KR0163669B1 - 선택적 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 일반식 (I)의 신규한 선택적 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 저급알킬, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족환, 또는 1개 이상의 질소원자를 포함하는 헤테로 방향족환을 나타내고, R²는 수소, 하이드록시, 저급알킬, 하이드록시저급알킬, 또는 저급알킬에 의해 치환 되거나 비치환된 아미노를 나타내며, X는 글리신을 나타내고, Y는 O또는 NH를 나타내며, n은 1 또는 1을 나타내고, A는 저급알콕시, 벤질옥시, 저급알킬아민, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타낸다.

Description

선택적 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법

본 발명은 하기 일반식 (I)의 신규한 선택적 트롬빈 억제제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 저급알킬, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족환, 또는 1개 이상의 질소원자를 포함하는 헤테로 방향족환을 나타내고, R²는 수소, 하이드록시, 저급알킬, 하이드록시저급알킬, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아미노를 나타내며, X는 글리신을 나타내고, Y는 O 또는 NH를 나타내며, n은 0 또는 1을 나타내고, A는 저급알콕시, 벤질옥시, 저급알킬아민, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타낸다.

일반적으로 혈액응고 과정에는 여러가지 복잡한 효소반응이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 그리고, 그 마지막 단계는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 반응을 포함하고 있다. 이 반응에서 생성된 트롬빈은 혈소판을 활성화시키고 섬유소원을 섬유소로 바꾸는 등의 역할을 수행하는데, 섬유소는 중합반응에 의해 고분자물질로 바뀌고 활성화된 혈액인자 XIII에 의해 교차결합되어 불용성 응혈로 되는 것이므로 트롬빈은 혈액응고에 있어 매우 중요한 역할을 한다. 트롬빈은 또한, 혈액인자 V와 VIII를 활성화시키는데, 이들은 피이드백에 의해 혈액응고 반응을 가속화시킨다.

따라서, 트롬빈 억제제는 효과적인 항응혈제로 작용할 수 있으며, 동시에 혈소판 활성을 억제하고 섬유소 생성 및 안정화를 억제할 수 있다.

이와 같이 트롬빈이 혈액 응고에 있어 중요한 역할을 수행하고 있으므로 오래전부터 트롬빈 활성을 억제할 수 있는 신규한 물질을 개발함으로써 혈액응고를 예방하고 각종 혈전증을 치료하기 위한 방법이 모색되어 왔다.

한편, 트롬빈은 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소로서, 인체내, 특히 혈액 내에는 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소가 다양하게 존재하고 있는데, 혈전용해와 관계하는 플라즈민이 그 대표적인 경우라 할 수 있다. 이와같은 트롬빈의 특성상 효과적인 트롬빈 억제제는 일반적으로 트립신에 대한 억제 효과도 높은 특징이 있으므로 세린계 단백질 분해효소의 원형인 트립신을 상대적으로 덜 억제하는 트롬빈 억제제의 개발은 매우 중요하다.

이러한 사정하에 트롬빈을 효과적으로 억제하는 동시에 트립신에 대한 억제 활성은 낮은 선택적 트롬빈 억제제에 대한 개발이 필요하다고 인식되었으며, 그 결과 아릴설포알지닌계 화합물인 아가트로반(argatroban; 미합중국 특허 제 938711 호)이 개발된 바 있다. 이 화합물은 트립신 대비 트롬빈을 250배 가량 더 잘 억제하며(참조: Biochemistry 1984, 23, p85-90), 매우 복잡한 합성과정을 거쳐서 얻어지는 것으로서 1990년 일본에서 상품화 되었다.

또한, 벤즈아미딘계 아릴설포닐 화합물인 NAPAP도 개발되었는데, 이 화합물은 합성이 용이할 뿐아니라 효과적인 트롬빈 억제제임에도 불구하고 트립신 대비 트롬빈 억제 효과가 50배 정도 밖에 안된다는 문제점이 있다(참조: J.Biol. Chem. 1991, 266, p20085-20093).

