KR100268828B1 - 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 감작하여 만든 hdp를 이용한 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약 - Google Patents

신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 감작하여 만든 hdp를 이용한 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약 Download PDF

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Abstract

본원은 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 감작하여 만든 HDP를 이용한 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원이 고농도 입자(High Density Particle, 일본 AT ＆ T사 제품, 등록상표)에 짐작되어 있는 입자를 0.005∼2.000％(w/v)g함유한 수성 현탁액인 것으로 신놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약을 개시한다. 또한 그의 제조방법도 개시한다. 본 발명의 진단시약에 의해 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자를 신속하고 용이하게 진단할 수 있다.

Description

신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 감작하여 만든 ＨＤＰ를 이용한 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약
본 발명은 최근 발견된 분야비리다에과(Bunyaviridae family) 한타바이러스 속(Hantavirus genus)의 새로운 혈청형인 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus) 또는 뉴욕 바이러스(New York virus)에 감염된 한타바이러스 폐증후군(Hantavirus Pulmonary syndrome) 환자의 진단용 시약에 관한 것이며 상세하게 기술하면, 혈청 검사로 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 고농도 입자(High Density Particle, AT ＆ T사 등록상표, 이하, "HDP"라 한다)에 감작시킨 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP를 이용하여 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자를 신속하고 용이하게 진단할 수 있는 진단용 시약에 관한 것이다.
신 놈브레 바이러스는 1993년에 미국에서 발견된 한타바이러스의 새로운 혈청형이다. 이 바이러스의 발견은 미국의 인디안 건강 지원 센터(Indian Health Service, 이후 IHS)의 질병분포에 정통한 한 임상의의 조사에서 시작되었다. 1993년 5월, 이 임상의는 불규칙적인 호흡 곤란 증세로 입원한 환자를 치료하게 되었는데, 이후, 미국의 뉴멕시코주 건강 조사국(Office of Medical Investigation, OMI)에서 유사한 증세를 보이는 4명의 환자를 추가적으로 확인하였다. 동년 IHS와 뉴멕시코주의 보건부는 미국 질병예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention, 이후 CDC)에 협조를 요청하여 CDC의 역학자들이 조사를 진행하였다. 초기 환자의 조사에서 이 질병은 건강한 젊은이에서 발견되었으며, 처음 열과 근육통 그리고 비특정 증세들이 수반되는 점을 확인하였다. 갑작스런 폐수종(interstitial pulmonary edema)으로 증세가 악화되어 호흡곤란이 신속히 진행되어 약 70%의 치사율을 나타내었다. 다른 신체조직에서는 환자가 심한 쇼크를 일으켜도 큰 변화는 없었다. 백혈구 증가는 없었으며, 경미한 신부전의 증세가 보였다. 유사한 증세의 환자가 미국 남서부의 광대한 지역에서 발생하였으며, 현재까지 미국에서만 150여명의 환자가 발생하고 67명이 사망하였다. CDC에서는 즉시 원인물질과 독성 물질에 대한 광범위한 조사를 시행하였고, 동시에 질병의 유행지역의 역학반 이외에 임상-역학적 연구를 촉진하기 위해 역학자를 파견하여 환자로 판단되는 사람의 혈청에서 한탄바이러스 및 서울바이러스와 교차 반응을 하는 항체가 증명되었다.
한탄바이러스는 음성 가닥RNA(negative-stranded RNA) 바이러스이다. 한타바이러스 및 서울바이러스에 의한 질병은 신증후 출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)이라 불리며, 이 질병은 우리 나라에 많이 서식하고 있는 등줄쥐와 집쥐 등의 배설물중에 바이러스가 있으며, 여기에 섞여 있던 바이러스가 마르면서 공기중에 떠돌아다니다가 사람의 호흡기로 전염된다. 처음에는 감기와 비슷한 증상이 나타나고, 이어서 높은 열, 두통, 복부와 등의 통증, 출혈증세, 신부전 등으로 이어져 심한 경우에는 사망하게 된다. 한타바이러스에는 원조인 한탄바이러스(Hantaan virus)를 비롯하여 푸우말라(Puumala), 프로스펙트 힐(Prospect Hill), 서울(Seoul)바이러스, 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus), 뉴욕 바이러스(New York virus) 등이 있다. 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스의 숙주는 미국에서 서식하는 사슴쥐(deer mouse,Peromyscus maniculatus)임이 증명되었다.
미국에서 발생한 질병과 바이러스의 분포를 표시한 지도를 참조하면 신 놈브레 바이러스의 숙주인 사슴쥐의 광범위한 분포는 미국의 여러 지역에서 한타바이러스 폐증후군 환자가 발생할 수 있다는 점을 제시한다.
한타바이러스의 혈청형 숙주 발생지 질병
한탄서울푸우말라벨그라드프로스펙트 힐토타팔라얌신 놈브레 Apodemus agrarius Rattus norvegicus Clethrionomys glareolus A. flavicollis Microtus pennsylvanicus S. murinus P. maniculatus 아시아아시아유럽유고슬라비아미국인도미국 중증중등도약함, 없음중증불명불명중증
본 발명에 사용하고자 하는 신 놈브레 바이러스는 상기 서술한 대로 1994년 한탄바이러스의 새로운 혈청형으로 분류되었으며, 분류 초기에는 퍼 코너 바이러스[Four corner virus(FCV)], 뮤르토 캐년 바이러스(Meurto canyon virus) 등으로 명명되었다가 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus, SNV)로 최종 명명되었다. 기존의 한타바이러스에 의한 신증후 출혈열 환자가 고열, 두통, 복통과 요통, 출혈증세, 신부전 등으로 이어져 사망하게 되는데 비해, 이 신 놈브레 바이러스에 의한 질병인 한타바이러스 폐증후군(Hantavirus Pulmonary Syndrome, HPS)은 폐수종과 호흡곤란 증세를 보여 사망하게 되며, 치사율은 약 60%에 이른다.
