KR100309705B1

KR100309705B1 - 푸말라바이러스감염진단용시약

Info

Publication number: KR100309705B1
Application number: KR1019980014796A
Authority: KR
Inventors: 이호왕; 유선자; 안창남; 김훈; 데쯔오 도미야마
Original assignee: 허일섭; 주)녹십자; 이호왕
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2001-12-28
Also published as: KR19990081080A; RU2218571C2; EP0952450A1; YU53498A

Abstract

본 발명은 신증후출혈열 환자의 푸말라바이러스에 의한 감염여부를 혈청학적 검사에 의하여 간편하게 진단할 수 있는 불용성 담체 입자에 감작되어 있는 푸말라바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 푸말라바이러스 감염 진단용 시약에 관한 것이다. 본 발명자들은 미합중국종균협회(ATCC)로부터 입수한 푸말라바이러스(ATCC VR-984)를 생후 1일 이내의 햄스타의 뇌 또는 조직 배양한 Vero E6 세포에 감염시킨 다음, 적절한 시기에 감염된 뇌 또는 Vero E6 세포를 파쇄하고, 초원심분리와 투과여과법을 이용하여 순수한 바이러스 항원을 얻었다. 이어서, 전기 바이러스 항원을 화학적으로 변질시켜 반응감도를 높인 다음, 고비중 실리콘 입자 또는 적혈구에 감작시켜, 감도와 특이성이 양호한 새로운 푸말라바이러스 감염 진단용 시약을 개발하는데 성공하였다. 본 발명의 .진단용 시약에 함유되어 있는 푸말라바이러스 항원으로 감작된 불용성 입자는 푸말라 바이러스 감염 환자의 혈청내의 항체와 민감하고 특이적으로 반응하고, 검체로 사용되는 혈청의 전처리 과정 및 특수한 기기를 필요로 하지 않기 때문에, 본 발명의 진단용 시약을 이용함으로써 간편하고 신속하게 푸말라바이러스에 의한 감염 여부를 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 시약은 신증후출혈열의 발병 이전에 푸말라바이러스에 의한 감염의 진단을 가능케하므로, 신증후출혈열의 보다 효과적인 치료를 기대할 수 있을 것이다.

Description

푸말라바이러스 감염 진단용 시약

본 발명은 푸말라바이러스(Puumala virus) 감염 진단용 시약에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 푸말라바이러스에 감염에 의한 신증후출혈열 환자를 혈청학적 검사에 의하여 간편하게 진단할 수 있는 불용성 담체 입자에 감작되어 있는 푸말라바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 푸말라바이러스 감염 진단용 시약에 관한 것이다.

1976년 이 등은 한국형 출혈열 환자의 병원체를 등줄쥐의 폐에서 발견하여 '한탄바이러스'라 명명하였는데, 이는 세계 최초의 한타바이러스(Hantavirus)이며, 그 후 서울바이러스 및 푸말라바이러스 등이 분리됨으로써, 이들 바이러스는 분야비리데(Bunyaviridae)과를 이루게 되었다. 아세아에서 발생하는 유행성출혈열의 병원체는 한탄바이러스와 서울바이러스이나, 유럽에서 발생하는 신증후출혈열의 병원체는 푸말라바이러스이며, 푸말라바이러스의 자연계 보균동물은 대륙밭쥐이다. 한편, 최근 미주에서는 사망률이 높은 새로운 한타바이러스 폐증후 환자가 발생되어 큰 사회적 문제로 대두되고 있는데, 이 새로운 병의 병원체는 한탄바이러스와 형태가 같으나 항원적으로 차이가 있는 새로운 신놈부레바이러스임이 증명되었다. 아세아에서 발생하는 한탄바이러스와 서울바이러스에 의한 유행성출혈열의 증상은 고열, 출열과 함께 신장기능 장애를 나타내는 것이 특징이나, 유럽에서 발생하는 푸말라바이러스에 의한 신증후출혈열은 발열과 더불어 경미한 출혈과 신장기능 장애가 두드러진다. 그리고, 최근 미주에서 발생한 새로운 한타바이러스 폐증후는 발열과 더불어 상호흡기도의 염증과 폐수종의 증상이 급격히 진행되어, 호흡곤란으로 발병 일주일 전후에 사망하는 것이 특징이다.

