KR0153490B1

KR0153490B1 - 선택적 트롬빈 억제제

Info

Publication number: KR0153490B1
Application number: KR1019950043956A
Authority: KR
Inventors: 홍성원; 오영수; 김상수; 황상열; 윤미경; 이구; 신유승
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970027063A

Abstract

본 발명은 트롬빈을 선택적으로 억제하며 경구투여에 의해서도 효과적으로 사용할 수 있는 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 신규의 화합물, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 또는 각종 혈전증 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아릴 그룹 또는 N-함유 헤테로사이클릭 그룹을 나타내고, R²는 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시를 나타내며, R³은 알칸술포닐, 알콕시카보닐, 알킬카보닐, 포르밀, 저급알킬, 또는 알콕시 또는 할로게노알킬에 의해 치환된거나 비치환된 아릴, 또는 하이드록시-치환된 저급알킬을 나타내고, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.

Description

선택적 트롬빈 억제제

본 발명은 트롬빈을 선택적으로 억제하는 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 신규의 화합물, 그의 제조방법 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 또는 각종 혈전증 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

상기 일반식(Ⅰ)의 화합물은 경구투여시에도 효과가 있기 때문에 매우 유용하다.

혈액응고에는 여러가지 복잡한 효소반응이 관여하고 있는데, 그 마지막 단계는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는 반응을 포함한다. 이 반응에서 생성된 트롬빈은 혈소판을 활성화시키며, 섬유소원을 섬유소로 바꾸는 등, 혈액응고의 중요한 역할을 수행하는데, 섬유소는 중합반응에 의해 고분자물질로 바뀌고, 활성화된 혈액인자 ⅩⅢ에 의해 교차결합되어 불용성 응혈이 된다. 트롬빈은 또한 혈액인자 Ⅴ와 Ⅷ를 활성화시키고, 이들은 피이드백에 의해 혈액응고반응을 가속화시킨다. 따라서, 트롬빈 억제제는 효과적인 항응혈제로 작용하여 혈소판의 활성화를 억제할 수 있으며, 섬유소의 생성 및 안정화를 막을 수 있다.

트롬빈은 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소이다. 따라서 효과적인 트롬빈 억제제는 트립신에 대한 억제효과도 높은 것이 일반적인 특성이다. 인체내, 특히 혈액내에는 트립신과 유사한 세린계 단백질 분해효소가 다양하게 존재하고 있는데, 예를들어 혈전용해에 관계하는 플라즈민이 그 대표적인 경우이다. 그러므로 이러한 세린계 단백질 분해효소의 원형인 트립신을 상대적으로 덜 억제하고 트롬빈에 대해 선택적인 억제효과를 나타내는 트롬빈 억제제의 개발이 매우 중요하다.

이러한 조건하에서 트롬빈에 대한 선택성이 개선된 트롬빈 억제제를 개발하고자 하는 연구가 광범하게 진행되었다. 그 결과 다음 구조식(A)로 표시되는 아릴술포닐알기닌계 화합물인 아가트로반(Argatroban)(참조:미합중국특허 제4258192호 및 4201863호)이 개발되었다.

이 화합물은 트립신 대비 트롬빈을 250배 가량 더 잘 억제하는 것으로 보고되었으나(참조:Biochemistry 1984,23,85-90) 매우 복잡한 합성과정을 거쳐서 수득되며, 1990년에 일본에서 상품화되었다.

그후에 벤즈아미딘계 아릴술포닐 화합물인 다음 구조식(B)의 NAPAP가 또한 개발되었다.

이 화합물 NAPAP는 합성이 용이한 효과적인 트롬빈 억제제임에도 불구하고 트립신 대비 트롬빈 억제효과가 50배 정도 밖에 안되어 바람직하지 못하였다(참조:J.Biol.Chem.1991,266,20085-20093).

또한, 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 개선된 다음 구조식(C)의 Ro 64-6240화합물이 보고되었는데, 이 화합물은 혈중반감기가 짧아서 정맥주사용 제제로서의 개발가능성을 보여 주고 있으나, 경구투여의 가능성은 보고되고 있지 않다(참조:J.Med.Chem.1994,37,3889-3901).

