KR100242264B1

KR100242264B1 - N-알킬-n-알콕시아민 구조를 갖는 신규한 트롬빈 억제제

Info

Publication number: KR100242264B1
Application number: KR1019970052150A
Authority: KR
Inventors: 김인철; 이구; 박철원; 유영준; 홍창용; 김영관; 정원혁
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2000-02-01
Also published as: KR19990031440A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 신규한 트롬빈 억제제, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 트롬빈 억제제 조성물에 관한 것이다:

상기식에서,

R₁은 치환되거나 비치환된 아릴 그룹을 나타내고,

R₂는 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내며,

R₃은 저급알콕시 또는 사이클로알킬옥시를 나타낸다.

Description

Ｎ-알킬-Ｎ-알콕시아민 구조를 갖는 신규한 트롬빈 억제제

본 발명은 신규한 트롬빈 억제제, 더욱 구체적으로는 하기 화학식 1 로 표시되는 N-알킬-N-알콕시아민 구조를 갖는 신규한 트롬빈 억제제, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 트롬빈 억제제 조성물에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기식에서,

R₁은 치환되거나 비치환된 아릴 그룹을 나타내고,

R₂는 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내며,

R₃은 저급알콕시 또는 사이클로알킬옥시를 나타낸다.

일반적으로 혈액응고 과정에는 여러가지 복잡한 효소반응이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 그리고, 마지막 단계는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 반응을 포함하고 있다. 이 과정에서 생성된 트롬빈은 혈소판을 활성화시키고, 섬유소원을 섬유소로 바꾸는 등의 역할을 수행하는데, 이때 생성된 섬유소는 중합반응에 의해 고분자물질로 바뀌고, 활성화된 혈액인자 XIII 에 의해 교차결합되어 불용성 응혈이 된다. 트롬빈은 또한 혈액응고 과정에 참여하는 혈액인자 V 와 VIII 을 활성화시키는 역할도 하여 혈액응고 반응을 더욱 가속화시킨다. 따라서, 트롬빈 억제제는 효과적인 항응혈제로 작용하는 동시에, 혈소판 활성을 억제하고 섬유소 생성 및 안정화를 막을 수 있으므로 오래 전부터 트롬빈 활성을 억제할 수 있는 신규한 물질을 개발함으로써 혈액응고를 예방하고 각종 혈전증을 치료하기 위한 방법이 모색되어 왔다.

그러나, 단순히 트롬빈을 억제할 수 있다는 점만으로는 효과적인 항응혈제로 사용하는데 제약이 따른다. 그 이유는 트롬빈이 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소이므로, 효과적인 트롬빈 억제제는 트립신에 대한 억제효과도 높은 특징이 있기 때문이다. 인체내, 특히 혈액내에는 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소(대표적인 예: 플라스민)가 다양하게 존재하고 있기 때문에, 트롬빈 억제제를 개발함에 있어서는 이러한 세린계 단백질 분해효소를, 특히 트립신을 상대적으로 덜 억제하는 성질을 갖도록 하는 것이 매우 중요하다.

이러한 사정하에서 트롬빈을 효과적으로 억제하는 동시에 트립신에 대한 억제활성은 낮은 선택적 트롬빈 억제제를 개발하고자 하는 연구가 광범위하게 이루어 졌다.

지금까지 효과적인 트롬빈 억제제로 개발된 대표적인 화합물로는 첫째 아릴설포닐알지닌계 화합물인 하기 화학식 10 의 아가트로반(Argatroban; 미합중국 특허 제 4258192 호 및 제 4201863 호)을 들 수 있다.

이 화합물은 트롬빈을 효과적으로 억제(Ki=5nM)한다고 보고되어 있으며, 이미 1990 년에 일본에서 주사용 제제로 상품화되었다(참조: Biochemistry 1984, 23, 85-90). 그러나 이 화합물은 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 250 배 정도로 낮을 뿐 아니라 매우 복잡한 합성과정을 거쳐야만 제조된다는 단점을 가지고 있다.

또한, 경구투여가 가능하면서 효과적인 트롬빈 억제제로서 개발된 화합물로는 코르바스(Corvas)사에서 개발한 하기 화학식 11 의 CVS-1123 이 있다. 이 화합물은 쥐에서 뿐만 아니라 개 및 원숭이에도 경구투여가 가능한 것으로 보고되었으나, 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 50 배 이하로 저조한 것이 큰 단점이다(참조: WO 9315756 및 WO 9408941).