이에 본 발명자들은, 합성이 비교적 용이하고 효과적인 트롬빈 억제 활성을 나타내면서도 트립신 대비 트로빈에 대한 선택성이 현저히 향상된 화합물을 개발하기 위해 오랜동안 집중적인 연구를 수행한 결과, 본 발명에 따른 일반식 (I)의 선택적 트롬빈 억제제를 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 선택적 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하기 일반식 (I)로 나타내는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염, 용매화물 및 이성체에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 저급알킬, 저급알킬에 의해 차환되거나 비치환된 방향족환, 또는 1개 이상의 질소원자를 포함하는 헤테로 방향족환을 나타내고, R²는 수소, 하이드록시, 저급알킬, 하이드록시저급알킬, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아미노를 나타내며, X는 글리신을 나타내고, Y는 O 또는 NH를 나타내며, n은 0 또는 1을 나타내고, A는 저급알콕시, 벤질옥시, 저급알킬아민, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타낸다.

본 발명에 따른 일반식 (I)의 화합물의 치환기에 대한 상기 정의에서, 용어 저급알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸과 같은 탄소수 1 내지 4개의 포화된 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 래디칼을 의미하고, 용어 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족환 이란 모노 또는 디사이클릭 방향족환으로서 메틸을 포함하여 저급알킬 1 내지 4개가 방향족환에 치환되거나 비치환된 것을 의미하며, 용어 저급알킬아민은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸과 같은 탄소수 1 내지 4개의 포화된 직쇄 또는 측쇄 알킬에 의해 치환된 아민을 의미한다.

상기 일반식 (I)의 화합물 중에서도 바람직한 화합물은 R¹은 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 방향족 환을 나타내고; R²는 수소, 하이드록시, 저급알킬, 또는 아미노를 나타내며; A는 벤질옥시, 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 펜타메틸렌이민, 또는 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 헥사메틸렌이민을 나타내는 화합물이다.

본 발명의 대표적인 화합물에는 하기에 나타내는 바와 같은 화합물들이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 화합물은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으므로 라세미화합물, 부분 입체 이성체 혼합물 및 개개의 부분 입체 이성체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

다른 한편으로, 본 발명은 상기 정의된 일반식 (I)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 일반식 (I)의 화합물은 하기 반응도식 1에서 도시된 바와 같이 신규한 하기 일반식 (II)의 화합물을 용매 존재하에 하기 일반식(III)의 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기식에서, R¹, R², X, Y, n 및 A는 앞에서 정의된 바와 같다.

상기 반응도식 1에서 반응온도, 반응량 등을 포함한 반응조건은 특정의 반응물질에 따라 당업계에 통상의 지식을 가진 자에 의하여 정해질 수 있다. 또한, 반응용매로도 통상의 용매가 사용될 수 있으나, 메탄올 등의 알콜류가 특히 바람직하다.

또한, 반응도식 1에서 일반식 (I)의 화합물을 제조함에 있어 중간체로 사용된 일반식 (II)의 화합물은 신규한 화합물로서 그 자체로 본 발명의 목적이 되며, 따라서, 일반식 (II)의 화합물을 제조하는 하기 반응도식 2 및 3의 방법을 제공하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 반응도식 1 및 2에서, R¹, X, n 및 A는 앞에서 정의된 바와 같고, P는 아미노보호기를 나타낸다.

상기 반응도식 2 및 3에 대해 설명하면 다음과 같다.

반응도식 2에서는 화합물 [1]의 C-터미날에 먼저 A 그룹을 커플링시켜 화합물 [2]를 제조한 후에 N-터미날의 아미노보호기를 제거하고 여기에 설폰아미드 그룹을 형성시켜 화합물 [4]을 제조하는 반면, 반응도식 3에서는 먼저 화합물 [6]의 N-터미날에 술폰아미드 그룹을 형성시키고 C-터미날에 A그룹을 커플링시킴으로써 화합물 [4]를 제조하고 있다.

상기의 커플링 방법에서 사용될 수 있는 공지의 커플링 시약에는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필 카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-C1), 디페닐포스포릴아지드(DPPA) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 반응도식 2 및 3에서 A 그룹과 커플링 반응을 수행함에 있어 사용된 카르복실산 화합물 [1] 및 [7]은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 그의 산 할라이드 유도체 또는 다른 활성화 에스테르 유도체로 변화시킨 후 사용됨으로써 반응을 더욱 촉진시킬 수 있다. 특히, 활성화 에스테르 유도체는 아민과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하거나, 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성하기 위해 필요하다. 산 할라이드 유도체에는 산 클로라이드가 포함되며, 그밖에 메톡시카보닐클로라이드, 이소부틸옥시카보닐클로라이드 등의 알콕시카보닐할라이드와 커플링 시약으로부터 유도된 카르복실산의 무수물, N-하이드록시프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시숙신아미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2',3'-디카복시이미드-유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀-유도된 에스테르 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

