KR0130775B1 - 비-특이적 면역 유도물질의 제조방법 - Google Patents

비-특이적 면역 유도물질의 제조방법

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루디 마이어 · 귄터 슈마허
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Description

비-특이적 면역 유도물질의 제조방법
본 발명은 두 단계 처리에 의해, 비-특이적 면역화 활성을 파괴시키지 않으면서 항원성을 저하시키는 동시에 바이러스를 불활성화시키는, 바이러스로부터 비-특이적 면역 유도물질(inducer)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
에이. 마이어(A. Mayer)에 따른 비-특이적 면역이란, 다수의 매우 다른 감염, 독소 및 항원에 대해 개체가, 다양한 기간동안 유지되고 비병원성이며 항원-특이적인 아닌(부특이적 : Paraspecific), 빠르게 전개하는 보호반응을 획득하는 것을 의미한다. 부특이적 보호반응(비-특이적 면역)은 세포성 및 체액성 면역 시스템의 부-특이적 부분을 자극하는 것에 기인하여 전개된다.
비-특이적 면역은 감염의 진행동안 자연적으로, 또는 비-특이적 면역 유도물질, 면역조절제, 생물학적 반응 변형체(BRM)등으로 처리하여 획득할 수 있다. 비-특이적 면역의 공지된 유도물질의 예는 불활성화된 조류의 전염성 상피종, 파라폭스(Parapox) 또는 오르토폭스(orthopox) 바이러스이다. [참조 : Tierarztl. Praxis 14, pages 237-244 (1986)].
공지된 비-특이적 면역 유도물질은 감마선에 의해서나, 가열 또는 화학적 방법에 의해 불활성화 된다 (참조 : DE-OS 2,714,665). 본 발명에 이르러서야 비-특이적 면역 유도물질의 제조를 위한 두 단계 불활성화 방법이 밝혀졌다.
사용된 방법은 기술 그 자체로서는 신규한 것이 아니다. 그러나, 이 방법은 바이러스학에서는 단지 다른 목적으로 사용되어 왔다. 즈와토우(Zwartouw)등은 종두증 입자로부터 항원을 침전시켜 분리하기 위하여 가열 및 알칼리화를 사용하였다 [참조 : Zwartow, J, gen. Microbiol. 38, 39-45 (1965)].
이러한 조직은 불활성화를 목적한 것이 아니며, 이들은 완전한 바이러스에 대한 항체를 함유하는 것을 목적으로 하였다.
선택된 시스템에서, 상기 저자들은 단지, 종두증 바이러스의 화학적 열처리 후 일어나는 항원-항체 반응이 양적으로 거의 구별되지 않다는 것만을 입증할 수 있었다.
폭스바이러스 및 파라믹소바이러스(Paramyxovirus)로부터의 비-특이적 면역 유도물질을 사용해온 현재까지의 경험상, 하기 두가지 기준이 이러한 유형의 유도물질의 활성에 중요하다:
1. 온건한 조건하에서 불활성화 및
2. 총 항원성은 감소되는 동시에 비-특이적 면역화 활성은 보유.
비-특이적 면역 유도물질은 비-특이적 면역을 유도하는 바이러스의 바이러스 현탁액의 pH를 8내지 11로 조절한 후 50내지 60℃에서 40내지 120분동안 가열함으로써 수득된다는 것이 밝혀졌다.
놀랍게도, 알칼리화와 가열의 조합은 바이러스의 불활성화 및 총 항원성의 감소와 동시에 비-특이적 면역활성을 보유시키는데 필요할 뿐만 아니라, 이것은 추가로 비-특이적 면역 유도물질을 제조하는데 장점을 갖는다.
장점은 하기와 같다.
1. 이 불활성화 방법은 방사선 또는 독성 화학물질에 노출 없이 간단히 수행한다.
2. 감소되는 항원성이란 반복된 사용후 감응성의 위험도가 감소되는 것을 의미한다.
3. 제조방법의 단순화로 경제성이 향상된다. 이 방법은 바이러스 현탁액의 pH를 약 8내지, 11, 바람직하게는 약 9내지 10으로 조절하여 수행된다.
이 조절은 수성 무기 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어, 수산화나트륨 또는 칼륨, 탄산염, 예를 들어, 탄산나트륨 또는 중탄산염, 예를 들어, 중탄산나트륨 또는 칼륨 등으로 수행한다. 그 후, 열 불활성화 과정을 약 50내지 60℃에서 40내지 120분 동안 가열시켜 수행하고, 55내지 60℃에서, 특히 약 56℃에서, 60내지 120분 동안 가열하는 것이 바람직하다.
불활성화를 위한 공정은 약 pH 10 및 약 56℃에서 약 60내지 120분 동안이 바람직하다.
