KR100232396B1

KR100232396B1 - 보호기, 이 기로 보호된 화합물 및 보호된 화합물상에 보호기를 그라프트하기 위한 장치

Info

Publication number: KR100232396B1
Application number: KR1019930701991A
Authority: KR
Inventors: 라피 길리; 라미지 로베르뜨
Original assignee: 로디아 쉬미
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1991-12-31
Publication date: 1999-12-01
Also published as: DE69131168D1; JP3286316B2; JPH06506914A; EP0565607A1; WO1992012167A1; ES2133313T3; HU217033B; KR930703346A; BR9107286A; GB2251242B; AU669324B2; HU9301892D0; GB9028208D0; GR3030169T3; ATE179180T1; DE69131168T2; DK0565607T3; HUT69324A; EP0565607B1; GB2251242A

Abstract

[보호기]

하기식 (I)의 보호기 :

Ar - L -

[식중, Ar은 실질적으로 평면인 4 이상의 방향족 고리를 함유하는 융합 고리계를 나타내고, L은 보호될 기에 결합할 수 있는 하나 이상의 탄소원자를 함유하는 기를 나타낸다.]

Description

보호기, 이 기로 보호된 화합물 및 보호된 화합물상에 보호기를 그라프트하기 위한 장치

본 발명은 신규 보호기 및 특히 펩티드 합성에서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 더 구체적으로, 합성하는 동안 또는 말기에 화합물, 특히 펩티드 정제를 용이하게 하는 보호기에 관한 것이다.

유기 합성에서, 특히 다단계에서 수득한 생성물의 정제는 합성 그 자체 보다 더 많은 문제점을 가질 수 있다. 이것은 특히 체계적으로 보호기를 사용하고 또한 보충 역할도 할 수 있는 펩티드 합성의 경우에 사실이다.

그러므로, 아미노산중에 있는 특정한 관능기를 보호 또는 활성화하기 위한 필요는 정제 단계를 용이하기 위해서 두상 (biphase) 펩티드 합성을 수행하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 메리필드 기술 (Merrifield technique) [J. Amer. Chem. Soc. 1986, 108,5242) 등과 같은 이러한 기술에는 펩티드 합성중의 정제 문제가 완전히 해결되지 않았다. 이러한 문제점을 위한 가장 훌륭한 해결책 중의 하나는 작업 및 정제 공정중, 물리적으로 가역적인 방법으로 고체에 결합시켜 펩티드 또는 보호가 필요한 다른분자를 변성하는 것이다. 오늘날까지 이러한 성질을 발휘할 수 있는 보호기는 개시되고 있지 않다.

이러한 이유 때문에 본 발명의 주요 목적 중의 하나는 상기 기준에 대응되는 보호기를 제공하는 것이다.

제1도 및 제2도는 실시예에서 기재한 바와 같이 본 발명의 화합물중의 하나에 대한 X - 선 결정 구조를 나타낸다.

본 발명은 하기식 (I)의 보호기를 제공하는 것이다 :

Ar - L -

[식중, Ar은 실질적으로 평면인 4이상의 방향족고리를 함유하는 융합 고리계를 나타내고, L은 보호될 기에 결합할 수 있는 1 이상의 탄소 원자를 함유하는 기를 나타낸다.]

Ar기는 바람직하게는 6이상의 방향족고리를 함유하며 방향족 고리는 바람직하게는 육각 구조 (hexagonal)이다. 바람직하게는 Ar은 헤테로 원자를 함유하지 않는다.

예를 들어, L기는 알킬기 또는, 특히, 펩티드 기 일 수 있다. 일반적으로, 기 L은 보호기와 보호될 분자간에 연결을 형성하기 위한 당해 공지의 것으로 임의의 가교 또는 측쇄로 구성될 수 있다. 기 L은 바람직하게는 탄소 원자에 의해 기 Ar에 연결되는 것이다. 기 L은 기 Ar과 이탈기사이에 공액결합이 없게 선택된다. 바람직하게는, 기 L은 기 - CR′- L′- (식중, L′는 하기에서 정의되며 R′는 알킬기 바람직하게는 탄소수 4 이하의 알킬기 이거나, 또는 수소 원자이다)로 구성된다. 본 발명의 바람직한 기는 하기식 (II)이다:

[식중, n은 0 또는 1이며 ; O은 n이 1일때 주위의 고리가 방향족이고, n이 0일때 비방향족인 것을 의미하고 ; 한편으로는 R₁및 R₂와 또다른 한편으로는 R₃및 R₄는 그들에 부착된 탄소원자와 함께 융합 방향족 고리계를 각기 형성할 수 있도록 선택되며 ; R′는 알킬기 또는 수소이고 ; 및 L′는 직접 결합을 나타내거나 보호될 기에 결합할 수 있는 기를 나타낸다.]

보호기를 강성화 하기 위해서, 바람직하게는 육각 구조이며 유리하게는 헤테로 원자를 함유하지 않는 하나 이상의 보충 방향족 고리를 형성하기 위해 선택된 기 R₅를 제공하여 하기식 (III)의 기를 수득하는 것이 가능하다 :

n이 0일때 중심 고리와 R₅사이에는 결합이 없으며 n이 1일 때 R₅및 R₃사이의 결합은 임의이지만 바람직하다.

방향족 고리의 전체수는 유리하게는 4 ∼ 8이다. 유리 정점은 “넓은 뜻으로” 알킬기, 유리하게는 짧은 사슬 (탄소수 1 ∼ 5)를 갖는 알킬기로 치환될 수 있다. 기에 있는 탄소원자의 총수 (연결 L의 수는 세지 않음)는 일반적으로 탄소수 20 ∼ 60, 바람직하게는 탄소수 25 ∼ 50 이다.

합성에 의한 접근의 용이성 때문에, 한편으로는 R₁및 R₂, 다른 한편으로는 R₃및 R₄와 R₅는 중심 고리에 대하여 (연결 L에 부착된 메틸렌을 운반하는 탄소의 내부 고리각의 등분선에 대하여) 대칭인 계를 형성하기 위해 유리하게 선택된다.

본 발명은 상술한 기로 보호된 분자가 활성탄을 포함하는 흑연화된 표면 또는 흑연에 매우 강하게 흡수된다는 것을 알아냈다는 사실에 근거한다. 또한, 본 기술의 하기 부분에서 설명되는 바와 같이, 이 흡착은 가역적이다.

방향족 고리가 기에 의하여 더 많이 운반될 수록 흡착은 더 좋으며 용리가 더 어렵게 되고, 반대도 또한 같다. 최적은 당해 공지기술의 경우에 의해 정의될 수 있다. 그러나, 일반적인 구성에서 중심 고리 이외에 4 ∼ 8의 방향족 고리수는 경제적인 측면과 흡착 및 용리 기준의 측면 모두로 만족스럽다.

특히 라디칼 R₅가 없는 n이 0인 기는 더 쉽게 접근 가능하다.

본 발명에 따른 군의 화학은 n이 0일때 기 fmoc에 대해서와 동일하며 다른 경우에는, 예를 들어 n이 1일때는 벤질기에 대해서와 동일하다.

기 fmoc에 대한 화학은 공지이고 보호기에 관한 일반 공고 뿐만 아니라 논문 [CARPINO-J. Amer. Chem. Soc. 1970, 92, 5748, J. Org. Chem. 1972, 37, 3404, Synthesis 1983, p. 671, F. Org. Chem. 1983, 48, 77, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 22, 125, Biopolymers 1983, 22, 2157]에서 참고할 수 있다.

상기 기들은 하기 반응순서 또는 그와 동등하게 하여 쉽게 수득할 수 있다.

벤질기의 화학도 또한 공지되었으며 상기 주제에 대한 특정한 공고 및 가르침을 참고로 하는 것이 적당하다. 또한 새로운 장을 연 논문 [Int. J. Peptide Protein, Res, 1986, 27, 358 ; Synthesis 1986, p. 303 ; J. Org. Chem. 1983, 48, 661 및 666]을 참고할 수 있다.

본 발명의 기는 상술한 논문에서 기술한 방법 및 프리델 - 크라프츠 반응등과 같은 공지의 기술로 제조될 수 있다.

상기 논문에서는 상기 구체화한 기가 보호될 관능기에 그라프트 하는 방법을 공지의 기술로 나타낸다. 이 기들은 예를 들어 산, 알콜, 티올, 아민 또는 아미드 관능기를 갖는 분자를 변성시키는데, 보호된 분자도 본 출원의 주제이다. 이러한 방법으로 보호된 분자는 어떠한 종류의 분자라도 가능하지만 더 일반적으로 아미노산 또는 펩티드이다.

펩티드의 구성 아미노산은 천연 또는 합성에 의해 수득될 수 있으며 ; 펩티드 및/또는 아미노산은 그들의 각종관능기상에 보호되거나 치환될 수 있다.

본 발명에 따라 놀랍게도 상기보호기로 변성된 분자는 활성탄을 함유하는 흑연화된 물질의 컬럼 또는 흑연 컬럼상에서 상당히 잘 체류된다는 것을 밝혀냈다. 이러한 분자는 키랄 분리에 잘 적용된다.

전체 또는 표면에 탄소를 함유하는 흑연화한 물질하에서 일반적인 열분해로 흑연화 처리를 수행하는 것이 상책이다.

본 발명의 보호기의 강한 친화력은 펩티드 정제를 위해 특히 적당하다는 것을 의미한다. 활성탄의 사용은 흑연과 동등한 결합을 제공하며 활성탄이 흑연화한 탄소(PGC) 보다 더 싸기 때문에 바람직하다.

본 발명은 또한 질소, 산소, 황, 셀렌, 텔루르, 규소 또는 할로겐 원자를 함유하는 기등과 같은 이탈기에, L 또는 L′기를 통해 부착된 상술한 기를 함유하는 보호화합물을 제공하는것이다. 이탈기의 예로는 할로겐 원자 (예 F, Cl, Br 또는 I) 또는 -OH, -COOH, -NH₂, -CONH₂, -SO₃C₆H₄-PCH₃, -SH, -CN 또는 -Si(CH₃)₃기이다.

본 발명에 따른 기는 특히 또다른 유리한 특성을 가지고 있다. 즉 그들중의 대다수는 천연 아미노산과는 다른 파장에서 가시광선 또는 자외선의 흡수제이다. 이러한 기의 몇개는 천연 아미노산의 파장과는 다른 파장에서 형광을 발한다.

이러한 성질은 연속 또는 동시사용을 위하여 하기를 함유하는 장치를 개발할 수 있게 한다 :

a) 흑연물질, 바람직하게는 흑연 또는 활성탄으로 채워진 챔버(chamber), 예를 들면 컬럼, 및 b) 분자상에 상기 정의된 보호기를 그라프트 하기 위한 키트(kit).

보호기를 그라프트화 하기 위한 키트가 보호될 분자상에 보호기를 그라프트 하기 위한 당해 공지 기술로 알려진 각종 시약을 함유하는 반면 흑연 또는 흑연화한 물질은 상기 정의 하였다.

이러한 장치는 자외(UV), 가시 분광 측정기, 또는 형광 분광 측정기가 부착된 분획 - 수집 계(C)로 유리하게 완성된다.

예를 들어 Tbfmoc기는 형광 라벨로서 작용할수 있다. 들뜸 파장(excitation wavelength) : 383㎚ ; 방출 파장 : 424㎚. 높은 감도의 기술이 필요한 매우 낮은 농도의 본 발명의 화합물을 검출하는, 면역학에서 특히 유리하다.