이에 본 발명자들은 합성이 비교적 용이하고 트롬빈 억제활성이 뛰어난 화합물을 개발하기 위해 새로운 구조를 갖는 다양한 화합물들을 개발하여 그의 트롬빈 억제효과에 대하여 검토하였다. 특히, 본 발명자들은 지금까지 개발된 트롬빈 억제제들과는 달리 P-포켓(pocket)에 키랄 구조가 아닌 N-알킬-N-알콕시아민 구조를 갖는 새로운 화합물들에 대하여 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 상기 정의된 화학식 1 의 구조를 갖는 화합물들이 뛰어난 트롬빈 억제효과를 가질 뿐 아니라 트립신에 비해 트롬빈에 대해 뛰어난 선택성을 가진다는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 N-알킬-N-알콕시아민 그룹을 갖는 신규한 트롬빈 억제제 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 및 각종 혈전증 치료용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따라 제공되는 화합물은 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성체이다:

[화학식 1]

상기식에서,

R₁은 치환되거나 비치환된 아릴 그룹을 나타내고,

R₂는 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내며,

R₃은 저급알콕시 또는 사이클로알킬옥시를 나타낸다.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 치환기에 대한 상기 정의에서 용어 ″저급알킬″은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 이들의 이성체를 포함하는 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 측쇄 포화탄화수소 라디칼을 의미하고, 용어 ″사이클로알킬″은 각각 사이클로프로필, 사이클로펜틸 등을 포함한 탄소수 3 내지 8 의 사이클릭 알킬을 의미하며, 용어 ″저급알콕시″ 및 ″사이클로알킬옥시″는 각각 상기 정의된 저급알킬 및 사이클로알킬 그룹이 산소 원자와 결합된 그룹을 의미하고, 용어 ″치환되거나 비치환된 아릴″은 하나 이상의 적절한 치환체에 의해 치환되거나 비치환된 6 내지 10-원 아릴 그룹을 의미한다. 여기에서 아릴에 대해 적합한 치환체의 예로는 저급알킬 또는 저급알콕시 등이 언급될 수 있다.

본 발명에 따르는 바람직한 화학식 1 의 화합물은 R₁이 C₁-C₄알킬에 의해 치환되거나 비치환된 C₆-C₁₀아릴 그룹을 나타내며, R₂는 C₁-C₄알킬 또는 사이클로펜틸을 나타내고, R₃가 C₁-C₄알콕시를 나타내는 화합물이다.

본 발명에 따르는 특히 바람직한 화학식 1 의 화합물은 R₁이 프로필에 의해 치환되거나 비치환된 페닐 또는 나프탈레닐 그룹을 나타내며, R₂는 메틸 또는 사이클로펜틸을 나타내고, R₃가 메톡시 또는 에톡시를 나타내는 화합물이다.

본 발명의 대표적인 화합물에는 다음과 같은 화합물이 포함된다:

1. (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(4-프로필벤젠술포닐아미노)-프로피온아미드

2. (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드

3. (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-에톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드

4. (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메톡시-2- (나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수도 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를들면 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산 또는 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기 카본산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 나프탈렌술폰산 등과 같은 술폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 또한 화학식 1 의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염에는 수화물 또는 용매화물도 포함되는 것으로 이해하여야 한다.

한편, 본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로 라세미 화합물, 부분입체이성체 혼합물 및 개개의 부분입체이성체로서 존재할 수 있다. 이들 모든 이성체 형태도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 또한 상기 정의된 화학식 1 의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 상기 정의된 화학식 1 의 화합물은 하기 화학식 2 의 메틸머캅토 유도체를 하기 화학식 3 의 하이드라진 화합물과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.

상기식에서, R₁, R₂및 R₃는 상기에서 정의한 바와 같다.

본 발명에 따르는 화학식 1 의 화합물의 제조방법은 다음 반응식 1 로 표시할 수 있다.

상기 반응식 1 에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따르는 화학식 1 의 화합물은 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물을 친핵체인 화학식 3 의 하이드라진과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 이 반응은 바람직하게는 용매의 존재하에서 수행할 수 있다. 이러한 목적으로 바람직하게 사용될 수 있는 용매의 예로는 반응에 악영향을 미치지 않는 유기용매라면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 일반적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알콜 용매가 바람직하게 사용된다.

본 반응에서 사용되는 반응물의 양, 반응온도, 반응시간 등을 포함한 반응조건은 특정의 반응물질에 따라 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로 반응온도는 다양하게 변화시킬 수 있으나, 0℃ 내지 50℃ 에서 반응을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 또한 반응시간은 일반적으로 0.5 내지 5 시간이 소요되나, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 반응을 수행한다.