HFRS와 마찬가지로 한타바이러스 폐증후군은 임상 소견만으로 진단하는 것이 힘들 때가 많다. 종래의 진단법으로는 형광항체법 및 효소항체법이 상용되었다. 그러나, 이들 모두 특이성, 감도에 대해서는 만족스러우나, 양자 모두 조작이 번잡하고, 시간이 많이 소요되며, 또한, 특수한 기기가 필요하기 때문에 실제의 임상검사에 응용하기 어려운 결점이 있다. 이 때문에, 간단하고도 신속하게 신 놈브레 바이러스에 감염되어 있는지의 여부를 진단하는 기술의 개발이 요망되고 있다.
본 발명자는 이러한 문제를 해결하기 위하여 오랫동안 각종 진단시약 및 진단법의 개발에 종사하여 왔으며, 한타바이러스 감염의 진단법 개발에 대하여 예의 연구하여 왔다. 그 결과, 한타바이러스 항원을 마우스 또는 랫트 뇌에 감염시킴으로서 고역가의 항원이 얻어진다는 것과, 이 한탄바이러스 항원을 정제하여 HDP에 감작시킨 감작 HDP를 수성 현탁액으로 한 시약에 의하여 감도가 양호하고, 신속하게 신증후 출혈열을 진단할 수 있음을 발견하고, 이를 한타디아(녹십자사의 등록상표)라는 제품으로 신증후 출혈열 환자의 진단에 사용하고 있다. 이러한 기술을 바탕으로 본 발명자는 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 감작시킨 HDP를 이용하여 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약 조제를 시도하여 본 결과, 양호한 결과를 얻을 수 있음을 발견하고, 이를 기초로 하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 신 놈브레 바이러스를 HD0P에 감작시켜 특수한 기기를 사용하지 않고도 간단하고, 신속하게 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바리어스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자의 혈청진단용 시약을 제공하는데 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단에 사용되는 시약은 신 놈브레 바이러스 항원이 HDP에 감작되어 있는 감작 불용성 입자를 0.005∼2.000%(w/v)의 범위로 함유한 수성 현탁액으로서 구성된다.
본 발명에 이용한 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스는 본 출원의 발명자중 1인이며, 출원인의 1인인 이 호황 명의로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, KRIBB)에 1998년 1월 8일자로 국제기탁번호 KCTC 0422BP 및 KCTC 0423BP로기탁되었다.
본 발명에 사용하는 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원은 감염동물(햄스터, 몽고리안 저빌, 마우스, 쥐)의 장기, 감염세포, 조직 배양 세포 등으로부터 조제할 수 있다. 수량, 안정성 등의 면에서, 감염된 포유동물 햄스터의 폐조직세포, 뇌세포로부터 조제하는 것이 바람직하며, Vero E6 클론 세포(ATCC Vero clone C1008), A549(사람 폐암세포), J77(마우스 단구/마크로파아지), HLF(사람 태아 폐 섬유아세포), L929(마우스 결합조직), MRC5(사람 태아성 폐 섬유아세포) 세포 등에서도 필요한 바이러스 항원을 얻을 수 있다. 상기 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원의 조제는 특별히 한정되지 않으며, 상기 동물, 특히 작은 포유동물을 사용하여 기타의 항원을 조제하는 방법과 기본적으로 같은 방법으로 조제할 수가 있다.
가장 바람직하게 채용할 수 있는 방법중 대표적인 것으로 젖먹이 햄스터의 폐조직세포로부터 조제하는 방법을 예시하면 다음과 같다. 즉, 젖먹이 햄스터의 뇌내에 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스를 접종 감염시키고, 이 감염 폐조직에서 얻은 조직 유제를 저온에서 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 에탄올과 황산프로타민으로 처리한 후, 고속 원심분리하여 상층액을 취하고, 초원심분리하고, 포르말린으로 불활성화한 후, 이 포르말린을 투석하여 제거함으로서 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 얻는 방법을 들 수가 있다.
본 발명에 관계되는 불용성입자는 공지의 소수성 폴리머 입자와 무기화합물 입자 및 적혈구 등을 적절하게 사용할 수 있다. 예를 들면 소수성 폴리머 입자로서는 구조식 1과 2를 들 수 있다.
다음 식[I]
(식중, R1은 수소 원자 또는 알킬기이며, R2는 할로겐 원자, 치환 또는 비치환의 페닐기, 알콕시카르보닐기, 아실옥시기, 알콕시기 또는 시아노기를 나타낸다)로 표시되는 모노머 단위 및/또는
다음 식[II]
(식중, R3은 수소 원자 또는 알킬기를 나타낸다.)로 표시되는 모노머 단위를 갖는 소수성 폴리머의 입자를 들 수가 있다. 상기한 R2로서의 페닐기의 치환기는 특히 한정되지는 않으나, 할로겐 원자, 할로알킬기, 알킬기 등을 들 수가 있다. 그리고, 이들 중에서도 R2가 치환 또는 비치환 페닐기, 염소 원자, 또는 알콕시카르보닐기인 모노머 단위가 바람직하다.