그러므로 분자, 특히 펩티드 분절을 합성 및/또는 분리하기 위한 하기 단계를 함유하는 신규 방법을 개발하는 것이 가능하다 :

(F) 벤젠

(G) 디클로로메탄

(H) 메탄올 / 클로로포름 / 아세트산 (1 : 9 : 0.5)

(I) n - 부탄올 / 아세트산 / 물 (3 : 1 : 1)

화합물의 시각표상은 하기방법의 적당한 조합으로 성취된다 : 요오드 증기, 254㎚ 또는 352㎚에서 자외선흡수, 중성 과망간산 칼륨 및 브로모페놀 블루 스프레이, 산 관능기를 위한 메리 시약 (Mary's reagent) (4,4′- 비스 (디메틸아미노) 디페닐 카르비놀) 및 유리아미노기가 있는 화합물을 위한 닌히드린, 광학 회전은 본문에 인용된 용매중 1dm 셀을 사용한 AA 1000 편광계 상에서 측정된다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 워터스 (Waters) 시스템 즉 2 x 600 A 펌프, U 6K 사출기, 680 자동 구배 조절기, 모델 441 자외 검출기 ; 또는 어플라이드 바이오시스템즈 시스템 (Applied Biosystems system), 즉, 2 x 1406A 용매 운반 시스템, 1480 A 사출기 / 혼합기, 및 1783 A 검출기 / 조절기를 사용하여 수행된다. 분석 분리는 본문에서 지시한 조건하에서 화트만 파르티실-5 (Whatman Partisil-5) ODS-3 (4.6mm ID x 250mm) 및 ABI (RP18) 아쿠아포르 OD-300, 300Å 공극크기, 7㎛ 구형 실리카 (4.6mm ID x 220mm) 컬럼상에서 수행한다. 플래쉬 크로마토그래피는 실리카겔 - 분리될 화합물의 혼합물중 하나 이상의 화합물에 있는 하나 이상의 기를 상술한 기로 보호하고, - 흑연 물질로 채워진 챔버를 통해 화합물의 혼합물을 통과시킨다.

본 발명은 또한 분자의 하나 이상의 관능기를 보호하기 위한 상기 정의된 기의 용도를 제공하는 것이다.

지금부터 본 발명을 하기 실시예로 더 설명한다 :

모든 아미노산 유도체는 플루카 (Fluka), 알드리치 (Aldrich) 또는 시그마 (Sigma)에서 구입한다. 융점은 전기로 가열된 부치 (Bchi) 510 융점 장치상의 개방 모세관 또는 전기로 가열된 레이체트 7905 핫 스테이지 (Reichert 7905 hot stage) 상의 현미경 슬라이드에서 측정하였고 수정하지 않았다. 박층 크로마토그래피 (t.l.c)는 하기 시스템 중에서 실리카겔 60 GF - 254 (Merck 5735)로 피복된 플라스틱 시이트를 사용하여 수행한다 :

(A) 에틸 아세테이트 / 페트롤 (끓는점. 40 ∼ 60℃) (1 : 4)

(B) 메탄올 / 클로로포름 (1 : 9)

(C) 톨루엔

(D) 클로로포름

(E) 에틸 아세테이트

60 (230 ∼ 400 메쉬 (플루카) ; 조물질 1g 당 60 ∼ 100g의 실리카 ; 활성 길이 15 ∼ 20cm)을 사용하여 수행한다. 적외 스펙트라는 지시된 용매 또는 KBr 디스크 기술로, 표준으로서 폴리스티렌 (1603cm^-1)을 사용하여 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer) 781 분광 광도계 상에 기록한다. 자외 스펙트럼은 캐리 (Cary) 210분광 광도계 상에 기록하고 형광 스펙트라는 퍼킨 엘머 LS-5 루미네센스 분광 광도계 상에 기록한다. 질량 스펙트럼은 크라토스 (Kratos) MS 50 TC 기계상에서 측정한다. 프로톤 핵자기 공명 (㎚R) 스펙트럼은 표준으로서 외부 테트라메틸실란 (δ = 0.00)을 사용한 지시된 용매중에서 부루커 (Brker) WP 80 (80MHz), WP 200 (200MHz) 또는 WH 360 (360MHz) 기계 상에 기록한다. 탄소 - 13 ㎚R 스펙트럼은 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하여 지시된 용매중에서 부루커 WP 200 (50MHz) 또는 WH 360 (90MHz) 기계 상에 기록한다. 원소 분석은 카를로 엘바 (Carlo Erba) 모델 1106 원소 분석기 상에서 수행한다.

단일 결정 X - 선 구조 측정은 흑연 - 단색 (CU - K_α선 : λ = 1.54184Å) 화된 스토에 스타디 - 4 - 원 (Stoe Stadi - 4 four - circle) 회절기 상에서 수행된다. 모든 용매는 사용하기전에 증류하고 그후 필요할때 괄호안에 주어진 시약을 사용하여 건조한다 : 벤젠 (나트륨 선), 클로로포름 (오산화 인), 디클로로메탄 (수소화 칼슘), 디에틸 에테르 (나트륨 선), 디옥산 (중성 알루미나 및 나트륨 선), 메탄올 (마그네슘 - 요오드), 톨루엔 (나트륨 선). 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃)은 40℃ ∼ 60℃에서 끓는 분획을 말한다.

[13 - 히드록시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌의 합성]

메틸 (페난트렌 - 9 - 일, 페닐) 히드록시아세테이트 (25)

메틸 (페난트렌 - 9 - 일, 페닐) 5 - 히드록시아세테이트 (25)의 합성은 9 - 페난트레닐 리튬 (23)과 메틸벤조일 - 포르메이트의 반응에 의해 에테르 중에서 수행된다.

질소하 건조 에테르 (10ml) 중에 있는 9 - 브로모페난트렌 (2.57g, 10mmol)의 차가운 (0℃) 용액에, 헥산중의 n - 부틸리튬용액 (8ml, 11mmol ; 1.1당량 ; 1.38 M 적정)을 10분간에 걸쳐 적가한다. 반응 혼합물은 실온에서 1 시간 교반한다. 수득한 현탁액을 방치하고 그후 상청액은 주사기로 제거한다. 잔류물은 에테르 (5ml) 중에서 다시 현탁시킨다. 이 용액을 질소하에서 50ml의 디에틸에테르에 용해된 메틸 벤조일포르메이트의 차가운 (0℃) 용액 (1.64g, 1.4ml, 10mmol)에 가한다. 수득한 혼합물을 2시간 환류하에 가열하고 밤새 교반한다. 묽은 (10% v/v) HCl (50ml ; pH=1)을 가한 후에, 유기층을 분리하고, 수성층의 에테르 세척액 (2 x 50ml)와 혼합하고, 물 (2 x 50ml)로 세척하고 MgSO₄로 건조한다. 용매는 진공하에서 제거하여 황색 오일을 수득한다. 플래쉬 (flash) 크로마토그래피 (용리액 : (A))로 정제한 후, 페트롤로 분쇄한 황색오일을 수득한다. 수득한 백색고체를 여과하고 진공 건조기에서 건조하여 필요한 화합물 (1.75g, 51%)를 수득한다 ; 융점 143 ∼ 145℃ (실측치 : C, 79.7 ; H, 5.24 C₂₃H₁₈O₃계산치 : C, 80.7 ; H 5.26%) ; t.l.c. R_f(A) 0.32 ; R_f(B) 0.76 ; υmax CH₂Cl₂3690 (유리 OH), 3510 (H 결합 OH), 3025 (CH 신축, 아릴), 2960, 2880, 2860, (CH 신축, 알킬), 1730 (CO, 에스테르), 1600, 1500 (방향족 고리), 1225, 1185, 1170, 1110, 1100, 1070 (CO 신축) cm^-1; λ_max296 (9832), 284 (9200), 276 (11981), 254 (48450), 248 (37620) ㎚ ; δ_H(CDCl₃, 200 MHz) 8.72 (1H,d,³J=8Hz, 방향족), 8.66 (1H,d,³J=8Hz, 방향족), 8.16 (1H,d,³J=8Hz, 방향족), 7.75 ∼ 7.25 (11H, m, 방향족), 4.32 (1H,s,OH), 3.85 (3H,s,CH₃) ; δ_C(CDCl₃, 50 MHz) 175.7 (CO, 에스테르), 141.1, 135.6, 131.3, 130.6, 130.3, 129.8 (사차 방향족 C′s), 129.1, 128.2, 128.1, 127.3, 127.0, 126.9, 126.6, 126.2 126.1, 122.9, 122.2 (방향족 CH′s), 82.1 (C₁, 사차), 53.4 (CH₃) ; m/z (EI) 342, 283, 105.

[13 - 카르복시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (26)]

산 조건 (10℃에서 진한 H₂SO₄, CH₃COOH) 하에서 (25)를 처리하여 불량한 수율의 (26)을 형성한다.

놀랍게도 110℃에서 PPA와 함께 (25)의 처리는 42% 수율의 소망하는 에스테르를 형성한다.

다가인산 (60g)을 110℃로 가열하면서 기계 교반 패들로 교반한다. 여기에 메틸 (페난트렌 - 9 - 일, 페닐) 히드록시아세테이트 (5g, 14.6mmol)을 가한다. 혼합물은 110℃에서 1시간 교반한다. 그후 반응을 실온까지 냉각하고 물(150ml)로 희석한후 에틸아세테이트(4 x 250ml)로 추출한다. 유기층을 혼합하고, NaHCO₃(10% v/v ; 200ml), 물 (100ml)로 세척하고 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 진공에서 제거하여 황색고체를 수득한다. 이러한 조 고체를 용리액으로서 톨루엔을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제한다. 크로마토그래피한 후 필요한 화합물 (2.82g, 60%)을 단리할 수 있다. 이 고체를 CH₂Cl₂/ 페트롤 (끓는점. 40 ∼ 60℃)로 재결정하여 백색 고체 (1.96g, 42%)를 수득한다 ; 융점 190 ∼ 191℃ (실측치 : C, 85.2 ; H, 4.93 C₂₃H₁₆O₂계산치 : C, 85.2 ; H, 4.94 %) ; t.l.c. R_f(C) 0.50 ; R_f(D) 0.56 ; υmax (CH₃Cl₂), 3040, 3020 (CH 신축, 아릴), 2970 (CH 신축, 알킬), 1730 (CO, 에스테르), 1610, 1600, 1580 (방향족 고리) cm^-1; λ_max364 (540), 346 (16200), 322 (18360), 268 (64800) ㎚ ; δ_H(CDCl₃, 200 MHz), 8.84 ∼ 8.67 (3H,m, 방향족), 8.36 (1H,d,³J=7.8Hz, 방향족), 7.98 ∼ 7.90 (1H, m, 방향족), 7.80 ∼ 7.35 (7H, m, 방향족), 5.16 (1H,s, CH), 3.63 (3H,s, CH₃) ; δ_C(CDCl₃, 50 MHz), 172.0 (CO, 에스테르), 142.7, 141.9, 137.4, 135.6, 131.1, 130.0, 128.7, 128.4 (사차 방향족 C′s), 128.1, 127.0, 126.7, 126.3, 126.2, 124.3, 124.1, 123.8, 123.3, 123.2, 122.9 (방향족 CH′s), 53.4 (CH₃), 52.4 (CH) ; m/z (EI) 324, 265, 262, 132.

[13 - 히드록시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (21)]

에스테르 (26)의 환원은 -50℃에서 디클로로메탄 중에 있는 디이소부틸 알루미늄 수소화물 (DIBAL - H) 3당량을 사용하여 48% 수율로 수득한다.

디이소부틸 알루미늄 수소화물 (4.6ml, 4.62mmol ; CH₂Cl₂중의 1M)을 디클로로메탄 (10ml)에 용해된 13 - 카르복시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (0.5g, 1.54mmol)의 용액에 -65℃에서 가한다. 반응 혼합물은 3시간 동안 교반하고 온도를 -50℃ ∼ -40℃로 유지한다. 백색 침전물을 수득한다. 반응 혼합물은 아세트산과 물 (1 : 1 ; 30ml)의 혼합물로 처리하고 디클로로메탄 (3 x 60ml)로 추출한다. 유기층을 포화 중탄산염 (50ml), 물 (30ml)로 세척하고 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 진공하에서 제거하여 조 고체를 수득한다. 이 조 고체를 용리액으로 클로로포름을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제한다. 표제 화합물은 페트롤로 세척한 백색 고체로서 수득한다 (0.217g, 48%) ; 융점 167 ∼ 168℃ ;

이 방법은 4 단계로 13 - 히드록시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (21)의 합성을 전체 10% 수율로 제공한다.

