KR100280779B1

KR100280779B1 - 정제 콘도로이티나제의 제조법 및 의약조성

Info

Publication number: KR100280779B1
Application number: KR1019930011667A
Authority: KR
Inventors: 노부까즈 하시모또; 히데오 모찌지끼; 아끼오 하마이; 신이찌 이시까꾸; 미사꼬 도리까이; 이사오 미야찌
Original assignee: 야마야 와따루; 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1992-06-26
Filing date: 1993-06-25
Publication date: 2001-02-01
Also published as: AU669528B2; ES2146600T3; KR940005793A; AU4146493A; DE69328519D1; CA2099138A1; US6184023B1; ATE192486T1; EP0576294A2; RU2144833C1; US5763205A; DE69328519T2; SG50677A1; CA2099138C; US5496718A; DK0576294T3; EP0576294A3; EP0576294B1

Abstract

분자량이 SDS-PAGE 및 겔여과법에 있어서의 약 100,000 탈톤이고, N 말단 아미노산이 알라닌이며, C 말단 아미노산이 프롤린이고 결정화되기쉬운 정제 콘도로이티나제 ABC.

콘도로이티나제 ABC생산균체 추출물에서 핵산을 제거하고, 약가티온 교환수지와 강가티온 교환수지와를 사용하여 농도구배가 컬럼 크로마토그래피 처리하여 결정화하여 얻는 정제 콘도로이티나제 ABC를 정제하는 방법.

콘도로이티나제와 혈청 알부민, 젤라틴 또는 비온성 계면활성제로 되는 조성물 그 조성물이 안정성이 높고 주사제로서 추간판 헤르니아 치료를 위하여 사용되는 것.

Description

정제 콘도로이티나제의 제조법 및 의약조성

제1도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC결정 현미경 사진을 나타낸 것임.

제2도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC의 활성과 반응 pH와의 관계를 나타낸 것임.

제3도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC의 소정의 pH에 있어서 25℃에서 24시간 방치한 때의 pH와 잔존 활성과의 관계를 나타낸 것임.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

○- ○: 초산완충액

×- ×: 도리스 초산 완충액

△-△ : 도리스 염산완충액

●- ●: 글리신 완충액의 각 완충액중에 보유한 때의 잔존활성

제4도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC활성과 반응온도와의 관계를 나타낸 것임.

제5도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC를 소정의 온도에 있어서 1시간 동안 보유한 때의 잔존활성과의 관계를 나타냄.

제6도는 본 발명의 콘도로이티나제 ABC에 대하여, HPLC에 의한 겔여과를 한때의 크로마토그래피를 나타냄.

제7도는 본 발명의 실시예 1의 콘도로이티나제 ABC의 정제 공정의 각 단계에서의 SDS-PAGE의 밴드를 나타냄.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

A : 프로타민처리상등액

B : CM-세파로즈 처리액

C : S-세파로즈 처리액(비환원)

D : S- 세라로즈 처리액(환원)

제8도는 본 발명의 실시예 3의 균체에서의 콘도로이티나제 ABC의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC활성과의 관계를 나타냄.

제9도는 본 발명의 실시예 4의 균체를 농도가 다른 트리톤(Triton) X-100 함유완충액으로 25℃와 37℃의 조건으로 추출한 것의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC활성과의 관계를 나타냄.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 25℃ : (- □-)

2. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 37℃ : (- + -)

3. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 25℃ : (- ◇ -)

4. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 37℃ : (- △ -)

제10도는 본 발명의 실시예 4의 균체를 농도가 다른 브리지(Brij)-35함유 완충액으로 25℃와 37℃하의 조건으로 추출한 것의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC활성과의 관계를 나타냄.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 25℃ : (- □-)

2. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 37℃ : (- + -)

3. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 25℃ : (-- ◇ --)

4. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 37℃ : (- △ -)

제11도는 본 발명의 실시예 4의 균체를 농도가 다른 노니데트(Nonidet) P-40 함유 완충액으로 25℃와 37℃의 조건으로 추출한 것의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC활성과의 관계를 나타냄.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 25℃ : (- □-)

2. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 37℃ : (- + -)

3. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 25℃ : (-- ◇ --)

4. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 37℃ : (- △ -)

제12도는 본 발명의 실시예 4의 균체를 농도가 다른 POELE 함유 완충액으로 25℃와 37℃의 조건으로 추출한 것의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC활성과의 관계를 나타냄.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 25℃ : (- □-)

2. 계면활성제 농도 2%, 추출온도 37℃ : (- + -)

3. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 25℃ : (-- ◇ --)

4. 계면활성제 농도 5%, 추출온도 37℃ : (- △ -)

본 발명은 극히 정제도가 높고 안정성이 높은 정제 콘도로이티나제 ABC, 콘도로이티나제 ABC결정 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

또 본 발명은 콘도로이티나제를 유효성분으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

콘도로이티나제 ABC(Chondroitinase ABC)(BC 4.2.2.4)는 히아루론산(hyaluronic acid), 콘도로이틴황산, 콘도로이틴, 데루마탄황산등을 불포화 올리고당 및 이당으로 분해하는 효소이다.

이 효소는 프로테우스·불가리스(Proteus vulgaris)등의 세균에서 생산된다는 것이 알려져 있다.

그리고, 콘도로이티나제 ABC를 얻으려면 균체파괴액을 스트렙토마이신처리, 황안처리, DEAE 셀룰로오즈 처리 및 포스포셀룰로오스 처리를 순차로 행하는 방법(J. Biol. Chem., 243(7), 1523-1535(1968)), 혹은 균체파괴액을 DEAE 셀룰로오즈처리, 하이드록시 애피타이트처리, 아연고정화 아가로오즈처리, 겔여과처리를 순차로 행하는 방법(Agric. Biol. Chem., 50(4), 1057-1059(1986); 특개소 62-122588호 공보)등이 알려져 있다.

한편, 사람의 요통의 병인으로서 구분되는 추간판(椎間板)헤르니아증의 치료에 식물 파파야 유래의 단백분해효소, 기모파파인과 박테리아 유래의 교질분해효소, 콜라게나아제등을 헤르니아증 환자의 추간판공에 주입하여 헤르니아를 용해하는 추간판용해요법(ID 요법)이 개발되어 구미에서는 기모파파인이 의약품(상품명 기모다이아구틴)으로 시판되고 있다.

그런데, 상기 단백분해 효소를 사용하는 ID 요법은 척추, 추간판의 헤르니아부분 뿐만 아니라 주변 구조조직의 단백부분까지 분해되어 신경마취나 알레르기 발현등 부작용이 생기기 쉬운 결점을 가지고 있다.

R. Brown은, 헤르니아에 특이적으로 작용하는 효소의 검색의 결과, 헤르니아의 주된 구성자인 프로테오글리칸의 분해에 착안하여 콘도로이티나제 ABC, 및 콘도로이티나제 AC를 사용하는 ID 요법을 제안하였다.(미국특허 제 4696816호)

특히 프로테우스·불가리스가 생산하는 콘도로이티나제 ABC는 프로테오 글리칸에서 콘도로이틴 황산 또는 데루마탄 황산 측쇄를 선택적으로 제거하여 게라탄 황산, 헤파린, 헤파란황산에는 작용하지 않는 것 및 효소의 생산량이 많은 것에서 산업상의 이용에 적합한 것으로 생각되고 있다.

그리고, 상기한 방법에 의해 프로테우스·불가리스의 배양물에서 콘도로이티나제 ABC활성을 가지는 효소 조제물을 얻는 것이 시행되고 있으나, 이들은 어느 것이건 프로테아제 활성, 엔도톡신활성, 핵산이 잠재하고 있고, 혹은 효소단백으로서 불안정한 등이 있어 전기와 같은 추간판 헤르니아의 치료약제로 투여하거나 고순도의 시약으로서 사용하는데는 부적당하였다. (J. Biol. Chem., 243(7), 1523-1059(1986), 영국특허 제1067253호 명세서, Agric. Biol. Chem., 50(4), 1057-1535(1968), 특개소 62-122588호 공보, 특개평 2-57180호 공보)

특히, 이와같은 불순물의 혼재나 안정성이 떨어지는 것은 콘도로이티나제 ABC를 의약용으로서 이용하는 경우에 치명적인 결점이 되는 위험이 있다.