최근에 이르러 피페라자이드계의 화합물이 쥐에서 경구투여가 일부 가능한 트롬빈 억제제로 보고되었으나, 이들은 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 매우 저조하였다(참조:WO 94/18185).

이에 본 발명자들은 합성이 비교적 용이하고 트립신 대비 트롬빈에 대한 선택성이 현저히 향상되었으며 경구투여도 가능한 트롬빈 억제제를 개발하기 위해 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 상기 정의한 바와 같은 일반식(Ⅰ)의 화합물이 이러한 목적을 달성함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 경구투여가 가능하며 트롬빈에 대한 선택성이 높은 트롬빈 억제제 화합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 및 이성체가 제공된다.

본 명세서에서 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물이 치환기를 정의하는데 사용된 용어 저급알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸을 포함하는 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 측쇄 알킬을 의미하며, 용어 아릴은 탄소수 6 내지 10의 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 탄화수소로부터 수소원자 1개가 제거되어 형성된 그룹을 의미하며, 예를들면 페닐, 나프틸 등이 포함된다.

본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물중에서 바람직한 화합물은 R¹이 나프틸 그룹을 나타내고, R²가 수소를 나타내며, R³가 메탄술포닐, 에톡시카보닐, 포르밀, 에틸, 페닐, 또는 트리플루오로메틸 또는 에톡시에 의해 치환되거나 비치환된 페닐, 메틸카보닐 또는 하이드록시에틸을 나타내는 화합물이다.

본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물중의 대표적인 화합물에는 다음과 같은 물질이 있다.

1. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-메틸술포닐-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드

2. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-에톡시카보닐-피페라지닐)-에틸]아미드

3. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-포르밀-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드

4. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-에틸-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드

5. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-페닐-피페라지닐)-에틸]아미드

6. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-피페라지닐)-에틸]아미드

7. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [2-(4-아세틸-피페라지닐)-1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소에틸]아미드

8. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-하이드록시에틸)-피페라지닐]-에틸]아미드

9. (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-에톡시페닐)-피페라지닐]-에틸]아미드

본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수도 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를들면 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산 또는 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다.

본 발명의 화합물들은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으며, 라세미체, 라세미 화합물, 부분입체이성체 혼합물 및 개개 부분입체이성체로서 또는 호변이성체(tautomer)로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성체 형태는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 또한 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 일반식(Ⅱ)의 아민 화합물과 반응시킴으로써 목적하는 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조할 수 있다. 본 발명의 제조 방법은 다음 반응도식1로 나타낼 수 있다.

상기 반응도식에서 R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 상기에서 정의한 바와 같다.

상기 반응도식 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물은 일반식(Ⅱ)의 메틸머캅토 화합물을 친핵체인 일반식(Ⅲ)의 아민 유도체와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 이 반응은 바람직하게는 용매의 존재하에서 수행할 수 있다. 이러한 목적으로 바람직하게 사용되는 용매의 예로는 반응에 악영향을 미치지 않는 유기용매이면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 일반적으로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알콜 용매가 바람직하게 사용된다.

본 반응에서 반응량, 반응온도, 반응시간 등을 포함한 반응조건은 특정의 반응물질에 따라 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로 반응온도는 다양하게 변화시킬 수 있으나, 0℃ 내지 50℃에서 반응을 수행하는 것이 특히 바람직하다. 반응시간은 일반적으로 0.5 내지 5시간이 소요되나 바람직하게는 1 내지 2시간 동안 반응을 수행한다.

본 반응이 완결된 후에 생성물은 통상적인 후처리 방법, 예를들면 크로마토그라피, 재결정화 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

상기 반응도식 1에서 일반식(Ⅰ)의 화합물을 제조하는데 중간체로 사용된 일반식(Ⅱ)의 메틸머캅토 화합물은 다음 반응도식 2 및 3에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다.

상기 반응도식 2 및 3에서, R¹, R², R³, R⁴및 R⁵는 상기에서 정의한 바와 같으며, P는 아미노 보호그룹을 나타낸다.