이어서, PGC로 채워진 HPLC 컬럼상에서의 행위를 비교하기 위해서 알콜 (21)과 9 - 플루오렌메탄올 (제조는 하기에 나타냄) 모두의 아세테이트를 제조한다.

9 - 플루오레닐메틸 아세테이트 (29)는 체류시간이 3.3분 (CHCl₃로 용리)인 반면, 동일한 조건하에서 13 - 아세톡시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (30)은 컬럼상에 완전히 체류되진않지만 느리게 용리된다.

[13 - 아세톡시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (30)의 제조]

13 - 히드록시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌 (215.2mg, 0.727mmol)을 아세트산 무수물 (5ml)에 용해한다. 이 용액에 황산 (2M) 한방울을 가한다. 반응 혼합물을 30분간 교반한다. 수득한 백색 침전물은 여과 및 물(150ml)로 세척한다. 고체는 최종적으로 진공 건조기안에 있는 일정 중량의 P₂O₅에서 건조하여 백색 고체로서 13 - 아세톡시메틸디벤조 (a,c) 플루오렌을 수득한다 (206.3mg, 84%) ; 융점 135 ∼ 136℃ ; (실측치 : C, 84.9 ; H, 5.33 C₂₄H₁₈O₂계산치 : C, 85.2 ; H, 5.33 % ; t.l.c. R_f(D) 0.57 ; R_f(E) 0.68 ; υmax (CH₂Cl₂) 3030 (CH 신축, 아릴) 2980, 2920 (CH 신축, 알킬) 1735 (CO, 에스테르), 1610, 1600, 1570 (방향족 고리) cm^-1; λ_max366 (1184), 338 (25160), 322 (27528), 265 (52688), 246 (53020) ㎚ ; δ_H(CDCl₃, 200 MHz), 8.86 ∼ 8.69 (3H,m, 방향족), 9.38 (1H, d,³J=7.9Hz, 방향족), 8.30 ∼ 8.25 (1H,m, 방향족), 7.78 ∼ 7.35 (7H,m, 방향족), 5.16 (1H,dxd,³J_a,c=4.1Hz,²J_a,b=10.8Hz, H_a, CH₂), 4.56 (1H, dxd,³J_c,a=4.1Hz,³J_c,b=9.3Hz, H_c), 3.76 (1H, dxd,²J_b,a=10.8Hz,³J_b,c=9.3Hz, H_b, CH₂), 2.17 (3H,s,CH₃) ; δ_C(CDCl₃, 50 MHz) 171.0 (CO, 에스테르), 146.7, 142.1, 138.7, 134.8, 131.1, 130.1, 128.7, 128.6 (사차 방향족 C′s), 127.6, 127.0, 126.8, 126.2, 126.1, 125.7, 124.9, 124.8, 124.3, 123.4, 123.3, 122.9 (방향족 CH′s), 67.3 (CH₂), 46.5 (CH), 20.9 (CH₃) ; m/z (EI) 338, 277, 265, 139, 43.

HPLC : 컬럼 (ODS3-PL5-393, 용매 : A(H₂O), B(CH₃CN)

조건 : B (50%) 2분.

λ = 254 ㎚, 유속 : 1 ml / 분, 주입 : 5㎕, C = 1.42 mg / ml, AUFS = 2,

체류시간 : 21.6 분.

[9 - 플루오레닐메틸 아세테이트 (29)의 제조]

9 - 플루오레닐 메탄올 (0.215g, 1.1mmol)을 아세트산 무수물 (5ml)에 용해한다. 이 용액에 황산(2M)을 두방울 가한다. 이것을 30분간 교반한다. 깨끗한 용액을 냉수 (20ml)에 붓는다. 수득한 침전물을 뷔흐너 여과기 상에서 수집하고 진공 건조기 안에 있는 일정 중량의 P₂O₅상에서 건조하여 백색 고체로서 9 - 플루오레닐메틸 아세테이트 (0.175g, 67%)를 수득한다. 융점 : 83 ∼ 84℃ ;

[실시예 2]

[17 - 히드록시메틸 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (31)의 합성]

테트라벤조플루오레닐 알콜 (31)을 하기와 같이 제조한다.

(a) BuLi, Et₂O, 체류시간., 30 분 ; EtOOCCOOEt, Et₂O, 0℃ ∼ 5℃, 2h, 63% ; (b) 9 - 브로모페난트렌, BuLi, Et₂O, 체류시간., 30분 ; (32), Et₂O, 0℃ ∼ 5℃, 2h, 46% ; (C) PPA, 140℃, 4h, 49% ; (d) DIBAL-H (3 당량), CH₂Cl₂, -65℃, 1h, 73%.

[에틸, 2 옥소 - 2 - (페난트렌 - 9′ - 일) 아세테이트 (32)]

0℃에서 에테르에 용해된 디에틸옥살레이트 용액 (20% 과량)에 9 - 페난트레닐 리튬을 가하여 α - 케토 에스테르 (32)를 합성한다. 반응 혼합물은 2시간 동안 환류하에서 연속해서 가열한다. 플래쉬 크로마토그래피로 정제한 후, 생성물을 23% 수율로 단리한다.

α - 케토 에스테르 (32)도 또한 0℃ ∼ 5℃에서 디에틸 옥살레이트의 용액 (20% 과량)에 9 - 페난트레닐 리튬을 조심스럽게 가하고, 이어서 실온에서 반응물을 교반하여 에테르 중에서 유리하게 제조할수 있다.

건조 에테르 (20ml) 중에 용해된 9 - 브로모페난트렌 (5.14g, 20mmol)의 교반 용액에 헥산중에 용해된 n -부틸 리튬 용액 (16ml, 22mmol ; 1.1 당량 ; 1.38M 적정)을 질소하 0℃에서 10분간에 걸쳐 적가한다. 반응물을 실온에서 1시간 교반한다. 수득한 현탁액을 방치하고 상청액은 주사기로 제거한다. 잔류물은 에테르 (10ml)에 다시 현탁시킨다. 이 현탁액을 질소하에서 에테르 (100ml)에 용해된 디에틸 옥살레이트 (3.4ml, 25mmol)의 차가운 (0℃) 용액에 가한다. 온도를 가하는 동안 0℃ ∼ 5℃로 유지한다. 반응 혼합물은 그후 0℃ ∼ 5℃에서 2시간 교반하고 마지막으로 실온에서 2시간 교반한다. 묽은 HCl (100ml ; 10% v/v) 첨가후, 유기층을 분리하고 수성층의 에틸 아세테이트 세척액 (3 x 100ml)과 혼합하고, NaHCO₃용액 (100ml : 1M)로 중화하고 물 (50ml)로 세척한 후 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 진공하에서 제거하여 페트롤 (융점 40℃ 60℃)로 분쇄시킨 오렌지색 오일을 수득한다. 여과 및 건조된 표제 화합물을 황색 고체로서 수득한다 (3.53g, 63%) ; 융점 : 67 ∼ 68℃ ;

[에틸 (비스 - 페난트렌 - 9′ - 일) 히드록시 아세테이트]

케토 에스테르 성분으로서 (32)를 사용하여 유사한 조건하에서 적당한 수율로 삼차 알콜 (33)을 합성한다.

건조 에테르 (10ml)에 용해된 9 - 브로모페난트렌 (2.57g, 10mmol) 교반 용액에 질소하 0℃에서 헥산¹²⁷에 용해된 n - 부틸리튬 용액 (8ml, 11mmol ; 1.1 당량 ; 1.38M 적정)¹⁴⁴을 10분에 걸쳐 적가한다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 교반한다. 이 용액을 질소하에서 에테르 (50ml)에 용해된 에틸, 2 - 옥소 - 2 - (페난트렌 - 9′- 일) 아세테이트 (2.78g, 10mmol)의 차가운 (0℃) 용액에 가한다. 첨가하는 동안 온도는 0℃ ∼ 5℃로 유지한다. 반응 혼합물은 최종적으로 실온에서 2시간 교반한다. 묽은 HCl (50ml ; 10% v/v)을 가한후 유기층을 분리하고, 수성층의 에틸 아세테이트 세척액 (3 x 250ml)과 혼합하고, NaHCO₃용액 (1M : 200ml)로 중화하고, 물 (200ml)로 세척한 후 최종적으로 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 진공하에서 제거하여 잔류물을 수득한다. 클로로포름 / 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃) (4 : 1)을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제한 후, 목적 생성물을 R_f= 0.23의 물질을 함유하는 분획으로 부터 수득한다.

디클로로메탄 / 페트롤 (끓는점 40℃ ∼ 60℃)로 부터 재결정한 후, 수득한 백색고체를 여과 및 건조하여 표제화합물(2.11g, 46%)을 수득한다 ; 융점 : 188 ∼ 189℃ ; (실측치 C, 83.1 ; H, 5.23 C₃₂H₂₄O₃계산치 : C, 84.2 ; H, 5.26 %) ; t.l.c R_f(E) 0.71 ; R_f(D) 0.48 ; υ_max(CH₂Cl₂) 3680 (유리 OH), 3510 (H 결합 OH), 3060 (CH 신축, 방향족), 2990, 2940 (CH 신축, 알킬), 1735 (CO, 에스테르), 1600 (방향족 고리) cm^-1; λ_max332 (629), 300 (25080), 288 (23560), 256 (123120) ㎚ ; δ_H(CDCl₃, 200 MHz), 8.80 ∼ 8.69 (4H,m, 방향족), 8.51 (1H,s, H₁₀, 방향족), 8.47 (1H, s, H₁₀, 방향족), 7.72 ∼ 7.41 (12H, m, 방향족), 4.46 (1H,s, OH), 4.41 (2H, 9,³J=7.1Hz, CH₂), 1.17 (3H, t,³J=7.1Hz, CH₃), δ_c(CDCl₃, 50 MHz) 175.7 (CO, 에스테르), 135.0, 131.4, 130.6, 130.5, 130.1 (사차 방향족 C′s), 129.2, 128.2, 127.3, 126.6, 126.2, 126.1, 122.9, 122.3 (방향족 CH′s), 84.3 (C₁, 사차), 62.9 (CH₂), 13.8 (CH₃) ; m/z (EI) 383, 206, 177, 176.

[17 - 카르복시에틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (34)]

140℃에서 다가 인산과 함께 (33)의 처리로 α - 에톡시카르보닐 디아릴 양이온의 4π - 전자 고리화 (4π - electrocyclisation)를 통해 49% 수율로 고리 에스테르 (34)를 형성하게 한다.

(34)의 정제는 부산물의 형성때문에 어렵다. 플래쉬 크로마토그래피 후 조 물질의 재결정화를 수행할 수 있다.

다가 인산 (20g)을 기계 교반 패들이 부착된 3 목 100ml 둥근 바닥 플라스크에 넣는다. 에틸 (비스 - 페난트렌 - 9′- 일) 히드록시 아세테이트 (0.402mg, 0.881mmol)를 그후 가하고 반응물을 140℃ 에서 4시간 교반한 후 실온에서 밤새 교반한다. 반응 혼합물은 물 (50ml)로 희석하고 에틸 아세테이트(4 x 50ml)로 추출한다. 유기층을 NaHCO₃(1M ; 2 x 30ml)로 중화하고, 물 (30ml)로 세척한 후 플래쉬 크로마토그래피 하고 DCM 으로 부터 재결정화 하여 (31)의 결정을 수득하였으며 X - 선 분석용으로 적당하다는 것이 증명되었다.