본 반응이 완결된 후에 생성물은 통상적인 후처리 방법, 예를들면 크로마토그라피, 재결정화 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

상기 반응식 1 에서 화학식 1 의 화합물을 제조하는데 중간체로 사용된 화학식 2 의 메틸머캅토 화합물은 예를들어 화학식 4 의 화합물을 R₂및 R₃가 치환된 아민과 커플링시켜 C-말단에 상응하는 아민 그룹을 도입시킴으로써 화학식 5 의 화합물을 수득하고, 화학식 5 의 화합물로 부터 아미노 보호그룹을 제거하여 생성된 화학식 6 의 화합물을 화학식 7 의 술포닐클로라이드 유도체와 반응시켜 화학식 8 의 화합물을 수득하고, 수득된 화학식 8 의 화합물을 염기의 존재하에서 황화수소로 포화시켜 화학식 9 의 화합물을 생성시키고 생성된 화학식 9 의 화합물을 메틸화시킴으로써 제조할 수 있다.

상기식에서 R₁, R₂ 및 R₃는 상기에서 정의한 바와 같고, P 는 벤질옥시카보닐, 알릴옥시카보닐, t-부톡시카보닐 또는 트리틸 그룹 등과 같은 통상적인 아미노 보호그룹을 나타낸다.

상기한 바와 같은 화학식 2 화합물의 제조방법은 하기 반응식 2 로 나타낼 수 있다.

반응식 2 에서 보는 바와 같이, 화학식 2 의 화합물을 제조하기 위해서는 화학식 4 의 화합물을 먼저 R₂및 R₃가 치환된 아민 화합물과 커플링시켜 C-말단에 상응하는 아민 그룹을 도입시킴으로써 화학식 5 의 화합물을 수득한다.

화학식 4 화합물의 커플링반응을 위해 사용될 수 있는 공지의 커플링시약에는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디메틸아미노)-프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-Cl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA) 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한 이 커플링반응에서 사용된 화학식 4 의 카복실산 화합물은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 그의 반응성 유도체, 예를들면 산 할라이드 및 그밖의 다른 활성화 에스테르 유도체로 전환시켜 커플링반응에 사용함으로써 반응을 촉진시킬 수 있다. 카르복실산의 활성화 유도체는 아민과의 커플링반응에 의해 아미드 결합을 형성시키기 위해 필요하다. 이러한 반응성 유도체에는 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있는 통상적인 유도체들이 포함되는데, 예를들어 산 할라이드에는 산 클로라이드가 포함되고, 활성화 에스테르에는 메톡시카보닐클로라이드, 이소부틸옥시카보닐클로라이드 등의 알콕시카보닐할라이드와 커플링 시약으로 부터 유도된 카복실산의 무수물, N-하이드록시프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시숙신이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2',3'-디카복시이미드-유도된 에스테르, 2,4,5-트리클로로페놀-유도된 에스테르 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

상기의 커플링반응에서 생성된 화학식 5 의 화합물은 그 다음에 통상적인 아미노 보호그룹 제거방법에 의해 N-말단 아미노 보호그룹을 제거하여 화학식 6 의 화합물을 수득한다. 이 화학식 6 의 화합물을 화학식 7 의 술포닐클로라이드 화합물과 반응시킴으로써 그의 N-말단 부위에 술포닐 그룹을 도입시켜 화학식 8 의 화합물을 수득한 후, 이 화학식 8 의 니트릴 화합물을 피리딘 및 트리에틸아민과 같은 염기의 존재하에서 황화수소로 포화시켜 화학식 9 의 티오아미드 화합물을 생성시키고, 이 화학식 9 의 티오아미드 화합물을 메틸화시킴으로써 화학식 2 의 목적하는 출발화합물을 제조할 수 있다. 화학식 9 화합물의 메틸화를 위해서는 요오드화메탄, 디메틸술페이트((CH₃)₂SO₂) 또는 메틸트리플레이트(CH₃OTf) 등과 같은 메틸화제를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 트롬빈 억제효과는 문헌(참조: Methods in Enzymology V. 80, p341-361; Biochemistry 27, p2144-2151, 1988)에 기재된 방법에 따라 하기 식을 이용하여 해리상수 Ki 값을 결정함으로써 측정한다.

Ki = [E]ㆍ[I]/[EI]

상기식에서, [E] 는 억제제와 결합하고 있지 않은 효소의 농도이고, [I] 는 효소와 결합하고 있지 않은 억제제의 농도이며, [EI] 는 효소와 억제제 결합물의 농도이다.

해리상수 Ki 는 효소와 트롬빈 억제제 화합물의 해리정도를 나타내는 것이므로 해리상수 값이 작을수록 효소에 대한 억제제의 결합성이 큰 것을 의미하며 따라서 억제활성이 큰 것으로 평가될 수 있다. 이러한 해리상수는 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색성을 나타내는 특정 기질과 반응시키고 그 발색정도를 분광광도법에 따라 시간의 함수로 측정함으로서 구할 수 있다.