이와 같은 커플링반응에 의해 수득된 중간체 화합물 [4]는 피리딘 용매의 존재하에 황화수소를 포화시켜 반응시킴으로써 화합물 [5]로 제조될 수 있으며, 계속하여 화합물 [5]는 요오드화메탄과 반응하여 신규한 일반식 (II)의 화합물로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 일반식 (I)의 화합물의 트롬빈 억제 효과는 문헌 (참조: Methods in enzymology v. 80, p341-361; Biochemistry 27, p2144-2151(1988) 기재된 방법에 따라 하기 식으로 나타내어지는 해리상수 Ki 값을 결정함으로써 측정한다.

* [E] : 결합하고 있지 않은 효소의 농도

** [I] : 결합하고 있지 않은 억제제의 농도

*** [EI] : 효소와 억제제 결합물의 농도

해리상수 Ki는 효소와 트롬빈 억제제 결합물의 해리정도를 나타내는 것이므로 해리상수 값이 작을수록 효소에 대한 역제제의 결합성이 큰 것을 의미하며 따라서 억제활성이 큰 것으로 평가될 수 있다. 이러한 해리상수는 트롬빈을 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색성을 나타내는 특정 기질과 반응시키고 그 발색정도를 분광광도법에 따라 시간의 함수로 측정함으로써 구할 수 있다.

본 발명에서는 트롬빈의 기질로서 트롬빈의 작용을 받아 발색하는 물질로 크로모자임 티에취(Chromozyme TH: Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 사용한다. 크로모자임 티에취가 트롬빈에 의해 가수분해되면 노란색의 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 따라서, 생성되는 노란색의 파라-니트로아닐리드 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정함으로써 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 억제 활성을 측정할 수 있다. 즉, 흡광도의 변화속도로부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 이는 곧바로 트롬빈 억제제의 효소활성 억제능력과 연관될 수 있다(참조: Methods in Enzymology V. 80 p341-361, Biochemistry 27, p2144-2151, 1988).

한편, 본 발명에 따른 화합물의 트립신 대비 트롬빈 억제에 대한 선택성을 알아보기 위하여 상기 트롬빈 억제 활성을 측정하는 방법과 동일하게 실시하여 트립신에 대한 일반식 (I) 화합물의 억제 효과를 Ki 값으로 측정한 다음 트립신/트롬빈의 비율을 구한다.

이때, 트립신에 대한 실험방법은 트롬빈과 동일하게 하되, 단 기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알지니 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드(N-benzoyl-Val-Gly-Arg p-nitroanilide hydrochoride)를 사용한다.

이와 같이 트롬빈 및 트립신에 대해 본 발명에 따른 일반식 (I) 화합물의 억제활성을 측정한 결과, 본 발명의 화합물은 트롬빈 억제 효과가 우수할 뿐아니라 트립신 대비 트롬빈의 선택성도 뛰어나며, 특히 실시예 3 또는 5의 화합물의 선택성은 각각 약 12000배 및 2500배로서 공지의 트롬빈 억제제가 250배 또는 50배에 불과한데 비해 선택성의 개선이 현저하게 이루어졌음을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 신규한 일반식 (I)의 화합물은 트롬빈 억제 활성이 크고 트립신 대리 트롬빈의 선택성도 우수하므로 혈액 응고 예방 및 각종 혈전증 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물을 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여할 경우 일일 총 용량은 체중 1kg 당 0.001 mg 내지 10 mg의 범위가 바람직하나, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를들면 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 당업계에 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이때, 사용가능한 수성 용매로는 물, 링거액, 또는 등장성 NaCl 용액을 들 수 있다. 또한 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용하는데, 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제로 사용할 수 있다.

경구투여용 구체투여 형태로는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입체가 가능하고, 그 중에서도 특히 캅셀제와 정제가 유용하며, 정제 및 환제는 장용피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태에서는 본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈 또는 스타치 중에서 선택된 1종 이상의 불활성 회석제와 함께 혼합하여 사용할 수 있고, 이러한 희석제 외에 마그네슘 스케이레이트와 같은 윤활제를 함유할 수도 있다.