이들 바이러스는 다같이 한타바이러스속에 속하나, 항원성 차이로 인하여 중화항체가 다르기 때문에 효과적인 예방백신도 각각 달리 만들어야 한다. 또한, 현재 사용하고 있는 간접형광항체법(IFA)으로는 교차반응이 나타나기 때문에, 특이한 바이러스의 감염을 정확하게 감별 진단하는 것은 매우 어렵다.

푸말라바이러스 감염은 유럽 전역에서 발생하고 있으며, 특히 매년 수천명의 환자가 북유럽에서 발생하고 있는데, 임상증상이 다른 한타바이러스에 의한 질병보다 경미하고, 상호흡기도 감염증상과 신장기능 장애 때문에 다른 상호흡기도 질환이나 급성 신장염과 임상적으로 구별하는 것이 어려워, 간편하고 신속한 혈청학적 겁사에 의한 푸말라바이러스 감염의 진단법이 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 유럽에서 발생하는 푸말라바이러스 감염을 간단하고 신속하게 진단할 수 있는 진단용 시약을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 푸말라바이러스에 감염된 배양세포 또는 조직으로부터 바이러스 항원을 정제하고, 전기 항원을 불용성 입자 즉, 고비중 실리콘 입자 및 적혈구에 감작시켜, 전기 고비중 실리콘 입자 또는 적혈구에 감작되어 있는 푸말라바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 혈청 진단용 시약이 푸말라바이러스 감염환자의 혈청과 민감하고 특이적으로 반응함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 푸말라바이러스에 감염된 사람과 동물을 혈청학적으로 신속하게 진단할 수 있는 푸말라바이러스 감염 진단용 시약을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 미합중국종균협회(ATCC)로부터 입수한 푸말라바이러스(ATCC VR-984)를 생후 1일 이내의 햄스타의 뇌 또는 조직 배양한 Vero E6 세포에 감염시킨 다음, 적절한 시기에 감염된 뇌 또는 Vero E6 세포를 파쇄하고, 초원심분리와 여과법을 이용하여 순수한 바이러스 항원을 얻었다. 이어서, 전기 바이러스 항원을 화학적으로 변형시켜 반응감도를 높인 다음, 고비중 실리콘 입자 또는 적혈구에 감작시켜 감도와 특이성이 양호한 새로운 푸말라바이러스 감염 진단용 시약을 개발하는데 성공하였다. 본 발명에 의하여 제공되는 진단용 시약은 전기에서 분리한 푸말라바이러스 항원이 무기화합물 입자 또는 동물의 적혈구에 감작되어 있는 불용성 입자를 함유한 수성현탁액을 함유한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 진단용 시약에 함유되는 푸말라바이러스 항원은 감염동물의 장기, 특히 뇌 조직 및 감염된 조직배양 세포 등으로부터 제조할 수 있으나, 감염성이 높은 바이러스 항원 제조시의 편리성, 안전성 및 무균성을 고려하여, 고도로 순수한 항원을 제조하기 위해서는 감염된 조직배양 세포로부터 제조하는 것이 바람직하다. 푸말라바이러스 항원을 얻을 수 있는 바람직한 방법 중 가장 대표적인 것은 푸말라바이러스로 감염시킨 Vero E6 세포를 배양하여, 이로부터 바이러스 항원을 추출하는 것이다. 그러나, 동물조직에서 대량의 바이러스 항원을 제조하기 위해서는, 생후 1일 이내의 햄스타의 뇌내에 푸말라바이러스를 직접 접종하고 사육한 다음, 적절한 시기에 감염된 뇌를 적출하여, 이로부터 바이러스 항원을 추출한다.