본 발명에서는 트롬빈의 기질로서 트롬빈의 작용을 받아 가수분해되면 발색하는 물질인 크로모자임 TH(Chromozyme TH : 토실-Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 사용한다. 크로모자임 TH 가 트롬빈에 의해 가수분해되면 노란색의 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 따라서, 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정함으로써 본 발명에 따른 화합물의 트롬빈 억제활성을 측정할 수 있다. 즉, 흡광도의 변화로 부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 이 결과는 바로 트롬빈 억제제의 효소활성 억제능력과 연관될 수 있다.

이와 같은 방법으로 본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물의 트롬빈 억제활성을 측정한 결과, 본 발명의 화합물은 매우 우수한 트롬빈 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 동물실험에서 혈전생성 억제능력을 측정한 바에 따르면 실시예 3 의 화합물은 5㎎/㎏ 의 용량에서 혈전생성을 52% 억제하는 우수한 효과를 나타내었다.

상기 언급한 바와 같이 본 발명에 따른 화학식 1 의 화합물은 공지의 트롬빈 억제성 화합물들에 비해 합성이 용이하고 트롬빈 억제능력이 뛰어나며, 동물실험에서도 우수한 혈전생성 억제효과가 입증된 효과적인 트롬빈 억제제이다. 따라서 본 발명의 화합물은 혈액응고 예방 및 혈전증의 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명은 또한 화학식 1 의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 및 혈전증 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1㎏ 당 0.001㎎ 내지 10㎎ 의 범위가 바람직하나, 특정환자에 대한 특이용량 수준은 사용될 특정화합물, 개개 환자의 체중, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다.

주사용 제제, 예를들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며 멸균 고정오일은 통상적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제 등의 형태일 수 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 화학식 1 의 활성화합물을 슈크로즈, 락토즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물을 임상적으로 투여하여 목적하는 항응혈 효과 및 혈전용해효과를 얻고자 하는 경우에, 본 발명에 따른 화학식 1 의 활성화합물은 혈전용해제 및 혈소판 활성 억제제중에서 선택된 1 종 이상의 성분과 동시에 투여를 할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 화합물과 혼합하여 투여될 수 있는 혈전용해제로는 t-PA, 유로키나제(Urokinase), 스트렙토키나제(Streptokinase) 등이 포함될 수 있으며, 혈소판 활성 억제제로는 아스피린, 티클로피딘(Ticlopidin), 클로피드로겔(Clopidrogel), 7E3 단일항체 등이 포함된다.

그러나, 혈전의 치료 및 예방을 목적으로 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제제는 상술된 것으로 제한되는 것은 아니며, 혈전의 치료 및 예방에 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명의 범위가 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

제조예 1

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-메톡시-N-메틸-2-(t-부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온아미드의 합성

(S)-3-(4-시아노-페닐)-2-(t-부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온산 0.3g(1.03 밀리몰)을 디메틸포름아미드(DMF) 5㎖ 에 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃ 로 냉각시킨 후, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염(EDC) 0.4g 과 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT) 0.2g 을 가하고 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 이 용액에 N,O-디메틸하이드록실아민 0.1g(1.03 밀리몰)과 트리에틸아민 0.7㎖ 를 가하였다. 반응혼합물을 상온으로 서서히 상승시키고 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류용액을 에틸아세테이트로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 묽은 염산 및 포화 염수로 차례로 세척하였다. 이어서 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 농축시켰다. 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 에틸아세테이트/헥산(2/1, 부피비)]시켜 정제된 표제화합물 0.30g(수율: 85%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.57(2H, d), 7.30(2H, d), 5.24(1H, bs), 4.93(1H, bs), 3.73(3H, s), 3.12(1H, m), 2.93(1H, m), 2.90(3H, s), 1.40(9H, s)