본 발명의 트롬빈 억제제를 투여하여 항응혈 효과 또는 혈전용해 효과를 얻고자 할 경우, 본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)의 화합물을 혈전 용해제 또는 혈소판 활성 억제제 중에서 선택된 1종 이상의 물질과 동시에 투여할 수 있다.

이와 같이, 혼합하여 투여될 수 있는 혈전용해제로는 티피에이(t-PA), 유로키나아제(Urokinase), 스트렙토키나아제(Streptokinase) 등을 들 수 있으며, 혈소판 활성 저해제로는 아스피린, 티클로피딘(Ticlopidin), 클로피드로겔(Clopidrogel), 7E3 단일항체 등을 들 수 있다.

그러나, 혈전치료 및 예방을 목적으로 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제제는 기 상술된 것으로 제한되지 않으며, 그러한 목적에 유용한 어떠한 제제라도 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다.

그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-(4-시아노페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

50ml 용량 플라스크에β-(4-시아노페닐)-α-(2-나프탈렌설폰아미도)프로 피온산 1g(2.7mmol)을 디메틸포름아미드(DMF) 3ml에 용해시켜 가하고 0℃로 냉각시켰다. 반응혼합물에 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(550mg, 4.1mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디아미드 염산염 98%, 1g(5.5mmol)을 차례로 가하고 DMF 27ml를 더 가하여 완전히 용해시켰다. 계속하여, 헥사메틸렌이민 99%, 300mg(3.0mmlo) 및 트리에틸아민 0.57ml(4.1mmol)을 차례로 가하고 동 온도에서 10분 교반한 다음 얼음물 중탕을 제거하고 1 시간 동안 더 교반하였다. 반응을 완결시킨 후 감압하여 DMF를 제거한 다음 에틸아세테이트 30ml로 희석시키고 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세척하였다. 포화 소금물과 1N 염산 수용액으로 차례로 세척해주고 다시 한 번 포화 소금물로 세척해준 다음 무수 마그네슘설페이트로 건조, 여과, 농축시켜 표제화합물 1.1g(수율:90%)을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, ppm)δ; 8.3(1H,s), 8.0-7.2(10H,m), 6.2(1H, d), 5.1(1H, dd), 4.45(2H,m), 3.7-2.8(4H, m), 1.8-0.8(6H,m)

Mass (FAB, m/e) : 462(M⁺+1)

[제조예 2]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-(4-머캅토이미도일페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

50ml 용량의 가지 두 개 달린 플라스크에 제조예 1에서 합성한 화합물 800mg(1.69mmol)을 가하였다. 여기에 피리딘 12ml 및 트리에틸아민 0.4ml를 가하고 황화수소 가스로 3시간 동안 용액을 포화시켜 주었다(이때 갈색 용액에서 진한 연두색 용액으로 바뀌었다). 마개로 잘 밀봉하여 상온에서 5일간 방치한 다음 냉각증류수 10ml를 가하였다. 1N 염산 수용액을 조금씩 가하여 약 pH 2로 조정하면 고체가 생성되었다. 생성된 고체를 여과하여 모으고 1 N 염산 수용액 2ml와 증류수 3ml로 세척해준 다음 질소대기하에 건조시켜 표제화합물 600mg(수율: 72%)을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 45℃, ppm) δ;8.3(1H, s), 7.9-7.1(10H, m), 5.89(1H, d), 4.41(1H, m), 3.5-2.8(8H,m), 1.7-0.8(8H,m)

Mass (FAB, m/e) : 496(M⁺+1)

[제조예 3]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-(4-메틸티오이미도일페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

50ml 용량 플라스크에 제조예 2에서 합성한 화합물 600mg(1.2mmol), 아세톤 20ml 및 요오드화메탄 (CH₃I) 0.6ml를 가하고 40분간 가열환류시켜 주었다(이때, 노란색의 현탁액에서 붉은색의 맑은 용액상태로 변하였다). 반응을 완결시킨 후 상온으로 냉각시키고 혼합액에 에틸에테르를 가하여 고체화시켰다. 여과후 에틸에테르로 세척해주고 질소대기하에 건조시켜 표제화합물 500mg(수율: 81%)을 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 45℃, ppm) δ;8.5(1H, s), 7.95-7.3(1H, m), 6.0(1H, d), 4.4(1H, m), 3.4-2.8(7H,m), 2.15(3H,s), 1.4-0.8(8H, m)

Mass (FAB, m/e) : 510(M⁺+1)

[실시예 1]