한편, 본 발명의 진단용 시약에 함유되는 불용성 입자는 공지의 무기화합물입자 또는 동물의 적혈구 등을 사용할 수 있다. 전기 무기화합물 입자로서는, 공지의 물질을 적절하게 사용할 수가 있으며, 예를 들어, 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아, 산화제2철, 사삼산화철, 산화코발트, 산화니켈 등의 주기율표 제III족, 제IV족 또는 VI족의 금속의 산화물; 수산화알루미늄, 수산화제2철, 수산화크롬 등의 수산화물; 브롬화은, 염화은 등의 할로겐화물; 황화카드뮴 등의 황화물; 탄산칼슘, 탄산마그네슘 등의 탄산염; 또는, 황산바륨, 황산스트론륨 등의 황산염 등을 들 수 있다. 그리고, 이들 중에서도 특히 바람직한 것은, 실리카, 알루미나, 티타니아, 지르코니아 또는 이것들을 주요 구성성분으로 하는 복합 산화물이다.

또한, 무기화합물 입자로서, 실리카와 결합 가능한 주기율표 제II족, 제III족 및 제IV족으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종의 금속산화물과 실리카를 주요 구성 성분으로 하는 무기 산화물을 사용할 수도 있다. 무기 산화물의 구체적인 예로서는, 산화리튬, 산화나트륨, 산화칼륨, 산화마그네슘, 산화칼슘, 산화스트론튬, 산화바륨, 산화알미늄, 산화티타늄, 산화지르코늄, 산화게르마늄, 산화하프늄, 산화주석, 산화아연 등을 들 수 있다.

전술한 본 발명의 진단용 시약에 함유되는 무기화합물 입자로서는, 전기와 같은 재질로 구성되어 있으며 본 발명의 목적을 저해하지 않는 무기화합물 입자, 특히 그 무기화합물 입자의 구조를 제한하지 않으며, 전기 재질로 구성되는 입자를 핵으로 하고, 그 핵을 하나 또는 둘 이상의 층, 예를 들어 후술하는 염료를 함유하는 색소층 등으로 피복하여 만들어진 무기화합물 입자도 사용될 수 있다. 또한, 무기화합물 입자의 평균 직경은 0.1 내지 10.0㎛, 바람직하게는 0.8 내지 5.0㎛이며, 비중은 통상 1.5 내지 4.0, 바람직하게는 1.8 내지 2.5이다.

전기 무기화합물 입자 중에서도 특히 바람직한 것은 전기 재질, 예를 들어, 실리카를 주요 구성 성분으로 하는 복합 산화물을 핵으로 하고, 그 핵을 후술하는 염료를 함유하는 색소층으로 피복한 다음, 필요에 따라, 그 위에 전기 복합산화물로 피복하고, 그 표면을 실란커플링제, 티탄커플링제 등으로 처리함으로써 그 표면에 반응기를 가지도록 한 무기 복합체 입자로, 그 평균 직경이 0.1 내지 10.0㎛이며, 비중이 1.5 내지 4.0인 소위 고비중복합체 입자(high density particle, 이하, 'HDP'라 약함)이다.

본 발명에 있어서는, 전기 무기화합물 입자의 입자 분산성이 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상인 것이 적합하다. 본 발명에서 '입자 분산성'이란, 전 입자 중에서 차지하는 비응집 입자, 즉, 단일 입자의 개수의 비율(%)이며, 통상, 콜터카운터사제 모델ZD-1를 사용하여 측정할 수 있다.

전기 무기화합물 입자의 형상은, 사용되는 무기화합물의 결정 구조 및 제조법에 따라 상이하며, 다면체, 주체(主體), 양추체(兩錐體), 구체(具體) 등이 존재하고, 이들 전부가 본 발명에 사용 가능하나, 바람직하게는 구체, 특히 바람직하게는 진구체(眞具體)가 좋다. 이와 같은 무기화합물 입자는, 공지의 제조 방법, 예를 들어 일본국 특개 소52-138094호, 일본국 특개 소61-149644호 공보 등에 개시된 방법에 의하여 얻을 수 있다.

