KR0163668B1 - 비펩티드성 트롬빈억제제 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)의 신규한 비펩티드성 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서, X는 N 또는 CH를 나타내고, n은 0내지 3의 정수를 나타내며, R¹및 R²는 각각 독립적으로 R³-(CH₂)_p-(Y)_q- 또는 수소를 나타내고, 여기서, R³는 페닐 또는 사이클로알킬을 나타내며, Y는 O, S, SO 또는 SO₂를 나타내고, p는 0 내지 3의 정수를 나타내며, q는 0 또는 1을 나타내고, A는또는를 나타내며, 여기서, R⁴는 수소, 니트로, 저급알킬, 저급알킬아민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고, B는 저급알데히드, 하이드록시저급알킬, 저급알킬 또는 저급알콕시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타낸다.

Description

비펩티드성 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법

본 발명은 하기 일반식(I)의 신규한 비펩티드성 트롬빈 억제제및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서, X는 N 또는 CH를 나타내고, n은 0 내지 3의 정수를 나타내며, R¹및 R²는 각각 독립적으로 R³-(CH₂)_p-(Y)_q- 또는 수소를 나타내고, 여기서, R³는 페닐 또는 사이클로알킬을 나타내며, Y는 O, S, SO 또는 SO₂를 나타내고, p는 0 내지 3의 정수를 나타내며, q는 0 또는 1일 나타내고, A는또는를 나타내며, 여기서, R⁴는 수소, 니트로, 저급알킬, 저급알킬아민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고, B는 저급알데히드, 하이드록시저급알킬, 저급알킬 또는 저급알콕시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타낸다.

일반적으로 혈액응고 과정에는 여러 가지 복잡한 효소반응이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 그 마지막 단계는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 반응을 포함하고 있다. 이 반응에서 생성된 트롬빈은 혈소판을 활성화시키고 섬유소원을 섬유소로 바꾸는 등의 역할을 수행하는데, 섬유소는 중합밥응에 의해 고분자물질로 바뀌고 활성화된 혈액인자 XIII에 의해 교차결합되어 불용성 응혈로 되는 것이므로 트롬빈은 혈액응고에 있어 매우 중요한 역할을 한다.

트롬빈은 또한, 혈액인자 V와 VIII를 활성화시키는데, 이들은 피이드백에 의해 혈액응고 반응을 가속화시킨다.

따라서, 트롬빈 억제제는 효과적인 항응혈제로 작용할 수 있으며, 동시에 혈소판 활성을 억제하고 섬유소 생성및 안정화를 억제할 수 있다.

이와 같이 트롬빈이 혈액 응고에 있어 중요한 역할을 수행하고 있으므로 오래전 부터 트롬빈 활성을 억제할 수 있는 신규한 물질을 개발함으로써 혈액응고를 예방하고 각종 혈전증을 치료하기 위한 방법이 모색되어 왔다.

이러한 과정중에 트롬빈의 기질인 피브린 단편과 유사한 펩티드 물질을 사용함으로써 트롬빈을 억제하기 위한 시도가 여러번 이루어졌다. 이들은 주로 아미노산 3개로 구성된 펩티드로서, 이러한 펩티드의 예로는 D-Phe, S-Pro, L-Arg 서열의 물질및 여기에 C-말단을 알데히드나 포스포네이트 혹은 보론산으로 치환한 것들을 들 수 있다.(참조: Trends in Pharm. Sci. 1993, 14, 366-376).

그러나, 이들 화합물들은 피브린 단편과 유사함으로 해서 트롬빈 억제에 상당한 효능을 나타내는 반면, 어느 정도 펩티드 성격을 유지하고 있으므로 경구투여용으로 적당하지 않다는 문제점을 지니고 있다. 즉, 펩티드계 화합물은 일반적으로 생체내에서 불안정하고, 장기내로 흡수가 잘 되지 않으며, 빨리 분해되는 성질을 갖고 있으므로 펩티드계 화합물을 유용한 약제로 개발한다는 것은 매우 난감한 일로 알려져 있기 때문이다.

이에 본 발명자들은 종래의 펩티드성 트롬빈 억제제의 단점을 해결함으로써 경구투여용으로 사용하여도 우수한 효과를 나타낼 수 있는 신규한 트롬빈 억제제를 발견하기 위해 다년간에 걸쳐 광범위한 연구를 수행한 결과, 본 발명에 따른 비펩티드성 일반식(I)의 화합물을 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 비펩티드성 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하기 일반식(I)로 나타내는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 용매화물및 이성체에 관한 것이다.