디이소부틸알루미늄 수소화물 (12.3ml, 12.3mmol ; 3 당량 ; CH₂Cl₂에서 1M 용액)을 -65℃에서 건조 증류된 디클로로메탄 (25ml)에 용해된 17 - 카르복시에틸 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (1.795g, 4.098mmol) 용액에 적가한다. 온도를 첨가하는 동안 -65℃ ∼ -60℃로 유지한다. 반응 혼합물을 -65℃에서 1시간 교반하고 실온에서 1시간 더 교반한다. 반응 혼합물을 -30℃로 냉각한다. 그후 아세트산 수용액 (50ml ; 10% v/v)을 적가한다. 두층을 분리한 후, 수성층은 디 클로로메탄 (3 x 100ml)로 추출한다. 혼합된 유기상을 물 (70ml)로 세척하고 NaHCO₃로 중화한다. 최종적으로 유기상을 MgSO₄상에서 건조하고 증발하여 조 오일 (1.7g)을 수득한다. 용리액으로서 벤젠을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제한 후 R_f=0.14의 물질을 함유하는 분획을 증발시켜 황색 고체를 수득한다. 이것을 CH₂Cl₂/ 페트롤 (끓는점 40℃ ∼ 60℃)로 재결정하여 황색 고체로서 표제 화합물을 수득한다 (1.18g, 73%) ; 융점 202 ∼ 203℃ ;

알콜 (31)의 결정 구조는 두 히드록시기 사이에서 수소 결합으로 두 분자가 함께 유지되는것을 나타낸다. 제1도 및 제2도는 알콜 (31)의 결정 구조를 나타낸다. 고리밖 (exocyclic) 히드록시메틸기는 두개의 다른 형태를 갖는데, 아마도 수소 결합 이량체의 형성을 위해 필요시 되기 때문일 것이다. H₈과 H₉사이의 상호작용 (d = 2.03Å, 수소에 대한 반데르 발스 반경 = 1.2Å)은 분자중에 비 평면도 때문이다. 그러나, 분자는 본 발명의 목적을 위해서는 충분히 평면이다.

이러한 분자는 결정 구조에서 처럼 고정된 배향을 채택한다면 키랄이다. 그러므로 저온에서 용액중에 있는 분자도 고정된 배향을 채택하여 키랄이 되는 것도 가능하다. 실온에서 CDCl₃에서의¹H n.m.r은 메틸렌기 각각의 두 프로톤과 H(17)에 대응하는 삼중선 (δ = 5.05 ppm)과 이중선 (δ = 4.5 ppm)이 나타난다. 페난트렌 고리는 포착 기간동안 빠르게 진동하고 결과적으로 CH₂기의 프로톤은 자기적으로 동등 (방향족 프로톤의 꼭맞는 쌍 (matched pairs), 예를 들어 H(2) 및 H(15)) 하다고 설명할 수 있다.

이 화합물에 대하여 수행한 뉴클리어 오버하우제르 (Nuclear Overhauser) 실험은 메틸렌기와 두방향족 프로톤 H(1) 및 H(16)의 공간을 통한 상호작용이 밀접하다는 것을 나타낸다.

[실시예 3]

[17 - 아세톡시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (35)의 합성]

17 - 아세톡시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (35)를 다량의 아세트산 무수물과 촉매량의 황산을 사용하여 알콜(31)로부터 80% 수율로 쉽게 제조된다.

기대한 바와 같이, 아세테이트 (35)는 PGC로 채워진 HPLC 컬럼 (용리액 CHCl₃)을 통과할때 전체가 체류된다.

17 - 히드록시메틸테트라벤조 (a, ac, g, i) 플루오렌 (0.207g, 0.522mmol)을 아세트산 무수물 (4ml)에 용해한다. 이 용액에 두방울의 H₂SO₄(2M)을 가한다. 반응 혼합물은 1시간 교반한다. 물 (80ml)로 세척하고 진공 건조기 안에 있는 일정한 중량의 P₂O₅상에서 건조한 표제 화합물을 황색 고체로서 수득한다 (183.8mg, 80%) ; 융점 209 ∼ 210℃ ;

[실시예 4]

[17 - 히드록시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌에서 클로로포르메이트로의 전환]

하기 반응 순서로 클로로포르메이트 (37)을 합성한다 : 알콜 (31)과 N,N′- 비스 - 트리메틸실릴 요소 (2.5 당량)을 처리하여 대응하는 트리메틸실릴 에테르 (39)를 수득한후 후자를 포스겐과 반응시킨다. 재결정화 후 21% 수율로 순수한 생성물을 수득한다.

(a) N,N′- 비스 - 트리메틸실릴 요소 (2.5 당량), CH₂Cl₂, 환류, 3시간, 81% ; (b) 포스겐 (7.5 당량), CH₂Cl₂, 환류, 2시간, 21%.

[17 - (트리메틸실릴) 옥시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (39)]

디클로로메탄 (2ml)에 용해되어 있는 17 - 히드록시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (0.05g, 0.126mmol) 및 N,N′- 비스 - 트리메틸실릴 요소 (32.3mg, 0.158mmol ; 2.6 당량)의 용액을 환류하 3시간 가열한다. 침전된 요소를 여거하고 디클로로메탄 (2 x 1ml)으로 세척한다. 용매는 진공에서 제거하여 잔류물을 수득한다. 웨트 (wet) 플래쉬 크로마토그래피 (벤젠 / 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃) (75 : 25) 에 의한 정제로 표제 화합물 (47.8mg, 81%)를 수득한다. 융점 130 ∼ 131℃ ;

[17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (37)]

디클로로메탄 (5ml)에 용해된 17 - (트리메틸실릴) 옥시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (0.177g, 0.38mmol)용액에 포스겐 (1.5ml, 2.9mmol ; 7.5 당량 ; 톨루엔 중 1.93M)을 가한다. 반응 혼합물은 2시간 환류하에 가열한후 질소하 48시간 동안 실온에서 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여 디클로로메탄 / n - 헥산으로 재결정화한 표제 화합물을 황색 고체로서 수득한다 (36.9mg, 21%) ; 융점 188 ∼ 189℃ ;

[실시예 5]

[N^α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐글리신 (Tbfmoc Gly OH)의 제조]

Tbfmoc Gly OH는 알콜 (31)로 부터 p - 니트로페닐 카르보네이트 (41)를 경유하여 세단계로 합성된다.

(a) p - 니트로페닐 클로로포르메이트 (2 당량), N,N′- 디메틸아닐린 (1 당량), CH₂Cl₂, 체류시간., 72시간, 80% ; (b) CH₃COOH.NH₂CH₂COOC(Me)₃, N,N′- 디메틸아닐린 (2 당량), CH₂Cl₂, 체류시간, 24시간 79% ; (c) p - 톨루엔술폰산 (0.3 당량), CH₂Cl₂. 환류, 5시간, 90%.

시판의 p -니트로페닐 클로로포르메이트 (2당량)과 알콜 (31) 및 N,N′- 디메틸아닐린과의 반응으로 혼합된 카르보네이트 (41)을 80% 수율로 수득한다. 그후 상기 물질을 2당량의 N,N′- 디메틸아닐린의 존재하에서 글리신 t - 부틸 에스테르의 아세테이트염과 반응시켜 보호된 글리신 t - 부틸 에스테르(42) (79%)를 수득한다. 환류하는 DCM 중에서 p - 톨루엔술폰산을 사용하여 후자를 단순 가수분해 하여 90% 수율로 목적하는 산 (36)을 수득한다. 이것은 온화한 염기 조건을 사용하여 알콜 (31)을 기준으로 전체 수율 57%인 Tbfmoc Gly OH의 쉬운 합성이다.

[17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메틸 - p - 니트로페닐 카르보네이트 (41)]

디클로로메탄 (2ml) 에 용해된 17 - 히드록시메틸테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오렌 (0.05g, 0.126mmol) 및 p - 니트로페닐 클로로포르메이트 (35.5mg, 0.175mmol ; 1.4당량) 용액에 N,N′- 디메틸아닐린 (16㎕, 0.126mmol)을 가한다. 반응은 24시간 질소하 실온에서 교반한다. p - 니트로페닐 클로로포르메이트 (45mg, 0.223mmol ; 1.7 당량)을 더 가하고 실온에서 48시간 더 교반하여 반응을 완결한다. 용리액으로서 톨루엔을 사용한 플래쉬 크로마토그래피로 정제한후, R_f=0.29의 물질을 함유하는 분획을 증발시켜 황색 오일을 수득한다. 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃)에서 분쇄하여 황색 고체로서 표제 화합물 (56.5mg, 80%)을 수득한다 ; 융점 139 ∼ 140℃ ;

[N_α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐글리신 t - 부틸 에스테르(42)]

디클로로메탄 (1.5ml)에 용해된 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐 메틸 - p - 니트로페닐 카르보네이트 (39.2mg, 0.07mmol) 및 글리신 t - 부틸에스테르 아세테이트염 (14.7mg, 0.077mmol ; 1.1 당량) 용액에 N,N′- 디메틸아닐린 (18㎕, 0.14mmol; 2 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 72시간 질소하 실온에서 교반한다. 물 (10ml)을 가하고 KHSO₄(2M ; pH=1)로 산성화한후 반응혼합물은 디클로로메탄(3 x 15ml)로 추출하고, 물 (3 x 20ml)로 세척한후 MgSO₄상에서 건조한다. 용매를 진공에서 제거하여 에테르로 분쇄된 오렌지오일을 수득한다. 황색 고체를 수득하였으며, 이것을 여과, 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃)로 세척 및 건조시켜 표제 화합물 (30.6mg, 79%)을 수득한다 ; 융점 170 ∼ 171℃ ;

[N_α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐글리신, Tbfmoc GLYOH(36)]

디클로로메탄 (15ml)에 용해된 N_α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐글리신 t - 부틸 에스테르 (0.392g, 0.708mmol) 및 p - 톨루엔술폰산 (39.2mg, 0.206mmol) 용액을 4.5시간 환류하에 가열하고, 이시간 동안 침전물이 형성된다. 이 침전물을 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 15ml)으로 세척하고 건조하여 표제 화합물 (319mg, 90%)을 수득한다. 융점 240 ∼ 241℃ ;

[실시예 6]

[고체상 합성]

보호된 아미노산 유도체 모두를 노바비오켐 (Novabiochem)에서 구입했으며 L - 입체화학을 갖는다. 고체상 펩티드 합성은 어플라이드 바이오시스템즈 430A 펩티드 합성기 (Applied Biosystems 430A peptide synthesiser) 상에서 수행한다. 사용한 DMF는 라트번 (Rathburn) 화학회사에서 구입했다 (켑티드 합성 등급). 각 배열의 제1 잔기 (즉, C - 말단 잔기)는 합성기 바깥의 p - 알콕시벤질 알콜 수지에 카플링된다. 카플링 정도는 하중 수지의 작은 시료를 탈보호하고 Fmoc - 펩티드의 경우에 300㎚에서 Tbfmoc - 펩티드의 경우에 364㎚에서 UV로 생성된 올레핀을 정량적으로 체크한다. 각 잔기는 두번 (2 당량) 카플링되며, 첫번째는 대칭 무수물법과 두번째는 HOBt 활성 에스테르법 (‘이중 카플링’) (HOBt 에스테르에 의해 두번 카플링된 Arg, Asn, Gln 및 대칭 무수물에 의해 한번 카플링된 Gly (4 당량)을 제외)이다. 대칭 무수물을 Fmoc - 아미노산 (1mmol) 및 DICI (0.5mmol)로 부터 15분의 활성시간으로 제조하고 Fmoc - 아미노산 (0.5mmol), DICI (0.5mmol)과 HOBt (0.5mmol)로 부터 HOBt 에스테르를 30분의 활성시간으로 제조한다. 카플링 반응은 30 ∼ 60분간 수행한다. 미반응 아미노 관능기의 캡핑 (capping)을 DMF중 아세트산 무수물 및 피리딘을 사용하여 6분간 수행한다. Fmoc - 펩티드 - 수지의 탈보호를 DMF중 20% 피페리딘 용액을 사용하여 12분 (5 + 3 + 3 + 1분)에 걸쳐 성취한다. 각 사이클의 말기에 DMF로 수지를 철저히 세척한다. 카플링에 대한 대략적인 모니터로서, 탈보호 단계의 생성 용액은 자외선 검출기 (313㎚)를 통해 공급되고 그의 흡수는 일련의 피이크를 기록한다. 수지로부터 펩티드의 제거 및 동시에 측쇄 보호기의 분해는, 2 ∼ 3시간동안 트리플루오로아세트산 / 물 / 스캐빈저 (scavenger) (95 : 5 : 5)의 혼합물을 사용하여 수행한다. N^α- 보호 펩티드의 크로마토그래피는 유리 컬럼에서 흑연화한 탄소 (PGC 220 ∼ 224 ; 150 ∼ 180 pm, 100 ㎡/g)을 사용하여 수행한다. HPLC는 예비 분리를 위해서 ABI 아쿠아포르 프렙 10 C-18 300Å 구멍 크기 20㎛ 구형 실리카 (10 mm ID x 250 mm) 컬럼 및 분석 분리를 위해서 ABI RP 18 아쿠아포르 OD 300 7㎛ 구형 실리카 (4.6mm ID x 220mm) 컬럼을 사용한 워터스 시스템에서 수행한다. 용매 A (물중 0.1% TFA) 및 용매 B (아세토니트릴 중 0.1% TFA)를 괄호안에 명시된 바와같은 구배로 사용한다. 유속은 분석 HPLC을 위해 1ml / 분이고 예비 HPLC를 위해 5ml / 분이다. 시료의 용리는 214㎚에서 자외선 흡수로 모니터 한다. 아미노산 분석은 18 ∼ 36시간동안 110℃에서 일정 끓는점의 염산중에서 밀봉 관 가수분해 한후 LKB 4150 알파 아미노산 분석기 상에서 수행한다.

[Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH 및 Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH의 합성과 그의 성질의 비교]

a. Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH의 합성

보호된 수지 결합 펩티드 Fmoc Ser (O^tBu) Met Val Leu Ser (O^tBu) (43)을 수직적인 방법을 사용하여 펩티드 합성기에서 제조한다. Fmoc는 각 아미노산의 아민 관능기의 일시적인 보호를 위해 사용되며 DMF 용액중 20% 피페리딘과 함께 각기 카플링되기 전에 제거한다. 세린의 측쇄 관능기는 t - 부틸기로 보호된다. 카플링 공정은 대칭 무수물후 HOBt 에스테르 카플링을 포함한다. 아세트산 무수물 및 피리딘은 미반응 아미노 관능기를 아세틸화 하는데 사용된다. 메리필드 (Merrifield)수지는 연결제 (linker)로서 p - 알콕시벤질알콜기와 함께 사용된다.

Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (44)는 하기의 간략한 일련의 반응을 통해 수지 결합 펩티드 (43)으로 부터 합성된다.

염기성 조건하에서 Fmoc기의 탈보호후 펩티드의 아미노 말단을 디옥산 중에서 카플링하여 그의 대칭 무수물 (3당량)로 부터 Fmoc Gly OH를 88% 카플링 효율로 수득한다. 수지로 부터 헥사펩티드의 깨짐 및 t - 부틸기의 제거는 TFA를 사용하여 양이온 스캐빈저로서 에틸메틸술피드 및 아니솔의 존재하에서 수행된다. 진공중에서 용매를 제거한후 최종적으로 펩티드를 에테르로 침전시키고, 여과 및 건조한다. HPLC를 사용한 정제는 디옥산을 사용하여 수행되며 여기에서 펩티드는 약 1.5mg / ml에서 가용성이다. 예비 HPLC는 질량분석법 (MH + 16⁺)에서 지시한 바와 같이 소량의 술폭시드 유도체와 함께 펩티드(44)를 수득한다. 펩티드의 확인을 질량 분석법 및 아미노산 분석으로 확인한다.

[N^α- 9 - 플루오레닐메톡시카르보닐 글리실세릴메티오닐발릴로이실세린, Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (44)]

수지 결합 펩티드 Fmoc Ser (O^tBu) Met Val Leu Ser (O^tBu) (130.5mg, 0.05mmol)을 20분간 N,N - 디메틸포름아미드 (5ml) 중에서 20% 피페리딘 용액에서 음파분쇄 한후 여과하고 최종적으로 N,N - 디메틸 - 포름아미드, 디클로로메탄 및 디옥산으로 잘 세척한다. Fmoc Gly OH (89.2mg, 0.3mmol ; 6 당량)을 디옥산 (2ml)에 용해하고 ; 그후 1,3 - 디이소프로필카르보디이미드 (47㎕, 0.3mmol ; 6 당량)을 가하고 반응 혼합물은 5분간 음파분쇄 한다. 그후 이 용액을 디옥산 (1ml)에 미리 팽윤시킨 수지 - 결합 펩티드에 가한다. 반응 혼합물을 4.5시간 음파분쇄 한다. 수지 결합 펩티드를 여과, 디클로로메탄, 에테르로 세척하고 건조한다. (129.8mg) ; 생성물 수지 관능성 (mmol/g) : 0.334, 수지 하중 / 카플링 백분율 : 88 ; A₃₀₀㎚ = 0.76 (수지 - 펩티드 : 2.52mg). 수지 - 펩티드 (126.1mg, 0.042mmol) 아니솔 (0.25ml), 에틸메틸술피드 (0.25ml) 및 물 (0.25ml)의 혼합물에 트리플루오로아세트산 (10ml)를 가한다. 반응 혼합물을 2시간 음파분쇄 한다. 수지를 여과하고 트리플루오로아세트산 (2 x 1ml) 및 클로로포름 (4ml)로 세척한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔류물을 수득한다. 펩티드는 에테르를 가하여 침전, 여과, 에테르로 세척 및 건조 (42.7mg) 한다 ;

b. Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH의 합성

이어서 유사한 방법으로 수지 결합 펩티드 (43) 으로 부터 Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (45)를 제조한다.

Tbfmoc Gly OH는 80% 카플링 효율로 디옥산 중에서 카플링된다. 수지로부터 펩티드의 분리 및 t - 부틸 분해는 동일한 스캐빈저의 존재하에서 TFA로 수행한다. 펩티드는 최종적으로 에테르로 침전, 여과 및 건조한다 (69% 수율).

펩티드는 미리 정제한다. 디옥산중의 조 펩티드의 신선한 용액은 HPLC 상에 하나의 피크가 형성되지만 동일한 용액을 방치(30분) 한것은 소망하는 펩티드 및 술폭시드 유도체에 대응하는 두 피크를 형성한다. 메티오닌에서 술폭시드로의 용이한 산화는 디옥산 중에 있는 퍼옥시드의 존재 때문일 수 있다. 이러한 두 펩티드를 예비 HPLC로 단리한후, 이러한 할당물을 질량 분광 측정법 (MH⁺및 MH+16⁺) 및 아미노산 분석으로 확인한다.

[N_α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐글리실세릴메티오닐 발릴로이실세린, Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (45)]

수지 - 결합 펩티드 Fmoc Ser (O^tBu) Met Val Leu Ser (OBU^t) (65.3mg, 0.025mmol)을 20분간 DMF (5ml) 중에 20% 피페리딘 용액에서 음파분쇄 한다. 그후 수지 - 결합 펩티드를 여과하고 DMF, 디클로로메탄 및 디옥산으로 잘 세척한다. Tbfmoc Gly OH (74.5mg, 0.15mmol ; 6 당량)을 디옥산 (2ml)에서 30분간 음파분쇄 한다. 그후 1,3 - 디이소프로필카르보디이미드 (23.5㎕, 0.15mmol ; 6 당량)을 가하고 반응 혼합물을 5분간 음파분쇄 한다. 그후 이 용액을 디옥산 (1ml)에 미리 팽윤시킨 수지 - 결합 펩티드에 가한다. 반응 혼합물을 5시간 음파분쇄 한다. 수지를 여과하고 디클로로메탄, 디옥산 및 에테르로 잘 세척한후 건조한다. (58.3mg) : 생성물 수지 관능성 (mmol / g) : 0.28 ; 수지 하중 / 카플링 백분율 : 80 ; A₃₆₄㎚ = 0.43 (수지 - 결합 펩티드 : 0.85mg), 수지 - 결합 펩티드 (57.3mg, 0.016mmol), 아니솔 (0.25ml), 에틸메틸술피드 (0.25ml) 및 물 (0.25ml)의 혼합물에 트리플루오로아세트산 (5ml)를 가한다. 반응혼합물을 2시간 음파분쇄한다. 수지를 여과하고 트리플루오로아세트산 (1ml) 및 클로로포름 (4ml)로 세척하고 용매를 진공에서 제거한다. 에테르 중에서 잔류물의 분쇄물을 여과, 에테르로 잘세척, 및 건조시켜 황색 고체로서 소망하는 펩티드를 수득한다 (17.2mg, 69%) ;

c. PGC에서 Tbfmoc 및 Fmoc 유도체의 행위

Fmoc Gly OH 및 Tbfmoc Gly OH 모두의 체류를 흑연화 탄소로 채워진 컬럼상에서 비교한다. 디옥산 중에 있는 Fmoc Gly OH (10.2mg, 34.3μmole) 용액을 PGC (1.5g)으로 채워진 6mm 직경 컬럼상에 하중한다. 15ml의 디옥산 만이 화합물을 완전히 용리하는데 필요하다 (t.l.c로 모니터함). 반면, Tbfmoc Gly OH (10.2mg, 20.5μmole) 이 동일한 조건하에서 하중될때 이러한 물질은 첫번째 35ml로 용리되지 않는다. 실제로 화합물을 용리하기 위해 필요한 디옥산의 전체 부피는 300ml 이다.

Fmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (44)의 흑연화 탄소 컬럼상의 행위는 그후 Tbfmoc 유도체 (45)와 비교한다. 전체 체류 시간을 증가시키기 위해 디옥산 / 물 (2 : 1)의 혼합물은 두 펩티드를 용리하기 위해 사용된다. 디옥산 / 물 (2 : 1)의 혼합물에 Fmoc 헥사펩티드 (9.2mg, 11.3μmole)의 용액을 컬럼상에 하중한후, 펩티드를 75ml의 용매 혼합물로 완전하게 용리한다. 반면, Tbfmoc 유도체 (10.5mg, 10.3μmole)은 첫번째 80ml용매에서 전혀 용리되지 않으며 그후 컬럼으로 부터 단지 매우 느리게 용리된다.

d. Tbfmoc 기의 탈보호

흑연화 탄소 컬럼상에 체류시키면서, 펩티드로 부터 Tbfmoc기의 탈보호를 수행한다.

디옥산 / 물 (2 : 1)의 혼합물에서 20% 피페리딘을 사용하여 탈보호를 수행한다. 이러한 조건하에서 Tbfmoc 헥사펩티드를 완전히 탈보호한다. 유리 펩티드 (HGly Ser Met Val Leu Ser OH (46))을 용리하고 닌히드린을 사용한 t.l.c로 모니터하여 아미노 관능기를 나타낸다. 생성물의 후속적인 분리는 간단하다; 피레리딘 및 용매를 진공에서 제거하고 펩티드를 에테르로 침전시키고, 여과 및 건조한다 (85%). 질량 분광 측정법은 펩티드 (MH⁺) 및 술폭시드 유도체 (MH+16⁺)의 존재를 나타낸다. 아미노산 분석으로 펩티드 조성을 확인한다.

글리실세릴메티오닐발릴로이실세린, H Gly Ser Met Val Leu Ser OH (46)

디옥산과 물 (2 : 1 ; 15ml)의 혼합물에 Tbfmoc Gly Ser Met Val Leu Ser OH (29.2mg, 28.8μmol)의 용액을 흑연화 탄소 (4g)로 채워진 9mm 직경 컬럼상에 하중한다. 그후 컬럼을 디옥산과 물 (2 : 1 ; 60ml)의 혼합물로 용리한다. 디옥산과 물 (2 : 1 ; 20ml)의 혼합물에서 20%피페리딘으로 컬럼을 용리하여 탈보호를 수행한다. 펩티드를 함유하는 분획들 (t.l.c로 모니터함, R_f= 0 (MeOH / CHCl₃/ CH₃COOH (1 : 9 : 0.5) (닌히드린 사용))을 합하고 증발시켜 잔류물을 수득한다. 펩티드를 에테르로 침전, 여과 및 건조 (14.5mg, 85%) 한다.

(실측치 : Ser₂1.92, Gly₁0.98, Val₁1.03, Met₁0.87, Leu₁1.02 ; m/z (FAB) 609, 593 (MH⁺).