한편, 전기 무기화합물 입자 즉, 불용성 담체 입자에는 염료를 함유시키는 것도 가능하다. 염료로서는, 특히 제한되는 것은 아니고, 공지의 염료를 사용할 수가 있는데, 예를 들어, 말라카이트 그린, 로다민 B, 메틸렌 블루 등의 양이온 염료; 다이아닉스(Mitsubushi Chemical Co., Ltd., Japan), 디스바졸(I. C. I., U.K.), 미케톤 폴리에스테르(Mitsui Toatsu K. K., Japan) 등의 분산 염료; 콩고레드(Congo red), 다이렉트 디프 블랙 E W(Direct Deep Black E W), 크리소페닌 G 등의 직접 염료; 알리자린 사프롤 B; 알리자린 다이렉트 블루 A, 알리자린 시아린 그린 G 등의 산성염료; 다이아몬트 블랙 F, 크롬패스트 네이비블루 B, 팔라틴패스트 블루 BN 등의 산성 매염염료; 아시돌(BASF, Germany), 아이젠오팔(호로야 가가꾸사, Japan), 오레오솔(다오까가가꾸사, Japan) 등의 함금속염료; 다이아미라, 미카시론(Mitsubushi Chemical Co., Ltd., Japan), 스미픽스(Smitomo Chemical Co., Ltd., Japan) 등의 반응염료; 미카화이트(Mitsubushi Chemical Co., Ltd., Japan), 화이턱스(Smitomo Chemical Co., Ltd., Japan) 등의 형광증백염료 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 특히 바람직한 것은, 함금속염료, 양이온 염료이며, 더욱 바람직하게는 양이온 염료이다. 또한, 이들 염료 중에서 메탄올 100 중량부에 대한 용해도가 1 중량부 이상, 바람직하게는 5 중량부 이상, 특히 바람직하게는 10 중량부 이상인 것이 좋다. 전기 불용성 담체 입자에서 염료의 양은, 특히 제한하는 것은 아니나, 통상 0.5 내지 8 중량%, 바람직하게는 1.0 내지 5.0 중량%이다. 염료의 양을 이와 같은 범위로 설정함으로써, 푸말라바이러스 감염 진단시 항원-항체 응집반응의 판정을 용이하게 행할 수가 있음과 동시에 특히, 불용성 담체 입자가 무기화합물 입자인 경우에는, 염료의 용출을 방지할 수가 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 불용성 담체 입자로서는 적혈구를 사용할 수도 있다. 적혈구는 특히 한정되지 않으며, 항원-항체 반응에 있어서의 항원 담지 담체로서 종래로부터 사용되어 왔다. 본 발명에서는, 이와 같은 공지의 적혈구를 그대로 사용할 수 있는데, 고비중 복합체 입자에 비하여 감도면에서 약간 떨어지는 경향이 있으나, 적혈구도 바람직한 불용성 담체 입자로 사용될 수 있다.

본 발명의 진단용 시약에 함유되는 감작 불용성 입자는, 전술한 바와 같이 제조된 푸말라바이러스 항원을 전기 불용성 담체 입자, 바람직하게는 고비중복합체 입자(HDP) 또는 동물의 적혈구에 감작하여 얻을 수 있다. 푸말라바이러스 항원을 불용성 담체 입자에 감작하는 방법은 특히 한정되지 않으며, 공지의 방법이 채용될 수 있는데, 예를 들어, 불용성 담체 입자와 푸말라바이러스 항원을 수성 매체(예를 들어, 생리식염수, PBS 등) 중에서 접촉시키는 것이 바람직하며, 일반적으로 불용성 담체 입자의 수성매체 현탁액과 푸말라바이러스 항원을 혼합한 다음, 진탕하여 감작한다. 감작시의 푸말라바이러스 항원의 용량은, 일반적으로 불용성 담체 입자 1g에 대하여 푸말라바이러스 항원을 100 내지 400 HDP 응집단위, 바람직하게는 150 내지 250 HDP 응집단위의 범위에서 선택하는 것이 좋고, 감작 조건은 pH 6.0 내지 8.0, 4℃ 내지 20℃에서 행하는 것이 바람직하다. 이때, 본 발명에 있어서 HDP 응집단위란, HDP 응집에 필요한 항원의 최저 농도를 '1 HDP 응집단위'로 정의한다.