본 발명은 이와같은 결점을 개선함을 목적으로 한 것으로서 즉, 본 발명의 과제는 불순물이 혼재하지 않은 고순도이고 비활성성이 높고 안정성이 높은 의약품으로서도 사용 가능한 신규한 정제 콘도로이티나제 ABC, 그 결정화물 및 이와같은 콘도로이티나제 ABC를 고수율로 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

또한 본 발명은 콘도로이티나제를 유효성분으로 하는 의약조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기위한 목적으로 콘도로이티나제 ABC의 정제에 관하여 검토를 거듭하였던바, 균체에서 효소를 추출하여 효소 추출물에서 핵산을 제거하고 그 핵산을 제거한 효소추출액을 약가티온 교환수지와 강가티온 교환수지를 조합시켜 크로마토그래피 처리를 하면 엔도톡신, 핵산, 단백분해효소등의 불순물이 완전히 제거되어 전기영동(SDS-PAGE)으로 단일의 밴드를 나타내는 고유액체 크로마토그래피(겔여과, 가티온교환)로도 단일의 피크를 나타낼 정도로 순화된 정제 콘도로이티나제 ABC가 얻어지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

그리하여, 이 콘도로이티나제 ABC는 결정화 할 수가 있고, 비활성이 종래의 콘도로이티나제 ABC조제품에 비하여 약 3배 이상 높고, 장기간 보존하여도 안정하며, 의약품으로서도 충분히 사용할 수 있는 것이 된다.

즉, 본 발명은 다음에 그 특성을 표시하는 바와같이 정제도가 높고, 안정성이 높은 정제 콘도로이티나제 ABC에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다음의 공정으로부터 되는 이와같은 정제도가 높고 안정성이 높은 정제 콘도로이티나제 ABC의 제조방법에 관한 것이다.

(i) 콘도로이티나제 ABC생산균체에서 효소 추출액을 얻는 공정(공정 1)

(ii) 얻어진 효소 추출액에서 핵산을 제거하는 공정(공정 2)

(iii) 핵산이 제거된 효소 추출액을

(a) 약 가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여 콘도로이티나제 ABC를 흡착시켜 흡착된 해(該)효소를 용출시켜 용출액을 강가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여 콘도로이티나제 ABC를 흡착, 용출시키는 공정(공정 3-1), 또는

(b) 강가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여 콘도로이티나제 ABC를 흡착, 용출시켜, 용출액을 약가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여 콘도로이티나제 ABC를 흡착, 용출시키는 공정(공정 3-2).

본 발명에 있어서 콘도로이티나제 ABC의 추출은 습균체에 계면활성체를 가한 용액을 가하여 균체를 현탁시키고, 이 현탁액을 교반함으로써 효소를 추출하는 방법으로 행하여진다.

본 발명에서는 콘도로이티나제 ABC를 포함하는 균체 추출액에서 핵산을 제거하고, 이들을 약가티온 교환수지와 강가티온 교환수지와를 조합하여서 사용하여 크로마토그래피 처리한다는 두단계의 크로마토그래피 처리를 하는 것으로, 종래의 콘도로이티나제 ABC에 비하여 순수하고 안정성이 높으며 비활성이 약 3배 이상 높은 정제 콘도로이티나제 ABC를 얻을 수 있다.

또, 본 발명에서는 콘도로이티나제 ABC생산균체에서 효소 추출액을 얻을 때, 추출을 계면활성제를 사용하여 행하면 추출효율이 대단히 좋고, 동시에 불순물이 적어 목적효소의 비활성이 높은 추출액을 얻을 수 있다.

또, 본 발명에서는 콘도로이티나제 ABC생산균체에서 계면활성제를 사용하여 콘도로이티나제 ABC를 추출하고, 추출액을 약 가티온 교환수지 또는 강가티온 교환수지인 어느것을 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여 콘도로이티나제 ABC를 해수지에 흡착시켜 흡착된 해효소를 그라디엔드법에 의하여 용리액의 이온강도를 연속적으로 변화시켜서 용출함으로서 상기와 같이 정제도가 높은 정제 콘도로이티나제 ABC를 얻을 수가 있다.

또 더 나아가 본 발명은 상기와 같은 정제도가 높은 콘도로이티나제 ABC를 원료로 하여, 양말단이 수산기인 구조를 가지는 폴리에테르(예컨데 폴리에틸렌글리콜)를 사용하여 결정화함으로써 제조할 수가 있고, 정제콘도로이티나제 ABC의 특성을 가지며, 또한 핀상 혹은 주상 결정인 콘도로이티나제 ABC에 관한 것이다.

이와같은 콘도로이티나제와 그의 결정은 균일성이 높고, 품질이 안정되어 있어 비활성도 높으며 보존안정성도 뛰어나다.(예로서, 약 25∼40℃로 1개월간 방치하여도 거의 활성이 저하되지 않음)

또한 본 발명은 콘도로이티나제를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 콘도로이티나제와 혈청 알부민 또는 젤라틴 등으로 된 콘도로이티나제 함유 조성물에 관한 것이다.

또, 본 발명은 콘도로이티나제와 비이온선 계면활성제와로 되는 콘도로이티나제 함유 조성물에 관한 것이다.

나아가서 또한 본 발명은 이와같은 콘도로이티나제 함유 조성물의 의학, 특히 척추·추간판 헤르니아의 치료를 위한 의약에 관한 것이다.

이와같은 조성물에는 전기한 정제 콘도로이티나제 ABC뿐만 아니라, 종래 공지의 콘도로이티나제 ABC, 콘도로이티나제 AC 등도 사용된다.

이와같은 조성물은 수용액으로 하였을 때 콘도로이티나제가 용기에 흡착되거나 혹은 메카니칼 스트레스에 의하여 불용물이 생성되는 것을 방지하고, 높은 활성을 유지하며 의약으로서 유용하다.

[본 발명의 실시예에 대한 상세한 설명]

본 발명의 정제 콘도로이티나제 ABC및 콘도로이티나제 ABC결정의 제조법에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 콘도로이티나제 ABC생산균체로서는, 종래 콘도로이티나제 ABC를 산생할 수 있다고 알려져 있던 어떠한 미생물의 균체일지라도 사용될 수 있다.

예를 들어, 프로테우스·불가리스등에 속한 콘도로이티나제 ABC산생균이 사용되었다.

이와같은 균의 구체적 예로서는, 프로테우스·불가리스 NCTC 4636(=ATCC 6896, = IFO 3988)을 들 수 있다.

이 균체는 통상의 방법(J. Biol. Chem., 243(7), 1523-1535(1968), 특개소 62-122588호, 특개평 2-57180호 공보참조)으로 배양하여, 배양액으로부터 습균체를 채취해 이것을 중성부근의 pH를 가지는 완충액에 현탁시켜, 현탁액으로부터 효소의 추출을 행한다.

중성부근의 완충액은, 통상 pH 6.0∼8.0 의 1∼100mM 인산완충액, 도리스-염산완충액, 초산완충액등의 완충액을 사용하여 초음파처리 혹은 균체파괴장치(DYNOMILL)등에 의한 처리를 행하여 균체를 파괴하여, 콘도로이티나제 ABC, 프로테아제, 기타 효소, 핵산, 단백질등을 함유한 효소액을 추출했다.

더욱, 콘도로이티나제 ABC의 균체로 부터의 추출은, 계면활성제 용액, 예를들어 계면활성제를 첨가한 완충액을 사용하므로하여, 효소의 추출수율을 한 단계 더 높일 수 있다.

본 발명에서 사용한 계면 활성제는, 전기 효소를 효율적으로 추출되는 것이라면 좋다.

추출에 사용한 계면활성제로서는 비이온성 계면활성제가 우수하고, 예를들면 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 P-t-옥틸페닐에테르, 폴리솔베이트(poly solvate)등이 좋다.

폴리옥시에틸렌알킬에테르에는, 에뮬젠(Emulgen)계 계면활성제, 리포녹스(Liponox)계 계면활성제, 브리지계 계면활성제등이 있다.

이런 시판되고 있는 계면활성제에는 에뮬젠 120, 에뮬젠 109, P, 리포녹스 DCH, 브리지-35, 78, 76, 96, 56, 58 혹은 98, 니콜(Nikkol) BL-9·EX, BL-21 혹은 BL-25 등이 있다.

또, 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸 페닐에테르에는 트리톤(Triton)계 계면활성제, 노니데트계 계면활성제, 이퀘팔(Igepal) CA계 계면활성제, 폴리테르젠트 (polytergent) G계 계면활성제, 뉴트로닉스(Neutronyx)계 계면활성제 혹은 콩코(Conco)계 계면활성제등이 있다.

이런 시판되고 있는 계면활성제에는, 트리톤 X-100, X-45, X-114, X-102, X-165, X-305, X-405, 노니테트 P-40, 이퀘팔 CA-630, 뉴트로닉스 605, 콩코 NIX-100 등을 예를 들 수 있다.