전기 식[Ⅰ]로 표시되는 모노머 단위를 이루는 단량체로서는, 예를 들어, 스티렌, 비닐톨루엔, 클로로메틸스티렌, 클로로스티렌, 염화비닐, 브롬화비닐, 메틸메타크릴레이트, 에틸메타크릴레이트, 프로필메타크릴레이트, 아세트산비닐, 에틸비닐에테르, 프로필비닐에테르, 부틸비닐에테르, 아크릴로니트릴, 메타아크릴로니트릴 등을 들 수가 있다. 그리고, 이들 중에서도 바람직한 것은, 스티렌, 비닐톨루엔, 클로로메틸스틸렌, 염화비닐, 메틸메타크릴레이트, 에틸메타크릴레이트이다.
전기[Ⅱ]식으로 표시되는 모노머 단위를 이루는 단량체로서는, 예를 들어 글리시딜아크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트 등을 들 수가 있다.
또, 전기 식[Ⅰ]로 표시되는 모노머 단위 및 전기식 [Ⅱ]의 모노머 단위를 갖는 소수성 폴리머 입자에 있어서는, 전기 [Ⅱ]식으로 표시되는 모노머 단위의 함유량을 폴리머 입자 중에 0.01∼20몰%, 바람직하게는, 0.05∼5몰%이 되는 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.
또, 소수성 폴리머 입자는, 진단용 시약의 성질에 악영향을 미치지 않는 범위, 예를 들어, 20몰% 이하의 범위에서 전기 식[Ⅱ] 이외의 친수성 비닐계 모노머 단위를 함유하고 있어도 좋다.
친수성 비닐계 모노머 단위를 이루는 단량체로서는, 예를 들어, 메타크릴산, 아크릴산, 스티렌설폰산, 스티렌설폰산나트륨, 2-히드록시에틸(메타)아크릴레이트, 비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜(메타)아크릴산에스테르 등을 들 수가 있다.
또, 소수성 폴리머 입자에는, 디비닐벤젠, 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 디에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 비스페놀 A-디글리시딜에테르 등의 가교성 단량체도 함유시킬 수가 있다. 이상에서 서술한 소수성 폴리머 입자를 얻기 위한 중합방법은, 공지의 소위 라텍스 입자의 제조 방법을 채용할 수가 있으며, 예를 들어, 일본국 특개 소59-1503호에 기재한 방법을 들 수가 있다. 본 발명에 관계되는 소수성 폴리머 입자의 평균 입경은, 0.01∼10㎛, 바람직하게는, 0.05∼5㎛이다.
소수성 폴리머 입자의 형상은, 다면체, 주체(柱體), 양추체(兩錐體), 구체(球體) 등 특히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 구체(球體), 더욱 바람직하게는 진구체(眞球體)이다. 전기 무기 화합물 입자로서는, 공지의 것을 적절하게 사용할 수가 있으며, 예를 들어, 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아, 산화제2철, 사삼산화철, 산화코발트, 산화니켈 등의 주기율표 제Ⅲ족, 제Ⅳ족 또는 제Ⅵ족의 금속의 산화물; 수산화알루미늄, 수산화제2철, 수산화크롬 등의 수산화물; 브롬화은, 염화은 등의 할로겐화뮬; 황화카드뮴 등의 황화물; 탄산칼슘, 탄산마그네슘 등의 탄산염; 황산바륨, 황산스트론튬 등의 황산염 등을 들 수가 있다.
그리고, 이들 중에서도 바람직한 것은, 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아 또는 이것들을 주요 구성 성분으로 하는 복합 산화물이다.
또, 무기 화합물 입자로서, 실리카와 결합 가능한 주기율표(제Ⅰ족, 제Ⅱ족, 제Ⅲ족 및 제Ⅳ족으로 되는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 금속산화물과 실리카를 주요 구성 성분으로 하는 무기 산화물을 사용할 수도 있다. 그 무기 산화물의 구체예로서는, 예를 들어 산화리튬, 산화나트륨, 산화칼륨, 산화마그네슘, 산화칼슘, 산화스트론튬, 산화바륨, 산화알미늄, 산회티타늄, 산화지르코늄, 산화게르마늄, 산화하프늄, 산화주석, 산화아연 등을 들 수가 있다.
또, 본 발명에 관계는 무기 화합물 입자에 있어서는, 이와 같은 재질로 되고, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한, 특히 그 무기 화합물 입자의 구조를 제한하는 것은 아니며, 전기 재질로서 되는 입자라도 좋고, 또 그 입자를 핵으로 하고, 그 핵을 1 또는 2 이상의 층, 예를 들어 후술하는 염료를 함유하는 색소층 등으로 피복하여서 되는 무기 화합물 입자라도 좋다.
무기 화합물 입자의 평균 입경은 0.1-10.0㎛ 바람직하게는 0.8-5.0㎛이다.
무기 화합물 입자의 비중은 통상 1.5-4.0, 바람직하게는 1.8내지 2.5이다.
