정도.

제2도는 선발된 우수한 개체를 죽이지 않고 식물체 측면에서 부정아를 2-3개 유도하여 만든 유식물체에서 줄기배양을 통해 원괴체를 유도하는 과정도.

제3도는 플라스크 클론묘의 줄기기저부를 이용하여 원괴체를 유도, 대량증식에 응용하는 줄기배양과정도.

제4도는 화경배양을 통해 얻은 액아발달 유래의 유식물체에서의 줄기배양을 통해 원괴체를 유도하는 과정도.

제5도는 우량선발개체에서 생장점을 죽인 후 측면에서 발달된 유식물의 사진.

제6도는 BA 고농도에서 화경액아 유래의 다신초유식물이 형성된 모습의 사진.

제7도는 유식물에서 줄기배양을 위해 절취한 줄기기저부의 사진.

제8도는 탈지면 흡지배지에 치상된 줄기조직에서 원괴체가 유도되는 모습의 사진.

제9도는 탈지면 휴지배지에서의 원괴체증식 모습의 사진.

제10도는 원괴체에서 유도된 유식물체 모습의 사진.

본 발명의 바람직한 실례를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 다음의 실시예는 본 발명의 예시를 나타내는 것으로서 이들 실시예에 의하여 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[줄기 기저부 배양을 통한 원괴체 유도]

호접란중에서 WYI(Phal. Amabilisx Phal. Mount Kaala)와 DPI(Dark Pink)를 선발하여 제1도에 나타낸 바와 같이 유식물에서 뿌리부분과 신초부분을 제거한 후 줄기 기저부를 절취한 뒤 다시 2~4개의 작은 절편체를 만들어서 원괴체유도 배지(Vacin & Went 기본배지에 150㎖/L의 코코넛밀크 첨가, 이하 VW+Coconut Water 150ml/L라 칭함)에 치상하였다. 배양은 28℃, 2주간 암상태로 유지하였고, 2주후부터는 1500룩스에서 16시간 광상태와 8시간 암상태의 광조건을 유지하였다. 상기 원괴체를 유도한 결과, 줄기 기저부 절편을 치상할 경우 45% 이상의 원괴체가 유도되었다. 이는 다른 조직을 이용한 방법에 비교해서 매우 높은 성공률을 나타내고 있다(표 1 참조).

[표 1]

원괴체 유도배지 : VW+Coconut Water 150ml/L

그리고 줄기배양에서 품종간 차이가 원괴체 유도에 미치는 영향을 알아보기 위해 11개 품종을 선택하여 그들의 유식물체에서 줄기기저부를 절취한 후 원괴체유도 배지에 치상하였다. 이 줄기배양 방법은 원괴체유도 성공률이 매우 심한 편차를 보이는 화경엽배양과 달리 원괴체 유도가 힘든 것으로 알려진 유색계 계통에서도 높은 원괴체 성공률을 나타내었을 뿐 만 아니라 품종에 큰 구애를 받지 않고 높은 원괴체 유도율을 나타내었다(표 2 참조).

[표 2]

원괴체 유도배지 : VW+Coconut Water 150ml/L

NY714: Phal. White Dream 'M24×Phal. Yukimai 'M-1,

NY715: Dtps. Happy Valentine 'M-12×Dtps. Happy Valentine 'M-39,

NY716: Dtps. Happy Valentine 'M-6×Dtps. Happy Valentine 'Morita,

NY717: Phal. (kawai Pink×Ray Craft)×Zeda Kala)× Dtps. Otohime 'Doagashima'

NY718: Dtps. (Hisa Nasu×City Girl) 'AMP16×Dtps. City Girl 'M-2'

NY719: Dtps. City Girl 'M-2'×Dtps.(City Girl×(Love street×Spot jason)) 'M51'

NY721: Phal. White Dream 'M14'×Phal. Musashino' MH'

NY726: Dtps. Happy Valentine 'M-12×Dtps. Happy Valentine'' Full Moon',

AMP40: Dtps. City Girl #C,

SB93169: Dtps. Quevedo' sierra Vasquez',

SB94378: Dtps. White Castle' Amado Vasquez'

[실시예 2]

[측아유도 유식물체의 줄기조직을 이용한 원괴체 유도]

제2도에 나타낸 바와 같이 우량선발 개체를 송곳으로 생장점을 죽이고 측아의 발생을 유도하고 줄기 기저부를 절취하여 줄기를 절단하고 치상하여 원괴체를 유도하였다. 배양과정은 실시예 1과 동일한 조건으로 하여 원괴체를 유도하였다. 이와 같은 줄기배양방법은 육종프로그램을 통해 선발된 우수개체를 생장점을 죽여 측아에서 유도한 유식물체를 이용하여 다시 얻을 수 없는 우수개체를 죽이지 않고 영양번식이 가능하게 하였다. 원괴체 유도율은 약 50%정도의 수준에 이르고 있기 때문에 우수한 개체의 클론묘 생산을 할 수 있었다.