상기식에서, X는 N 또는 CH를 나타내고, n은 0 내지 3의 정수를 나타내며, R¹및 R²는 각각 독립적으로 R³-(CH₂)_p-(Y)_q- 또는 수소를 나타내고, 여기서, R³는 페닐 또는 사이클로알킬을 나타내며, Y는 O, S, SO 또는 SO₂를 나타내고, p는 0 내지 3의 정수를 나타내며, q는 0 또는 1을 나타내고, A는또는를 나타내며, 여기서, R4는 수소, 니트로, 저급알킬, 저급알킬아민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고, B는 저급알데히드, 하이드록시저급알킬, 저급알킬 또는 저급알콕시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타낸다.

본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물의 치환기에 대한 상기 정의에서, 용어 저급알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸과 같은 탄소수 1 내지 6개의 포화된 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 래디칼을 의미하고 , 용어 저급알킬아민은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸과 같은 탄소수 1 내지 4개의 포화된 직쇄 또는 측쇄 알킬에 의해 치환된 아민을 의미한다.

상기 일반식(I)의 화합물 중에서도 바람직한 화합물은 X는 CH를 나타내고; n은 0이며; R3는 페닐을 나타내고; Y는 SO₂를 나타내며; p및 q는 각각 독립적으로 0 또는 1이고; A는을 나타내며, 여기서 R⁴는 수소, 니트로, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내는 화합물이다.

더욱 바람직한 화합물은, R¹은 R³-(CH₂)_p-(Y)_q- 를 나타내고; R²는 수소를 나타내며; R⁴는 수소, 니트로, 또는 메틸에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고; B는 포르밀, 하이드록시메틸, 메틸 또는 메톡시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타내는 화합물이다.

본 발명의 대표적인 화합물에는 하기에 나타내는 바와 같은 화합물들이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 화합물은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으므로 라세미화합물, 부분 입체 이성체 혼합물및 개개의 부분 입체 이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 한편으로 본 발명은 상기 정의된 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 일반식(I)의 화합물은 하기 반응도식 1에 따라 일반식(II)의 산 화합물을 용매및 커플링제존재하에 일반식(III)의 아민화합물과 커플링 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기 반응도식에서, X, n, R¹, R², A및 B는 상기 정의된 바와 같다.

상기 반응식 1에서 일반식(III)의 화합물은 일반식(II)의 화합물에 대하여 0.5내지 2당량의 범위로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 , 각 출발물질의 합성용이성, 경제성 등을 고려하여 어느 한쪽의 물질을 과량으로 사용하여도 무관하다. 또한 , 상기 반응은 0 내지 40℃의 범위에서 수행하는 것이 바람직하며, 용매로는 에틸에테르, 테트라하이드로퓨란 등의 에테르류, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드류, 할로알칸류 등의 통상적인 용매를 사용할 수 있으나, 그 중에서도 아미드류가 바람직하다.

상기 커플링 반응을 수행함에 있어 커플링제로는, 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-디메틸아미노-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-C1), 디페닐포스포릴아지드(DPPA)중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한 , 본 발명에서는 HOBT(1-Hydroxybenzotriazole Hydrate)와 같은 커플링 보조제를 사용함으로써 반응속도를 증가시킬 수도 있다.

한편, 상기 반응에 사용된 일반식(II)의 산 화합물은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 그의 산 할라이드 유도체 또는 다른 활성화 에스테르 유도체로 변화시킨 후 사용됨으로써 반응을 더욱 촉진시킬 수 있다. 특히 , 활성화 에스테르 유도체는 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하거나, 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성하기 위해 필요하다. 산 할라이드 유도체에는 산 클로라이드가 포함되며, 그밖에 메톡시카보닐클로라이드, 이소부틸옥시카보닐클로라이드 등의 알콕시카보닐할라이드와 커플링 시약으로 부터 유도된 카르복실산의 무수물, N-하이드록시프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시숙신이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2', 3'-디카복시이미드-유도된 에스테르, 2, 3, 5-트리클로로페놀-유도된 에스테르 등의 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 반응도식 1에서 출발물질로 사용된 일반식(II)의 화합물은 하기 반응도식 2에 따라 제조될 수 있다.

상기 반응도식에서, X, n, R¹및 R²는 상기 정의된 바와 같다.

반응도식 2에 나타난 바와 같이, 일반식(II)의 산 화합물은 케톤화합물을 리튬알루미늄하이드라이드 등으로 환원반응시켜 알콜을 만든 후, 브롬산 또는 브롬화수소산과 반응시켜 브롬이 치환된 화합물을 얻은 다음, 마그네슘을 이용한 그리나드 시약(Grignard Reagent)과 함께 이산화탄소와 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물의 트롬빈 억제효과는 문헌(참조: Methods in enzymology v. 80, p341-361; Biochemistry 27, p2144-2151(1988))기재된 방법에 따라 하기 식으로 나타내어지는 해리상수 Ki 값을 결정함으로써 측정한다.