[N-[2-(4-아미디노페닐)-1-(1-아제판카보닐)]-에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

10ml 용량 플라스크에 제조예 3에서 합성한 화합물 150mg(0.29mmol)을 99.5% 메탄올 7ml에 용해시켜 가하였다. 이 반응용액에 암모늄아세테이트 (CH₃CO₂NH₄) 45mg(2몰당량)을 가한 뒤 60℃ 오일중탕에서 2시간 동안 교반하였다. 반응을 완결시킨 후 감압 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합물 100mg (수율: 71%)을 수득하였다.

o 용리액; 메탄올:물 (75:25 v/v)각각 CF₃COOH 0.1%포함

o 파장; 215mm

o 용리속도; 20ml/min

o 칼럼; Delta PAK C₁₈100Å(30×300mm)

o 표제화합물 용리시간; 9.6분

¹H NMR (CD₃OD, ppm) δ; 8.31(1H, s), 8.0-7.4(10H,m), 4.48(1H, m), 3.3-2.8(6H, m), 1.5-0.8(8H, m)

Mass(FAB, m/e) : 479 (M⁺+1)

[실시예 2]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4-(N¹-하이드록시아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

10ml 용량 플라스크에 제조예 3에서 합성한 화합물 100mg(0.19mmol)과 99.5% 메탄올 1ml를 가하였다. 여기에 히드록시아민 염산염 (HONH₂·HCI)19.5mg (1.3mol 당량)과 포타슘 t-부톡사이드(KO⁺)31.2mg(1.3mol 당량)를 가열 환류시키면서 6시간에 걸쳐 세차례로 나누어 가하였다. 첨가 완료후에도 2시간 동안 더 가열환류 및 교반시킨 후 상온으로 냉각시키고 농축하여 HPLC로 정제함으로써 표제화합물을 67mg(수율: 64%) 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간 8.7 분이었다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ; 8.3(1H, s), 7.9-7.3(10H, m), 6.9(1H, bs), 6.23(1H, d), 4.35(1H, m), 3.4-2.8(6H, m), 1.5-0.7(8H, m)

Mass(FAB, m/e) : 495(M⁺+1)

[실시예 3]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4-(N¹-메틸아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

5ml 용량 플라스크에 제조예 3에서 합성한 화합물 50mg(0.098mmol)을 99.5% 메탄올 1ml에 용해시켜 가한 다음 메틸아민 수용액(40%) 15㎕(2mol 당량)을 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응혼합액을 감압 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합물 24mg(수율: 50%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같은 표제화합물 용리시간은 9.7분이었다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.3(1H, s), 8.0-7.4(10H, m), 4.48(1H, m), 3.25(2H, m), 3.05(3H, s), 3.04-2.8(4H, m), 1.5-0.8(8H, m)

Mass(FAB, m/e) : 493(M⁺+1)

[실시예 4]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-[4-(N¹-에틸아미디노)페닐]]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

10ml 용량 플라스크에 제조예 3에서 합성한 화합물 40mg(0.078mmol)을 99.5% 메탄올 1ml에 용해시켜 가하였다. 반응액을 상온에서 교반하면서 70%에틸아민 수용액(CH₃CH₂NH₂) 13㎕(2mol 당량)을 6시간에 걸쳐 네차례로 나누어 가한 다음 17시간 동안 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 HPLC로 정제하여 표제화합물 6mg(수율: 18%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간은 11분이었다.

¹H NMR(CD₃CD, ppm) δ; 8.32(1H, s), 8.02-7.4(10H, m), 4.7(1H, m), 3.45(2H, q), 3.28-2.8(6H, m), 1.45-0.8(11H, m)

Mass(FAB, m/e) : 507(M⁺+1)

[실시예 5]

[N-[1-(1-아제판카보닐)-2-(4-아미드라조노페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

10ml 용량 플라스크에 제조예 3에서 합성한 화합물 100mg(0.19mmol)을 가하여 99.5% 메탄올 1ml에 용해시켰다. 이 반응 화합물에 80% 수화히드라진(NH₂NH₂H₂O) 41mg(2mol 당량)을 상온에서 30분 간격으로 세차례로 나누어 가한 다음 1시간 동안 더 교반하고 농축시켰다. HPLC로 정제하여 표제화합물 24mg (수율 : 25%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간은 9.4분이었다.