반응도식 2는 C-말단에 먼저 피페라지닐 그룹을 커플링시킨 후에 N-말단 부위를 도입하는 것이고, 반응도식 3은 N-말단에 술폰아미드 부위를 형성시킨 후에 C-말단에 피페라지닐 그룹을 커플링하는 공정을 도시한 것이다.

즉 반응도식 2에 따르면 일반식[1]의 화합물에 R²및 R³가 치환된 피페라진 화합물을 커플링시켜 일반식[2]의 화합물을 수득하고, 화합물[2]의 N-말단의 아미노 보호그룹을 제거하여 일반식[3]의 화합물을 수득하고, 이 화합물[3]의 N-말단 부위에 설폰아미도 그룹을 도입시켜 일반식[4]의 화합물을 수득한 후, 이 니트릴 화합물[4]를 피리딘 및 트리에틸아민의 존재하에서 황화수소로 포화시켜 일반식[5]의 티오아미드 화합물을 생성시키고, 이 티오아미드 화합물을 요오드화메탄, 디메틸술페이트(CH₃OSO₂OCH₃) 또는 메틸트리플레이트(CH₃OTf)와 같은 메틸화제로 메틸화하여 일반식(Ⅱ)의 메틸머캅토 화합물을 수득한다.

반응도식 3에 따르면 구조식[7]의 화합물을 일반식[6]의 화합물과 반응시켜 화합물[7]의 N-말단에 설폰아미도 그룹을 도입시키고, 생성된 일반식[8]의 화합물을 R²및 R³가 치환된 피페라진 화합물과 커플링시켜 C-말단에 피페라지닐 그룹을 도입시킴으로써 일반식[4]의 화합물을 수득한 후에 반응도식 2에서와 동일한 방법에 따라 일반식(Ⅱ)의 메틸머캅토 화합물을 수득한다.

상기 반응도식 2 및 3에서 커플링 반응을 위해 사용될 수 있는 본 분야에서의 공지의 커플링 시약에는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 3-에틸-3'-(디에틸아미노)프로필카보디이미드(EDC), 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산클로라이드(BOP-Cl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA) 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

반응도식 2 및 3에서 사용된 카르복실산[1] 및 [7]은 그대로 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 그의 반응성 유도체, 예를들면 산할라이드 및 그밖의 다른 활성화 에스테르 유도체로 전환시켜 커플링 반응에 사용함으로써 반응을 더욱 촉진시킬 수 있다. 카복실산의 활성화 에스테르 유도체는 특히 피페라진 화합물과의 커플링 반응에 의해 아미드 결합을 형성하거나, 알콜과의 커플링 반응에 의해 에스테르 결합을 형성시키기 위해 필요하다. 이러한 반응성 유도체에는 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있는 통상적인 유도체들이 포함되는데, 예를들어 산할라이드에는 산클로라이드가 포함되고, 활성화 에스테르에는 메톡시카보닐클로라이드, 이소부틸옥시카보닐클로라이드 등을 포함하는 알콕시카보닐할라이드와 커플링 시약으로부터 유도된 카복실산의 무수물, N-하이드록시프탈이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시석신이미드-유도된 에스테르, N-하이드록시-5-노르보넨-2', 3'-디카복시이미드-유도된 에스테르. 2,4,5-트리클로로페놀-유도된 에스테르 등이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.

상기 언급한 바와 같이 본 발명에 따르는 일반식(Ⅰ)의 화합물은 공지의 화합물들에 비해 트롬빈에 대한 선택성이 월등히 높으며, 경구투여에 의해서도 효과적인 트롬빈 억제효과를 나타내는 트롬빈 억제제이다. 따라서 본 발명의 화합물은 혈액응고 예방 및 각종 혈전증의 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명은 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 예방 및 혈전증 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1kg당 0.001㎎ 내지 10㎎이고, 특정 환자에 대한 특이 용량수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제로 투여할 수 있다. 주사용 제제, 예를들면 멸균주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 사용될 수 있는 수성 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균고정오일은 통성적으로 용매 또는 현탁매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산은 주사용 제제에 사용한다.