HRMS 593.29689, C₂₄H₄₅O₉N₆S 계산치 : 593.29685 (∴) < 1 ppm.

최종적으로 탈보호 단계의 부산물인 테트라벤조플루오렌 올레핀 또는 그의 피페리딘 부가물을 뜨거운 디옥산으로 용리하여 컬럼으로 부터 제거한다.

[실시예 7]

[Fmoc 유비퀴틴 (Ubiquitin) (54-76) OH 및 Tbfmoc 유비퀴틴 (53-76) OH의 합성 및 그의 성질 비교]

a. Fmoc 유비퀴틴 (54-76) OH의 합성

수지-결합 펩티드 Fmoc 유비퀴틴 (54-76) (47)을 실시예 6 (a)에서 기재한 조건하 펩티드 합성기 상에서 제조한다. 대부분의 카플링 공정은 용매로서 DMF/디옥산 (1 : 1) 혼합물 중에서 대칭 무수물 후 HOBt 에스테르 카플링을 포함한다.

b. Tbfmoc 유비퀴틴 (53-76) OH의 합성

Tbfmoc 유비퀴틴 (53-76) OH (48)을 하기 묘사한 수지-결합 펩티드 (47)로 부터 합성한다.

수지-결합 펩티드 Fmoc 유비퀴틴 (54-76)을 임의의 아미노 관능기를 캡시키기 위해서 첫번째로 아세트산 무수물 / 피리딘(1 : 1)의 혼합물로 처리한다. 염기성 조건에서 탈 보호한 후 펩티드를 디옥산 중에서 카플링시켜 DIC 및 HOBt 로부터 원위치에서 생성된 Tbfmoc Gly OBt 에스테르 (4 당량)을 88% 카플링 효율로 수득한다. 양이온 스캐빈저로서 아니솔 및 티오아니솔의 존재하에 TFA를 사용하여 최종분해를 수행한 후 Tbfmoc 유비퀴틴 펩티드 (48)을 에테르로 침전시킨다 (96% 수율).

N^α- (17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐 메톡시카르보닐) 글리실 아르기닐 트레오닐 로이실 세릴 아스파르틸 티로실 아스파라길 이소로이실 글루타미닐 리실 글루타밀세릴 트레오닐로이실 히스티딜로이실 발릴로이실 아르기릴로이실 아르기닐글리실글리신, Tbfmoc - 유비퀴틴 (53 - 76) OH (48)

DMF (1ml) 중에 있는 Fmoc - 유비퀴틴 (54 - 76) 수지 결합 펩티드 (150mg, 22.65μmol)에 아세트산 무수물 (21.4㎕, 226μmol ; 10당량) 및 피리딘 (18.2㎕, 226μmol ; 10 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 30 분 음파분쇄한다. 여과 및 DMF로 세척한 후 DMF (25ml) 중에 있는 20% 피페리딘 용액에서 15분 음파분쇄한다. 수지 결합 펩티드를 그후 여과하고 DMF 및 에테르로 잘 세척한다. Tbfmoc Gly OH (45mg, 0.09mmol ; 4 당량)을 완전히 용해될때까지 디옥산 (1.5ml) 에서 30분간 음파분쇄한다. 이 용액에 1,3 - 디이소프로필카르보디이미드 (14㎕, 0.09mmol ; 4 당량) 및 1 - 히드록시벤조트리아졸 (12.2mg, 0.09mmol ; 4 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 2 분간 음파분쇄한다. 이 용액을 그후 디옥산 (1.5ml)에 30분간 미리 팽윤시킨 수지 결합 펩티드에 가한다. 3.5시간 음파분쇄한 후, 수지결합 펩티드를 여과하고 디옥산 및 에테르로 세척하고 진공하 건조기에서 밤새 건조한다 (148.1mg)

치환 효율 : Tbfmoc 수지 결합 펩티드 (2.1mg)을 30분간 DMF (10ml)중 20% 트리에틸아민 용액에서 음파분쇄 한다. 364㎚에서 특정한 흡수를 기록하고 그것으로부터 하기결과를 유도한다: 생성물 수지 관능성 (mmol/g) : 0.133 ; 수지 하중 / 카플링 백분율 : 88 ; A₃₆₄㎚ = 0.505 (수지 결합 펩티드 : 2.1mg).

수지 결합 Tbfmoc - 펩티드 (146mg)에 물 (75㎕), 티오아니솔 (75㎕), 아니솔 (75㎕) 및 트리플루오로아세트산 (3ml)를 가한다. 반응 혼합물을 2.5시간 음파분쇄한다. 수지를 여과하고 TFA (2 x 0.5ml) 및 클로로포름 (2 x 1ml)으로 세척하고 건조 (24mg) 한다. 여액을 감압하에 증발시켜 잔류물을 수득한다. 에테르중에서 분쇄한 분쇄물을 밤새 차갑게 하고 여과 및 건조시킨 황색 고체로서 조 펩티드 (68.5mg)를 수득한다. CH₃CN / H₂O (1 : 1 ; 0.1% TFA ; 12ml) 중에 조 Tbfmoc - 유비퀴틴 (53 - 76) (12mg)의 현탁액을 그 후 완전히 용해될때까지 2시간 음파분쇄한다. 이 생성물의 정제는 A : B 구배 (25분에 걸쳐서 20 ∼ 80%)로 역상 C-18 컬럼 (10 x 250mm)를 사용한 예비 HPLC 및 214㎚에서 자외선 검출을 최종적으로 수행하여 백색 분말 (4.5mg)로서 동결 건조한 후 순수한 Tbfmoc 유비퀴틴 (53 - 76)을 수득한다 ; 아미노산 분석 : Asx₂2.14, Thr₂1.94, Ser₂1.87, Glx₂2.38, Gly₃2.73, Val₁1.14, Ile₁0.94, Leu₅5.02, Tyr₁0.94, His₁1.01, Lys₁0.94, Arg₃2.94 ; m/z (FAB) 3147.4 (MH⁺),

HRMS 3149.64063, C₁₄₉H₂₁₉N₃₈O₃₈계산치 : 3149.64048 (∴) < 1 ppm ; HPLC (A:B, A (90%)A (10%) ; 214 ㎚ ; C = 0.2mg / 0.2ml (A), 주입 : 25 ㎕) R_t= 18.2 분

c. PGC에서 N_α- 아세틸 - 유비퀴틴 (54 - 76) OH 및 Tbfmoc 유비퀴틴(53-76) OH의 행위

N^α- 아세틸 - 유비퀴틴 (54-76) OH (49)를 하기 반응으로 수지 결합 펩티드 (47) 로부터 제조한다.

DMF 중 20% 피페리딘을 사용한 펩티드로 부터 Fmoc 기의 탈보호는 유리 N - 말단 아미노 기와 함께 펩티드를 수득하게 하고, 그후 아세트산 무수물 / 피리딘 (1 : 1) (100당량)의 혼합물로 아세틸화 한다. 수지로부터 펩티드의 제거 및 측쇄 보호기의 분해는 스캐빈저로서 아니솔 및 티오아니솔의 존재하에 TFA를 사용하여 수행된다. 에테르로 후속하는 침전은 조

N^α- 아세틸 - 유비퀴틴 (54 - 76) OH (49)를 수득한다.

N^α- (아세틸) 아르기닐트레오닐로이실세릴아스파르틸티로실 아스파라길이소로이실글루타미닐리실글루타밀세릴트레오닐히스티딜로이실발릴로이실아르기닐로이실아르기닐글리실글리신, N^α- 아세틸 - 유비퀴틴 (54-76) OH (49)

수지 결합 펩티드 Fmoc - 유비퀴틴 (54-76) (100mg, 0.0151 mol)을 DMF (25ml) 중에 있는 20% 피페리딘 용액에서 30분간 음파분쇄한 후 여과하고 최종적으로 DMF 및 에테르로 잘 세척한다. DMF (1ml)에 30분간 미리 팽윤된 수지 결합 펩티드에 아세트산 무수물 (143㎕, 1.51mmol ; 100 당량) 및 피리딘 (122㎕, 1.51mmol ; 100 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 1시간 음파분쇄한다. 수지 결합 펩티드를 여과하고 DMF 및 에테르로 세척한다.

수지 결합 N^α- 아세틸 - 펩티드에 물 (50㎕), 티오아니솔 (50㎕), 아니솔 (50㎕) 및 트리플루오로아세트산 (2ml)을 가한다. 반응 혼합물을 2.5시간 음파분쇄한다. 수지를 여과, TFA (2 x 0.5ml) 및 클로로포름 (2 x 0.5ml)으로 세척한다. 용매를 진공에서 제거한다. 에테르로 분쇄된 분쇄물을 밤새 차갑게하고, 여과하고 건조하여 백색분말로서 생성물 (43.6mg)을 수득한다. 이 펩티드 (23.4mg)의 정제는 A : B 구배 (16분간 10 ∼ 60% B)로 동일한 역상 C-18 컬럼을 사용한 예비 HPLC 및 214㎚ 에서 UV 검출하여 동결 건조한 후 백색 고체로서 순수한 N^α- 아세틸 - 유비퀴틴 (54 - 76) OH를 수득한다 ; 아미노산 분석 : Asx₂1.98, Thr₂1.82, Ser₂1.69, Glx₂2.33, Gly₂2.36, Val₁1.14, Ile₁0.91, Leu₅5.06, Tyr₁0.85, His₁1.01, Lys₁0.98, Arg₃2.87 ; m/z (FAB) 2712.1 (MH⁺), HRMS 2712.49903, C₁₁₈H₂₀₀N₃₇O₃₆계산치 : 2712.49891 (∴) < 1 ppm ; HPLC (A:B, A (90%)A (10 %) ; 214 ㎚ ; C = 0.2mg / 0.2ml (A), 주입 : 25 ㎕), R_t= 13.2 분.

PGC 컬럼상에서 N^α- 아세틸 및 Tbfmoc 유비퀴틴 펩티드의 행위를 그 후 시험한다.

각 펩티드 5mg을 함유하는 용액을 컬럼상에 하중하고 그후 다른 용매혼합물을 사용하여 용리한다. 분획을 수집한후, 용매를 진공에서 제거하고 수득한 잔류물은 HPLC로 분석하기 전에 신선한 용매에 다시 용해한다.

CH₃CN / H₂O (1 : 1)의 혼합물을 사용할때 가장 좋은 결과가 수득된다.

이러한 조건하에서 30ml의 혼합물로 N^α- 아세틸 - 펩티드가 완전하게 용리되는 반면 Tbfmoc 펩티드는 체류된다.

만약 용매를 주의깊게 선택하였다면, 이러한 밀접하게 연관된 펩티드의 전체 크로마토그래피 분리는 방법의 효율성 및 고체상 방법론으로 합성된 펩티드 정제에 대한 가능성을 명백히 보여준다.

d. 유비퀴틴 (53-76) OH의 정제

흑연화 탄소로 채워진 컬럼상의 단순 크로마토그래피 용리는 제1 정제 단계 (상기 (c)에서 기재되었음)로서 사용된다. CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 0.5% TFA) 혼합물에 용해된 조 Tbfmoc 유비퀴틴 (53-76) OH (48)을 PGC로 채워진 컬럼상에 하중 (50 x 펩티드의 질량) 한다. 동일 용매의 혼합물 50ml가 주요 불순물 (N^α- 아세틸 유비퀴틴 (55 - 76) 및 미반응된 유비퀴틴 (54-76)일 것이다)을 완전히 용리하는데 필요하다. 4 번째 CH₃CN/H₂O (1 : 1) 50ml로 컬럼을 플러쉬한 후에도 Tbfmoc 펩티드의 어느 것도 용리되지 않는다. Tbfmoc 기의 탈보호는 CH₃CN/H₂O (1 : 1) 혼합물중에서 20% 피페리딘을 사용하여 수행되며 목적 펩티드인 유비퀴틴 (53-76) OH만이 용리된다. 용매를 진공에서 제거한 후, 펩티드는 에테르로 최종적으로 침전시킨다. 예비 HPLC 에 의한 후속하는 정제는 15% 전체 수율로 순수한 유비퀴틴 (53 - 76) OH (50)을 수득하게 한다.