본 발명에 따른 불활성화가 특히 적당한, 비-특이적 면역 유도물질의 제조를 위한 바이러스 종은 하기와 같다 :
폭스바이러스, 특히 이비폭스(avipox)속, 더욱 바람직하게는 갈리나에(gallinae)종, 약화된 면역화 스트레인 HP-1,438 닭(chicken)의 배 섬유아세포 배양물(FHE)에 통과[이 스트레인은, 예를 들어, (Collegium Veterinarum 1978, 35페이지 이하 참조)에 기술되어 있다. 이 바이러스 스트레인은, 기탁명 마이어-스틱클 아비폭스 인터페론 유도물질(May-Stickl Avipox Interferon Inducer)로 기탁되어 있다(기탁기관: the Landesimpfanstalt Nordrhein-Westfalen Abteilung Viruszhtung und-prung). 이것은 제3자에게 입수 용이하다]; 파라폭스 바이러스 속, 특히 바람직하게는 오르프바이러스(orfvirus)종, 약화된 스트레인 C 1701, 138. 어린양(lamb)의 신장 또는 소의 배발생 폐 배양물에 통과[스트레인 ORF D 1701은 예를 들어 Tierztl. Praxis 14, 237-244, 1986에 기술되어 있다]; 그로부터 제조된 비-특이적 면역 유도물질에 대한 실험 명칭 : PIND-ORF. [이 스트레인은 면역화 스트레인으로서 1981년 9월 1일자로 기탁되었다(기탁기관: the Bayerischen Landesimpfanstalt, Am Neudeck 1, 80000 Munich 95)]. 이 스트레인은 1988년 4월4일자로 기탁되었다(기탁기관 : the Institut Pasteur, Collection Nationale de Microorganismes, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris; 기탁명 CNCM I-751); 오르토폭스바이러스 속, 특히 바람직하게는 종두증 바이러스종, 약화된 스트레인 MVA, 530. FHE배양물에 백시니아 바이러스 CVA의 통과. 이 스트레인 MVA는 A. Mayr in Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. B, 167, 367 (1978)에 기술되어 있다. 이는 폴-얼리히 인스티튜트(Paul-Ehrilich Institute, Frankfurt)에 의해 사람의 마마에 대한 예비 면역이 입증되었고, 기탁되어 있다(기탁기관: The Institute of Microbiology, Dusseldorf). 그러나, 다른 바이러스 종도 또한 본 발명에 따른 불활성화를 이용하여 비-특이적 면역 유도물질을 제조하는데 적당하며, 예를 들어, 파라믹소바이러스, 레오바이러스 및 허피스바이러스가 있다.
바이러스는 먼저 공지된 방법으로 적당한 세포 배양물 예를 들어, 포유류 또는 조류 조직 세포의 세포 배양 물상에서 성장시킨다. 이것은 단층 세포 배양물 또는 현탁액 배양물에서나 부화된 달걀에서 수행할 수 있다.
단층 또는 현탁액 배양물에 사용되는 영양 배지는 공지된 배지, 예를 들어, 이얼(Earle), 이글(Eagle) 또는 행크스(Hanks)의 배지이다.
바이러스를 회수하고, 경우에 따라, 공지된 방법에 의해 정제한다. 이어서 바이러스 회수물에 본 발명에 따른 불활성화 방법을 적용시킨다.
불활성화 바이러스 회수물을 계속해서 냉각 또는 동결 건조시켜 비-특이적 면역 유도물질 제조에 사용하거나 저장한다.
이것은 예를 들어 경구 또는 비내 투여와 같이 점막을 통해, 및 근육내 또는 피하 투여와 같이 비경구 투여할 수 있는 생성물을 제조하게 된다.
하기 실시 예에서와 같이 제조된 비-특이적 면역 유도물질은 동결 건조할 수 있고 이 형태로 적당한 약제의 제조를 위한 출발물질로서 사용될 수 있다. 동결건조물을 사용하기 전에 출발물질의 용적으로 적당하게, 통상적인 약제학적 비히클, 바람직하게는 멸균된 발열물질-비함유증류수와 혼합한다. 이러한 형태의 제제는 비경구(예를 들어, 근육내 또는 피하)투여 및 국소적 투여 모두에 적당하다.
비-특이적 면역 유도물질은 또한 다른 약제학적 비히클에 혼입할 수도 있다. 이에 관해서는 멸균성 및 안전성이 예를 들어 비히클의 단백분해 성분에 의해 손실되지 않도록 주의할 필요가 있다.
예방에 있어서, 비-특이적 면역 유도물질은 24시간 간격으로 1내지 3회 투여한다. 치료 용도로는, 매일 1 내지 3회 처리를 질환의 중증도에 따라 3 내지 5일 동안 수행한다.