또 폴리솔베이트는, 솔비탄 모노-9-옥타데세노에트 폴리(옥시-1,2-에탄디엘) 유도체가 좋고, 트윈(Tween) 80이 시판되고 있다.

또한, 폴리솔베이트로서는 트윈 20, 40 또는 60, 에마솔(Emasol) 4115 혹은 4130도 시판되고 있다.

이중, 특히 좋은 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌-라우릴 에테르(POELE)등의 폴리옥시에틸렌 알킬에테르를 들 수 있다.

이런 계면활성제를 사용하여 효소의 추출효율을 높일 수 있을뿐만 아니라, 다른 추출법과 비교해서 효소이외의 협잡단백과 핵산, 혹은 프로테아제의 혼입이 적은 효소추출액을 얻을 수 있다.

DYNOMILL을 사용한 종래의 추출방법에서는 습균체 1g 당의 효소추출량을 약 150∼200단위정도 이었으나, 계면활성제를 사용하여 추출한때는 습균체 1g 당 적어도 약 500∼600 단위의 효소를 추출할 수가 있다.

이 추출액에서 약가티온 교환수지나 강가티온 교환수지에 의한 크로마토그래피 처리를 행함으로써 엔도톡신의 함량도 의약용의 적응할 수 있는 정도로 미량이었다.

전기 영동적으로 단일 밴드를 나타내는 활성이 높은 콘도로이티나제 ABC를 용이하게 고수율로 얻을 수 있다.

추출은 습균체를 전기계면활성제를 2∼7% 함유하는 완충액에 가하여 균체 현탁액으로 하고, 15∼45℃로 좋기로는 37℃전후로 가온하여 약 1∼10시간 동안, 좋기로는 2∼6시간 교반하여 현탁액을 실온온도로 냉각하고, 이를 원심분리등의 분리수단으로 균체잔사와 추출액과를 분리한다.

이와같이 하여 얻어지는 추출액에는 주로 콘도로이티나제 ABC, 기타의 효소, 단백질, 핵산이 함유되어 있으므로 다음과 같은 콘도로이티나제 ABC의 정제 공정을 한다.

이와같이 하여 추출된 균체 추출액에서는 단백질, 핵산등을 제거한다.

단백질, 핵산의 제거는 통상 행하여지는 어떠한 방법을 사용하여도 좋으나, 특히 핵산을 제거하기위해서는 황산프로타민을 첨가하여 행하는 것이 본 효소를 의약품으로서 사용하는 경우를 고려할때 바람직하다.

프로타민 처리는 전기 균체 추출액의 3∼7%의 황산프로타민 수용액을 최종 농도가 약 0.25∼1% 농도가 되도록 첨가하여 약 10∼30분간 4℃내지 실온부근에서 교반하여 핵산등의 침전물을 생성시켜, 이를 원심 기타의 방법에 의하여 분리 제거한다.

얻어진 상등액은 콘도로이티나제 ABC, 프로테아제, 기타의 효소를 함유하고 있으므로 가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 한다.

본 발명의 정제 콘도로이티나제 ABC제조방법에 있어서는, 약가티온 교환수지와 강가티온 교환수지를 조합하여 사용하고 크로마토그래피 처리를 한다.

여기서 사용하는 약가티온 교환수지로서는 교환기가 카르복시메틸기등의 카르복시알킬기인 교환수지를 들 수 있다.

구체적으로 교환기로서는 카르복시메틸기를 가지는 다당류 유도체(아가로스 유도체, 가교 덱스트란 유도체등)를 들 수가 있다.

시판품으로서는 CM 세파로스, CM 세파텍스(모두 상품명 파마시아사)등을 들 수가 있다.

강가티온 교환 수지로서는 교환기가 설파알킬기인 가티온 교환수지를 들 수 있다.

구체적으로는 교환기로서 설포에틸기, 설포프로필기등을 가지는 다당류 유도체(아가로스 유도체, 가교덱스트란 유도체등)를 들 수 있다.

시판품으로서는 S 세파로스 또는 SP 세파로스(상품명 파마시아사), SP 세파텍스(상품명 파마시아사), SP 도요팔(상품명 도소주식회사등을 들 수 있다.

상기 2종의 가티온 교환수지를 조합한 크로마토그래피 처리로서는 다음의 방법을 한 예로서 들 수 있다.

먼저, 최초의 크로마토그래피 처리는 약 가티온 교환수지를 균체 추출에 사용한 것과 같은 완충액, 예를들면 pH 6.5∼7.5의 완충액(예, 1∼50mM의 인산완충액, 도리스염산완충액, 초산완충액등)으로 평형화하여, 여기에 전기의 효소함유상등액을 접촉시켜 효소를 흡착시켜서 이 가티온 교환수지를 필요에 따라서 염류용액(예 20∼25mM NaCl 용액)및/또는 전기 계면활성제 용액(예 0.5% POELE 용액) 사용하여 세정하였다.

상기 완충액은 0.1M 정도의 식염을 용해시켜서 용출액을 조제하고, 전기 수지와 접촉시켜서 효소활성을 가지는 획분(劃分)을 용출한다.

용출법은 농도구배법(그라디엔드법)에 의하거나 스테프 와이즈법에 의하여서도 좋다.

이와같이 크로마토그래피 처리는 컬럼법이건 배치법으로도 좋다.

얻어지는 획분을 같은 완충액으로 평형화한 강가티온 교환수지와 접촉시켜 콘도로이티나제 ABC를 흡착시켜 이 가티온 교환수지를 필요에 따라 염류용액(예 20∼50mM NaCl 용액) 및/또는 물을 사용하여 세정한 후 0∼0.5M의 식염을 함유하는 전기된 것과 같은 완충액(예: 인산완충액, 도리스염산완충액, 초산완충액 등)으로 농도구배법에 따라 콘도로이티나제 ABC를 용출 단리한다.

이와같은 크로마토그래피 처리는 컬럼법으로 하는 것이 좋다.

이상의 2종류의 가티온 교환수지를 사용하는 크로마토그래피 처리를 상기된 역의 순위로 시행하는 것도 가능하다.

또 균체를 계면활성제를 함유하는 완충액으로 추출한 때는 추출액 중에 전기한 바와같이 추출액의 불순물 양이 적으므로, 프롤라민 처리등, 추출액에서의 핵산제거조작을 하지 않고 직접 CM 세파로즈 컬럼을 통하여 콘도로이티나제 ABC를 컬럼 흡착시켜서 컬럼을 세정후, 농도 구배법(그라디엔드법)등으로 컬럼에서 효소를 추출한다는 간단한 조작으로 효소를 정제할 수도 있다.

크로마토그래피처리를 하여 정제한 효소용액을 상법에 의하여 농축, 탈염하여 그대로 정제효소용액으로서 의약품, 시약등으로 사용해도 좋고, 또 농축 탈염한 효소용액을 효소로 변성, 실활성시키지 않은 조건하에서 일반적 건조 방법(냉동건조법등)으로 선발하여도 좋다.

또한, 상기의 정제효소용액을, 양 말단이 수산기인 구조를 가지는 폴리에테르(예: 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜등)와 혼합 접촉시켜, 콘도로이티나제 ABC를 결정화시킬 수도 있다.

예를들면, 콘도로이티나제 ABC용액에 폴리에틸렌 글리콜(분자량 4000, 6000등)을 첨가하고 효소농도 250∼500U/ml, 폴리에틸렌 글리콜 농도 5∼20%, 좋기로는 10∼15% 로 조정하여, 실온내지 4℃정도에서 결정이 생성될때까지 방치한다.

이 결정은 사방정계 혹은 단사정계의 침상 또는 주상 결정이고, 실시예에 표시되는 바와같은 파라메타를 나타냄.

이와같이하여 얻어진 콘도로이티나제 ABC는 불순물의 엔도톡신, 핵산, 프로테아제, 기타의 단백질등이 제거되어 있고, 전기영동(SDS-PAGE)으로 단일의 밴드를 나타내며, HPLL(겔여과, 가티온교환)에 있어서도 단일의 피크를 나타내며 특히 비활성도 종래의 콘도로이티나제 ABC의 비하여 약 3배 이상 높은 것이 된다.

더욱이 본 발명의 방법에 있어서는 종래 방법에서와 같이 황안 분획과 제조공정의 도중에서 농축, 탈염 조작을 할 필요가 없어졌으므로, 콘도로이티나제 ABC의 제조시간이 단축되고 수율을 향상시킬 수 있어, 제조 경비를 절감할 수가 있다.

또한, 소량의 콘도로이티나제 ABC일지라도, 혹은 대량의 콘도로이티나제 ABC라도 그 생산량은 관계없이 자유로 생산할 수 있다.