* [E] : 결합하고 있지 않은 효소의 농도

** [I] : 결합하고 있지 않은 억제제의 농도

*** [EI] : 효소와 억제제 결합물의 농도

해리상수 Ki는 효소와 트롬빈 억제제 결합물의 해리정도를 나타내는 것이므로 해리상수 값이 작을수록 효소에 대한 억제제의 결합성이 큰 것을 의미하며 따라서 억제활성이 큰 것으로 평가될 수 있다. 이러한 해리상수는 트롬빈을 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색성을 나타내는 특정 기질과 반응시키고 그 발색정도를 분광광도법에 따라 시간의 함수로 측정함으로써 구할 수 있다.

본 발명에서는 트롬빈의 기질로서 트롬빈의 작용을 받아 발색하는 물질로 크로모자임 티에취(Chromozyme TH: Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 사용한다. 크로모자임 티에취가 트롬빈에 의해 가수분해되면 노란색의 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 따라서, 생성되는 노란색의 파라-니트로아닐리드양을 시간에 따른 홉광도의 변화로 측정함으로써 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 억제활성을 측정할 수 있다. 즉, 홉광도의 변화속도로 부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧바로 트롬빈 억제제의 효소활성 억제능력과 연관될 수 있다(참조: Methods in Enzymology V. 80 p341-361, Biochemistry 27, p2144-2151, 1988).

본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물 중에서 대표적으로 실시예 5및 실시예 8 화합물에 대해 하기 참조예에 기재된 바에 따라 그 억제활성을 측정한 결과, 실시예 5 및 8 화합물은 각각 145μM, 1.9μM의 Ki값을 나타내었다.

따라서, 이와 같이 높은 트롬빈 억제활성을 나타내는 본 발명의 신규한 목적 화합물은 혈액 응고 예방및 각종 혈전증 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물을 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여할 경우 일일 총 용량은 체중 1kg 당 0.001 mg 내지 10mg의 범위가 바람직하나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합및 질환의 중증도에 따라 변화할 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 또는 경구용 제제로 투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를 들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 당업계에 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이때, 사용가능한 수성 용매로는 물, 링거액, 또는 등장성 NaCl 용액을 들 수 있다. 또한, 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용하는데, 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제로 사용할 수 있다.

경구투여용 고체투여 형태로는 캅셀제, 정제, 환제, 산제및 입제가 가능하고, 그 중에서도 특히 캅셀제와 정제가 유용하며, 정제및 환제는 장용피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태에서는 본 발명에 따른 일반식(I)의 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈, 또는 스타치 중에서 선택된 1종 이상의 불활성 희석제와 함께 혼합하여 사용할 수 있고, 이러한 희석제외에 마그네슘 스케아레이트와 같은 윤활제를 함유할 수도 있다.

본 발명의 트롬빈 억제제를 투여하여 항응혈 효과 또는 혈전용해 효과를 얻고자 할 경우, 본 발명에 따른 일반식(I)의 화합물을 혈전 용해제또는 혈소판 활성 억제제 중에서 선택된 1종 이상의 물질과 동시에 투여할 수 있다.

이와 같이, 혼합하여 투여될 수 있는 혈전용해제로는 티피에이(t-PA), 유로키나아제(Urokinase), 스트렙토키나아제(Streptokinase)등을 들 수 있으며, 혈소판 활성 저해제로는 아스피린, 티클로피딘(Ticlopidin), 클로피드로겔(Clopidrogel), 7E3 단일항체 등을 들 수 있다.

그러나, 혈전치료 및 예방을 목적으로 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제제는 기 상술된 것으로 제한되지 않으며, 그러한 목적에 유용한 어떠한 제제라도 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한된다는 것은 아니다.

[제조예 1]

3-페닐티오사이클로펜탈올의 합성

건조한 250ml 둥근바닥 플라스크에 리튬알루미늄하이드라이드(LiAIH₄) 2.8g(0.07몰)과 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 150ml를 혼합하고 질소대기하에 실온에서 10분간 교반한 다음 -10℃로 냉각시켰다. 문헌(Journal of Organic Chemisty, 46, P235(1981))에 기술되어 있는 방법에 따라 합성한 3-페닐티오사이클로펜탄온 6.7g(0.035몰)을 THF 50ml에 희석시킨 후, 질소대기하에 주사기를 이용하여 LiAIH₄가 들어있는 냉각된 플라스크에 40분간에 걸쳐 조금씩 가하였다.