또, 이와 같은 무기 화합물 입자 중에서도 특히 바람직한 것은 전기 재질, 예를 들어, 실리카를 주요 구성 성분으로 하는 복합 산화물을 핵으로 하고, 그 핵을 후술하는 염료를 함유하는 색소층으로 피복하고, 필요에 따라, 그 위에 전기 복합산화물로 피복하고, 그 표면을 실란커플링제, 티탄커플링제 등으로 처리함으로서 그 표면에 반응기를 가지도록 한 무기 복합체 입자로, 그 평균 입경이 0.1∼10.0㎛이며, 또 비중이 1.5-4.0인 소위 고 비중 복합체 입자(이하, "HDP"라 한다.)이다.
더욱이 본 발명에 있어서는, 전지 무기 화합물 입자의 입자 분산성이 80%이상 바람직하게는 90% 이상인 것이 적합하다. 본 발명에서 말하는 입자 분산성이란, 전 입자 중에서 차지하는 비응집 입자, 즉, 단일 입자의 개수의 비율(%)이며, 통상, 콜터카운터사제 모델 ZD-1에 의하여 측정할 수가 있다. 무기 화합물 입자의 형상은, 사용되는 무기 화합물이 결정 구조, 제법에 따라 상이하며, 다면체, 주체(主體), 양추체(兩錐體), 구체(具體)등이 존재하고, 이들 전부가 사용 가능하나, 바람직하게는 구체, 특히 바람직하게는 진구체(眞具體)가 좋다. 시판되는 불용성 담체 입자는 HDP는 일본의 AT＆T사에서 구입한 소수성 폴리머 입자, 무기화합물 입자를 사용할 수 있다.
본 발명에 관계되는 감작 HDP에는 전기 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 전기 HDP에 감작하여 얻을 수 있다. 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 HDP에 감작하는 방법은, 예컨대 다음 방법을 채용할 수 있다. 즉, HDP와 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 수성 매체, 특히 0.030∼0.045M의 PBS 완충액중에서 접촉시키는 것이 좋으며, 통상의 HDP가 함유된 수성 매체 현탁액과 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원이 함유된 수성매체 현탁액을 혼합하고 진탕하여 감작한다. 이때 진탕시간은 30∼60분이 바람직하다.
신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 HDP에 감작하는 때, 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원의 용량은 일반적으로 HDP 1g에 대하여 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 20∼100 ELISA 역가(IgM capture ELISA), 바람직하게는 50∼70 ELISA 역가의 범위에서 선택하면 좋다.
본 발명에 있어서 ELISA 역가란 환자 혈청을 이용하여 바이러스 항원을 적정하는 일반적인 IgM 포착 ELISA를 말한다. 상기의 감작은 pH 6.0∼8.5, 10℃∼28℃에서 행하는 것이 바람직하다.
이때 사용하는 혈청 알부민은 소혈청 알부민이 양호한 효과를 얻을 수 있으며, 그의 양은 1.5∼2.0%(w/v)가 바람직하다.
본 발명의 진단용 시약은 전기 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP를 수성 용액에 현탁시켜서 얻을 수 있다. 상기 시약중에 포함되는 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP의 함유량은 0.005∼2.000%(w/v), 바람직하게는 0.05∼1.00%(w/v) 범위에서 선택하면 좋다.
또한, 본 발명에 관계되는 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP은 안정하나, 이를 동결건조함으로서 더욱 장기간 보존할 수 있다. 동결건조품은 사용시에 순수를 가하여 용해시키는 것만으로 신선제품과 완전히 동일하게 사용할 수 있다.
본 발명의 진단용 시약은 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항체에 의하여 응집되므로, 사람 또는 동물의 혈청 등의 체액 또는 그 희석액과 본 발명의 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP를 마이크로타이터용의 플레이트상에서 접촉시키고, 감작 입자의 관저 응집상을 관찰함으로서 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 대한 항체의 존재를 판정할 수가 있다.
따라서, 상기 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항체의 존재의 판정은 특수한 기기를 사용할 필요가 없으며, 간단하고도 신속하게 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스의 감염여부를 진단할 수 있다. 또한, HDP에 대한 항체는 존재할 수 없고, 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 대한 항체의 존재 여부만이 판단되기 때문에, 검체로 되는 혈청 등에 전처리할 필요도 없다. 본 발명에 따른 진단 시약에 의하여 종래 임상 소견만으로 진단하기가 힘들고, 더구나 번잡한 조작으로 특수한 기기를 사용하여야 하고, 많은 노력을 필요로 하기 때문에, 쉽게 진단할 수 없었던 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감염의 여부를 간단하게 진단할 수 있게 되었으며, 시중의 일반 의원에서 1시간이내의 짧은 시간에 진단이 가능하게 되었다.
따라서, 본 발명은 통상의 임상뿐 만 아니라, 한타바이러스의 여러 혈청형에 의해 발생하는 환자중 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 환자를 조기에 구별함으로서 정확한 치료를 가능하게 하는 점에서도 본 발명의 높은 평가가 기대된다.