경구투여용 고체투여 형태는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하고, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 또한 장피제로 제조하는 것이 유용하다. 고체투여 형태는 활성화합물을 슈크로오즈, 락토오즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 따르는 화합물은 또한 실험결과 쥐 및 개와 같은 포유류에 대해 급성독성을 나타내지 않으면서 소기의 목적을 달성할 수 있었다.

또한 본 발명의 화합물을 임상적으로 투여하여 목적하는 항응혈효과 및 혈전용해요과를 얻고자 하는 경우에, 본 발명에 따르는 활성화합물(Ⅰ)은 혈전용해제 및 혈소판활성 억제제중에서 선택된 1종 이상의 성분과 동시에 투여할 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 화합물과 혼합하여 투여될 수 있는 혈전용해제에는 t-PA, 유로키나제(urokinase), 스트렙토키나제(streptokinase) 등이 포함될 수 있으며, 혈소판활성 억제제에는 아스피린, 티클로피딘(ticlopidin), 클로피드로겔(clopidrogel), 7E3 단일항체 등이 포함된다.

그러나, 혈전의 치료 및 예방을 위한 본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제제는 상술한 것으로 제한되는 것은 아니며, 혈전의 치료 및 예방에 유용한 제제라면 어떠한 것도 포함될 수 있다.

본 발명은 다음 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1]

(S)-4-[2-(부틸옥시카보닐-아미노)-3-(4-메틸술포닐-피페라지닐)-3-옥소-프로필]-벤조니트릴의 합성

(S)-3-[4-(시아노페닐)-2-(부틸옥시카보닐-아미노)-프로피온산 0.5g(1.7밀리몰)을 디메틸포름아미드(DMF) 20㎖에 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각시키고, 여기에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염(EDC) 0.5g과 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT) 0.3g을 가하여 완전히 용해될 때 까지 교반하였다. 이 용액에 1-메탄술포닐피페라진 0.3g과 N-메틸모르폴린 0.2㎖를 가하였다. 반응혼합물을 상온으로 서서히 상승시키고 3.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에 반응혼합물을 감압하에서 증류하여 휘발성물질을 제거하고, 잔류용액을 에틸아세테이트로 희석하고 포화 중탄산나트륨 수용액, 묽은 염산 및 포화 염수로 차례로 세척하였다. 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 농축시킨 후에 잔류물을 에틸아세테이트/헥산(6/4, 부피비)을 용출제로 사용하여 칼럼크로마토그라피시켜 정제된 표제화합물 0.7g(수율 93%)을 수득하였다.

[제조예 2]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-(4-메틸술포닐-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 수득한 화합물 0.7g(1.6 밀리몰)을 디클로로메탄 3㎖에 용해시키고, -10℃로 냉각시킨 후에 트리플루오로아세트산(TFA) 3㎖를 가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하고 온도를 서서히 상온으로 상승시켜 3분 동안 교반한 후에 감압하에서 증류하여 휘발성물질을 제거하였다. 잔류용액을 진공펌프로 건조시킨 후에 DMF 20㎖를 가하였다. 0℃로 냉각시키고 2-나프탈렌술포닐클로라이드 0.5g과 디이소프로필에틸아민 0.9㎖를 가하여 완전히 용해될 때 까지 교반하였다. 반응혼합물을 상온으로 서서히 상승시켜 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에 감압하에서 증류하여 휘발성물질을 제거하였다. 잔류용액을 클로로포름으로 희석하여 포화 중탄산나트륨, 묽은 염산 및 포화 염수로 차례로 세척하였다. 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 농축하였다. 잔류물을 클로로포름/메탄올(95/5, 부피비)을 용출제로 사용하여 칼럼크로마토그라피시켜 정제된 표제화합물 0.8g(수율 95%)을 수득하였다.