상기 감작후에는, 수성매체로 담체 입자를 세척하여 미감작된 푸말라바이러스 항원을 제거하고, 다시 불용성 담체 입자에 흡착되는 물질, 예를 들면, 소 혈청 알부민 등으로 입자의 잔여면을 포화시킨다.

본 발명의 진단용 시약은, 전기 감작 불용성 입자를, 예를 들어, 수성 용액에 현탁시켜서 얻을 수 있는데, 이 시약중에 포함되는 감작 불용성 입자의 함유량은 0.005 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량% 범위에서 선택하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 관계되는 감작 불용성 입자는 안정하지만, 이것을 동결건조시킴으로써 더욱 장기간 보존할 수 있는데, 동결 건조품은 사용할 때에 증류수를 가하여 용해시키는 것만으로 신선 제품과 완전히 동일하게 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이 제조된 본 발명의 푸말라바이러스 감염 진단용 시약은 푸말라바이러스 감염환자의 혈청과 높은 감도로 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 실리카를 핵으로 하고, 색소와 실리카의 혼합물로 피복되었으며, 실란 커플링제로 표면처리된 고비중복합체 입자를 사용하였으나, 본 발명의 진단용 시약에 함유되는 무기화합물 입자는 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 푸말라바이러스 항원의 제조

본 발명의 진단용 시약에 함유되는 푸말라바이러스 항원의 생산 균주로는 미합중국종균협회(ATCC, U.S.A.)로부터 입수한 푸말라바이러스 Sotkamo주(ATCC VR-984)를 Vero E6 세포(ATCC CRL 1586)에 10대에 걸쳐 계대배양한 다음, Vero E6 세포에서 가장 뚜렷하고 크기가 큰 플라크(plaque)를 형성하는 클론을 채취하여 사용하였다. 한편, 푸말라바이러스의 숙주로서는 가) Vero E6 세포와 나) 생후 1일 이내의 햄스타 2 가지를 모두 사용할 수 있으나, 전자의 방법이 더욱 바람직하게 사용될 수 있다.

실시예 1-1: Vero E6 세포로부터 푸말라바이러스 항원의 제조

조직 배양한 Vero E6 세포에 0.1ml의 푸말라바이러스를 접종한 다음, CO₂배양기에서 약 10일간 배양하였다. 이어서, 감염된 세포를 0.1% Triton-X로 처리한 다음, 세포를 수집하여 초음파분쇄기로 완전히 파쇄하고, 4℃에서 원심분리하여 바이러스가 함유된 상층액을 모아, 3,000rad의 감마선으로 처리하여 바이러스를 완전히 불활화시켰다. 전기 불활화한 바이러스 용액을 Vero E6 세포에 접종하고, 간접형광항체법(IFA)으로 바이러스의 불활화를 확인한 다음, 70,000rpm에서 4시간 동안 초고속원심분리하여, 바이러스 항원을 함유하는 상등액을 취하여 PBS로 적절히 희석하고, 특수한 여과기로 정제하여 순수한 바이러스 항원용액을 제조하였다. 전기 바이러스 항원용액에 0.05%(v/v) 포르말린을 4℃에서 2주간 처리하여, 바이러스 항원 단백질을 변형시킴으로써 반응감도를 높인 다음, 식염수로 투석하여 푸말라바이러스 감염 진단시약용 항원으로 사용하였다.