[실시예 3]

[플라스크묘의 줄기조직을 이용한 원괴체 유도]

제3도에 나타낸 바와 같이 플라스크묘에서 배양된 유묘의 줄기를 절단하여 치상하여 원괴체를 유도하였으며 배양조건은 실시예 1에서와 같다. 플라스크묘를 이용한 줄기배양방법은 자가생산한 플라스크묘나 외부에서 구입한 플라스크묘를 사용하여 원괴체를 유도해내는 방법인데 이 방법을 적용할 경우 외부에서 구입한 플라스크묘를 매번 구입하지 않고 일부만 남겨 원괴체를 유도하여 증식에 이용할 수 있었다.

[실시예 4]

[화경배양유래 유식물체의 줄기조직을 이용한 원괴체 유도]

제4도에 나타낸 화경배양 액아유래 유식물체의 줄기조직을 이용한 원괴체유도 방법은 원괴체의 유도율이 약 30%로서 호접란 클론묘생산의 대량생산에 쓰이는 또다른 하나의 유용한 방법을 제시하였다.

보통의 경우 화경배양을 통해 얻은 액아유래의 유식물체에서 엽절편을 채취하여 조직배양에 응용하고 있으며 줄기조직은 버린다. 그러나 엽절편의 경우 품종에 따라 매우 분화율이 낮아 실용화에 많은 문제점을 나타내고 있다. 반면 줄기기저부조직은 분화력이 매우 높아 원괴체유도 성공률이 매우 높다. 그러므로 화경절편마디를 BA(Benzyladenine) 고농도 (10~15mg/L)의 MS배지에 치상하여 다신초(multi-shoot)를 유기하여(표 3, 제6도 참조) 여러개 얻어진 유식물의 기저부 배양을 통해 성공률이 높은 원괴체를 유도하였다. 상기 기저부배양은 실시예 1에서와 같은 조건하에 실시하였다.

[표 3]

본 발명은 유식물체에서 줄기기저부만을 절취하여 원괴체의 유도와 증식 그리고 클론묘를 연속적으로 생산하는 기술을 응용함으로써 클론묘의 순환적 연속대량 증식의 체계를 구축할 수 있다. 더욱이 원괴체를 일정한도내로 계속 증식할 경우 분열능력이 저하되는데 이런 경우에 대개 다시 모주의 화경배양으로 다시 새로운 원괴체를 유도해내야 한다. 그러나 이 방법은 다시 원괴체유도 까지 시간이 많이 걸리므로 원괴체에서 얻은 클론 유묘를 이용하여 줄기기저부를 배양함으로써 빠른 시일내에 새로운 원괴체를 얻을 수 있다. 아울러 본 발명의 줄기 배양방법은 호접란 조직배양에 있어서 다양하게 응용할 수 있다. 즉 우수선발개체를 회생시키지 않고 영양번식 할 때 응용될 수 있으며, 플라스크묘의 대량 연속증식, 화경배양유래의 유식물체를 이용한 원괴체 유도에도 응용될 수 있다.

Claims

호접란의 유식물체에서 줄기 기저부만을 절취하여 이를 2~4개의 절편체를 만들고 VW+Coconut Water 150ml/L조성의 원괴체유도배지에 치상한 후 원괴체를 유도증식함을 특징으로 하는 줄기 기저부배양에 의한 호접란 영양개체의 연속대량증식방법.
제1항에 있어서, 상기 유식물체는 생장점을 고사시켜 축아로부터 유도된 것것임을 특징으로 하는 줄기 기저부배양에 의한 호접란 영양개체의 연속대량증식방법.
제1항에 있어서, 상기 유식물체는 영양번식으로 얻은 호접란의 플라스크 클론묘임을 특징으로 하는 줄기 기저부배양에 의한 호접란 영양개체의 연속대량증식방법.
제1항에 있어서, 상기 유식물체는 화경절편마디를 벤질아데닌 10~15mg/L을 함유한 배지에 치상하여 유도된 다신초에서 얻어진 것임을 특징으로 하는 줄기 기저부배양에 의한 호접란 영양개체의 연속대량증식방법.