또, 상기 방법으로 결정화하여 얻어진 콘도로이티나제 ABC결정은 침상 또는 주상결정(제1도 참조)이고 균일하고 품질이 안정하며 비활성도가 높고 보존안정성이 우수하다.

본 발명의 전기 방법으로 얻어진 콘도로이티나제 ABC의 특성을 표시하면 다음과 같다.

(1) 작용

히아루론산, 콘도로이틴 황산, 콘도로이틴, 데르마탄황산에 작용하고, 반응초기에는 소량의 큰 불포화 올리고당을 생산하며, 최종적으로는 불포화이당(△⁴-글루크로닐-N-아세틸 헥소사민 및 그의 4- 또는 6- 황산 에스테르) 또는 불포화 올리고당을 생성한다.

(2) 최적 pH 및 안정 pH

콘도로이틴 황산 C를 가질로한 경우(도리스 염산 완충액중)의 최적 pH는 8.0∼8.2 이다.(제2도)

pH 5∼9에 있어서 25℃로 24시간 방치한 경우 약 80% 이상의 잔존활성을 나타냄(제3도)

(3) 역가의 측정법

효소반응에 의해 자외부에 현저한 흡수를 가지는 불포화 이당류가 생성하는 것에 기인한다.

콘도로이틴 황산((기질) 1.2mg, 50mM 초산나트륨을 함유하는 50mM 도리스 염산 완충액(pH 8∼8.5), 카제인 10㎍에 효소를 가한 효소반응액을 37℃로 20분간 보온하여 반응시키고, pH 1.8의 0.05M 염산을 가하여 반응을 정지시켰다.

232mm 에서의 흡수를 측정한다.

한편, 대조로서 열변성시킨 효소액을 위 조성의 기질 용액중에 유지하고, 같은 처리를 하여 232nm 에서의 흡수를 측정하였다.

생성물의 불포화 이당의 양은 대비에 대한 흡수의 증가에서 계산한다.

또 2-아세트아미드-2-디옥시-3-0-(β-D-글루코-4-엔피라노실우론산)-6-D-술포-D-갈락토오즈의 mM 분자 흡광계수는 5.5로 한다.

이 결과 1단위(U)의 효소량을 상기 반응조건에 있어서 1분간에 불포화이랑을 1μM 유리하는 반응을 촉매하는 양으로 정의한다.

(4) 작용의 적온 및 온도 안정성

작용최적온도는 37℃이고, 30∼37℃로 약 90% 이상의 활성을 나타낸다.(제4도)

또, pH 7.0의 도리스 염산 완충액을 사용하여 각 온도로 1시간 유지하여 잔존활성을 측정한다.

2℃에서 30℃의 사이에서 안정하였고, 50℃에서는 활성을 잃었다.(제5도)

(5) 저해

표 1에 표시하는 바와같이 아연(Zn²⁺), 니켈(Ni²⁺), 철(Fe³⁺), 동(Cu²⁺)의 각 이온에 의해 활성이 저해된다.

[표 1]

(6) 분자량

도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미도겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 단일 밴드로 되고, 환원 상태에서도 혹은 비환원 상태에서도 약 100,000 탈톤이고, 또 겔여과 (HPLC)에 의한 겔여과로 같이 약 100,000 탈톤이다.(제6도 참조; 조건은 후술함)

(7) 등전점 약 8.2∼8.5(페이스트 겔(Phast Gel) IEF pH 3∼9 및 스탠다드로 하여 pI 컬큐레이션 키트 3∼10을 사용하여, 페이스트 시스템 장치를 사용하여 측정하였다.(시약, 장치는 모두 파마시아제))

(8) 아미노산분석

표 2 에 표시되는 바와 같다.

[표 2]

또한, 이 분석은 콘도로이티나제 ABC를 6N 염산중에서 감압하고 110℃로 24시간 가수분해하여서 된 것이다.

시료는 3회 측정하고, 그 평균치를 표시하였다.

전분자량을 100,000으로 하여 산출하였다.

Trp, Cys는 미측정임.

(9) 말단 아미노산

N 말단 아미노산 잔기는 에드만(Edmam) 분해(「생화학 실험강좌 I-단백질의 화학 II, 일차구조결정법」 132∼142페이지, 1976년 8월 28일,주식회사동경 화학동인 발행)에 의하여 동정하였던바, 알라닌기였었다.

N 말단 아미노산 배열은 알라닌-트레오닌-X-아스파라진-플로린-알라닌-페닐알라닌-아스파라진산-플로린(단, X는 미동정)이었다.

또, C 말단 아미노산의 배열은 카르복시 펩티다제 Y를 사용하여 카르복시펩티다제법(「생화학 실험강좌 I-단백질의 화학 II, 1차구조 결정법」 203∼211면)에 의하여 동정하였던 바, -세린- 로이신-플로린이었다.

얻어진 결정에서 콘도로이티나제 ABC의 1차 구조는, 다음의 아미노산기로 되어 있다.

Ala - Thr - X - Asn - Pro - Ala - Phe - Asp - Pro ---- Ser - Leu - Pro X=미동정

(10) 안정성

인산 완충액(pH 6∼8) 존재하에 있어서 용액 상태, 건조상태 모두 실온에서 3개월 이상 안정하였다.

(11) 비활성

300U/mg 단백이상(단백의 측정은 BSA를 스탠다드로 하여 롤리법으로 측정하였다.)

(12) 기타

HPLC(가티온 교환 크로마토그래피) 및 HPLC(GPC: 겔여과)에 있어서 단일의 피크를 나타냈다.

또한, 겔여과의 조건 및 결과는 다음과 같다.

[조건]

컬럼 : TSK G 3000 SW x_I(도소주식회사제)

용출액: 0.2M 염화나트륨을 함유하는 0.1M 인산완충액(pH 7.0)

용출속도: 0.5ml/분

조작온도: 35℃

검출파장: 280nm

주입량 : 20㎕

분자량 마커: 치토크롬 C(12.4 킬로탈톤)

아데닌산기나아제(32 킬로탈톤)

에노라제(67 킬로탈톤)

젖산 디히드로나제(142 킬로탈톤)

글로타민산 디히드로 나제(290 킬로탈톤)

(이상, 모두 오리엔탈 효모공업주식회사제)

[결과]

본 발명의 콘도로이티나제 ABC는 보존시간 18.43 분의 위치에 단일 피크로서 용출되었다.(제6도)

이 보존시간을 상기 분자량 마커와 비교하여 분자량을 약 100 킬로탈톤으로 결정하였다.

엔도톡신을 실질적으로 함유함이 없고, DNA, 프로테아제는 검출한계이하이었었다.

시판 콘도로이티나제 ABC(생화학 공업주식회사, 카탈로그넘버 100332)에 대하여 같은 방법으로 측정하였던바, DNA는 검출한계의 5000배, 프로테아제는 검출한계의 200배이었었다.

또한 본 발명의 콘도로이티나제 ABC와 종래 알려져 있는 가장 정제도가 높은 콘도로이티나제 ABC(생화학공업주식회사제 콘도로이티나제 ABC, 프로테아제프리, 카탈로그넘버 100332)와를 대비하면 분자량은, 전자는 SDS-PAGE 및 겔여과의 어느것이나 약 100,000 탈톤인데 비하여, 후자는 SDS-PAGE에 의한 약 80,000탈톤이고, 겔여과에 의하면 약 120,000 내지 145,000탈톤이다.

이점에서 크게 상위하다.

더욱이 비활성은 전자가 300U/mg 단백이상인데 대해, 후자는 110U/mg 단백 전후이고, 안전성도 전자가 실온에서 3개월 이상 안정한데 비해 후자는 -70℃로 3개월 이상 안정으로, 이점에서 상위하다.

더욱더 전자의 콘도로이티나제 ABC는 전기영동 및 HPLC에 있어서도 단일하고 또 결정화 할 수도 있으며, 그 때문에 말단 아미노산, 등전점등을 측정할 수 있는데 비해, 후자는 물질로서 동점 가능한 순도의 효소 표품이 아니기때문에, 말단 아미노산, 등전점등을 측정할 수 없으며, 이점에 있어서도 상위하다.

본 발명의 조성물 및 의약에 대해 설명한다.

먼저, 콘도로이티나제와 혈청 알부민 또는 젤라틴으로된 조성물 및 의약에 대하여 설명한다.