¹H NMR(CD₃CD, ppm) δ; 8.32(1H, s), 8.02-7.4(10H, m), 4.47(1H, m), 3.28-2.8(6H, m), 1.5-0.8(8H, m)

Mass(FAB, m/e) : 494(M⁺+1)

[실시예 6]

[p-[2-(1-아제판카보닐)-2-(2-나프탈렌설폰아미도)에틸]벤즈 아미드의 합성]

상기 표제화합물은 실시예 5의 부생성물로서 32mg (수율: 35%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간은 12.2분이었다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.3(1H, s), 8.0-7.2(10H, m), 6.2(1H, d), 5.2(1H, m), 4.5(2H, m), 3.7-2.8(4H, m), 1.8-0.8(6H, m)

Mass(FAB, m/e) : 480(M⁺+1)

[실시예 7]

[N-[1-아제판카보닐)-2-(4-메톡시이미도일페닐)]에틸-(2-나프탈렌)설폰아미드의 합성]

10 ml 용량 플라스크에 제조예 1에서 합성한 화합물 40mg(0.078mmol)을 메탄올 1 ml에 용해시킨 후 3시간 동안 가열 환류시켰다. 상온으로 냉각시킨 후 감압 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합물 7mg(수율: 18%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.3-7.2(11H, m), 4.5(1H, m), 3.4-2.8(6H, m), 3.3(3H, s), 1.5-1.0(6H, m)

Mass(FAB, m/e) : 494(M⁺+1)

[실시예 8]

[β-(4-아미디노페닐)-α-(2-나프탈렌설폰아미도)프로피온산 번질에스테르의 합성]

β-(4-시아노페닐)-α-(2-나프탈렌설폰아미도)프로피온산 벤질에스테르 화합물을 제조예 1, 제조예 2 및 제조예 3 과 동일한 방법으로 실시하여 수득한 β-(4-메틸티오이미도일페닐)-α-(2-나프탈렌설폰아미도)프로피온산 벤질에스테르 100mg (0.2 mmol)을 30ml 용량 플라스크에 가하고 메탄올 8ml 및 암모늄아세테이트 (CH₃CO₂NH₄) 32mg (2mol 당량)과 혼합한 다음 65℃ 오일 중탕에서 17시간 동안 교반하였다. 반응을 완결시킨 후 감압 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합 물을 70mg (수율: 68%) 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.3-7.0(16H, m), 4.7(2H, m), 4.3(1H, m), 3.0(2H, m)

Mass(FAB, m/e) : 488(M⁺+1)

[제조예 4]

[N-[2-(4-머캅토이미도일페닐)-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드의 합성]

30ml 용량의 가지 두 개달린 플라스크에 N-[2-(4-시아노페닐)-1-(1-피페리딘카보닐)에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트이미드 390mg(0.7 mmol)을 가하고 여기에 피리딘 6ml 및 트리에틸아민 0.2ml를 가하여 용해시켰다. 반응혼합액에 황화수소 가스를 2시간 동안 통과시켜 포화시켜 주었다. 마개로 잘 밀봉한 다음 상온에서 1주일간 방치하였다. 반응을 완결시킨 후 냉각된 증류수 1ml를 붓고 1 N 염산수용액을 조금씩 가하여 pH를 2로 조정하였다. 이때 생성된 고체를 여과하고 1 N 염산수용액 및 증류수로 차례로 세척해준 다음 질소 대기하에 건조시켜 표제화합물 320mg (수율: 84%)을 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.68(1H, m), 8.5-7.3(8H, m), 7.05(2H, m), 5.8(1H, m), 5.05(1H, dd), 3.8-2.8(8H, m), 1.7-1.2(6H, m)

Mass(FAB, m/e) : 539(M⁺+1)

[제조예 5]

[N-[2-(4-메틸티오이미도일페닐)-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드의 합성]

50ml 용량 플라스크에 제조예 4에서 합성한 화합물 646 mg(1.2mmol) 아세톤 20ml 및 요오드화메탄(CH3I) 0.6ml를 가하고 50분간 가열 환류시켰다. 반응을 완결시킨 후 상온으로 냉각시키고 에틸에테르를 가하여 고체화시켰다. 여과 후 에틸에테르로 세척해주고 질소대기하에 건조시켜 표제화합물을 550mg(수율: 83%) 수득하였다.