[실시예 1]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-메틸술포닐-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드의 합성

제조예 2에서 수득한 화합물 0.4g(0.76 밀리몰)을 피리딘 5㎖에 용해시켜 가지달린 플라스크에 넣었다. 여기에 트리에틸아민 0.3㎖를 가하고, 플라스크의 한쪽 가지를 통해서는 황화수소 가스를 용액내로 서서히 도입시키고, 다른 한쪽 가지에서는 가스가 흘러 나오도록 장치하였다. 약 10분 동안 교반하면서 황화수소 가스를 용액에 포화시켰다. 이때 용액의 색깔은 무색에서 녹색으로 변하고 점점 진한 갈색으로 변화되었다. 플라스크를 고무마개로 막고 3일 동안 상온에서 방치한 후에 감압하에 증류하여 휘발성물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 수득된 황색 고체에 아세톤 10㎖와 요오드화메탄 0.5㎖를 함께 가하고 30분 동안 가열 환류시켰다. 이 반응혼합물을 다시 감압하에서 증류하여 휘발성물질을 제거하고 진공펌프로 건조시켰다. 잔류물을 무수 메탄올 5㎖에 용해시켜 교반하고, 여기에 80% 하이드라진 하이드레이트 0.06㎖를 10분 간격으로 3회에 걸쳐 나누어 가하였다. 반응이 완결된 후에 반응용액을 농축시키고 HPLC로 정제하여 표제화합물 0.3g(수율 65%)을 수득하였다.

[실시예 2]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-에톡시카보닐-피페라지닐)-에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-피페라진에틸카복실레이트를 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-옥소-2-(4-에톡시카보닐-피페라지닐)-에틸]아미드 1g(1.9 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.6g(수율 56%)을 수득하였다.

[실시예 3]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-포르밀-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-피페라진에틸카복스알데히드를 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-(4-포르밀-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드 7g(1.6 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.5g(수율 62%)을 수득하였다.

[실시예 4]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-에틸-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-에틸피페라진을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-(4-에틸-피페라지닐)-옥소에틸]아미드를 0.3g(0.6 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.2g(수율 56%)을 수득하였다.

[실시예 5]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-페닐피페라지닐)-에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-페닐피페라진을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-옥소-2-(4-페닐피페라지닐)-에틸]아미드를 0.5g(0.97 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.3g(수율 57%)을 수득하였다.

[실시예 6]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-피페라지닐]-에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메틸술포닐피페라진 대신에 1-(α,α,α-트리플루오로-m-톨릴)피페라진을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-옥소-2-[4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-피페라지닐]-에틸]아미드 0.5g(0.8 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.3g(수율 55%)을 수득하였다.

[실시예 7]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [2-(4-아세틸-피페라지닐)-1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-아세틸피페라진을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [2-(4-아세틸-피페라지닐)-1-(4-시아노벤질)-2-옥소에틸]아미드 1.25g(2.55 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.7g(수율 53%)을 수득하였다.

[실시예 8]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-하이드록시에틸)-피페라지닐]-에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-피페라진에탄을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-옥소-2-[4-(2-하이드록시에틸)-피페라지닐]-에틸]아미드 0.07g(0.14 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.05g(수율 68.5%)을 수득하였다.

[실시예 9]

(S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-에톡시페닐)-피페라지닐]-에틸]아미드의 합성

제조예 1에서 1-메탄술포닐피페라진 대신에 1-(2-에톡시페닐)피페라진을 사용하여 동일한 방법에 따라 반응시켜 수득된 화합물을 제조예 2와 동일한 방법에 따라 반응시켜 중간체 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-시아노벤질)-2-옥소-2-[4-(2-에톡시페닐)-피페라지닐]-에틸]아미드 0.4g(0.7 밀리몰)을 수득하였다. 이 중간체 화합물을 실시예 1과 동일한 방법에 따라 반응시켜 정제된 표제화합물 0.26g(수율 62%)을 수득하였다.

[실험예]

[트롬빈 억제제의 억제활성]

본 발명의 화합물인 트롬빈 억제제의 효소억제효과는 효소와 반응하여 색을 생성하는 기질을 사용하여 분광광도법으로 측정된 속도상수 Ki 및 Ks로 결정하였다. 속도상수 ki값은 효소와 기질 및 억제제를 동시에 넣었을 경우 억제제가 효소활성을 억제하는 정도를 나타낸 것이고, 속도상수 Ks값은 효소와 억제제를 미리 일정 시간 반응시킨 다음 기질을 가수분해하는 속도를 측정하여 얻은 값이다. 트롬빈의 기질인 크로모자임 TH(Chromozym TH:Tosyl-Gly-Pro-Arg-4-nitroanilide acetate)를 가수분해하면 파라-니트로아닐린이 생성된다. 이렇게 생성되는 노란색의 파라-니트로아닐린의 양을 시간에 따른 흡광도의 변화로 측정하였다. 이 속도로부터 효소의 활성을 측정할 수 있으며 억제제의 효소활성억제능력을 측정할 수 있다.