본 발명의 조성물을 제조할때에는 다음에 설명하는 첨가성분을 함유하고, pH 를 조정한 수용액을 준비하여, 여기에 예를들어 비활성 300U/mg 이상의 정제 콘도로이티나제를 혼합하여 10U/ml 이상, 좋기로는 40∼400U/ml 함유하는 수용액으로하여, 필요에 따라 세균여과를 하고, 용액상의 조성물로 하거나, 혹은 이 용액상의 조성물 냉동건조법등의 비가열조건으로의 건조처리에 붙여 건조물상의 조성물(좋기로는 냉동건조물로 할 수 있다.), 나아가서 용액상의 조성물을 예컨데 -80∼-20℃로 동결시켜도 좋다.

본 발명의 조성물에 있어서 정제 콘도로이티나제에 배합되는 필수 첨가성분은 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질이고, 이들은 병용하여도 좋다.

혈청 알부민으로서는 사람, 소, 말, 돼지, 양, 염소등의 포유동물의 혈청 알부민을 들 수 있다.

특히 사람에 투여하는 주사용 제제품으로 사용하는 경우에는 비경구투여에 사용가능한 인(人)혈청 알부민(HSA)이 좋다.

예컨데 건강한 통상의 혈장을 원료로 하여 고온(COHN)의 메탄올 분획법에 의하여 분획 정제된 것이 사용된다.

특히 좋기로는 혈청 알부민을 가열처리(좋기로는 60℃, 10시간 정도)하여 간염 바이러스등의 불활성화 처리를 한것이 사용된다.

또한, HSA에는 안정화제로서 N-아세틸 트립토판 나트륨 또는/및 카프릴산 나트륨이 첨가되어 있는 것도 상관없다.

젤라틴으로서는 소, 돼지등의 동물에서 유래된 것을 들 수 있다.

또한 여기서 젤라틴이란 동물에 가죽, 뼈 등에서 얻은 콜라겐을 적당한 전처리에 의해 가용화하여 얻어지는 것으로, 강산(pH 1∼3 정도의 염산, 황산, 아연산, 인산등)으로 처리한 등전점 7.0∼9.0의 산처리 젤라틴(A형) 및 석회등의 알카리로 처리한 등전점 4.5∼5.0의 알카리 처리 젤라틴(B형)을 들 수가 있다.

본 발명에 사용되는 젤라틴으로서는 산처리 젤라틴이 좋다.

또, 본 발명의 조성물은 용액상태에서 통상 pH 5∼9, 좋기로는 6∼8을 나타내도록 조정한다.

그런고로 그 pH 영역을 유지가능한 완충제를 통상 함유하곤 한다.

완충제로서는 생리학상 허용되는 것이면 좋고, 특히 한정되지 않지만 염산, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 인산, 인산제2 수소 칼륨, 인산수소제 2칼륨, 인산 2 수소나트륨, 인산수소 2 나트륨, 아미노초산, 안식향산 나트륨, 구연산, 구연산나트륨, 초산, 초산나트륨, 주석산, 주석산나트륨, 젖산, 젖산나트륨, 에탄올아민, 알기닌, 또는 에틸렌 디아민의 1종이상을 함유하는 완충제가 예시된다.

특히 인산염 완충액(제)가 바람직하다.

또 pH 5 보다 낮은 경우 및 9보다 높은 경우에는 콘도로이티나제가 활성을 소실하거나, 용액상태에서 불용물이 생성하는 수가 있다.

전기한 첨가성분의 첨가량은 단백질에 있어서는 콘도로이티나제의 단백질의 0.001 배 중량이상에서 효과가 인정되지만, 좋기로는 0.01∼100배 중량, 특히 좋기로는 0.05∼10배 중량의 비율로 배합된다.

또 100배 중량 이상이라도 본 발명의 효과를 달성할 수가 있으나, 단위 중량당의 효소활성이 낮아진다.

조성물 중의 완충제의 농도는 1∼100mM, 좋기로는 10∼50mM 이다.

또한 본 발명의 조성물에는 등장화제(等張化劑), 무형제, 보존제 혹은 무통화제 등의 의약품 제제에 통상 함유하는 첨가제를 함유하여도 좋다.

예컨데 무형제는 주사제에 통상 사용하는 것이라면 특별히 한정하지 않는다.

글리아티닌, 젖산, 만니톨, 정제백당, 기시로스등이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 주로 콘도로이티나제를 유효성분으로 하는 주사용 제제 또는 그의 원료로서 사용한다.

용액상의 조성물을 앰플, 바이얼등의 용기에 충진하고 그대로 유통시키며, 혹은 보존하고, 주사제로서 투여에 제공할 수 있고, 또 적당한 용기중에 건조 또는 동결된 조성물을 유통, 보존, 투여시에 주사용 증류수, 생리식염수등에 용해하여, 또는 용해시켜서 투여에 제공할 수도 있다.

이와같은 주사제는 콘도로이티나제를 유효성분으로 하는 주간판에 헤르니아 치료제로서 사용할 수가 있다.

이 치료제를 헤르니아증 환자의 추간판공에 주입하여, 수핵을 용해하여 치료하는 추간판 용해 요법에 사용할 수가 있다.

사용량은 증상, 연령 등에 따라 다르다.

일괄하여 특정할 수는 없으나 콘도로이티나제 ABC의 경우 보통 1회 10∼100U 정도를 주입한다.

또 본 발명에 있어서의 콘도로이티나제 ABC의 역가는 콘도로이틴 황산을 기질로 하여 37℃로 반응시킨 특히 생성되는 자외부에 현저한 흡수를 가지는 불포화 이당류를 흡광 광도법으로 측정함으로써 구할 수 있다.

또한, 콘도로이티나제 ABC의 일단위(U)는 1분간에 불포화이당을 1μM 유리시키는 효소량이다.

다음에 콘도로이티나제의 비이온성계면활성제와로 된 조성물 및 의약에 관하여 설명한다.

본 발명에 있어서 콘도로이티나제에 배합되는 첨가성분은 비이온성 계면활성제 및 완충제이다.

비온성 계면활성제로서는 의약, 특히 주사약으로 허용되는 것이라면 한정되지 않지만, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 수지산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 서당 지방산 에스테르, 혹은 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 프로필렌글리콜등이 바람직스럽다.

폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르로서는 폴리옥시에틸렌솔비탄(중합도 약 20)의 모노라우레이트, 모노팔미틴, 모노올레이트, 또는 트리올레이트등을 들 수가 있다.

시판품으로서는 폴리솔베이트(트윈 80)(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트), 폴리솔베이트 60, 40, 트윈 21, 81, 65, 85등을 들 수가 있다.

폴리옥시에틸렌 경화 피마자유로서는 시판품의 HCO-10, HCO-50, HCO-60등을 들수가 있다.

또, 서당 지방산 에스테르는 시판품의 DK 에스테르 F-160등을 들수가 있다.

폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜로서의 시판품은 플로닉 F-68등을 들수 있다.

완충제로서 생리학상 허용되는 것이라면 전기한 완충제와 같은 것이 사용된다.

특히 인산 나트륨 완충액 및 인산칼륨 완충액이 좋다.

이 완충제에 의하여 수성의학제제의 pH 영역 5∼9, 좋기로는 6∼8로 조정한다.

pH 5 보다 낮은 경우 또는 9보다 높은 경우에는 콘도로이티나제가 활성을 잃거나 용액상태에서 불용물을 생성할 때가 있다.

전기한 첨가성분은 콘도로이티나제 일 중량부에 대하여 비이온성 계면활성제의 0.06 중량부(배량) 이상으로서 효과가 인정되지만, 좋기로서는 0.6∼300중량부(배량)율의 배합이 된다.

또한 실시예에서 원료로 사용하는 정제 콘도로이티나제 ABC용액은 30U/ml=0.1mg/ml 의 농도이었다.

수성 의약제제중의 완충제 농도는 1mM 이상, 좋기로서는 10∼50mM이다.

또한 본 발명의 제제 조성물에 대하여 상기한 바와 같이 등장화제, 부형제, 보존제 혹은 무통화제를 첨가하여 가공하고, 즉 말하는 최종 제형조제할 수 있다.

얻어진 제제는 상기한 조성물과 같이 추간판 헤르니아의 치료제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 정제 콘도로이티나제는 극히 정제도가 높고, 프로테아제, 핵산 및 엔도톡신을 실질적으로 함유함이 없어, 의약품 및 연구용 시약으로서의 유용성이 극히 높다.

즉, 본 발명의 콘도로이티나제를 의약품으로 사용할 때, 보존 안정성이 우수하므로 거의 활성이 저하되지 않는다.

또, 비활성이 높고 불순물을 함유치 아니하여, 투여량을 적게할 수가 있으며, 부작용을 나타내지 않는다.