반응을 완결시킨 후, 1N 염산수용액(300ml)을 조심스럽게 조금씩 가하였다. 반응 혼합물을 분액깔대기에 옮기고 에틸에테르 50ml씩으로 5회 추출하였다. 유기층을 모아서 포화소금물로 세척한 다음 농축시켜 표제화합물을 정량적으로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 7.3(5H, m), 4.35(1H, m), 3.62(1H, m), 2.31(1H, m), 2.2-1.6(5H, m)

Mass (FAB, m/e) : 194 (M⁺+1)

[제조예2]

3-브로모사이클로펜틸 페닐 설파이드의 합성

250ml 플라스크에 제조예 1에서 수득한 화합물 6.8g(0.035몰)과 진한 브롬산 20ml을 가하고 110℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결되면 상온으로 냉각시키고 분액 깔대기로 옮겨서 에틸에테르로 추출하여 회수하였다.

추출액을 포화소금물로 세척해준 다음 무수 마그네슘설페이트로 건조시키고 여과및 농축시켰다. 실리카겔이 충진된 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 (용리액: n-헥산) 정제하여 표제화합물을 3.3g(수율 : 37%) 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 7.3(5H, m), 4.55(1H, m), 3.93(1H, m), 2.6-2.1(5H, m), 1.75(1H, m)

Mass (FAB, m/e) : 256(M⁺)

[제조예3]

3-페닐티오사이클로펜탄카르복실산의 합성

100ml 용량의 가지 셋 달린 둥근바닥 플라스크에 가열 환류장치를 하고 잘게 썰은 마그네슘(Mg) 330mg (13.6mmol)을 가하였다. 각 구멍을 고무마개로 막아주고 감압상태에서 불꽃으로 플라스크 전체를 건조시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 질소가스를 충진시키고 무수 에틸에테르 2ml를 가한 다음, 1, 2-디브로모메탄 100㎕를 가하고 가열시켜 반응을 개시하였다. 곧바로 제조예 2에서 합성한 화합물을 에틸에테르 3ml에 희석시킨 용액을 상기 혼합물에 서서히 첨가하였다. 이때 자체발열에 의해 부드럽게 가열 환류되었다. 다 가하고 나서 1시간 더 가열환류시켜준 다음 드라이아이스를 몇 조각 넣어주고 1시간 동안 교반하여 반응을 완결시켰다. 반응완결 후, 1 N 염산수용액 20ml을 조금씩 가하면서 교반하였다. 반응 혼합액을 여과시킨 후, 여과액을 분액 깔대기로 옮겨서 층을 분리하고 , 물층을 에틸에테르로 추출하여 모았다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨(NaHCO₃)용액으로 추출하여 모으고, 물층은 1N 염산 수용액으로 대략 pH 1로 산성화시킨 다음 다시 에틸에테르(20ml)로 3회 추출하여 모았다. 추출액을 무수 마그네슘설페이트로 건조시킨 다음 여과및 농축시켜 표제화합물을 340mg(수율 : 39%) 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 7.3(5H, m), 3.7(1H, m), 2.9(1H, m), 2.3-1.8(6H, m)

Mass (FAB, m/e) : 223(M⁺+1)

[제조예 4]

3-페닐설포닐사이클로펜탄카르복실산의 합성

10ml용량 플라스크에 메탄올 0.9ml에 용해시킨 제조예 3에서 합성한 화합물 50mg (0.225mmol)을 가한 다음 0℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물에 증류수 0.9ml에 용해시킨 옥손(2KHSO₅, KHSO₄, K₂SO₄) 산화제414mg (3mol 당량)을 가하고 상온에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응을 완결시킨 다음, 반응액을 증류수 20ml로 희석시키고 클로로포름으로 추출하여 회수하였다. 추출액을 황산나트륨(Na₂SO₄)로 건조시킨 후 여과, 농축시켜 표제화합물을 48mg(수율 :84%) 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 7.9(2H, m), 7.6(3H, m), 3.7(1H, m), 2.9(1H, m), 2.4-1.8(6H, m)

Mass (FAB, m/e) : 223(M⁺+1)

[실시예1]

5-[3-(2,4,6-트리메틸페닐설포닐)구아니디노-2(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도펜탄올의 합성

30 ml용량 플라스크에 제조예 4에서 합성한 화합물 228mg (0.9mmol)을 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 5ml에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 여기에 2-아미노-5-[3-(2, 4, 6-트리메틸페닐설포닐)구아니디노펜탄올 306mg (1 mol 당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT) 182 mg (1.5 mol 당량) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디아미드 염산염(EDC) 98%, 343 mg(2 mol 당량)을 차례로 가하였다. 상기 반응혼합물에 N-메틸모폴린 0.5ml를 조금씩 가하고 같은 온도에서 10분 동안 교반시킨 다음, 중탕을 제거하고 1시간동안 더 교반시켰다.