Mass(FAB, m/e) : 334[M+H]⁺

제조예 2

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-메톡시-N-메틸-2-(4-프로필벤젠술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 1 에서 수득한 화합물 0.3g(0.83 밀리몰)을 메탄올 10㎖ 에 용해시킨 후, 0℃ 로 냉각시켰다. 여기에 과량(30 당량)의 아세틸클로라이드를 서서히 가하였다. 반응혼합물을 상온으로 상승시켜 1 시간 동안 교반하였다. 감압하여 휘발성 물질을 모두 제거하여 흰색 고체를 수득하였다. 수득된 화합물을 진공건조시킨 후, 디메틸포름아미드 10㎖ 에 용해시켰다. 생성된 용액에 N-메틸모폴린 0.5㎖ 를 가하고 10 분 동안 교반하였다. 여기에 4-프로필벤젠술포닐클로라이드 0.2g(0.91 밀리몰)을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 진공감압하여 용매를 제거하고, 잔류용액을 에틸아세테이트로 희석한 후, 물, 탄산수소나트륨 수용액 및 1N 염산 용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 수득된 고체를 칼럼크로마토그라피[용출제: 헥산/에틸아세테이트(7/3, 부피비)]시켜 분리, 정제하여 표제화합물 0.29g(수율: 83%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.69(2H, d), 7.56(2H, d), 7.43(2H, d), 7.30(2H, d), 5.71(1H, bs), 4.48(1H, bs), 3.78(3H, s), 3.11(1H, m), 2.97(1H, m), 2.94(3H, s), 2.78(2H, t), 1.77(2H, m), 1.04(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 416[M+H]⁺

실시예 1

(S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(4-프로필벤젠술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 2 에서 수득한 화합물 0.2g(0.48 밀리몰)을 황화수소(H₂S) 가스로 포화시킨 피리딘-트리에틸아민(10:1, 부피비) 혼합물 10㎖ 에 용해시키고 뚜껑을 잘 막은 다음 상온에서 2 일간 방치하였다. 반응이 완결된 후, 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 수득된 노란색 고체에 아세토니트릴 10㎖ 와 요오드화메탄(CH₃I) 0.25㎖ 를 함께 가하고 30 분간 가열환류시켰다. 이를 다시 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 잔류물을 무수 메탄올 8㎖ 에 용해시켜 교반하였다. 여기에 80% 하이드라진 수화물(H₂NNH₂ㆍH₂O) 0.04㎖(0.7 밀리몰)를 10 분 간격으로 3 회 걸쳐 나누어 가하였다. 반응이 완결된 후, 반응용액을 농축하고 칼럼크로마토그라피[용출제: 디클로로메탄/메탄올(9/1, 부피비)]시켜 정제하여 표제화합물 0.14g(수율: 68%)을 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 7.72(2H, d), 7.58(2H, d), 7.52(2H, d), 7.33(2H, d), 4.67(1H, bs), 3.75(3H, s), 3.13(1H, m), 2.96(3H, s), 2.95(1H, m), 2.80(2H, t), 1.78(2H, m), 1.03(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 448[M+H]⁺

실시예 2

(S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

2-나프탈렌술포닐클로라이드를 사용하여 제조예 2 의 방법에 따라 반응을 수행하여 수득한 중간체 화합물을 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물을 70% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 8.34(1H, s), 8.03(3H, m), 7.72(3H, m), 7.52(2H, d), 7.39(2H, d), 4.70(1H, bs), 3.70(3H, s), 3.12(1H, m), 2.96(3H, s), 2.95 (1H, m)

Mass(FAB, m/e) : 456[M+H]⁺

제조예 3

O-에틸-N-(t-부틸옥시카보닐)-N-메틸-하이드록실아민의 합성

O-에틸하이드록실아민 염산염 0.5g(5.13 밀리몰)을 디클로로메탄 20㎖ 에 용해시키고 t-부틸옥시카보닐안하이드라이드 1.12g(5.13 밀리몰)과 트리에틸아민 0.84㎖ 를 가하였다. 반응용액을 상온에서 2 시간 동안 교반한 다음, 물로 세척하고 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 디메틸포름아미드(DMF) 5㎖ 에 용해시키고 0℃ 로 냉각시킨 후, 수소화나트륨 226㎎(5.64 밀리몰)을 가하고 10 분 동안 교반한 다음 요오드화메탄 0.96㎖(15.4 밀리몰)를 가하고 상온에서 20 분 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, 반응용액을 감압증류하여 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류용액을 에틸아세테이트로 희석한 후, 물과 포화 염수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 에틸아세테이트/헥산(1/4, 부피비)]시켜 정제된 표제화합물 0.78g(수율: 87%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 3.92(2H, q), 3.18(3H, s), 1.46(9H, s), 1.23(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 176[M+H]⁺

제조예 4

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-에톡시-N-메틸-2-(t-부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 3 에서 수득한 화합물 0.3g(0.83 밀리몰)을 메탄올 10㎖ 에 용해시킨 후, 0℃ 로 냉각시켰다. 여기에 과량(30 당량)의 아세틸클로라이드를 서서히 가하였다. 반응혼합물을 상온으로 상승시켜 1 시간 동안 교반하고, 감압하여 휘발성 물질을 모두 제거하여 흰색 고체를 수득하였다. 수득된 화합물을 진공건조시킨 후, 제조예 1 과 동일한 방법에 따라 처리하여 표제화합물을 83% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.58(2H, d), 7.29(2H, d), 5.22(1H, bs), 4.92(1H, bs), 3.99, 3.92(2H, q, q), 3.18(3H, s), 3.12(1H, m), 2.92(1H, m), 1.39(9H, s), 1.25(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 348[M+1]⁺