투여량은 관련 종의 크기 및 투여 형태에 좌우된다(예를 들어, 소에 비경구 투여시: 4ml, 강아지(pup)에 비경구 투여시: 0.5ml).
[실시예 1]
사용된 출발물질은, 닭의 배 섬유아세포 배양액(FHE)중 441번째 배양물 통과단계의, 107.5CID50/ml)의 전염성 역가를 갖는, 약화된, 플라그-정재(3회 통과)된 조류의 전염성 상피종 바이러스 스트레인 HF-1이다. 3%태아소 혈청이 첨가된 이얼의 MEM을 FHE 배양물을 배양하기 위해 사용하고, 첨가물이 없는 이얼의 MEM은 보존 배지(바이러스 배지)로서 사용한다. 바이러스 물지를 약 90%-연속 FHE단층 배양물(예를 들어 라욱스 디쉬(Roux dish)당 200ml배지 및 바이러스 현탁액 0.5ml)을 접종하는데 사용한다.
감염후 약 24시간, 또는 세포 배양액의 80 내지 100%가 바이러스-특이적 변화(과립화, 원형화 및 분리, 세포용혈)를 일으켰을 때, 계속 존재하고 있는 세포를 배양액을 진탕시켜 분리하고, 그대로 남아있는 세포를 파괴시키기 위해 바이러스 및 세포-함유 배지를 초음파(Branson sonifier, 15분)처리한다. 그후, 세포 파편을 저속 원심 분리하여 제거한다.
바이러스 수득물에서 샘플을 취하여 멸균성 및 감염성을 확인한다. 오염물(바이러스, 세균, 진균, 마이코풀라즈마)이 없고 감염성 역가가 최소한 107.25CID50/ml인 바이러스 수득물만을 더 사용한다. 이러한 요구성을 만족 시키지 못하는 수득물은 버린다.
바이러스 수득물은 그 다음 사용 때까지 +4°또는 -60℃에서 보관한다.
바이러스 물질을 두단계 불활성화를 시작하기 전에 37℃까지 가열한다. 불활성화의 첫 번째 단계에서는, 바이러스 현탁액을 1 N NaOH로 pH 10.0으로 조절한다. 알칼리화된 현탁액을 즉시 56℃수욕에 넣는다. 통상적인 교반기를 사용하여 교반시키고 자기 교반기를 사용하여 바이러스 현탁액을 연속 혼합하여 일정하게 혼합 및 가열되도록 한다.
열 불화성화는 60분 동안 수행한다.
이 후에, 더 이상의 감염성이 감지되지 않는 것을 입증하기 위하여 연속 통과를 수행한다.
상기 방법으로 수득한 비-특이적 면역 유도물질을 PIND-AVTt(therm.)라 명명하고 +4°또는 -60℃에서 보관한다. 이것은 또한 동결 건조 형태로 저장할 수 있다.
본 발명에 따라 수득된 비-특이적 면역의 PIND-AViT유도물질의 순도, 특이성 및 무해성을 적당한 조절연구에 의해 시험한다.
특이성, 순도 및 무해성에 대한 시험은 하기 기준의 유럽 약전의 요구성을 충족시킨다:
1. 통상적인 방법을 이용하여 전자 현미경 검사에 의한 확인은 생성물 중에, 몇몇은 무용한, 많은 국소적 폭스입자를 보여준다. 다른 미생물 구조물은 없다.
2. 미생물 오염에 대한 통상적인 확인을 생성물에 다른 바이러스, 세균, 진균 및 마이코플라즈마가 없는 것으로 나타난다.
3. 독성, 배자 기형 발생성 및 발열성은 유럽 약전에 명시된 것과 같이 시험하여, 양성 결과를 발견되지 않았다.
4. 비-불활성화된 바이러스의 잔여량 확인: 이것은 통상적인 방법으로 FHE튜브 배양물에서 적정하고, 야기되는 세포 변성 효과에 의해 감염성 역가를 결정한 비-특이적 면역의 처리된 유도물질을 필요로 한다. 추가 3회 연속 통과시킨 바이러스 잔여량은 0이다.
활성을 입증하기 위하여, 비특이적 면역 유도물질을 하기 방법에 의해 시험한다.
어린 마우스의 VSV감염 모델을 생체내 실험 입증으로서 사용한다 [참조: J. Vet Med. B, 33, 321-339(1986)]. 이것은 또한 유효단위(EU/ml)를 결정하는데 사용한다.