반응을 완결시킨 후, 감압으로 DMF를 제거하고 에틸아세테이트로 희석시킨 다음 포화 탄산수소나트륨으로 세척하였다. 포화소금물과 1N 염산수용액으로 차례로 세척해주고 다시 한번 포화소금물로 세척해준 다음, 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과및 농축시켜 표제화합물 490 mg (수율 : 95%)을 수득하였다.

¹H NMR(DMSO, ppm) δ; 7.9-7.6(7H, m), 6.8-6.3(2H, bs), 4.6(1H, m), 3.8-2.5(7H, m), 3.35(9H, s), 2.0-1.2(10H, m)

Mass (FAB, m/e) : 579(M⁺+1)

[실시예 2]

5-구아니디노-2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도펜탄올의 합성

30 ml용량 플라스크에 실시예 1에서 합성한 화합물 490mg(0.85mmol)및 티오아니솔(Thioanisole) 2.5 ml를 가하고 여기에 트리플루오로아세트산 15ml를 서서히 가하였다. 오일 중탕으로 50℃까지 가열한 다음 3시간 동안 교반시켰다. 반응을 완결시킨 후, 감암농축시키고 HPLC 로 정제하여 표제화합물 70mg(수율 : 21%)을 수득하였다.

HPLC 조건

ｏ 용리액 ; 메탄올:물 (80:20 v/v)

ｏ 파 장 ; 215nm

ｏ 용리속도 ; 20㎖/min

ｏ 컬 럼 ; Delta PAK C18 100Å(30 x 300mm)

ｏ 표제화합물 용리시간 ; 16분

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 7.8(2H, m), 7.6(3H, m), 3.8-3.0(6H, m), 2.7(1H, m), 2.2-1.3(10H, m)

Mass (FAB, m/e) : 397(M++1)

[실시예 3]

N-메틸-N-메톡시-2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노)펜탄아미드의 합성

30 ml 용량 플라스크에 제조예 4에서 합성한 화합물 300 mg (1.2mmol)을 N, N-디메틸포름아미드(DMF) 5 ml에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 여기에 2-아미노-N-메틸-N-메톡시-5-(3-니트로구아니디노)펜탄아미드 430 mg(1 mol 당량), HOBT 240mg(1.5 mol 당량) 및 EDC 450 mg(2 mol 당량)을 차례로 가하였다. 상기 반응혼합물에 N-메틸모폴린 0.5 ml를 가하고 10분후 중탕을 제거한 다음 3시간 동안 교반시켰다. 반응을 완결시킨 후, 감압농축하고 에틸아세테이트로 희석시킨 다음 탄산수소나트륨 수용액, 1N 염산수용액 및 소금물로 세척하였다. 무수 마그네슘설페이트로 건조시킨 다음, 에틸아세테이트 : 아세토니트릴(5 : 1, v/v)을 용리액으로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼 크로마토그래피를 통과시켜 정제함으로써 표제화합물 290 mg(수율 : 48%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 8.6(1H, bs), 7.9(2H, m), 7.6(3H, m), 6.8(1H, m), 4.95(1H, m), 3.8(3H, s), 3.8-2.7(4H, m), 3.2(3H, s), 2.4-1.8(10H, m)

Mass (FAB, m/e) : 499(M⁺+1)

[실시예 4]

2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노)펜탄알의 합성

잘 건조시킨 플라스크에 실시예 3에서 합성한 화합물 80mg (0.16mmol)을 가하고 무수 테트라하이드로퓨란(THF) 1.6 ml를 가하여 용해시켰다. 용액을 -78℃로 냉각시킨 다음, 1M 디이소부틸알루미늄하이드라이드(DIBAL)을 0.32 ml가하였다. 동 온도에서 1시간 동안 교반시켜 반응을 완결시킨 후, 에틸아세테이트와 물을 가하고 1 N HC1을 사용하여 약 pH 1로 산성화시켰다. 물층을 에틸아세테이트로 추출하여 모으고 포화소금물로 세척해준 다음 무수 마그네슘설페이트로 건조시키고 여과및 농축시켰다. 수득한 화합물을 순수한 n-헥산으로 세척하여 표제화합물을 정량적으로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 7.9-7.5(5H, m), 3.8-2.5(5H, m), 2.2-1.3(10H, m),

Mass (FAB, m/e) : 440(M⁺+1)

[실시예 5]

2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-구아니디노펜탄알의 합성

100 ml 용량 플라스크에 실시예 4에서 합성한 화합물 80 mg(0.19mmol)을 아세트산 20 ml에 용해시켜 가한 다음 15% 팔라듐(Pd/C) 약 80mg을 가하였다. 반응 혼합물에 1,4-사이클로헥사디엔 1 ml를 가하고 수소존재하에 4일간 교반하였다. 가름종이를 통해 여과후 농축하여 표제화합물을 정량적으로 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 7.9(2H, m), 7.7(3H, m), 4.3-2.7(5H, m), 2.2-1.3(10H, m)

Mass (FAB, m/e) : 395(M⁺+1)

[제조예 5]

3-벤질사이클로펜탄올의 합성

무수 테트라하이드로퓨란 6ml을 질소하에서 -78℃로 냉각시켰다.