트롬빈에 대한 억제제의 효소활성 억제능력은 아래와 같은 방법으로 결정하였다.

1.5㎖ 큐벳에 150mM NaCl, 0.1% PEG 8000(폴리에틸렌글리콜, 분자량 약 800)이 포함된 0.1M 트리스 완충용액(pH7.8) 1160㎕ 씩을 가한 후, 여기에 색소생성기질인 크로모자임 TH(Chromozym TH:Tosyl-Gly-Pro-Arg-4-nitroanilide acetate) 0.1mM 용액 225㎕를 가하였다. 크로모자임 TH는 10mM의 농도가 되도록 디메틸설폭사이드(DMSO)로 용해시킨 것을 상기의 완충용액으로 0.1mM의 농도로 희석하여 사용하였다. 본 발명의 트롬빈 억제제는 디메틸설폭사이드로 10㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시킨 후에 상기 언급한 바와 같은 조성의 트리스 완충용액으로 희석하여 0.1㎎/㎖, 0.01㎎/㎖, 0.001㎎/㎖, 0.0001㎎/㎖의 농도로 만든 것을 억제제의 양이 0 내지 10.0㎍ 범위가 되도록 취한 후에 상기의 트리스 완충용액을 가하여 전체의 부피가 100㎕가 되도록 하여 각각의 큐벳에 가하였다.

실온에서 반응용액이 들어 있는 큐벳에 상기의 트리스 완충용액에 0.1㎎/㎖의 농도로 용해시킨 소트롬빈 용액 15㎕를 가하여 효소가수분해반응을 시작하였다. 효소를 가하는 순간부터 2분 동안 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐린의 양을 381nm에서 흡광도의 변화로 모니터하여 반응시간 대 흡광도의 연속 스펙트럼을 그렸다. 여러 종류의 억제제 농도에서 상기의 실험을 반복해서 수행하여 연속 스펙트럼을 얻었다.

각 스펙트럼에서 반응시간 초기 30초 이내의 기울기로부터 초기속도 Vi를 구한 후, 억제제 온도 대비 초기속도의 역수(1/Vi)에 대한 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족하는 1차식을 계산해낸 후 그 식의 x절편으로부터 다음과 같은 효소반응식(Michaelis-Menten equation)을 사용하여 Ki를 계산하였다.

미카엘리스-멘텐 반응식(Michaelis-Menten equation)

이 계산에서 사용된 Km값은 8.3μM이며, 그 값은 일정 효소농도에서 기질의 농도를 변화시킴으로써 얻었다.

속도상수 Ks는 상기 Ki를 구할때 사용한 것과 동일한 용액을 같은 농도로 사용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1.5㎖ 큐벳에 완충용액 1160㎕를 가하고, 여기에 0.1㎎/㎖ 농도의 소트롬빈 용액 15㎕ 및 억제제 용액 100㎕를 넣어 실온에서 15분 동안 방치한 후 0.1mM 기질용액 225㎕를 가하면서 2분 동안 시간의 변화에 따른 흡광도의 변화를 모니터하였다. 얻어진 연속 스펙트럼에서 직선을 나타내는 부분의 기울기를 측정하여 Vs로 나타낸다. 이 실험을 여러 종류의 억제제 농도에서 실행하여 각 억제제 농도에서 Vs값을 얻어 억제제 농도에 대한 1/Vs의 그래프를 도시하였다. 그래프 위의 점들을 만족시키는 1차식을 얻은 후, 그 x절편으로부터 효소반응식을 이용하여 Ks값을 결정하였다.

한편, 본 발명에 따른 화합물의 트립신에 대한 억제활성도 상기의 트롬빈의 경우에 대해 설명한 바와 같은 방법으로 측정하였다.