¹H NMR (CDCL₃, ppm) δ; 9.2(1H, d), 8.5-7.3(11H, m), 5.2(1H, m), 3.7-3.2(6H, m), 3.05(3H, s), 2.9(2H,m), 1.7-1.4(6H,m)

Mass(FAB, m/e) : 553 (M⁺+1)

[실시예 9]

[N-[2-[4-(N¹-메틸아미디노)페닐]-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드의 합성]

5ml 용량 플라스크에 제조예 5에서 합성한 화합물 60mg(0.11mmol)을 99.5% 메탄올 1ml에 용해시켜 가한 다음, 40% 메틸아민(CH₃NH₂) 수용액 16㎕(2mol 당량)을 2시간 간격으로 두차례로 나누어 가하였다. 다 가한 다음 2시간 더 상온에서 교반시킨 후 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합물 37mg(수율: 64%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간은 8.6 분이었다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.43-7.38(11H, m), 5.0(1H, m), 3.6(2H, s), 3.5-3.2(2H,m), 3.1(3H, s), 3.08-2.8(4H, m), 1.6-1.2(6H, m)

Mass(FAB, m/e) : 536(M⁺+1)

[실시예 10]

[N-[2-(4-아미드로조노페닐)-1-(1-피페리딘카보닐)]에틸-(2-나프탈렌설폰아미도)아세트아미드의 합성]

10ml 용량 플라스크에 제조예 5에서 합성한 화합물 60mg(0.11mmol)을 99.5% 메탄올 1ml에 용해시켜 가하였다. 이 반응혼합액에 80% 수화히드라진(NH₂NH₂·H₂O) 45.7㎕를 1시간 간격으로 4회에 걸려 가하였다. 다 가하고 1시간 더 교반한 다음 농축하고 HPLC로 정제하여 표제화합물 32mg(수율: 55%)을 수득하였다. 이때, HPLC 조건은 실시예 1과 같으며, 표제화합물 용리시간은 8.5분이었다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ; 8.5-7.4(11H, m), 5.05(1H, m), 3.55(2H, s), 3.5-2.8(6H, m), 1.7-1.3(6H, m)

Mass(FAB, m/e) : 537(M⁺+1)

[참조예]

[트롬빈 저해제의 억제활성]

하기 설명하는 바에 따라 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 활성에 대한 억제 능력을 측정하였다.

1.50mM NaCl 및 0.1% PEG 8000 (폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 8,000)이 함유되어 있는 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.8)을 1.5ml 용량 큐벳에 1160㎕가하였다. 기질 용액으로는 크로모자임 티에취를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 10mM 농도로 용해시킨 후 상기 완충용액으로 희석시켜 0.1mM 농도가 되도록 제조한 것을 사용하였다. 이렇게 제조한 0.1mM 기질용액 225㎕을 큐벳에 첨가하였다. 한편, 억제제 용액으로는 당해 억제제를 디메틸설폭사이드로 10mg/ml 되게 용해시킨 후 상기 완충용액으로 100내지 1000배 희석시킨 것을 억제제의 양이 0 내지 10㎍의 양이 되도록 취한 후 트리스 완충용액으로 전체 부피가 100㎍로 되도록 하여 큐벳에 가하였다.

실온에서 반응 용액이 들어있는 큐벳에 각각 0.1mg/ml 농도의 소 트롬빈 15㎍씩을 가하여 효소 가수분해 반응을 시작하였다. 효소를 가한 순간부터 2분 동안 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 381nm에서의 흡광도의 변화로 모니터하여, 반응시간 대 흡광도의 연속 스펙트럼을 도시하였다. 여러 종류의 억제제 농도에 대해 위의 실험을 수행하여 연속 스펙트럼을 얻었다.

각 스펙트럼에서 반응시간 초기 30초 이내의 기울기로부터 초기속도 Vi을 구한 후, 저해제 농도 대비 초기속도의 역수(1/Vi)에 대한 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족하는 1차식을 계산해 낸 후 그 식의 x 절편으로부터 효소 반응식을 사용하여 Ki값을 계산해 낼 수 있다. 이때, 경쟁적 억제제에 대한 효소반응식, 즉 Michaelis-Menten 반응식은 다음과 같이 표현된다.

이 계산에 사용된 K_M값은 8.3μM로서 일정한 효소 농도에서 기질의 농도를 변화시킴으로 구한 것이다.

한편, 트립신에 대한 본 발명에 따른 화합물의 억제 활성도 상기 트롬빈의 경우에 대해 설명한 바에 따라 실시하여 측정하였다.