실시예 1-2: 생후 1일된 햄스타로부터 푸말라바이러스 항원의 제조

생후 1일 이내의 햄스타의 뇌내에 0.01ml 의 푸말라바이러스를 직접 접종하고, 접종 후 약 20일경 동물들의 반수 이상이 마비증상을 나타낼 때, 뇌조직을 무균적으로 적출하여 파쇄한 다음, 식염수를 가하여 10-20%(v/v) 뇌조직 유제를 제조하였다. 이어서, 전기 뇌조직 유제를 4℃에서 6,000rpm으로 30분간 원심분리한 다음, 상등액을 취하여 부피비로 10배 용량의 에틸알코올을 가하고, 저온에서 교반하여 감압건조하였다. 전기 건조된 뇌조직에 식염수를 가하여 다시 원량으로 만들고, 여기에 20%(v/v) 프로타민셀페이트를 처리하고 저온에서 교반한 다음, 10,000rpm으로 60분간 윈심분리하여, 염기성 미엘린 단백질이 완전히 제거된 바이러스 항원을 포함하는 상등액을 취하였다. 전기 상등액을 PBS로 적절히 희석하고, 특수한 여과기로 정제하여, 순수한 바이러스 항원용액을 제조하였다. 전기 바이러스 항원용액에 0.05%(v/v) 포르말린을 4℃에서 2주간 처리하여, 바이러스 항원 단백질을 변형시킴으로써 반응감도를 높인 다음, 생리식염수로 투석하여 푸말라바이러스 감염 진단시약용 항원으로 사용하였다.

상기에서 수득한 바이러스 항원은 항상 일정한 양의 항원이 진단용 시약 중에 함유될 수 있도록, ELISA법으로 항원의 역가를 측정하여 HDP 응집단위/ ml로 표시하였는 바, 감염된 Vero E6 세포로부터 제조한 항원의 역가는 5 내지 10 HDP 응집단위/ml이었고, 감염된 뇌조직으로부터 다량 제조한 항원의 역가는 120 HDP 응집단위/ml이었다.

실시예 2: 고비중복합체 입자(high density particle, HDP)의 제조

교반기가 부착된 유리제 플라스크에 메탄올 2800ml, 암모니아수 (25 중량%) 616ml 및 수산화나트륨 수용액(5M) 21ml을 가한 다음, 10℃에서 테트라에틸실리케이트의 메탄올 용액(22 중량%) 256ml을 25.5ml/hr의 속도로 적가하여, 평균 직경 0.91um의 실리카 입자를 제조하였다. 전기 실리카 입자를 포함하는 반응액에 다시 테트라에틸실리케이트의 메탄올 용액(44 중량%) 624ml과 메틸렌 블루의 메탄올 용액(1.25 중량%) 625ml을 동시에 25.5ml/hr의 속도로 적가한 다음, 두 용액의 적가를 동시에 종료시켜 염료로 착색한 실리카 입자를 합성하였다. 얻어진 실리카 입자를 메탄올로 경사시켜 정제와 세척을 반복하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 2층 구조로 되는 실리카/염료 복합체의 평균 직경은 1.57um이었다. 이어서, 얻어진 실리카 입자를 10 중량% 농도가 되도록 메탄올 중에 분산하고, 그 분산액 100ml에 페닐트리에톡시실란을 0.5중량% 농도가 되도록 첨가한 다음, 10℃에서 16시간 동안 반응시켜 표면처리된 실리카 입자를 제작하였다.

실시예 3: 감작 HDP의 제조

전기 실시예 1로부터 수득한 푸말라바이러스 항원에 M/60, pH 7.2의 PBS를 첨가하여, 2HDP 응집단위/ml의 용액이 되도록 희석하고, 이 항원용액 5ml과 0.5% HDP/PBS 5ml을 혼합한 다음, 실온에서 서서히 교반기로 교반하면서 60분간 감작하였다. 그런 다음, PBS로 3회 세척하고, PBS에 56℃ 30' 비동화(非動化) 토끼 혈청을 1% 첨가하여 제조된 희석액 5ml에 현탁시켜 감작 HDP 용액을 제조하였다.

실시예 4: 고비중복합체 입자 항체법(HDPA법)과 간접형광 항체법(IFA법)에 의한 항 체가의 측정

V형 마이크로플레이트에 상기 희석액을 0.025ml씩 분주하고, 첫 번째 웰(well)에 1:10(희석배수) 공시(供試)혈청 0.025ml을 가하였다. 이것을 희석기로 배수희석을 한 다음, 각 웰(well)에 상기 실시예 5에서 수득한 감작 HDP 용액을 0.025ml씩 적가하고, 잘 혼합하여, 실온에서 40분간 정치하여 관저 응집상을 판정하고, 응집을 나타내는 공시혈청의 최대 희석배수를 HDP 항체가로 정하였다. 이와 같은 방법으로 공시혈청 43검체에 대하여 HDP 항체가를 구하였다.