제조예 5

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-에톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 1 의 화합물 대신에 제조예 4 에서 수득한 화합물을 사용하고 4-프로필벤젠술포닐클로라이드 대신에 2-나프탈렌술포닐클로라이드를 사용하는 것을 제외하고는 제조예 2 와 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물을 85% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 8.23(1H, s), 7.88(3H, m), 7.65(3H, m), 7.35(2H, d), 7.16(2H, d), 5.70(1H, bs), 4.51(1H, bs), 3.74, 3.56(2H, q, q), 3.03(1H, m), 2.97(3H, s), 2.82(1H, m), 1.18(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 438[M+H]⁺

실시예 3

(S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-에톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 5 에서 수득한 화합물을 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물을 70% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 8.32(1H, s), 8.03(3H, m), 7.72(3H, m), 7.52(2H, d), 7.39(2H, d), 4.64(1H, bs), 3.91, 3.82(2H, q, q), 3.12(1H, m), 2.92(3H, s), 2.89(1H, m), 1.32(3H, t)

Mass(FAB, m/e) : 470[M+H]⁺

제조예 6

O-메틸-N-(t-부틸옥시카보닐)-N-사이클로펜틸-하이드록실아민의 합성

사이클로헥사논 2.0g(23.8 밀리몰)을 메탄올 50㎖ 에 용해시킨 후, 메톡시아민 염산염 1.99g(23.8 밀리몰)을 가하고 나트륨시아노보로하이드라이드 1.80g 을 가하였다. 반응혼합물을 가열환류시키면서 12 시간 동안 교반하였다. 이 반응용액을 빙수로 냉각시키면서 6N 수산화나트륨 용액으로 pH 12 로 염기성화시켰다. 여기에 물 50㎖를 가하고 t-부틸옥시카보닐안하이드라이드 5.18g(23.8 밀리몰)을 가하였다. 반응혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반한 다음, 감압하에서 메탄올을 제거하고 에틸아세테이트로 3 회 추출하였다. 추출물을 합하여 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 칼럼크로마토그라피[용출제: 에틸아세테이트/헥산(1/4, 부피비)]시켜 정제된 표제화합물 4.09g(수율: 80%)을 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 4.43(1H, m), 3.71(3H, s), 1.82(4H, bs), 1.72(3H, bs), 1.48(3H, s)

Mass(FAB, m/e) : 216[M+H]⁺

제조예 7

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-사이클로펜틸-N-메톡시-2-(t-부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 6 에서 수득한 화합물을 사용하여 제조예 4 와 동일한 방법으로 반응을 수행하여 표제화합물을 85% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 7.57(2H, d), 7.30(2H, d), 5.25(1H, bs), 4.90(1H, bs), 4.55(1H, bs), 3.82(3H, s), 3.12(1H, m), 2.88(1H, m), 1.91, 1.75, 1.58 (8H, bs, bs, bs), 1.38(9H, s)

Mass(FAB, m/e) : 388[M+H]⁺

제조예 8

(S)-3-(4-시아노-페닐)-N-사이클로펜틸-N-메톡시-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 1 의 화합물 대신에 제조예 7 에서 수득한 화합물을 사용하고 4-프로필벤젠술포닐클로라이드 대신에 2-나프탈렌술포닐클로라이드를 사용하는 것을 제외하고는 제조예 2 와 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물을 85% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃, ppm) δ : 8.22(1H, s), 7.86(3H, m), 7.64(3H, m), 7.35(2H, d), 7.16(2H, d), 5.71(1H, bs), 4.90(1H, bs), 4.53(1H, bs), 3.80(3H, s), 3.10 (1H, m), 2.91(1H, m), 1.77, 1.57(8H, bs, bs)

Mass(FAB, m/e) : 478[M+H]⁺

실시예 4

(S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메톡시-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드의 합성

제조예 8 에서 수득한 화합물을 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법에 따라 반응을 수행하여 표제화합물을 70% 의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CD₃OD, ppm) δ : 8.30(1H, s), 8.01(3H, m), 7.72(3H, m), 7.52(2H, d), 7.42(2H, d), 4.53(1H, bs), 4.17(1H, bs), 3.77(3H, s), 3.10(1H, m), 2.87 (1H, m), 1.62, 1.48(8H, bs, bs)