글리실아르기닐트레오닐로이실세릴아스파르틸티로실아스파르길이소로이실글루타미닐리실글루타밀세릴트레오닐로이실히스티딜로이실발릴로이실아르기닐로이실아르기닐글리실글리신, 유비퀴틴 (53 - 76) OH (50)

CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 0.5% TFA ; 30ml) 혼합물에 용해된 Tbmoc - 유비퀴틴 (53 - 76) OH (30mg ; 조 펩티드) 용액을 완전히 용해될때까지 30분간 음파분쇄하고 흑연화 탄소 (1.4g ; PGC 220 - 224 ; 150 - 180㎛ ; 100 ㎡/g ; 채운 후 길이 : 140mm)로 채워진 5mm 직경 유리 컬럼상에 하중한다. 컬럼은 첫번째로 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 0.5% TFA, 50ml)로 용리한다. 동결 건조후 HPLC상에 하나의 주요 피크 (R_t= 13 분, N^α- 아세틸 - 유비퀴틴 (55 - 76) 또는 유비퀴틴 (54 - 76))가 있는 잔류물 (6.1mg)을 수득한다. 그후 컬럼을 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 50ml)의 혼합물로 용리한다. HPLC에 의해 불순물을 함유하고 있는 것을 알아낸 잔류물 (0.4mg)을 동결 건조 후 수득한다. 탈보호는 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 50ml) 혼합물중 20% 피페리딘 용액을 사용하여 수행한다. 진공중에서 용매를 제거하여 에테르로 분쇄, 여과 및 건조시킨 잔류물(11mg)을 수득한다. 이 조 펩티드(11mg)을 예비 HPLC (역상 C-18 컬럼 (10 x 250mm) ; 구배 (A : B), 25 분에 걸쳐 10 ∼ 60% B ; 214㎚에서 검출)로 정제하여 동결 건조후 백색 고체로서 유비퀴틴 (53 ∼ 76) OH (4.5mg, 15%)을 수득한다 ; 아미노산 분석 : Asx₂2.04, Thr₂1.88, Ser₂1.67, Glx₂2.27, Gly₃3.37, Val₁1.01, Ile₁0.90, Leu₅4.99, Tyr₁0.93, His₁1.01, Lys₁0.96, Arg₃2.95 ; m/z (FAB) 2727.8 (MH⁺), HRMS 2727.50986, C₁₁₈H₂₀₁N₃₈O₃₆계산치 : 2727.50981, (∴) < 1 ppm ; HPLC (A:B, A (90%)A (10%) ; 214 ㎚ ; C = 0.4mg / 0.4ml (A), 주입 : 25 ㎕), R_t= 12.6 분

Tbfmoc 유비퀴틴 (53 ∼ 76) OH 및 유비퀴틴 (53 ∼ 76) OH 펩티드의 확인은 고 분해능 질량 분석법 및 아미노산 분석으로 성취된다.

[실시예 8]

[유비퀴틴 (53 ∼ 76)의 합성 및 정제]

이 펩티드의 정제는 어떠한 문제도 가지고 있지 않으며 더 작은 유비퀴틴 단편 (50)으로 수행된다 ; Tbfmoc 유비퀴틴 (35 ∼ 76) OH (52)를 원위치에서 Tbfmoc Gly OBt를 수지 결합 펩티드 유비퀴틴 (36 ∼ 76)에 카플링시켜 수득 (75% 수율)한다. PGC 컬럼 상에서 크로마토그래피 및 예비 HPLC를 수행한 후 목적 펩티드 (51)를 수득할 수 있다.

(51)의 확인도 질량 분석법 및 아미노산 분석으로 하며, 그의 순도는 분석 HPLC로 확인한다.

N^α- (17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐 메톡시카르보닐) 글리실 이소로이실프로릴프롤릴아스파르틸글루타미닐글루타미닐아르닐로이실이소로이실페닐알라틸알라닐글리실리실글루타미닐로이실글루타밀아스파르틸글리실아르기닐트레오닐로이실세릴아스파르틸티로아스파라길이소로이실글루타미닐리실글루타밀세릴트레오닐로이실히스티딜로이실발릴로이실아르기닐로이실아르기닐글리실글리실 , Tbfmoc 유비퀴틴 (35 ∼ 76) OH (52)

DMF (1ml) 중에 있는 Fmoc 유비퀴틴 (36 ∼ 76) 수지 결합 펩티드 (109.3mg, 7.88μmol)에 아세트산 무수물 (14.8㎕, 157.6μmol ; 20 당량) 및 피리딘 (12.8㎕, 157.6μmol ; 20 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 1시간 음파분쇄 한다. 여과하고 DMF 및 에테르로 세척한 후 수지 결합 펩티드를 DMF (25ml)에 있는 20% 피페리딘 용액에서 15분간 음파분쇄 한다. 그후 수지 결합 펩티드를 여과하고 DMF 및 에테르로 잘 세척한다. Tbfmoc GlyOH (19.6mg, 39.4μmol ; 5 당량)을 디옥산 (1ml)에서 30분간 음파분쇄한다. 이 용액에 1,3 - 디이소프로필카르보디이미드 (6.2㎕, 39.4μmol ; 5 당량) 및 1 - 히드록시벤조트리아졸 (5.3mg, 39.4μmol ; 5 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 5분간 음파분쇄한다. 그후 이 용액을 1시간 디옥산(1ml)에 미리 팽윤시킨 수지-결합 펩티드에 가한다. 반응 혼합물을 19시간 음파분쇄한다.

수지-결합 펩티드를 여과하고 디옥산, 디클로로메탄 및 에테르로 세척한 후 진공 건조기에서 48시간 최종적으로 건조한다 (102mg).

치환 효율 : Tbfmoc 수지 결합 펩티드 (2.9mg)을 DMF (10ml) 중에 있는 20% 트리에틸아민 용액에 30분간 음파분쇄한다. 364㎚에서 특정 흡광도를 기록하고 그것으로부터 하기 결과를 유도한다 : A = 0.265 : 생성물수지 관능성 (μmol/g) : 50.51 ; 수지 하중/카플링 백분율 : 70.

그후 카플링은 동일한 조건 (Tbfmoc GlyOH 1,3 - 디이소프로필카르보디이미드 및 1 - 히드록시벤조트리아졸 각각 4당량 ; 반응시간 3.5시간)하에서 반복한다. 수지 결합펩티드를 여과하고 디옥산, 디클로로메탄 및 에테르로 세척하고 최종적으로 진공건조기에서 밤새 건조 (99.5mg) 한다.

치환 효율 : A = 0.265 (수지 - 결합 펩티드 : 2.7mg) ; 생성물 수지 관능성 (μmol/g) : 54.26 ; 수지 하중/결합 백분율 : 75.

수지-결합 Tbfmoc - 펩티드 (96.8mg) 에 물 (75㎕), 티오아니솔 (50㎕) 및 TFA (2.1ml)를 가한다. 반응 혼합물을 2.5시간 음파분쇄한다.

수지를 여과하고, TFA (2 x 0.5ml) 및 CHCl₃(2 x 1ml)로 세척하고 건조 (19.1mg) 한다. 용매를 진공에서 제거하여 잔류물을 수득한다. 디에틸 에테르로 분쇄한 분쇄물을 황색 고체로서 조 생성물을 수득하고 이 조생성물을 밤새 차갑게 하고, 에테르로 잘 세척하고 최종적으로 건조 (49.2mg) 한다. HPLC (A : B ; A (90%)A (10% ; 214 ㎚ ; C = 0.5mg/0.5ml (A/B (1 : 1)) ; 주입 30㎕) R_t= 19.2 분

글리실이소로이실프롤릴프롤릴아스파르틸글루타미닐글루타미닐아르기닐로이실이소로이실페닐알라닐알라닐글리실리실글루타미닐로이실글루타밀아스파르틸글리실아르기닐트레오닐로이실세릴아스파르틸티로실아스파라길이소로이실글루타미닐리실글루타밀세릴트레오닐로이실히스티딜로이실발릴로이실아르기닐로이실아르기닐글리실글리신, 유비퀴틴 (35 ∼ 76) OH (51)

CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 0.5% TFA, 25ml) 혼합물에 Tbfmoc - 유비퀴틴 (35 76) OH (30mg)현탁액을 20분간 (용해가 완전히 될때까지) 음파분쇄하고 흑연화 탄소 (1.5g ; PGC 220 ∼ 224 ; 150 ∼ 180㎛ ; 100 ㎡/g ; 활성 길이 : 15 cm)로 채워진 5mm 직경 유리 컬럼상에 하중한다. 컬럼을 첫번째로 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 0.5% TFA ; 50ml)혼합물로 용리한다. 용리액을 동결 건조후 HPLC상에 넓은 피크 (R_t= 13.8 분 (불순물))을 갖는 잔류물 (2mg)을 수득한다. 그후 컬럼을 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 50ml) 혼합물로 용리한다. HPLC에 의해 불순물을 함유하는 것(넓은 피크, R_t= 14.1분)으로 밝혀진 백색 고체 (4.5mg)을 동결 건조후 수득한다. 컬럼을 다시 CH₃CN/H₂O (1 : 1) 혼합물 50ml로 용리하고 잔류물 (0.3mg)을 동결건조 후 수득한다 (R_t= 14.2 분). CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 50 ml) 혼합물에 20% 피페리딘 용액을 사용하여 탈보호를 수행하고 그후 CH₃CN/H₂O (1 : 1 ; 50ml)로 컬럼을 용리한다. 용매를 진공에서 제거하여 갈색 잔류물을 수득한다. 디에틸 에테르를 가하고 수득한 침전물을 밤새 차갑게 하고, 여과한 후 에테르로 잘 세척하고 최종적으로 건조 (11.7mg)한다. 조 펩티드 (24.8mg)을 예비 HPLC (역상 C-18 컬럼 (10 x 250㎚) ; 구배 (A : B), 22분에 걸쳐서 20 60% B ; 214㎚에서 검출)로 최종적으로 정제하여 동결 건조 후 백색 고체로서 순수한 유비퀴틴 (35 76) OH (4.4mg)을 수득한다 ; 아미노산 분석 : Asx₄3.98 Thr₂1.83, Ser₂1.75, Glx₆6.67, Pro₂1.91, Gly₅5.10, Ala₁0.96, Val₁1.01, Ile₃2.99, Leu₇7.00, Tyr₁0.94, Phe₁1.04, His₁1.11, Lys₂1.91, Arg₄3.81 ; m/z (FAB) 4734.2 (MH⁺), HRMS 4734.57186, C₂₀₈H₃₄₄N₆₃O₆₃계산치 : 4734.57161 (∴) < 1 ppm ; HPLC (A:B, A (90%)A (10%) ; λ 214 ㎚ ; C = 0.1mg / 0.1ml (A), 주입 : 12 ㎕), R_t= 13.8 분

[실시예 9]

[Tbfmoc - L - Phe OH의 합성]

시판의 L - 페닐알라닌 t -부틸 에스테르 히드로클로라이드의 유리 아민 관능기를 트리에틸아민으로 초기에 유리시킨다. 20% 과량의 아민을 그후 N,N′- 디메틸아닐린의 존재하에서 혼합된 카르보네이트 (41)과 함께 반응시킨다. TFA로 t - 부틸기를 제거한 후, 화합물 (53)을 수득한다.

(53)의 형성은 혼합 카르보네이트 (41)의 β 제거, 생성된 올레핀 (38)상에 아미노 에스테르의 1,2첨가 및 최종적으로 t - 부틸 에스테르의 분해에 의하여 이론적으로 설명할 수 있다.