특히 본 발명의 제제에 있어서 용기와의 콘도로이티나제의 흡착이 방지되어 진동등의 매카니컬 스트레스에 의한 불용물의 생성이 없고, 유효성분의 콘도로이티나제의 안정성을 높일 수 있다.

또, 연구용 시약으로 사용할 경우, 예로서 동물 세포를 사용하는 실험에 있어서, 본 발명의 효소는 엔도톡신 및 프로테아제를 함유하지 않으므로 실험결과의 재현성을 높이는 효과가 있다.

뿐만 아니라 본 발명의 정제법은 종래 필요로 하는 황안 분획, 정제도중의 농축탈염 조작을 생략하였으므로, 정제의 공정수 및 시간을 단축하고, 수율을 향상시킴과 아울러 제조 코스트를 저감시킬 수 있다.

본 발명의 콘도로이티나제 ABC의 제조법에 대하여 실시예를 들어 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

프로테우스·불가리스(NITC 4636, ATCC 6896, IFO 3988)를 종래 알려진 통상의 방법(J.Biol. Chem., 243(7), 1523-1535(1968))으로 배양하여 습균체를 얻었다.

이 습균체 200g에 5mM 인산완충액(pH 6.5∼7.0) 600ml를 가하여 현탁시키고 DYNOMILL로 균체를 파괴하고 원심분리하여 효소추출액을 얻었다.(공정 1)

이 균체 추출액에서 핵산을 제거하기 위하여 황산 프로타민을 사용하였다.

상기 효소추출액에 최종농도 0.5%가 되도록 5% 황산 프로타민 용액을 가하여, 4℃로 약 30분간 교반하고 생긴 침전을 원심분리로 제거하고 상등액을 얻었다. (공정 2)

얻어진 상등액에 약 5배량의 물을 가하여 컬럼크로마토그래피로 정제하였다.

즉, CM 세파로스를 충진한 컬럼에 5mM 인산완충액(pH6.5∼7.0)을 흘려서 평형상태로 한후, 상기 상등액을 흘려 흡착시켰다.

그후, 컬럼을 같은 완충액으로 세정하여 이어서 0.025M 식염을 함유하는 같은 완충액으로 세정하고, 다음에 0.1M 의 식염을 함유하는 상기 완충액으로 용출하여 효소 활성을 가지는 획분을 얻었다. (공정 3)

이 효소 활성 획분에 약 5배량의 물을 가하고, 미리 5Mm 인산완충액(pH6.5∼7.0)으로 평형화한 S-세파로스컬럼에 흡착시켰다.

그후 컬럼을 상기 완충액으로 세정하고, 이어서 0.025M 식염을 함유하는 상기 완충액으로 세정하며, 다음에 0.025 내지 약 0.35M의 식염을 함유하는 상기 완충액으로 농도 구배법에 따라 용출하였다.

용출한 콘도로이티나제 ABC는 단일 밴드(SDS-PAGE)들을 표시하였고, 또한 핵산(DNA), 프로테아제등이 제거되어 있으며, 비활성은 380U/mg 이고, 종래의 콘도로이티나제 ABC에 비하여 비활성은 약 3배정도 이상 높고 고순도의 효소로 되었다.

이 효소용액(인산완충액 (pH 7.0))에 15%가 되도록 폴리에틸렌 글리콜(분자량 4000)을 첨가하고, 실온에서 약 1주간 방지하였던 바 침상 혹은 주상 결정상인 백색 내지 무색의 콘도로이티나제 ABC결정을 생성하였다.

얻어진 결정의 현미경 사진(2.5배)를 제1도로 표시한다.

얻어진 결정은 X선 결정 해석을 한 결과, 사방정계 또는 단사정계의 침상 또는 주상 결정이고, 다음에 결정 파라메터로 표시한다.

시방정계의 경우; 단사정계의 경우;

공간군 P222₁공간군 P2₁

격자정수 a=214Å a=214Å

b=92Å b=56Å

c=56Å c=92Å

α=90° α=90°

β=90° β≥90°(108°정도)

γ=90° γ=90°

이 정제 각 공정에서의 SDS-PAGE의 결과를 제7도 표시한다.

SDS-PAGE는 10%겔을 사용하여 상법(Laemmli, U.K. Nature, 227, 680-685(1970))에 따라 행하였다.

S-세라로스 처리하면, 비환원 및 환원 상태에서의 명료한 단일의 밴드로 되어 있다.(제7도, C,D 참조)

본 발명의 각 공정에 있어서의 콘도로이티나제 ABC의 정제도를 나타내면 표 3과 같다.

[표 3]

또 각 공정에 있어서의 엔도톡신의 함량 및, 프로테아제 잔존량을 표 4에 표시한다.

[표 4]

* 콘도로이티나제 ABC100단위(U)당의 엔도톡신함량: 톡신칼라시스템(생화학공업주식회사제)를 사용하여 측정. EU는 엔도톡신단위(Eudotoxin Unit)를 나타냄

** FITC는-카제인을 기질로 하여 측정

공정 4로 얻어진 효소용액중의 엔도톡신 함량은 상기와 같이 5.0pg/100U 정도의 극미량으로 실질적으로는 함유되어 있지 않으며, 또 핵산(DNA)에 있어서도 슬래슈볼드법(DNA 측정장치; 슬래슈볼드(몰레큘라 디하이스사 제))으로 측정하였으나, DNA는 검출되지 아니하였다.(검출한계이하)

또 본 발명의 공정 4로 얻어진 상기 콘도로이티나제 ABC를 용액상태에서 각 온도로 방치하였을때의 안정성을 표 5로 표시한 350U/ml의 농도로 5일간 보존하여 -40℃로 보존하였을때의 활성을 100%로 하여 상대활성을 표시함.

[표 5]

[실시예 2]

실시예 1에서 사용한 프로테우스·불가리스(NCTC 4636, ATCC 6896, IFO 3988)의 습균체 7.5Kg을 10% 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르(POELE: Nikkol BL-9EX(상품명))를 첨가한 40mM 인산 완충액(pH 7.0±0.5) 약 15ℓ와 정제수 약 7.5ℓ와를 넣은 탱크에 투입하여 교반하여 균체 현탁액으로 하였다.

이 균체 현탁액을 35℃±3℃로 가온하고, 같은 온도에서 약 2시간 교반하였다.

약 2시간 경과후, 20mM 인산완충액(pH 7.0±0.5) 약 30ℓ를 가하여 희석하고 액온이 20℃가 될때까지 현탁액을 냉각하였다.

이 현탁액을 샤프레스 원심 분리기로 원심분리하고 그 원심상층액을 얻었다.

원심의 전후의 온도를 측정하여 20℃를 넘지않게 하였다.

얻어진 원심 상층액에 2∼15℃로 냉각한 정제수 30ℓ를 가하여 희석하고, 이를 CM-세파로스컬럼(겔량 약 5ℓ)에 통하고 콘도로이티나제 ABC를 컬럼에 흡착시켰다.

이 컬럼에 정제수 1L를 통하여 컬럼을 세정하고, 다시 0.5% POELE 수용액 10, 0.04M 인산완충액(pH 6.2±0.2) 5ℓ를 통하여 컬럼을 세정하였다.

이어서 이 컬럼에 0M 및 0.25M의 NaCl 함유한 0.04M 인산완충액(pH 6.2±0.2) 약 10ℓ씩을 사용하여 리니얼 그래피엔트로용액을 흘려서 콘도로이티나제 ABC를 용출하였다.

이 용출액을 구경 0.22㎛의 여과멸균필터를 통하여 멸균용기에 모아서 콘도로이티나제 ABC효소용액을 얻었다.

POELE에 의한 균체 추출시간(hr)과 효소 활성과의 관계를 나타내면 다음 표 6과 같다.

[표 6]

균체에서의 콘도로이티나제 ABC의 추출은 1∼2시간으로 효소농도가 평형에 달한다.

또 추출액의 전 핵산량은 교반후 0.25시간의 동안이 최고로 되고 (약 25g), 그후 저감되어 약 1시간 후는 평형(약 2-3g)에 달하였다.

[실시예 3]

실시예 1에서 사용한 프로테우스·불가리스(NCTC 4636, ATCC 6896, IFO 3988)의 습균체 5Kg은 5%의 POELE를 가한 5배 용량의 20mM 인산완충액(pH 7.0)에 가하여 37℃로 3시간 추출하였다.

이 추출액을 실시예 1과 같이 프로타민 처리, CM-세파로스 처리 및 S-세파로스처리를 하여 (이들 조건은 표 7에 표시함), 그라비엔드용출에 의하여 콘도로이티나제 ABC를 용출하였다.

이 용액은 전기영동(SDS-PAGE)으로 콘도로이티나제 ABC의 단일의 밴드를 나타내었다.