테트라하이드로퓨란에 용해되어 있는 2.0 M 농도의 벤질마그네슘클로라이드 용액 30 ml(60.0 mmol)를 무수 요오드화구리 50 mg과 함께 반응용기에 가하였다.

2-사이클로펜텐온 5ml(59.68 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 20ml에 용해시킨 후 반응 용기에 천천히 적가하였다. 요오드화구리 140 mg을 더 첨가하고 12시간 동안 교반한 다음 서서히 상온으로 되도록 방치하였다. 반응온도를 0℃로 냉각시킨 다음 얼음물과 묽은 염산으로 반응을 완결시켰다. 에틸에테르로 생성물을 추출하고 무수 마그네슘설페이트로 건조및 여과시켰다. 감압증류하여 유기 용매를 제거하고 수득된 액체를 컬럼 크로마토그래피법 (2%, 5%, 10% 에틸아세테이트/헥산)으로 분리 및 정제하여 무색 액체인 3-벤질사이클로펜탄온 2.11g(수율 : 20.3%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 7.21(5H, m), 2.75(2H, d), 2.60-2.05(4H, m), 1.95(1H, q), 1.65(1H, m)

Mass (FAB, m/e) : 173[M+1]⁺

[제조예 6]

3-벤질사이클로펜탄올의 합성

질소대기하에 리튬알루미늄하이드라이드 2.61 g(68.77 mmol)및 무수 테트라하이드로퓨란 20 ml를 반응용기에 가하고 -78℃로 냉각시켰다. 제조예 5에서 수득된 화합물 5.7g (32.71 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 5ml에 용해시켜 반응용기에 서서히 적가하였다. 같은 온도를 유지하면서 2시간 동안 교반하였다. 묽은 염산으로 반응을 종결시키고 에틸아세테이트로 추출한 다음, 유기층은 탄산수소나트륨 포화수용액 및 염화나트륨 포화수용액으로 차례로 세척하였다. 유기층을 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과및 감압증류시켜 유기용매를 제거한 다음 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피법(5%, 10%, 20% 에틸아세테이트/헥산)으로 분리, 정제함으로써 무색 액체인 표제화합물 5.12g (수율 : 88.7%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 7.23(5H, m), 4.34(1H, m), 2.65(2H, dd), 2.20-1.15(8H, m)

Mass (FAB, m/e) : 177[M+1]⁺

[제조예 7]

3-브로모사이클로펜틸메틸 벤젠의 합성

제조예 6에서 수득된 화합물 3-벤질사이클로펜탄올 5.12g (29.05 mmol)을 진한 브롬산 25ml에 용해시키고 1.5 시간 동안 가열환류시켰다. 에틸아세테이트로 추출하고 탄산수소나트륨 포화수용액과 염화나트륨 포화수용액으로 차례로 세척하였다. 유기층을 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과및 감압증류시켜 유기용매를 제거한 다음 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피법(핵산)으로 분리, 정제함으로써 무색 액체인 표제화합물 2.80g (수율 : 40%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 7.26(5H, m), 4.56(1H, m), 4.35(1H, m), 2.75(2H, m), 2.52-1.97(4H, m), 1.90-1.25(3H, m)

Mass (FAB, m/e) : 240[M+1]⁺

[제조예 8]

3-벤질사이클로펜탄카르복실산의 합성

마그네슘 조각 0.6g을 진공 건조시킨 후 질소 가스를 채우고, 여기에 무수 테트라하이드로퓨란을 마그네슘 조각이 잠길 때까지 가하였다. 1, 2-디브로모에탄올 3 또는 4 방울 정도를 적가한 후 알콜 램프로 가열하였다. 용액이 끓기 시작하면 무수 테트라하이드로퓨란 15ml에 용해되어 있는 제조예 7에서 합성한 화합물 2.80g (11.71 mmol)용액을 서서히 적가하였다. 1시간 동안 가열환류시키면서 교반한 다음 상온으로 온도를 낮춘 후에 드라이아이스를 과량 가하였다. 묽은 염산으로 반응을 종결시키고 디에틸에테르로 용액을 희석시켰다. 10% 수산화나트륨 용액으로 추출하고 물층은 6N 염산을 이용하여 pH=2로 조정하였다.