Mass(FAB, m/e) : 510[M+H]⁺

실험예 1 : 트롬빈 억제제의 억제활성

본 발명의 화합물인 트롬빈 억제제의 효소억제효과는 효소와 반응하여 색을 생성하는 기질을 사용하여 분광광도법으로 측정된 속도상수 Ki 로 결정하였다. 속도상수 Ki 값은 효소와 기질 및 억제제를 동시에 가하였을 경우에 억제제가 효소활성을 억제하는 정도를 나타낸 것이다. 트롬빈이 기질인 크로모자임 TH(토실-Gly-Pro-Arg-4-니트로아닐리드아세테이트)를 가수분해하면 파라-니트로아닐리드가 생성된다. 이렇게 생성되는 노란색의 파라-니트로아닐리드의 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정하였다. 이 속도로 부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며, 억제제의 효소활성 억제능력을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 트롬빈에 대한 억제활성은 후술하는 방법에 따라 측정하였다.

1.5㎖ 큐벳에 150mM NaCl, 0.1% PEG8000(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 8000)이 함유되어 있는 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.8)을 1160㎕ 씩 가하였다. 기질용액으로는 크로모자임 TH 를 디메틸술폭사이드(DMSO)에 10mM 농도로 용해시킨 후 상기 완충용액으로 희석하여 0.1mM 농도가 되도록 제조한 것을 사용하였다. 이렇게 제조한 0.1mM 기질용액 225㎕ 를 큐벳에 가하였다. 억제제 용액으로는 본 발명에 따른 트롬빈 억제제 화합물을 디메틸술폭사이드에 10㎎/㎖ 의 농도가 되도록 용해시킨 후, 상기 완충용액으로 희석하여 0.1㎎/㎖, 0.01㎎/㎖, 0.001㎎/㎖ 농도로 만든 것을 억제제의 양이 0 내지 10㎍ 사이가 되게 취한 후 트리스 완충용액으로 전체 부피가 100㎕ 가 되도록 하여 큐벳에 가하였다.

실온에서 반응용액이 들어 있는 큐벳에 각각 상기 트리스 완충용액에 0.1㎎/㎖ 농도로 용해시킨 인간 트롬빈(human thrombin) 15㎕ 를 가하여 효소 가수분해반응을 시작하였다. 효소를 가한 순간부터 2 분 동안 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐리드의 양을 381㎚ 에서의 흡광도의 변화로 모니터하여 반응시간 대 흡광도의 연속 스펙트럼을 도시하였다. 여러 종류의 억제제 농도에 대해 위의 실험을 수행하여 연속 스펙트럼을 얻었다.

각 스펙트럼에서 반응시간 초기 30 초 이내에 기울기로 부터 초기속도 Vi 를 구한 후, 억제제 농도 대비 초기속도의 역수(1/Vi) 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족하는 1 차식을 계산해낸 후 그 식의 x 절편으로 부터 이하의 효소반응식(Michaelis-Menten equation)을 사용하여 Ki 를 계산해 낼수 있다. 이 계산에 사용된 Km 값은 5.2μM 로 일정 효소농도에서 기질의 농도를 변화시킴으로서 구한 것이다.

효소반응식(Michaelis-Menten equation)

상기 효소반응식에서 [I] 는 억제제의 농도를 나타내고, [S] 는 기질의 농도를 의미하며, Vmax 는 최고 초기속도를 의미하고, Km 은 미카엘리스(Michaelis) 상수로 여기에서는 5.2μM 을 의미한다.

한편, 트립신에 대한 본 발명에 따른 화합물의 억제활성도 상기 트롬빈의 경우에 대해 설명한 바에 따라 실시하여 측정하였다.

기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알기닌 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드의 20μM 용액을 사용하였으며, 억제제는 0 내지 120㎍ 범위내에서 여러가지 농도를 사용하였다. 또한, 트립신은 0.1N HCl 에 용해시킨 것을 실험 직전에 상기 트리스 완충용액으로 45㎍/㎖ 로 만든 후 40㎕ 를 사용하였다. 트롬빈에 대한 실험과 마찬가지로 반응용액의 총부피는 1.5㎖ 로 하고 그밖에도 동일한 방법으로 실험하였으며, Ki 계산에 사용된 Km 값도 동일한 방법으로 결정하였는데 그값은 20.2μM 이었다.

이상 설명한 방법에 따라 트롬빈과 트립신에 대해 측정된 본 발명에 따른 억제제의 각 효소활성 억제능력을 Ki 값으로 나타내었으며, 또한 트롬빈에 대한 선택성은 트립신/트롬빈으로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 1 에 나타낸 바와 같다.