이 효소용액을 송액펌프를 사용하여 구경 0.22㎛의 여과 멸균필터를 통하여 여액을 멸균용기에 모아서 콘도로이티나제 ABC효소액으로 하였다.

그 결과 표에 따라 산출하면 균체 1g 당 약 500U의 콘도로이티나제 ABC를 추출할 수가 있었다.

다음에 실시예 3의 각 공정에서의 콘도로이티나제 ABC의 정제도를 나타내면 표 7과 같다.

[표 7]

1)은 동결균체에서의 회수율, 다른 것은 프로타민 처리후의 액에서의 회수율

또 이 균체에서 콘도로이티나제 ABC의 추출시간과 콘도로이티나제 ABC의 활성도와의 관계를 제8도에 표시함.

[실시예 4]

실시예 3과 같이 하여 계면활성제로서 트리톤, 브리지, 노니데트, 혹은 POELE를 사용하여, 그 농도를 2% 혹은 5%로 하고, 현탁액의 온도를 25℃ 혹은 30℃에서 콘도로이티나제 ABC의 추출을 하였다.

그 결과는 제9도내지 제12도에 표시하였음.

어느 경우에서나 37℃ 기온하, 계면활성제 농도 5% 로 행한때가 추출액의 활성이 높고, 약 1∼2시간에서 거의 활성이 추출되었다.

[실시예 5]

글라스 및 플라스틱용기에의 흡착방지효과(용액); 실시예 1과 같은 방법으로 제조한 콘도로이티나제 ABC(비활성 300U/mg) 5단위(U)를 함유하는 용액에 표 1 및 2에 표시된 바와같이 정제 젤라틴(산처리젤라틴), 인(人)혈청 알부민(HSA) 또는 소혈청 알부민(BSA)를 효소단백질의 0.001∼100배량 첨가하고, 다시 50mM 인산칼륨염 완충액으로 pH를 7.0으로 조정하고 용액상의 콘도로이티나제 ABC조성물을 얻었다.

이 용액을 글래스제 및 플라스틱(폴리프로필렌) 제 바이얼병에 넣어 4℃, 24시간 보존후의 용액중에 효소활성을 측정하여 용기에의 흡착방지효과를 조사하였다.

글라스제 바이얼병에서의 효과를 표 8에, 플라스틱제 바이얼병에의 효과를 표 9로 나타냄.

또 결과는 보존 전의 용액중의 활성에 대한 보존후의 활성의 백분율로 표시하였다.

[표 8]

[표 9]

[실시예 6]

[재용해시의 불용물 생성방지효과 및 활성보존효과(냉동건조물)]

실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 콘도로이티나제 ABC(비활성 380U/mg) 50단위를 함유하는 용액에 표 10 및 11에 표시되는 물질을 효소단백질의 0.001∼10배 양 첨가하고, 또한 인산나트륨염 완충액으로 pH 를 6.5(20mM)로 조정하였다.

이 용액에 무형제로서 글리아티닌(10mg/ml)을 가하여 바이얼병에 넣어 동결 건조하여 건조물 상의 콘도로이티나제 ABC조성물을 얻었다.

이 조성물을 바이얼병중, 40℃로 1개월 보존하여, 보존 후의 조성물의 성상을 관찰하였더니, 착색 및 분해등의 이상이 없었다.

또, 주사용수를 가하여 재용해시의 성상을 관찰하고, 나아가 활성을 측정하여 첨가제의 활성 보존효과를 조사하였다.

그 결과를 표 10 및 표 11로 표시한다.

또한 표 10은 재용해시의 불용물의 생성의 유무를 육안적으로 관찰한 결과이고, 표 11의 결과는 보존전의 활성에 대한 보존후의 활성을 백분율로 표시하였다.

또 상기와 같은 방법으로 글리아티닌을 첨가치 않는 조성물(콘도로이티나제 ABC(비활성 380U/mg) 50단위: HSA, 효소단백량의 0.05배량)도 제조하고, 같은 방법으로 보존 후의 성상 및 활성을 측정하였으나, 액상은 무색투명, 활성의 잔존율은 80% 이었었다.

[표 10]

[표 11]

이상의 실시예의 실험결과에서 젤라틴, HSA, BSA를 정제 콘도로이티나제에 배합하여 용액상태로 pH를 거의 중성부근에 조정하면, 정제 콘도로이티나제의 용기에의 흡착이 방지되고 용해후 무색 투명한 상태가 되며, 또한 보존후의 활성율 저하시킴이 없이 유지할 수가 있다.

이 결과는 특히 젤라틴, HSA, BSA를 정제 콘도로이티나제 효소단백질의 0.05∼10배양 사용한 때가 현저하게 나타났다.

또 이때 실시예에 표시한 바와같은 고도로 정제되고 비활성이 높은 콘도로이티나제 ABC를 사용하여 이를 젤라틴, HSA, BSA과 같이 pH 5∼9, 좋기로는 6∼8의 인산나트륨염 완충액에 용해하여(인산나트륨염 완충액 농도로서는 10∼50mM)동결 건조하여 얻어지며, 용해상태로 한때에 전기 pH 의 범위가 되는 콘도로이티나제 조성물을 사용하는 것이 바람직하다.

[실시예 7]

글라스용기에의 흡착방지효과:

콘도로이티나제 ABC0.4 단위 및 4단위를 0.1 M 염화나트륨 수용액에 녹아서, 폴리 솔베이트 80을 효소단백량(1.33∼13.3㎍)의 0.075내지 70배양 첨가하고, 다시 인산완충액으로 pH 6.9로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약제제를 얻었다.

이 앰플으 20℃, 20시간 보존후의 역가를 측정하여 용기에의 흡착방지효과를 조사하였다.

그 결과를 표 12에 표시한다.

[표 12]

[실시예 8]

진동에 의한 불용물 생성 방지 효과;

콘도로이티나제 ABC40단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹여서 표 13에 표시하는 바와같은 물질을 효소 단백량(133㎍)의 0.0075 내지 7.5 배양 첨가하고, 다시 인산완충액으로 pH를 6.9로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하였다.

이 앰플을 진동(진동항온기, 160회/분, 8시간)후 불용성 생성의 유무를 관찰하였다.

그 결과를 표 13에 표시한다.

[표 13]

[실시예 9]

수송중의 진동에 의한 불용물 생성방지효과:

콘도로이티나제 ABC5단위를 0.1M 염산나트륨 수용액에 녹여서 폴리솔베이트 80을 효소단백량(16.7㎍)의 0.06∼6.0배량 첨가하고, 또한 인산완충액으로 pH를 6.9에 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하였다.

이 앰플을 트럭에 의해 수송 (수송온도 25℃이하, 수송기간 7일간) 후의 불용물 생성의 유무를 관찰, 그 결과를 표 14에 표시한다.

[표 14]

[실시예 10]

수송중의 진동에 의한 불용물 생성 방지효과;

콘도로이티나제 50(47.1 내지 53.6) 단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹여서 폴리솔베이트 80을 효소단백량(167㎍)의 0.0060 내지 0.60 배량 첨가하고, 또한 인산완충액으로 pH를 6.9로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하였다.

이 용액을 트럭으로 수송(수송온도 25℃이하, 수송기간 7일간)후의 불용물 생성의 유무를 관찰하였다.

그 결과를 표 15로 표시한다.

[표 15]

[실시예 11]

수송중의 진동에 의한 불용물 생성방지효과;

콘도로이티나제 ABC140단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹이고, 폴리 솔베이트 80을 효소단백량(467㎍)의 32배량 첨가하고, 또한 인산완충액으로 pH를 6.9에 조정한 용액을 글라스제앰플에 충진하였다.

이 앰플을 트럭으로 수송(수송온도 22.6℃ 이하, 수송기간 16일간) 후의 불용물 생성의 유무를 관찰하고, 역가를 측정하며, 잔존율을 측정, 그 결과를 표 16 및 표 17로 표시한다.

[표 16]

[표 17]

[실시예 12]

수송중의 진동에 의한 불용물 생성방지효과;

콘도로이티나제 ABC5단위를 0.1M 염화 나트륨용액에 녹이고, 폴리솔베이트 80을 효소단백량(16.7㎍)의 30∼300배량 첨가하고, 다시 인산완충액으로 pH를 6.9로 조정한 용액을 글라스제앰플에 충진하였다.

이 앰플을 트럭으로 수송(수송온도 11.7℃이하, 수송기간 19일간) 후의 불용물 생성의 유무를 관찰하고, 역가를 산출하며 잔존율을 산출하였다.

그 결과를 표 18 및 표 19로 표시한다.