다시 에틸에테르로 추출하고 무수 마그네슘설페이트로 건조및 여과시킨 다음 감압증류하였다. 유기 용매를 제거하여 무색 액체인 표제화합물 1.60g (수율 : 70.7%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 11.0-10.0(1H, bs), 7.15(5H, m), 2.78(1H, m), 2.57(2H, m), 2.30-1.15( 7H, m)

Mass (FAB, m/e) : 205[M+1]⁺

[실시예 6]

2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-N-메틸-N-메톡시-5-(3-니트로구아니디노) 펜탄아미드의 합성

제조예 8에서 수득한 화합물 0.3g(1.47 mmol)을 디메틸포름아미드 15ml에 가하고 0℃로 냉각시켰다. 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물 0.3g(2.22 mmol)및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염 0.4g(2.10 mmol)을 가하고 용해될 때까지 교반하였다. 반응혼합물에 2-아미노-N-메틸-N-메톡시-5-(3-니트로구아니디노)펜탄아미드 0.3g(0.80 mmol)을 4-메틸모폴린 2ml와 함께 가하였다. 반응액의 온도를 서서히 상온으로 올려서 3시간 동안 교반한 다음 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하였다. 에틸아세테이트로 추출한 다음 탄산수소나트륨 포화수용액, 묽은 염산및 염화나트륨 포화수용액으로 차례로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐설페이트로 건조, 여과시키고 감압증류하여 유기용매를 제거함으로써 흰색 고체의 표제화합물 0.35g(수율 : 96.4%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 8.53(1H, s), 7.65(2H, m), 7.22(5H, m), 6.58(1H, d), 4.93(1H, m), 3.74(3H, s), 3.21(3H, s), 2.68(3H, m), 2.35-1.20(13H, m)

Mass (FAB, m/e) : 449[M+1]⁺

[실시예 7]

2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노) 펜탄알의 합성

실시예 6에서 수득된 화합물 0.33g(0.74 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 5ml에 용해시켰다. 용액을 -78℃로 냉각시킨 다음 헥산에 용해되어 있는 1.0M 디이소부틸알루미늄하이드라이드 용액 3.5ml을 서서히 적가하고 동일 온도로 유지하면서 2시간 동안 교반하였다. 묽은 염산으로 반응을 종결시키고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 탄산수소나트륨 포화수용액및 염화나트륨 포화수용액으로 차례로 세척한 다음 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과시키고 감압증류하여 유기용매를 제거하였다. 실시예2에 기재된 바와 동일한 조건의 고성능 액체 크로마토그래피법으로 분리, 정제하여 표제화합물 0.2g(수율 : 69.0%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 9.58(1H, s), 7.90(2H, s), 7.20(5H, m), 5.89(1H, d), 5.76, 5.48(1H, m), 4.59(1H, m), 2.61(3H, m), 2.35-1.20(13H, m)

Mass (FAB, m/e) : 390[M+1]⁺

[실시예 8]

2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-5-구아니디노펜탄알의 합성

실시예 7에서 수득된 화합물 0.2g(0.51 mmol)을 아세트산 4ml에 용해시킨 후 질소가스를 충진시켰다. 10% 팔라듐(Pd/C) 0.5g을 가하고 1,4-사이클로헥사디엔을 10당량 이상으로 가한 다음 상온에서 2일 동안 교반하였다.

셀라이트로 여과한 후 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하였다. 수득된 잔류물을 실시예 2 동일한 조건의 고성능 액체크로마토그래피법으로 분리, 정제하여 표제화합물 0.1g(수율 : 57.1%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃) δ; 9.60(1H, s), 7.90(2H, s), 7.20(5H, m), 5.80(1H, d), 5.20(1H, m), 4.60(1H, m0, 3.80(1H, m), 2.65(3H, m), 2.35-1.20(13H, m)

FAB MS (M+1) : 345

[참조예]

트롬빈 저해제의 억제활성

하기 설명하는 바에 따라 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 활성에 대한 억제능력을 측정하였다.