기질로는 N-벤조일-발린-글리신-알기닌 파라-니트로아닐리드 하이드로클로라이드(N-benzoyl-Val-Gly-Arg-p-nitroanilide hydrochloride)를 20μM 용액으로 사용하였으며, 억제제의 양은 0 내지 120㎍ 범위내의 여러 농도를 사용하였다. 또한 트립신은 0.1N HCl에 용해시켜 실험 직전에 상기 트리스 완충용액을 사용하여 45㎍/㎖로 만든 후 40㎕를 사용하였다. 트롬빈에 대한 실험과 마찬가지로 반응용액의 총부피는 1.5㎖로 하였으며, 그밖의 방법도 트롬빈과 동일한 방법으로 실험하였으며, Ki값의 계산에 사용된 Km값도 동일한 방법으로 정하였는데, 그 값은 20.2μM이었다.

상기에서 설명한 방법에 따라 측정된 본 발명에 따른 억제제의 트롬빈 및 트립신에 대한 효소활성 억제능력과 트롬빈에 대한 선택성(트립신/트롬빈)을 하기 표1에 나타내었다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 및 이성체:

상기식에서, R¹은 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아릴 그룹 또는 N-함유 헤테로사이클릭 그룹을 나타내고, R²는 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시를 나타내며, R³은 알칸술포닐, 알콕시카보닐, 알킬카보닐, 포르밀, 저급알킬, 또는 알콕시 또는 할로게노알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아릴, 또는 하이드록시-치환된 저급알킬을 나타내고, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.
제1항에 있어서, R¹이 나프틸 그룹을 나타내고, R²가 수소를 나타내며, R³가 메탄술포닐, 에톡시카보닐, 포르밀, 에틸, 페닐, 또는 트리플루오로메틸 또는 에톡시에 의해 치환되거나 비치환된 페닐, 메틸카보닐 또는 하이드록시에틸을 나타내는 화합물.
제2항에 있어서, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-메틸술포닐-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-에톡시카보닐-피페라지닐)-에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-포르밀-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-(4-에틸-피페라지닐)-2-옥소에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-(4-페닐-피페라지닐)-에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(3-트리플루오로메틸-페닐)-피페라지닐)-에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [2-(4-아세틸-피페라지닐)-1-(4-아미드라조노)-벤질]-2-옥소에틸]아미드, (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-하이드록시에틸)-피페라지닐]-에틸]아미드 및 (S)-나프탈렌-2-술폰산 [1-(4-아미드라조노)벤질-2-옥소-2-[4-(2-에톡시페닐)-피페라지닐)-에틸]아미드로 구성된 그룹중에서 선택된 화합물.
하기 일반식(Ⅱ)의 화합물을 하기 일반식(Ⅲ)의 화합물과 반응시킴을 특징으로하여 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 그의 염을 제조하는 방법.

상기식에서, R¹은 저급알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아릴 그룹 또는 N-함유 헤테로사이클릭 그룹을 나타내고, R²는 수소, 저급알킬 또는 저급알콕시를 나타내며, R³은 알칸술포닐, 알콕시카보닐, 알킬카보닐, 포르밀, 저급알킬, 또는 알콕시 또는 할로게노알킬에 의해 치환되거나 비치환된 아릴, 또는 하이드록시-치환된 저급알킬을 나타내고, R⁴및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 저급알킬 또는 아미노를 나타낸다.
제4항에 있어서, 반응을 용매의 존재하에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 용매가 메탄올임을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 일반식(Ⅱ)의 화합물이 일반식[5]의 화합물을 요오드화메탄과 반응시켜 메틸기를 도입시킴으로써 제조된 화합물임을 특징으로 하는 방법.

상기식에서, R¹, R²및 R³는 제4항에서 정의한 바와 같다.
제7항에 있어서, 일반식[5]의 화합물이 하기 일반식[4]의 화합물을 피리딘 용매 및 트리에틸아민의 존재하에서 황화수소를 포화시킴으로써 제조된 화합물임을 특징으로 하는 방법.

상기식에서, R¹, R²및 R³는 제4항에서 정의한 바와 같다.