기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알지닌 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드(N-benzoyl-Val-Gly-Arg p-nitroanilide hydrochloride) 20μM 용액을 사용하였으며, 억제제는 0 내지 120㎍ 범위내에서 여러가지 농도를 사용하였다. 또한, 트립신은 0.1N HCl 용액에 용해시킨 것을 실험 직전에 상기 트리스 완충용액으로 45㎍/ml 농도로 만든 후 40㎍을 사용하였다. 트롬빈에 대한 실험과 마찬가지로 반응용액의 총 부피를 1.5㎖로 하고 그밖에도 동일한 방법으로 실험하였으며, Ki 값의 계산에 사용된 K_M값도 동일한 방법으로 정하였는데 그 값은 20.2μM이었다.

이상에서 설명한 방법에 따라 트롬빈과 트립신에 대해 측정된 본 발명에 따른 억제제의 각 효소활성 억제능력을 Ki 값으로 나타내었으며 또한 트롬빈에 대한 선택성은 트립신/트롬빈으로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

상기 표 1의 결과로부터, 본 발명에 따른 일반식 (1)의 화합물은 트롬빈에 대한 억제 활성이 뛰어날 뿐아니라 트립신 대비 트롬빈 억제 활성이 매우 현저함을 알 수 있었다.

Claims (8)

1. 하기 일반식 (1)의 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 입체이성질체.상기식에서, X는 N 또는 CH를 나타내고, n은 0내지 3의 정수를 나타내며, R¹및 R²는 각각 독립적으로 R³-(CH₂)_p-(Y)_q- 또는 수소를 나타내고, 여기서, R³는 페닐 또는 사이클로알킬을 나타내며, Y는 O, S, SO 또는 SO₂를 나타내고, p는 0내지 3의 정수를 나타내며, q는 0또는 1을 나타내고, A는또는를 나타내며, 여기서, R⁴는 수소, 니트로, C_1-6저급알킬, C_1-4저급알킬아민, 또는 C_1-6저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고, B는 C_1-4저급알데히드, 하이드록시C_1-6저급알킬, C_1-6저급알킬 또는 C_1-4저급알콕시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타낸다.
2. 제1항에 있어서, X는 CH를 나타내고; n은 0이며; R³는 페닐을 나타내고; Y는 SO₂를 나타내며; p 및 q는 각각 독립적으로 0 또는 1이고; A는을 나타내며, 여기서 R⁴는 수소, 니트로, 또는 C_1-6저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내는 일반식 (1)의 화합물.
3. 제2항에 있어서, R¹은 R³-(CH₂)_p-(Y)_q-를 나타내고; R²는 수소를 나타내며; R⁴는 수소, 니트로, 또는 메틸에 의해 치환되거나 비치환된 페닐설포닐을 나타내고; B는 포르밀, 하이드록시메틸, 메틸 또는 메톡시에 의해 치환되거나 비치환된 카르바모일을 나타내는 일반식 (1)의 화합물.
4. 제3항에 있어서, 5-[3-(2, 4, 6-트리메틸페닐설포닐)구아니디노-2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도펜탄올, 5-구아니디노-2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도펜탄올, N-메틸-N-메톡시-2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노)펜탄아미드, 2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노)펜탄알, 2-(3-페닐설포닐사이클로펜틸)카복사미도-5-구아니디노펜탄알, 2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-N-메틸-N-메톡시-5-(3-니트로구아니디노)펜탄아미드, 2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-5-(3-니트로구아니디노)펜탄알, 2-(3-벤질사이클로펜틸)카복사미도-5-구아니디노펜탄알인 일반식 (1)의 화합물.
5. 하기 일반식 (II)의 화합물과 하기 일반식 (III)의 화합물을 용매 및 커플링제 존재하에 반응시켜 하기 일반식 (I)의 화합물을 제조하는 방법.

   상기식에서, X, R¹, R², n, A 및 B는 제1항에 정의한 바와 같다.
6. 제5항에 있어서, 커플링제가 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-디메틸아미노-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-C1), 디페닐포스포릴아지드(DPPA) 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 반응이 0 내지 40℃에서 수행되는 방법.
8. 제5항에 있어서, 용매가 에틸에테르, 테트라하이드로퓨란, 아세톤, 메틸에틸케톤, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 중에서 선택된 1종 이상인 방법.