트롬빈과 트립신에 대한 억제제의 억제능력

화합물(실시예 번호)	트롬빈에 대한억제능력	트립신에 대한억제능력	선택성(트립신/트롬빈)
1	Ki = 11.7nM	Ki = 22000nM	1880
2	Ki = 27.7nM
3	Ki = 10.5nM	Ki = 35200nM	3352
4	Ki = 21.7nM

상기의 실험결과로 부터 본 발명의 화합물은 우수한 트롬빈 억제활성을 나타내며, 특히 실시예 1 및 3 의 화합물은 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성 면에서도 공지의 화학식 10 및 11 의 화합물이 각각 250 배 및 50 배인 것에 비해 월등히 우수함을 알 수 있다.

실험예 2 : 생체내 혈전형성 억제효과 실험(동물실험)

하기 설명하는 바에 따라 본 발명에 따르는 화합물의 혈전형성에 대한 억제능력을 생체내에서 측정하였다.

실험방법:

실험동물은 엘지화학 기술연구원 실험동물실에서 온도 20-22℃, 12 시간 간격의 명,암 조건에서 시판 표준사료를 사용하여 사육된 체중 250-300g 의 웅성 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 흰쥐를 사용하였다. 먼저 쥐에게 체중 ㎏ 당 1.3g 의 용량으로 우레탄을 복강주사하여 마취하였다. 쥐의 복부를 절개하여 하대정맥(inferior vena cava)을 노출시킨 다음, 왼쪽 신정맥(left renal vein) 바로 아래 부위와 1.6㎝ 아래 부위의 정맥에 봉합사를 걸쳐 놓았다. 실시예 1 및 실시예 3 의 화합물을 각각 왼쪽 대퇴정맥(left femoral vein)을 통하여 체중 ㎏ 당 5㎎ 의 용량으로 각각 주입하고 5 분후에 트롬보플라스틴을 역시 대퇴정맥을 통하여 주입하였다. 계속해서 30 초후에 걸쳐 놓았던 봉합사를 결찰하였다. 봉합사를 결찰한지 15 분후에 정맥을 적출하여 생성된 혈전을 취하여 무게를 측정하였다.

실험결과:

시험약물에 의한 정맥혈전생성 억제효과는 시료 투여 용적과 동일 용적의 10% HPCD(하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린) 용액을 투여한 대조군의 혈전생성 정도와 비교하여 산출하였으며 그 결과는 하기 표 2 에 기재하였다.

실시예	억제효과 % (5㎎/㎏)
1	48
3	52

상기 표에 기재된 결과로 부터, 본 발명의 화합물은 생체내에서도 우수한 혈전생성 억제효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1 로 표시되는 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성체:

[화학식 1]

상기식에서,

R₁은 치환되거나 비치환된 아릴 그룹을 나타내고,

R₂는 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내며,

R₃은 저급알콕시 또는 사이클로알킬옥시를 나타낸다.
제 1 항에 있어서, R₁이 C₁-C₄알킬에 의해 치환되거나 비치환된 C₆-C₁₀아릴 그룹을 나타내며, R₂는 C₁-C₄알킬 또는 사이클로펜틸을 나타내고, R₃가 C₁-C₄알콕시를 나타내는 화합물.
제 2 항에 있어서, R₁이 프로필에 의해 치환되거나 비치환된 페닐 또는 나프탈레닐 그룹을 나타내며, R₂는 메틸 또는 사이클로펜틸을 나타내고, R₃가 메톡시 또는 에톡시를 나타내는 화합물.
제 3 항에 있어서, (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(4-프로필벤젠술포닐아미노)-프로피온아미드, (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-메톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드, (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-에톡시-N-메틸-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드 및 (S)-3-[4-(아미노-하이드라조노-메틸)-페닐]-N-사이클로펜틸-N-메톡시-2-(나프탈렌-2-일-술포닐아미노)-프로피온아미드로 구성된 그룹중에서 선택된 화합물.
하기 화학식 2 의 메틸머캅토 유도체를 하기 화학식 3 의 하이드라진 화합물과 반응시킴을 특징으로 하여 화학식 1 의 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기식에서,

R₁은 치환되거나 비치환된 아릴 그룹을 나타내고,

R₂는 저급알킬 또는 사이클로알킬을 나타내며,

R₃은 저급알콕시 또는 사이클로알킬옥시를 나타낸다.
제 5 항에 있어서, 반응을 용매의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 용매가 알콜임을 특징으로 하는 방법.
활성성분으로서 제 1 항에 따르는 화학식 1 의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 트롬빈 억제제 조성물.