표1은 VSV모델에서 PIND-AVIt의 활성 적정을 나타낸다. 이러한 유형의 적정은 배치에서 유효 단위 (EU/ml)를 결정하는데 사용한다: 유효지수가 최소한 20이 계속 이루어지는 희석 단계는 0.1ml(마우스 하나당 주사 투여량)당 1EU 또는 10EUml(실시 예에서 1:16최종역가, 배치는 160EU/ml를 함유한다)를 함유한다.
[표1]
VSV 감염 모델에서 PIND-AVAt의 비-특이적 면역원 활성의 적정
Figure kpo00001
본 발명에 따른 비-특이적 면역 유도물질의 활성에 대한 시험관내 입증은, 4시간 크롬-51 유리 시험[참조: J. Vet Med. B, 33, 321-339(1986)]에서 PIND-AVAt 처리 24시간 후 복막 NK 세포의 활성이용을 수반한다. 목적을 위하여, 0.2ml의 PIND-AVAt를 세포수득 24시간 전에 마우스를 투여한다. 이 시험의 결과는 PIND-AVIt의 투여량-의존인 자극 효과를 나타낸다.
시험관내 시험에서, 처리 8시간 후 마우스 혈청에서 콜리니-자극 활성에 대한 PIND-AVIt의 효과를 시험한다.
이 CSA 시험의 결과는 PIND-AVIt의 투여량 의존적인 자극 효과를 낸다.
[실시예 2]
비-특이적 면역 유도물질의 제조를 위해 사용되는 출발 물질은, 어린양의 신장 또는 소의 배 발생단계의 폐 배양물에서 138번째 배양물 통과(감염성 역기: 107.75 CID50/ml)단계의, 약화된 파라폭스바이러스 오비스(ORF, 양의 농창), 스트레인 D 1701이다. 바이러스 수득물을 제조하여 실시예 1과 같이 불활성 시키는데, 이때 열 불활성화를 2시간 연장시킨다. 약 24시간 후에 불활성화 또는 바이러스 감염성이 완료된다.
순도, 무해성, 특이성 및 활성의 시험은 실시예 1에서와 같이 수행한다. 수득된 결과는 실시예 1에서와 같다.
[실시예 3]
실시예 1에서와 같이 수행하되 약화된 오르토폭스바이러스, 종두증 바이러스, 스트레인 MVA를 사용하여 비-특이적 면역 유도물질을 제조하고 순도 및 활성을 시험한다.
이 방법에 의해 불활성화된 바이러스는 비-특이적 면역화 특성을 갖는다.
[실시예 4]
실시예 1에서와 같이 제조된 비-특이적 면역 유도물질의 가능한 이용 및 활성을 입증하기 위하여, 치료학적 및 예방학적 이용의 예가 하기 표2 및 3에 있다.
임신중인 암컷 및 이들의 한배 새끼에 대한 이중맹검 시험(double-blind trial)에 PIND-AVIt로 처리(2×매회 4ml, 24시간 간격으로 근육내 투여)하는, 송아지 비육농장에서의 이중-맹검 시험은 생성물이 다양한 근원의 감염에 대해 우수한 예방학적 활성을 갖는 것을 명백히 보여준다.
자료로부터 입증될 수 있는 바와 같이, 비-특이적 면역 유도물질을 사용함으로써 다양한 근원의 감염성 질환의 진행을 중지시키거나 개선시킬 수 있고, 또는 질환의 개시를 완전히 예방할 수 있다.
이들은 또한 본 발명에 따른 비-특이적 면역 유도물질의 무해성을 입증한다. 부작용이 관찰되지 않았다.
[표 2]
감염성 쇠퇴의 예방에 있어서 PIND-AVIt의 효능
Figure kpo00002
[표 3]
송아지 비육시 많은 질병의 예방에 대한 의 PIND-AVt의 효능
Figure kpo00003

Claims (5)

  1. 아비폭스바이러스(avipoxviruses), 파라폭스바이러스(parpoxviruses), 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 레오바이러스(reoviruses)또는 허피스바이러스(herpesviruses)의 현탁액의 pH를 8내지 11로 상승시킨 다음, pH-상승된 바이러스 현탁액을 50 내지 60℃의 온도에서 40내지 120분 동안 가열함으로써 바이러스를 불활성화시켜 비-특이적 면역화 활성을 파괴하지 않으면서 항원성을 저하시킴을 특징으로, 비-특이적 면역 유도물질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 사용되는 바이러스 현탁액이 오르프바이러스(orfvirus)종의 파라폭스바이러스 또는 구진성 구내염 바이러스(stomatitis papulosa virus)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 바이러스 현탁액을 처음에 pH 9내지 10으로 조절한 후 55내지 60℃ 온도에서 60내지 90분 동안 가열하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 조류의 전염성 상피종(fowl pox)바이러스를 사용하여 수행하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 파라믹소바이러스 또는 레오바이러스를 사용하여 수행하는 방법.
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