이하, 실시예로서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그리나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
(신 놈브레 바이러스 항원의 조제)
생후 1일의 포유 햄스터 뇌내에 신 놈브레 바이러스 감염 햄스터 뇌의 1% 유제 0.01㎖를 접종하고, 15∼25일 후에 뇌를 적출하여 생리 식염수로 20%의 유제를 조제하였다. 이 유제를 4℃에서 10,000rpm으로 1시간 원심하여 상층액을 취하고, 여기에 20∼50%(v/v)의 에탄올을 가하고, 저온에서 교반하고 원심분리하여 침전시킨다. 이어서, 생리 식염수로 다시 원량으로 만들고, 여기에 0.1∼0.3%(w/v)의 황산프로타민을 가하여 저온에서 교반하고, 이를 10,000rpm으로 1시간 원심한 후, 상층액을 취하였다. 이를 초원심분리하여 포르말린을 0.05∼0.10%(w/v) 용량을 가하고, 4℃에서 30∼60일간 방치한 후, 생리 식염수로 투석하여 신 놈브레 바이러스 항원을 얻었다. 또 항원가는 400∼450 ELISA 역가이었다.
(신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP의 조제)
HDP와 신 놈브레 바이러스 항원을 수성매체인 0.035∼0.045M, pH 6.0∼8.5의 PBS중에서 접촉시키고, HDP가 함유된 수성매체 현탁액과 신 놈브레 바이러스 항원이 함유된 수성매체 현탁액을 혼합하고, 30∼60분간 진탕하여 감작하였다.
신 놈브레 바이러스 항원을 HDP에 감작할 때, 신 놈브레 바이러스 항원의 용량은 HDP 1g에 대하여 신 놈브레 바이러스 항원을 20∼100 ELISA 역가(IgM capture ELISA)의 범위에서 선택하였다.
상기의 감작은 pH 6.0∼8.5, 10℃∼28℃에서 행하였다.
상기의 감작 후, 수성매체로 2∼3회 세척하여 미감작된 신 놈브레 바이러스 항원을 제거하고, 다시 HDP에 흡착되는 물질, 즉, 소혈청 알부민 1.5∼2.0%(w/v)의 농도로 잔여면을 포화시켰다.
(음성 대조 정상 HDP의 조제)
신 놈브레 바이러스로 감염되지 않은 정상적인 젖먹이 햄스터의 뇌를 적출하여 상기 항원 정제 방법과 동일하게 처리하여 바이러스가 감염되지 않은 폐조직 유제를 얻었다.
HDP와 상기 폐조직 유제를 상기의 감작 방법과 동일하게 처리를 하여 음성 대조 정상 HDP를 얻었다.
상기의 감작 후, 수성매체로 2∼3회 세척하고, 상기 방법과 동일하게 HDP에 혈청 알부민 등으로 입자의 잔여면을 포화시킨다.
(항체가의 측정)
V형 마이크로 플레이트에 희석액을 0.025㎖씩 분주하고, 첫번째 웰(well)에 1:10공시 혈청 0.025㎖를 가하였다. 이것을 희석기로 배수 희석한 후, 각 웰에 신 놈브레 바이러스 감작 HDP와 음성 대조 정상 HDP를 각각 쌍으로 0.025㎖씩 적하하였다. 충분히 혼합한 후, 실온에서 40분간 정치하여 관저 응집상을 판정하고, 응집을 나타내는 공시 혈청의 최대 희석 배수를 HDP 항체가로 하였다.
시약의 특이성과 민감도를 조사하기 위하여 5개국의 신증후 출혈열 환자 혈청 각 5검체와 정상인 혈청 각 3검체를 사용하고, 미국의 한타바이러스 폐증후군 환자 혈청 각 5검체와 정상인 혈청 각 3검체를 사용하였다. 한탄바이러스와 서울 바이러스에 의해 신증후 출혈열 환자가 발생하는 한국, 중국과 일본의 경우는 표 2, 3, 4에 결과를 나타내었다. 이 경우 한타바이러스와 서울 바이러스에 의한 신증후 출혈열 환자 혈청과는 교차 반응을 일으키지 않았다. 푸우말라 바이러스에 의해 신증후 출혈열 환자가 발생하는 핀란드와 러시아의 경우는 표 5, 6에 결과를 나타내었다. 신 놈브레 바이러스에 의해 한타바이러스 폐증후군 환자가 발생하는 미국의 경우는 표 7에 나타내었다. 이 경우 높은 특이성과 민감도를 나타내었다.
(응집 판정법)
HDP 침강물이 중앙에 점 형태로 응집하고 외각은 매끄러운 원형을 나타내는 경우, 응집정도를 (-)로 표기하며 음성으로 판정하였다. HDP 침강물이 중앙의 점형태로 모여 있지만 점주위가 매끄럽지 못하고 응집이 약간 인정되는 경우, 응집정도를 (±)로 표기하며 판정을 보류하였다. 중앙의 HDP 침강물이 (±)상태보다 훨씬 흐리고 외각에 뚜렷한 응집이 인정되는 경우, 응집정도는 (+)로 표기하며 양성으로 판정하였다. 중앙의 HDP 침강물이 (+)상태보다 훨씬 흐리고, 외각에 뚜렷한 응집이 인정되는 경우 (++)로 표기하며 양성으로 판정하였다. 점 모양의 HDP 침강물이 관찰되지 않고 응집이 웰 전면에 걸쳐 균일하게 일어나 막형태를 이룰 경우, 응집정도를 (+++)로 표기하며 양성으로 판정하였다. 점 모양의 HDP 침강물이 관찰되지 않고 응집이 웰 전면에 걸쳐 균일하게 일어나지만 응집상태가 부분적으로 손상되어 있는 경우 응집정도를 (++++)로 표기하고 양성으로 판정하였다.