또한, 전기 HDPA법에 사용한 공시혈청 43검체에 대하여 종래의 간접형광항체법(IFA)으로 항체가를 측정하고, 간접형광항체법(IFA)에 의하여 검지할 수 있는 공시혈청의 최대 희석배수를 그 혈청의 IFA 항체가로 정하였다.

한편, 한탄바이러스 감염 혈청의 HDPA법에 의한 항체가 측정은 본 발명자들이 제조한 고비중복합체 입자에 감작된 한탄바이러스 항원을 유효성분으로 함유하는 신장증후증 출혈열의 진단용 시약(대한민국 특허공개 제 90-16761호)을 사용하였으며, 한타바이러스 감염에 대한 IFA법과 HDPA법의 민감도와 특이성을 비교하고자 표로 제시하였다.

하기 표 1은 공시혈청 43검체에 대하여 종래의 IFA법과 신규한 HDPA법으로 측정된 항체가를 비교하여 표로 나타낸 것이다.

HDPA법과 IFA법에 의한 한타바이러스 감염 혈청의 항체가 측정 성적비교

혈청번호	한타바이러스감염환자번호	국가명	HDPA	IFA
혈청번호	한타바이러스감염환자번호	국가명	Hantaan	Puumala	Hantaan	Puumala
1	KHF 81-498-6	한국	10240	80	20480	80
2	KHF 81-499-6		10240	20	40960	80
3	KHF 81-566-7		10240	160	40960	320
4	KHF 81-745-4		5120	160	20480	160
5	KHF 81-790-7		2560	<20	5120	20
6	ROK 88-110-3		10240	80	10240	80
7	ROK 88-119-3		5120	<40	10240	40
8	ROK 88-123-1		10240	320	10240	80
9	C-X-15	중국	1280	160	10240	2560
10	C-X-27-1		10240	40	20480	2560
11	C-X-46		10240	80	20480	80
12	C-X-28		10240	<20	20480	<20
13	C-X-24		10240	320	20480	20
14	USSR 75-1308a	러시아	640	2560	320	5120
15	USSR 90-1333		20	80	<20	160
16	USSR 96-1061		160	1280	80	5120
17	USSR 91-1333a		20	2560	20	2560
18	USSR 58-987		40	2560	80	2560
19	USSR 1848a		1280	5120	320	5120
20	USSR 488		160	5120	80	5120
21	USSR 1883a		640	10240	640	20480
22	Fin 85-869	핀랜드	40	1280	80	1280
23	Fin 85-860		60	5120	80	5120
24	Fin 85-786		160	5120	320	5120
25	Fin 85-816		160	10240	80	5120
26	Fin 85-907		40	640	<20	640
27	Fin 85-849		160	5120	640	5120
28	HM-9	일본	160	<20	320	20
29	Yoshimi Udea		80	<20	160	<20
30	NCU-8		160	<20	640	<20
31	NCU-28		160	<20	80	<20
32	Jap 13-3		5120	<40	10240	640

혈청번호	한타바이러스감염환자번호	국가명	HDPA	IFA
혈청번호	한타바이러스감염환자번호	국가명	Hantaan	Puumala	Hantaan	Puumala
33	Jap 13-5	일본	10240	<40	640	80
34	Jap HM-9	일본	1280	<40	320	20
35	Yugo 4601	유고	320	1280	20	20480
36	Yugo 4965		2560	<40	10240	320
37	Yugo 5455		160	2560	80	1280
38	USA RBi	미국	80	160	80	320
39	USA GMc		80	<40	40	5120
40	USA AH		<40	40	20	1280
41	USA RGH		80	<40	320	640
42	Control 96-110	한국	<40	<40	<20	<20
43	Control 96-111	한국	<40	<40	<20	<20

상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 한국, 중국, 일본 환자들은 한탄바이러스에 의한 감염임이 그리고, 러시아, 핀랜드 및 유고슬라비아 환자들은 푸말라바이러스에 의한 감염임이 IFA법 및 HDPA법으로 증명되었으며, IFA법 및 HDPA법은 감수성과 특이성에 있어서 큰 차이를 나타내지는 않았다. 이와 같이, HDPA법은 종래의 IFA법에 비하여 검사방법이 매우 간편하면서도 푸말라바이러스에 의한 감염과 한탄바이러스에 의한 감염을 비교적 정확하게 구별하여 진단할 수 있기 때문에, 종래에 임상소견만으로는 상호흡기도 질환이나 신장질환과 구별하는 것이 어려웠던 푸말라바이러스 감염에 의한 신증후출혈열의 정확한 조기진단을 가능케 한다.