[N^α- 17 - 테트라벤조 (a, c, g, i) 플루오레릴메틸 - L - 페닐알라닌, Tbfm - L - Phe OH (53)]

트리플루오로아세트산 (3.6ml) 및 물 (0.2ml)에 용해된 N^α- 17 - 테트라벤조 (a, c, g, i) 플루오레닐메틸 - L - 페닐알라닌 t - 부틸 에스테르 (421.1mg, 0.702mmol)용액을 실온에서 3.5시간 음파분쇄한다. 용매를 진공에서 제거하여 갈색 잔류물을 수득한다. 디에틸에테르에서 분쇄된 분쇄물을 밤새 차갑게 하고, 여과한후, 에테트로 세척하고 최종적으로 건조하여 황색 고체로서 표제 화합물을 수득한다. (352. 7mg, 92%) ; 융점 178 ∼ 180℃ ; (실측치 : C, 85.2 ; H, 5.47 ; N, 2.57 C₃₉H₂₉NO₂계산치 : C, 86.2 ; H, 5.37 ; N, 2.5 9%) ;-40.4°(C = 1, TFA) ; t.l.c R_f(H) 0.36, R_f(T) 0.62 ; υmax (KBr) 3090, 3060, 3030 (CH 신축, 아릴), 1620 (COO^-), 1500 (방향족고리), 1240., 1190, 1040 (CO 신축), 750, 725, 700 (CH 평면밖 변형) cm^-1; λmax 384 (18868), 369 (21267), 304 (52447), 292 (41894), 264 (78991), 255 (86346) um ; δ_C(TFA, 50 MHz) 169.5 (CO, 산), 137.9, 136.9, 136.1, 134.2, 131.8, 131.4, 130.5, 129.8, 126.3, 126.1, 125.8 (사차 방향족 C′s) 128.7, 127.9, 127.2, 127.0, 126.8, 124.8, 123.44, 123.34, 123.29, 122.2 (방향족 CH′s), 62.2 (α CH), 50.9 (CH₂), 43.2 (CH), 34.2 (β CH₂) ; m/z (FAB) 544 (MH⁺), 379.

HRMS 544.22762, C₃₉H₃₀NO₂계산치 : 544.22764 (∴) < 1 ppm.

Tbfmoc Gly OH 합성에서 글리신의 아세테이트가 성공적으로 합성된 바와 같이 이 방법은 또한 이 경우에 유용하다 ; 그러므로 L - 페닐알라닌 - t - 부틸 에스테르의 아세테이트염이 제조된다.

아미노산 에스테르의 히드로클로라이드 염이 트리에틸아민으로 중화되고 생성된 침전 Et₃N.HCl이 여거된다. 용매를 제거한후, 수득한 잔류물을 동결 건조전에 아세트산에 다시 용해시킨다. 2 당량의 N,N′- 디메틸아닐린의 존재하에서 혼합카르보네이트 (41)과의 후속하는 반응은 플래쉬 크로마토그래피에 의한 정제 및 재결정으로 정제한 후 46% 수율로 Tbfmoc - L - Phe O^tBu (54)를 수득한다. TFA/H₂O (95 : 5)의 혼합물을 사용한 t - 부틸 에스테르의 최종분해는 우수한 수율로 Tbfmoc - L - Phe OH (55)를 수득하게 한다.

[N^α- 17 - 테트라벤조 (a, c, g, i) 플루오레닐메톡시카르보닐 - L - 페닐알라닌 t - 부틸 에스테르, Tbfmoc Phe O^tBu (54)]

에틸 아세테이트 (6ml) 에 용해된 L - 페닐알라닌 t - 부틸 에스테르 히드로클로라이드 (126.7mg, 0.491mmol) 현탁액에 트리에틸아민 (68.5㎕, 0.491mmol)을 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 교반한다. 침전된 트리에틸아민 히드로클로라이드를 여거하고 에틸 아세테이트 (2 x 0.5ml)로 세척하고 건조 (65.3mg, 97%) 한다. 여액을 증발하여 잔류물을 수득하고 이것을 아세트산에 다시 용해시킨다. 동결 건조시킨 후 백색 고체로서 아세테이트 염 (83.9mg, 61%)을 수득한다.

디클로로메탄 (5ml) 에 용해된 17 - 테트라벤조 (a, c, g, i) 플루오레닐메틸 - p - 니트로페닐 카르보네이트 (139.4mg, 0.248mmol) 및 L - 페닐알라닌 t - 부틸 에스테르 아세테이트 (83.9mg, 0.298mmol ; 1.2 당량)의 용액에 N,N′- 디메틸아닐린 (63㎕, 0.497mmol ; 2 당량)을 가한다. 반응 혼합물을 120시간 질소하 실온에서 교반한다. 물 (10ml)을 가하고 KHSO₄(2M)로 pH = 1로 산성화 한 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (3 x 20ml)로 추출한다. 합한 유기상을 물 (2 x 15ml)로 세척하여 pH 6 ∼ 7이 되게 하고 MgSO₄상에서 건조한다. 여과후 총매를 감압증발하여 오렌지색 오일을 수득한다. 용리액으로서 톨루엔을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피로 정제한 후, Rf = 0.04 물질을 함유하는 분획을 증발시켜 황색 고체를 수득한다. 에테르 / 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃)로 재결정하여 담황색 고체로서 표제 화합물을 수득하며 이것을 여과하고, 페트롤로 세척한후 최종적으로 건조(73.9mg, 46%) 한다 ; 융점 158 ∼ 162℃ (분해) ; t.l.c. R_f(C) 0.04, R_f(H) 0.84 ; υmax (KBr) 3280 (NH 신축), 3060, 3030 (CH 신축, 아릴), 2980, 2930 (CH 신축, 알킬), 1735 (CO, 에스테르), 1715 (CO, 우레탄), 1680 (아미드 I), 1610 (방향족 고리), 1545 (아미드 II), 1500 (방향족 고리) 1440 (CH 변형, 알킬), 1390, 1370 (CH₃, 대칭 변형), 1290, 1255, 1220, 1155, 1050 (CO 신축), 850, 750, 720, 700 (평면밖 CH 변형) cm^-1; m/z (FAB) 643 (M⁺), 379. HRMS 643.27225, C₄₄H₃₇NO₄이론치 : 643.27224 (∴) < 1 ppm.

[N^α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐 - L - 페닐알라닌, Tbfmoc - L - Phe OH (55)]

트리플루오로아세트산 (950㎕) 및 물 (50㎕)에 용해된 N^α- 17 - 테트라벤조 (a,c,g,i) 플루오레닐메톡시카르보닐 - L - 페닐알라닌 t - 부틸 에스테르 (68.2mg, 0.106mmol) 용액을 2.5시간 음파분쇄한다. 용매를 진공에서 제거하여 자주색 잔류물을 수득한다. 디에틸 에테르 및 페트롤 (끓는점 40 ∼ 60℃)의 혼합물을 가한다. 수득한 침전물을 밤새 차갑게 하고, 여과한 후 페트롤로 세척하고 P₂O₅상의 진공 건조기에서 최종적으로 건조시켜 표제 화합물(57.6mg, 93%)를 수득한다 ; 융점 137 ∼ 140℃ ;-50.8 (c=0.25, CH₂Cl₂) ; t.l.c. : R_f(H) 0.43, R_f(I) 0.89 ; υmax (KBr) 3410 (NH 신축), 3060, 3030 (CH 신축, 아릴), 2960, 2860 (CH 신축, 알킬), 1715 (CO, 산 및 우레탄), 1610, 1500 (방향족 고리), 1435, 1420 (CH 변형, 알킬), 1340 (OH 굽힘), 1215, 1050 (CO 신축), 750, 730, 700 (평면밖 CH 변형) cm^-1; λmax 384 (15794), 368 (16896), 302 (39670), 290 (32324), 262 (59505), 254 (64647) ㎚ ; δ_H(CDCl₃, 200 MHz) 8.80 ∼ 8.58 (6H, m, 방향족), 8.30 ∼ 8.19 (2H, m, 방향족), 7.65 ∼ 7.54 (8H, m. 방향족), 7.19 ∼ 7.07 (5H, m, 방향족 (Phe)), 5.13 (1H, 겉보기 t, CH), 4.98 (1H, d,³J = 8.4 Hz, NH), 4.79 ∼ 4.64 (2H, m, H_a(CH₂) 및 αCH (Phe)), 4.30 ∼ 4.24 (1H, m, H_b(CH₂)), 3.08 (2H, m, βCH₂(Phe)) ; δ_c(CDCl₃, 90 MHz), 175.8 (CO, 산), 155.8 (CO, 우레탄), 142.6, 141.0, 136.8, 136.5, 135.3, 131.5, 130.3, 130.1 (사차 방향족 C′s), 129.0, 128.6, 127.4, 127.3, 127.1, 126.8, 126.6, 125.9, 125.7, 125.5, 125.1, 124.9, 124.8, 123.4, 123.1, 123.0 (방향족 CH′s), 69.2 (CH₂), 54.4 (α CH), 47.4 (CH), 37.4 (β CH₂) ; m/z (FAB) 587 (M⁺), 379. HRMS 588.21744, C₄₀H₃₀NO₄이론치 : 588.21747 (∴) < 1 ppm.

Claims

하기식 (II),

[식중, n은 0 또는 1 이며 ; O은 n이 1일때 주위의 고리가 방향족이고 n이 0일때 비 방향족인 것을 의미하고 ; 한편으로는 R₁및 R₂와 다른 한편으로는 R₃및 R₄는 각기 그들에 부착된 탄소원자와 함께 융합 방향족 고리계를 형성할 수 있도록 선택되며 ; R′는 알킬기 또는 수소이고 ; 및 L′는 - CO -, - O - CO -, - S -, - O -, - (CH₂)_m- O - (식중 m은 1 ∼ 6)이거나 또는 직접 결합을 나타낸다]의 하기식 (I): Ar - L - 로 표현되는 보호기 [식중, Ar은 4 내지 8개의 방향족 고리를 함유하는 실질적으로 평면인 융합 고리계를 나타내고, L은 -CR′-L′- (R′와 L′는 상기에서 정의된 것과 같음)로 구성되는 기를 나타낸다].
제1항에 있어서, 방향족 고리가 육각 구조 (hexagonal)인 기.
제1항에 있어서, Ar이 헤테로 원자를 함유하지 않는 기.
제1항에 있어서, 하기식 (III)의 기.

[식중 : O, n, R₁, R₂, R₃, R₄, R′ 및 L′는 제1항에서 정의한 바와 같고, R⁵는 그것이 부착되는 원자와 함께 하나 이상의 보충고리를 형성하는 기이다.]
L 또는 L′기를 통해서 이탈기에 부착된 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에서 정의된 기를 함유하는 보호 화합물.
제5항에 있어서, 이탈기가 질소, 산소, 황, 셀렌, 텔루르, 규소 또는 할로겐 원자를 함유하는 화합물.
제6항에 있어서, 이탈기가 할로겐원자, -OH, -COOH, -NH₂, -CONH₂, -SO₃C₆H₄-pCH₃, -SH, -CN 또는 -Si (CH₃)₃기인 화합물.
보호될 화합물의 기에 부착된 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에서 정의된 기를 함유하는 보호 화합물.
제8항에 있어서, 보호될 화합물의 기가 알콜, 티올, 산, 아민 또는 아미드기인 화합물.
제9항에 있어서, 보호될 화합물이 천연 또는 합성 펩티드 또는 아미노산인 화합물.
a) 흑연화 물질로 채워진 챔버 ; 및 b) 분자상에 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에서 정의된 보호기를 그라프트 하기 위한 키트(kit)를 함유하는 연속 또는 동시용으로 사용되는 장치.
제11항에 있어서, 흑연물질이 흑연 또는 활성탄인 장치.
제11항 또는 제12항에 있어서, c) 자외 (UV), 가시 분광, 또는 형광 분광 검출기가 부착된 분획 - 수집계도 또한 함유하는 장치.
- 분리될 화합물의 혼합물중 하나 이상의 화합물에 있는 하나 이상의 기를 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에서 정의된 기로 보호하고, - 흑연화 물질로 채워진 챔버를 통해 화합물의 혼합물을 통과시키는 단계를 함유하는 화합물의 혼합물을 합성 또는 분리하는 방법.
분자의 하나 이상의 관능기를 보호하기위해 사용되는 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에서 정의된 기.