(결과 판정법)
음성 대조 정상 HDP를 넣은 웰 및 신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP를 넣은 웰에서 동시에 응집이 일어나지 않으면 음성으로 판정하였다. 음성 대조 정상 HDP를 넣은 웰에서는 응집이 일어나지 않고 신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP를 넣은 웰에서는 응집이 일어나면 양성으로 판정하였다. 음성 대조 정상 HDP를 넣은 웰과 신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP를 넣은 웰에서 동시에 응집이 일어나거나 동시에 판정보류로 결과가 나타난 검체는 재검사를 실시하였다. 음성 대조 HDP를 넣은 웰에서는 응집이 일어나지 않고 신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP를 넣은 웰에서 판정보류 결과를 나타낸 검체는 1주일후, 다시 채혈하여 검사를 실시하였으며, 이 때도 판정 보류 결과를 나타내면 음성으로 판정하였다.
비교예 1
전기 HDP법에 사용한 각국 환자 혈청과 정상인 혈청 검체에 관하여 신 놈브레 바이러스에 대한 형광항체법(IFA)에 의하여 검지할 수 있는 공시 혈청의 최대 희석배수를 그 IFA 항체가로서 구하였다. 결과를 표 2, 3, 4, 5, 6, 7에 표시한다.
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 한국 HFRS 환자 〈 20 80
2 HFRS 환자 〈 20 80
3 HFRS 환자 20 160
4 HFRS 환자 〈 20 80
5 HFRS 환자 〈 20 40
6 건강인 혈청 〈 20 〈 20
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 중국 HFRS 환자 〈 20 〈 20
2 HFRS 환자 〈 20 〈 20
3 HFRS 환자 〈 20 80
4 HFRS 환자 〈 20 〈 20
5 HFRS 환자 〈 20 80
6 건강인 혈청 〈 20 〈 20
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 일본 HFRS 환자 〈 20 〈 20
2 HFRS 환자 〈 20 〈 20
3 HFRS 환자 〈 20 〈 20
4 HFRS 환자 〈 20 〈 20
5 HFRS 환자 〈 20 〈 20
6 건강인 혈청 〈 20 〈 20
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 핀란드 HFRS 환자 40 160
2 HFRS 환자 〈 20 〈 20
3 HFRS 환자 〈 20 〈 20
4 HFRS 환자 〈 20 〈 20
5 HFRS 환자 〈 20 〈 20
6 건강인 혈청 〈 20 40
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 러시아 HFRS 환자 〈 20 160
2 HFRS 환자 〈 20 320
3 HFRS 환자 40 640
4 HFRS 환자 〈 20 〈 20
5 HFRS 환자 〈 20 〈 20
6 건강인 혈청 〈 20 〈 20
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
샘플번호 국가 혈청형 신 놈브레 바이러스 HDPA 신 놈브레 바이러스 형광항체법
1 미국 HPS 환자 2,560 5,120
2 HPS 환자 10,240 10,240
3 HPS 환자 40,960 10,240
4 HPS 환자 20,480 10,240
5 HPS 환자 1,280 2,560
6 건강인 혈청 〈 20 〈 20
7 건강인 혈청 〈 20 〈 20
8 건강인 혈청 〈 20 〈 20
실시예 2
(신 놈브레 바이러스 항원의 조제)
Vero E6 클론 세포를 단층 배양한 후, 신 놈브레 바이러스를 감염시키고, 8∼15일 후에 세포를 회수하여 0.035∼0.045M PBS에 부유시켰다. 이 부유액을 동결융해법(freezing ＆ thawing) 또는 고주파음(sonication)으로 세포를 처리한 후, 원침한 상층액을 감마선 3000라드로 살아있는 바이러스를 불활화한 후, 4℃에서 10,000rpm으로 60분간 초고속 원침으로 상청액을 취하고, 포르말린 0.05∼0.1%(w/v)용량을 가하고, 4℃에서 30∼60일간 정치한 후, 생리 식염수로 투석하여 신 놈브레 바이러스 항원을 얻었다.
(신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP의 조제)
HDP와 상기 세포 배양 유래의 신 놈브레 바이러스 항원을 수성매체인 0.035∼0.045M, pH 6.0∼8.5의 PBS 중에서 접촉시켜, HDP가 함유된 수성매체 현탁액과 신 놈브레 바이러스 항원이 함유된 수성매체 현탁액을 혼합하고 30∼60분간 진탕하여 감작하였다.
신 놈브레 바이러스 바이러스 항원을 HDP에 감작할 때, 신 놈브레 바이러스항원의 용량은 HDP 1g에 대하여 신 놈브레 바이러스 항원을 20∼10 ELISA 역가(IgM capture ELISA)의 범위에서 선택하였다.
상기의 감작은 pH 6.0∼8.5, 10℃∼28℃에서 행하였다.
상기의 감작후에는 수성매체로 2∼3회 세척하여 미감작된 신 놈브레 바이러스 항원을 제거하고, 다시 HDP에 흡착되는 물질, 즉, 소혈청 알부민 1.5∼2.0%(w/v)의 농도로 입자의 잔여면을 포화시켰다.
상기 감작후에는 수성매체로 세척하여 미감작된 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 항원을 제거하고, 다시 HDP에 흡착되는 물질, 예를 들면 혈청 알부민 등으로 입자의 잔여면을 포화시킨다.