[표 18]

[표 19]

[실시예 13]

수송중의 진동에 의한 불용물 생성방지효과;

콘도로이티나제 ABC50단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹이고, 폴리솔베이트 80을 효소단백량(167㎍)의 3.0∼30배량 첨가하고, 또한 인산완충액으로 pH를 6.9로 조절한 용액을 글라스제 앰플에 충진하였다.

이 앰플을 트럭으로 운송(운송온도 11.7℃이하, 수송기간 19일간) 후의 불용물 생성의 유무를 관찰하고, 역가를 측정하여 잔존율을 산출하여 그 결과를 표 20 및 표 21에 표시한다.

[표 20]

[표 21]

[실시예 14]

콘도로이티나제 ABC30단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 용해하고, 프로닉크 F 68을 효소첨가량(100㎍)의 15배량 첨가하고, 다시 인산완충액으로 pH 7로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약 제제를 얻었다.

콘도로이티나제 ABC80단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹이고, HCO-60을 효소첨가량(267㎍)의 15배량 첨가하여 이에 인산완충액으로 pH 7로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약제제를 얻었다.

콘도로이티나제 ABC30단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹이고, 폴리솔베이트 80을 효소첨가량(100㎍)의 15배량 첨가하여 이에 인산완충액으로 pH 7로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약제제를 얻었다.

콘도로이티나제 ABC60단위를 0.1M 염화나트륨수용액에 녹이고, 폴리솔베이트 80, 프로니크 F 68을 각각 효소첨가량(200㎍)의 7.5배량씩을 첨가하고 이에 다시 인산완충액으로 pH 7로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약제제를 얻었다.

콘도로이티나제 ABC50단위를 0.1M 염화나트륨 수용액에 녹이고, HCO-60, DK 에스테르 F-160을 각기 효소첨가량(167㎍)의 7.5배량 첨가하고, 이에 다시 인산완충액으로 pH 7로 조정한 용액을 글라스제 앰플에 충진하여 의약제제를 얻었다.

Claims

다음의 특성을 가지는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 유래의 정제 콘도로이티나제 ABC (i) 분자량이 SDS-폴리아크릴아미노겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 측정(환원 및 비환원의 어느 것에 있어서도) 및 겔여과법에 의한 측정에서 약 100,000탈톤임. (ii) 등전점이 pH 8.2±0.1 내지 pH 8.5±0.1 임. (iii) 최적 pH는 8.0∼8.2(기질:콘도로이틴황산 C, 완충액:도리스 염산완충액), 최적온도는 37℃임. (iv) Zn²⁺, Ni²⁺, Fe³⁺,및 Cu²⁺에 의하여 활성이 저해됨. (v) N 말단 아미노산이 알라닌이고, C 말단 아미노산이 플로린임. (vi) SDS-PAGE 에 의해 단일의 밴드를 나타내며, 고속액체 크로마토그래피-(겔여과 및 가티온 교환)에 있어서도 단일의 피크를 나타냄. (vii) 엔도톡신은 공지의 검출방법으로는 검출되지 않고, 핵산, 프로테아제 함량은 검출한계 이하임. (viii) 결정화 되기 쉬움 (ix) 비활성이 300U/mg 이상임.
콘도로이티나제 ABC생산균체인 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 콘도로이티나제 ABC를 추출하고 추출액을 정제함을 특징으로 하는 제1항 기재의 정제콘도로이티나제 ABC의 제조방법.
제2항에 있어서, 추출을 계면활성제 용액을 사용하는 정제콘도로이티나제 ABC의 제조방법.
다음 공정으로 된 제1항의 정제 콘도로이티나제 ABC의 제조방법. (i) 콘도로이티나제 ABC의 생산균체인 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 효소추출액을 얻는 공정(공정 1) (ii) 얻어진 효소추출액에서 핵산을 제거하는 공정(공정 2) (iii) 핵산이 제거된 효소추출액을, (a) 약가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여서 콘도로이티나제 ABC를 흡착시켜 흡착된 그 효소를 용출시키고, 용출액을 강가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피처리를 행하여서 콘도로이타제 ABC를 흡착, 용출시키는 공정(공정 3-1) 또는 (b) 강가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피처리를 하고 콘도로이티나제 ABC를 흡착, 용출시켜, 용출액을 약가티온 교환수지를 사용하여 크로마토그래피처리를 하여 콘도로이티나제를 흡착, 용출시키는 공정(공정 3-2).
제4항에 있어서, 공정 3-1 또는 3-2에 있어서, 약가티온 교환수지로서 교환기가 카르복시 알킬기인 수지를 사용하며, 강가티온교환수지로서는 교환기가 설포알킬기인 수지를 사용하는 정제 콘도로이티나제 ABC의 제조방법.
제4항에 있어서, 공정 1에서 콘도로이티나제 ABC생산균체를 계면활성제 용액을 사용하여 추출하고 효소추출액을 얻는 정제콘도로이티나제 ABC의 제조방법.
다음의 공정에 의한 제1항에 기재된 정제 콘도로이티나제 ABC의 제조방법. (i) 콘도로이티나제 ABC생산균체인 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 계면활성제 용액을 사용하여 추출하고 효소 추출액을 얻는 공정. (ii) 얻어진 효소 추출액을 약가티온 교환수지 또는 강가티온 교환수지의 어느 하나를 사용하여 크로마토그래피 처리를 하여서 콘도로이티나제 ABC를 그 수지에 흡착시키는 공정. (iii) 그 수지에 흡착된 콘도로이티나제 ABC를 용리액의 이용강도를 연속적으로 변화시켜서 용출하는 공정.
제1항의 특성과 침상 또는 주상 결정인 콘도로이티나제 ABC결정.
제8항에 있어서, 양 말단이 수산기인 구조를 가지는 폴리에테르를 사용하여 결정화시킨 콘도로이티나제 ABC결정.
제1항에 있어서, 다음의 결정 바로메터를 나타내는 사방정계 또는 단사정계의 콘도로이티나제 침상 또는 주상결정.

시방정계의 경우; 단사정계의 경우;

공간군 P222₁공간군 P2₁

격자정수 a=214Å 격자정수 a=214Å

b=92Å b=56Å

c=56Å c=92Å

α=90° α=90°

β=90° β≥90°

γ=90° γ=90°
제1항의 콘도로이티나제 ABC와 혈청알부민 또는 젤라틴과로된 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항에 있어서, 용액상태로 하였을때 pH 5∼9를 나타내도록 조정되어 있는 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항 또는 제12항의 어느 한항에 있어서, 콘도로이티나제가 비활성 300U/mg 이상의 정제콘도로이티나제 ABC인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항 내지 제12항의 어느 한항에 있어서, 콘도로이티나제에 대하여 적어도 0.001 배 중량의 혈청 알부민 또는 젤라틴을 함유하는 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항 내지 제12항의 어느 한항에 있어서, 정제 콘도로이티나제가 비활성이 300U/mg 이상이고, 엔도톡신은 공지의 검출방법으로는 검출되지 않으며, 핵산, 프로테아제 함량은 검출 한계 이하인 정제 콘도로이티나제 ABC인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항 내지 제12항의 어느 한항에 있어서, 용액 또는 건조물인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제11항 내지 제12항의 어느 한항에 있어서, 용액 상태에서 pH 5∼9를 나타내고 1∼100mM의 생리학상 허용되는 완충제를 함유하는 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제17항에 있어서, 완충제가 염산, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 인산, 인산 2 수소칼륨, 인산수소 2칼륨, 인산 2수소나트륨, 인산수소 2나트륨, 아미노초산, 안식향산 나트륨, 구연산, 구연산나트륨, 초산, 초산나트륨, 주석산, 주석산나트륨, 젖산, 젖산나트륨, 에탄올아민, 알기닌 및 에틸렌 디아민에서 된 군에서 선택된 성분을 함유하는 완충제인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제1항의 콘도로이티나제 ABC와 혈청 알부민 또는 젤라틴으로된 조성물을 함유하는 척추·추간판 헤르니아 치료용 주사제.
제11항에 있어서, 비온성 계면활성제를 배합하고, 용액상태에서 pH 5∼9를 나타내도록 조정된 콘도로이티나제를 함유하는 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제20항에 있어서, 콘도로이티나제의 비활성이 300U/mg 이상인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제20항에 있어서, 비온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르인 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.
제20항에 있어서, 비활성이 300U/mg 이상의 콘도로이티나 제1중량부에 대해, 비온성 계면활성제 0.6∼300 중량부를 가하고 10∼50mM 인산완충액으로 pH 6∼8로 조정한 척추·추간판 헤르니아 치료용 조성물.