실시예 5: 감작 적혈구의 제조

2.5%의 고정화 양(羊) 적혈구를 포함하는 PBS에 1:100,000의 탄닌산/PBS 용액을 같은 양으로 가한 다음, 20℃에서 20분간 탄닌산을 처리하였다. 이어, PBS(1/60몰의 인산염 완충액(pH 7.2) 1용량과 생리식염수 3용량과의 혼합물)로 1회 세척한 다음, PBS에 현탁시켜 0.5%의 탄닌 혈구 현탁액을 조제하였다. 전기 탄닌 혈구 현탁액 1용량과 상기 실시예 1로부터 수득한 푸말라바이러스 항원의 80배 희석액 1용량을 혼합하고, 실온에서 서서히 교반기로 교반하면서 60분간 감작하였다. 이어서, PBS로 3회 세척하고, PBS에 비동화 토끼 혈청을 1% 첨가하여 제조된 희석액에 0.5%가 되도록 현탁하여 감작 적혈구 용액을 얻었다.

실시예 6: 감작 적혈구를 이용한 항체가의 측정

V형 마이크로플레이트에 상기 실시예 3의 희석액을 0.025ml씩 분주하고, 첫 번째 웰에 1:10 공시혈청(상기 실시예 4의 혈청 11번과 동일한 것) 0.025ml을 가하였다. 이것을 희석기로 배수희석한 다음, 각 웰에 감작 적혈구를 0.025ml씩 적하하고, 잘 혼합하여, 실온에서 3시간 동안 정치하고, 관저 응집상을 판정하였다. 그 결과, 항체가가 40임을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 푸말라바이러스 항원으로 감작된 불용성 담체입자를 유효성분으로 함유하는 수성현탁액으로 된 푸말라바이러스 감염 진단용 시약을 제공한다. 본 발명의 .푸말라바이러스 감염 진단용 시약에 함유되어 있는 푸말라바이러스 항원으로 감작된 불용성 입자는 푸말라바이러스 감염 환자의 혈청에 함유되어 있는 항체와 민감하고 특이적으로 반응하고, 검체로 사용되는 혈청의 전처리 과정 및 특수한 기기를 필요로 하지 않기 때문에, 본 발명의 진단용 시약을 이용함으로써, 간편하고 신속하게 푸말라바이러스에 의한 감염 여부를 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 시약은 신증후출혈열의 발병 이전에 푸말라바이러스에 의한 감염의 진단을 가능케하므로, 신증후출혈열의 보다 효과적인 치료를 기대할 수 있을 것이다.

Claims

양이온 염료, 분산 염료, 직접 염료, 산성염료, 산성 매염염료, 함금속염료, 반응염료 및 형광증백염료로 구성되는 그룹으로부터 선택되느 하나의 염료로 0.1 내지 10.0㎛의 평균직경과 1.5 내지 4.0의 비중을 가지는 고비중복합체 입자(HDP)를 피복하고, 실란커플링제 또는 티탄커플링제로 처리한 다음, 푸말라바이러스 항원과 결합시킨 푸말라바이러스 항원-고비중복합체 입자를 비동화 토끼 혈청이 1%(v/v/) 첨가된 인산완충식염수(PBS)에 0.005 내지 2중량%로 현탁시켜 제조한 푸말라바이러스 감염 진단용 시약.
제 1항에 있어서,

푸말라바이러스 항원은 푸말라바이러스로 감염된 Vero E6 세포 또는 햄스타의 뇌조직에서 얻어진 것을 특징으로 하는 푸말라바이러스 감염 진단용 시약.