(음성 대조 정상 HDP의 조제)
신 놈브레 바이러스로 감염되지 않은 정상의 상기 사용세포를 상기 정제 방법과 동일하게 처리하여 바이러스가 감염되지 않은 정제액을 얻었다.
HDP와 상기 신 놈브레 바이러스로 감염되지 않은 정제액을 상기의 감작방법과 동일하게 처리를 하여 음성대조 정상 HDP를 얻었다.
상기의 감작후에는 수성매체로 2∼3회세척하고, 상기 방법과 동일하게 HDP에 흡착되는 물질인 혈청 알부민으로 입자의 잔여면을 포화시켰다.
(항체가의 측정)
V형 마이크로 플레이트에 희석액을 0.025㎖씩 분주하고 첫번째 웰에 1:10 공시 혈청 0.025㎖를 가하였다. 이것을 희석기로 배수 희석한 후, 각 웰에 신 놈브레 바이러스 감작 HDP와 음성대조 정상 HDP를 각각 쌍으로 0.025㎖씩 적하하였다. 충분히 혼합한 후, 실온에서 40분간 정치하여 관저 응집상을 판정하고 응집을 나타내는 공시 혈청의 최대 희석배수를 HDP 항체가로 하였다.
실시예 3
(신 놈브레 바이러스 항원의 조제)
A549 cell을 단층 배양한 후, 신 놈브레 바이러스 감염 10∼14일 후, 세포를 회수하여 0.035∼0.045M, pH 6.0∼8.5, PBS에 부유시켰다. 이 부유액을 세포를 동결융해법 또는 초음파 처리하여 파쇄하였다. 생성액을 4℃에서 10,000rpm으로 60분간 고속 원심하여 상청액을 취하고, 이 상청액을 초원심하고, 포르말린을 0.05∼0.1%(w/v)용량을 가하고, 4℃에서 30∼60일간 정치한 후, 생리 식염수로 투석하여 신 놈브레 바이러스 항원을 얻었다.
(신 놈브레 바이러스 항원 감작 HDP의 조제)
HDP와 상기 세포 배양 유래의 신 놈브레 바이러스 항원을 수성매체, 즉, 0.035∼0.45M, pH 6.0∼85 PBS 중에서 접촉시켜, HDP가 함유된 수성매체 현탁액과 신 놈브레 바이러스 항원이 함유된 수성매체 현탁액을 혼합하고, 30∼60분간 진탕하여 감작한다.
신 놈브레 바이러스 항원을 HDP에 감작할 때, 신 놈브레 바이러스 항원의 용량은 HDP 1g에 대하여 신 놈브레 바이러스 항원을 20∼100 ELISA 역가(IgM capture ELISA)의 범위에서 선택하였다.
상기의 감작은 pH 6.0∼8.5, 10℃∼28℃에서 행하였다.
상기의 감작후에는 수성매체로 2∼3회 세척하여 미감작된 신 놈브레 바이러스 항원을 제거하고, 다시 HDP에 흡착되는 물질인 소혈청 알부민 1.5∼2.0%(w/v)의 농도로 잔여면을 포화시켰다.
(음성대조 정상 HDP의 조제)
신 놈브레 바이러스로 감염되지 않은 정상의 상기 사용세포를 상기 정제 방법과 동일하게 처리하여 바이러스가 감염되지 않은 정제액을 얻었다.
HDP와 상기 신 놈브레 바이러스를 감염시키지 않은 정제액을 상기의 감작방법과 동일하게 처리를 하여 음성대조 정상 HDP를 얻었다.
상기의 감작후에는 수성매체로 2∼3회 세척하고, 상기 방법과 동일하게 HDP에 흡착되는 물질인 혈청 알부민으로 입자의 잔여면을 포화시켰다.
(항체가의 측정)
V형 마이크로 플레이트에 희석액을 0.025㎖씩 분주하고 첫번째 웰에 1:10 공시 혈청 0.025㎖를 가하였다. 이것을 희석기로 배수 희석한 후, 각 웰에 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감작 HDP와 음성대조 정상 HDP를 각각 쌍으로 0.025㎖씩 적하하였다. 충분히 혼합한 후, 실온에서 40분간 정치하여 관저 응집상을 판정하고, 응집을 나타내는 공시 혈청의 최대 희석배수를 HDP 항체가로 하였다.
실시예 4
(감작 적혈구의 조제)
2.5％의 고정화 양 적형구를 포함하는 PBS에 1:100,000의 탄닌산/PBS 용액을 같은 양으로 가한후, 실온(20℃에서 20∼30분간 탄닌산 처리를 한 후, PBS로 1회 세척하고, PBS에 현탁시켜서 0.5％의 탄닌 혈구 현탁액을 조제하였다. (단, PBS와는 1/60몰의 인산염 완충액(pH7.2) 1용량과 생리 식염수 3용량과의 혼합물이다).
상기 조제된 탄닌 혈구 현탁액 1용량과 실시예 1과 동일하게 처리하여 얻은 신 놈브레 바이러스 항원의 50∼70 ELISA 역가 1용량을 혼합하고, 실온에서 서서히 교반기로 교반하면서 60분간 감작하였다, 감작후의 상기 입자를 PBS로 3회 세척하고, 0.5%가 되도록 희석액(PBS에 비동화 토끼 혈청을 1% 첨가한 것)에 현탁하여 감작 적혈구를 얻었다.