1.50mM NaC1및 0.1% PEG 8000(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 8,000)이 함유되어 있는 0.1M 트리스 완충용액 (pH 7.8)을 1.5ml 용량 큐벳에 1160㎕가하였다. 기질 용액으로는 크로모자임 티에취를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 10mM 농도로 용해시킨 후 상기 완충용액으로 희석시켜 0.1mM 농도가 되도록 제조한 것을 사용하였다. 이렇게 제조한 0.1mM 기질용액 225㎕을 큐벳에 첨가하였다. 한편, 억제제 용액으로는 당해 억제제를 디메틸설폭사이드로 10mg/ml 되게 용해시킨 후 상기 완충용액으로 10배 묽혀 1mg/ml 농도로 만든 것을 0 내지 100㎕ 사이의 여러 부피로 취하여 최종 부피가 100㎕ 되게 상기 완충용액과 함께 혼합한 것을 사용하였다. 이미 완충용액과 기질이 들어있는 큐벳들에 위에서 만든 여러 농도의 억제제 용액 100㎕ 씩을 각각 가하였다. 실온에서 반응 용액이 들어있는 큐벳에 각각 0.1 mg/ml 농도의 소 트롬빈 15㎕ 씩을 가하여 효소 가수분해 반응을 시작하였다. 효소를 가한 순간부터 2분 동안 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 381 nm에서의 홉광도의 변화로 모니터하여, 반응시간 대 홉광도의 연속 스펙트럼을 도시하였다. 여러 종류의 억제제 농도에 대해 위의 실험을 수행하여 연속 스펙트럼을 얻었다.

각 스펙트럼에서 반응시간 초기 30초 이내의 기울기로부터 초기속도 Vi을 구한 후, 저해제농도 대비 초기속도의 역수(1/Vi)에 대한 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족하는 1차식을 계산해 낸 후 그 식의 x 절편으로부터 효소 반응식을 사용하여 Ki값을 계산해 낼 수 있다. 이때, 경쟁적 억제제에 대한 효소반응식, 즉 Michaelis-Menten 반응식은 다음과 같이 표현된다.

이 계산에 사용된 KM 값은 8.3μM로서 일정한 효소 농도에서 기질의 농도를 변화시킴으로 구한 것이다.

본 발명에 따른 화합물을 대표하여 실시예 5및 8의 화합물에 대하여 상기 설명한 바에 따라 실험한 결과, 실시예 5 화합물의 Ki 값은 145 μM이고 실시예 8 화합물의 Ki 값은 1.9 μM인 것으로 나타났다.

Claims (8)

1. 하기 일반식(I)의 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염및 그의 입체이성질체.

   상기식에서, R¹은 C_1-4저급알킬, C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족환, 또는 1개 이상의 질소원자를 포함하는 헤테로 방향족환을 나타내고, R²는 수소, 하이드록시, C_1-4저급알킬, 하이드록시 C_1-4저급알킬, 또는 C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아미노를 나타내며, X는 글리신을 나타내고, Y는 O 또는 NH를 나타내며, n은 o 또는 1을 나타내고, A는 C_1-4저급알콕시, 벤질옥시, C_1-4저급알킬아민, C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타낸다.
2. 제1항에 있어서, R¹은 C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족환을 나타내고; R²는 수소, 하이드록시, C_1-4저급알킬, 또는 아미노를 나타내며; A는 벤질옥시, C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 C_1-4저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타내는 일반식(I)의 화합물.
3. 제2항에 있어서, N-[-2-(4-아미디노페닐)-1-(아제판카보닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4-(N'-하이드록시아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4(N'-메틸아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4-(N'-에틸아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, N-[1-(1-아제판카보닐)-2(4-아미드라조노페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, p-[2-(1-아제판카보닐)-2-(2-나프탈렌설폰아미도)에틸]벤즈아미드, N-[1-(1-아제판카보닐)-2-(4-메톡시이미도일페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드, β-(4-아미디노페닐)-α-(2-나프탈렌설폰아미노)]프로피온산벤질에스테르, N-[2-[4-(N'-메틸아미디노)페닐]-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드, N-[2-(4-아미드로조노페닐)-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드인 일반식(I)의 화합물.
4. 하기 일반식(II)의 화합물을 용매 존재하에 하기 일반식(III)의 화합물과 반응시켜 하기 일반식(I)의 화합물을 제조하는 방법.

   상기식에서, R¹, R², X, Y, n및 A는 제1항에서 정의된 바와 같다.
5. 제4항에 있어서, 용매가 메탄올인 방법.
6. 하기 일반식 (II)의 중간체 화합물:

   상기식에서, R¹, X, n및 A는 제1항에서 정의한 바와 같다.
7. 하기 일반식 [5]의 화합물에 요오드화메틸을 이용하여 메틸기를 도입시킴으로써 일반식(II)의 화합물을 제조하는 방법 :

   상기식에서, R¹, X, n및 A는 제1항에서 정의한 바와 같다.
8. 제7항에 있어서, 일반식 [5]의 화합물이 하기 일반식 [4]의 화합물을 피리딘 용매 존재하에 황화수소와 반응시켜 제조되는 방법.

   상기식에서, R¹, X, b및 A는 제1항에서 정의한 바와 같다.