(항체가의 측정)
V형 마이크로 플레이트에 희석액을 0.025㎖씩 분주하고 첫번째 웰에 1:10 공시 혈청(실시예 1의 혈청과 동일한 것) 0.025㎖를 가하였다. 이를 희석기로 배수 희석한 후, 각 웰에 신 놈브레 바이러스 감작 적혈구와 음성 대조 정상 HDP를 각각 쌍으로 0.025㎖씩 적하하였다. 잘 혼합하고 실온에서 3시간 정치한 후, 관저 응집상을 판정하였다. 그 결과 항체가는 전기 실시예 1의 경우와 비슷하거나 약간 낮은 민감도를 보였다.
이상의 실시예에서는 신 놈브레 바이러스를 이용하여 예를 들었으나, 뉴욕 바이러스를 이용한 경우에도 동일한 결과로 나타나므로 이에 대한 실시예는 생략한다.
본 발명에 따른 진단 시약에 의하여 종래 임상 소견만으로 진단하기가 힘들고, 더구나 번잡한 조작으로 특수한 기기를 사용하여야 하고, 많은 노력을 필요로 하기 때문에, 쉽게 진단할 수가 없었던 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스 감염 여부를 간단하게 진단할 수 있게 되었으며, 지역의 일반 병원에서도 1시간이내의 짧은 시간에 진단이 가능하게 된다. 따라서, 본 발명은 통상의 임상뿐 만 아니라, 한타바이러스의 여러 혈청형에 의해 발생하는 환자중 신 놈브레 바이러스 및/또는 뉴욕 바이러스에 감염된 환자를 조기에 구별함으로서 정확하고 적절한 치료를 가능하게 한다.

Claims (19)

  1. 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원이 평균입자 직경이 0.1∼10.0㎛이고, 비중이 1.5∼4.0g/㎤인 불용성 무기 화합물에 감지되어 있는 입자를 0.005∼2.000%(w/v) 함유한 수성 현탁액인 것을 특징으로 하는 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스에 감염된 한타바이러스 폐증후군 환자의 진단용 시약.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원이 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 감염 햄스터 폐조직에서 얻어진 것이 특징인 진단용 시약.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원이 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 감염 햄스터 뇌조직에서 얻어진 것이 특징인 진단용 시약
  4. 제1항에 있어서, 상기 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원이 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 감염 Vero E6 세포(ATTC Vero C1008), A549(사람 폐암세포), J77(마우스 단구/마크로파아지), HLF(사람 태아 폐 섬유아세포), L929(마우스 결합조직), MRC5(사람 태아성 폐 섬유아세포) 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포에서 얻어진 것이 특징인 진단용 시약.
  5. 제1항에 있어서, 상기 불용성 담체 입자가 적혈구인 것이 특징인 진단용 시약.
  6. 햄스터, 몽고리안 저빌, 마우스, 쥐로 이루어진 군에서 선택된 포유동물 젖먹이의 뇌내에 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스를 접종 감염시키고, 이 감염 조직으로부터 얻은 조직 유제를 저온에서 원심분리하여 바이러스 부유액을 취하고, 이를 에탄올과 황산프로타민으로 처리한 후, 고속 원심분리하여 상층액을 취하고, 다시 초고속원심분리하고, 포르말린으로 불활성화하여 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원을 얻고, 이를 HDP에 감작하고, 이 감작 입자를 수성매체에 0.005∼2.000%(w/v) 현탁시킴을 특징으로 하는 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 감염 환자 진단용 시약의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 감염 조직이 폐조직세포, 뇌세포, Vero E6 클론 세포(ATCC Vero clone C1008), A549(사람 폐암세포 유래), J77(마우스 단구/마크로파아지), HLF(사람 태아 폐 섬유아세포), L929(마우스 결합조직), MRC5(사람 태아성 폐 섬유아세포) 세포로부터 선택된 것이 특징인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항원을 20∼50%(v/v) 에탄올로 처리한 후, 0.1∼0.3%(w/v)의 황산프로타민으로 처리하여 정제함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 포르말린으로 불활성화한 후, 포르말린을 투석하여 제거함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항 또는 제9항에 있어서, 포르말린 0.05∼0.10% 처리하여 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원을 불활화함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 HDP로 감작할 때, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 감작량을 50∼70 μ/㎖ ELISA 역가로 감작함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제6항에 있어서, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 HDP로 감작할 때, 수성매체로 0.035∼0.045M, pH 6.0∼8.5의 PBS를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 HDP로 감작할 때, 10∼28℃의 온도에서 감작함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제6항에 있어서, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 HDP로 감작할 때, 30∼60분간 진탕하여 감작함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제6항에 있어서, 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원의 HDP로 감작한 후, 1.5∼2.0%의 소혈청 알부민을 사용하여 입자의 잔여면을 포화시킴을 특징으로 하는 방법.
  16. 제6항에 있어서, 불활화된 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 항원을 30∼60일 사이에 감작 항원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제6항에 있어서, 수성매체가 PBS 완충액임이 특징인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 수성매체가 0.030∼0.045M의 PBS 완충액임이 특징인 방법.
  19. 환자 혈청 검색시 사용하는 검체량과 신 놈브레 바이러스 및 뉴욕 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 1종이상의 바이러스 감작 HDP의 첨가량을 각각 0.015∼0.030㎖의 범위에서 동량 혼합하여 반응시켜서 판독하는 방법.
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