JPH02432A - 非特異免疫誘発剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウィルスから非特異免疫誘発剤を、２段階処理
で、ウィルスを不活性化し、同時に抗原性を低下させ、
しかし非特異免疫化活性は壊さずに製造する方法に関す
る。

Ａ、　Ｍａｙｒによれば非特異免疫化とは、個体が複数
の全く異なる感染症、毒素及び抗原に対する防御作用を
、特定な病原及び抗原に対してでなく［即ち副将異的に
（ｐａｒａｓｐｅｃｉｆ　ｉｃ）］急速に獲得発現し、
それを色々と異なる期間保持する現象を意味する。副枠
異的防御作用（非特異的免疫化）は細胞性及び体液性免
疫系の副枠異性部分が刺激されて発現する。

非特異免疫性は、感染する過程で、又は非特異免疫誘発
剤、免疫調節剤、生体応答調整物質（ＢＲＭ）その他で
処理する事により、自然に獲得することが出来る。公知
の非特異免疫誘発剤には例えば、不活性化した鶏痘（ｆ
ｏｗｌ　ｐｏｘ）ウィルス、バラボックス又はオルトポ
ックスウィルスが挙げられる［Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ　Ｐ
ｒａｘｉｓ　１４．２３７−２４４　（１９８６）参照
］。

公知の非特異免疫誘発剤はガンマ−線、加熱処理あるい
は化学的な方法によって不活性する［ドイツ国特許公告
公報（ＤＥ−Ｏ５）第２，７１４，６６５号参照１゜２
段階不活性化法は、非特異免疫誘発剤の製造では今まで
の所開示されていない。

そこで使用する技術それ自体は新規なものではない。し
かし、それら技術はウィルス学の分野では、今日迄全く
別の目的で使用されて来た。Ｚｗａｒｔｏｕｖ他［Ｊ、
　ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３８．３９−４５
　（１９６５）］は種痘粒子（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｐａ
ｒｔｉｃｌｅｓ）から抗体を沈澱分離するのに熱を用い
又アルカリ化を行った。これらの操作は不活性化を目的
にしたものではなくて、抗原の検出を目的としており、
続いて処理したウィルス懸濁液の上澄みで、完全ウィル
スに対する抗体を含む出発物質を、血清で処理した。こ
の系で著者達はワクチニアウィルスの化学的熱処理の後
に起こった抗原−抗体反応が、定量的にはあまり明確で
なかったことを示せたに過ぎなｌ／１゜非特異免疫誘発
剤をポックスウィルス及びノくラミクツウィルスから製
造した経験から、高活性なこの種誘発剤を得るには、下
記の２つの事項、即ち １、不活性化は温和な条件の下で行う、２、全体の抗原
性は減少させ、同時に非特異免疫化活性は保持する、 のが重要であることが判っている。

非特異免疫誘発剤が、非特異免疫性をもたらすウィルス
の懸濁液をｐＨ８ないし１１に調整、次ｐｓで５０ない
し６０°Ｃで４０ないし１２０分間熱処理することによ
り得られることが発見された。

アルカリ化と熱処理の２つの操作を組み合わせることに
よって、最適状態でウィルスが不活性化され、全抗原性
が減少し、そして非特異免疫化活性が維持されて、しか
もその上、それによって非特異免疫誘発剤が有利に製造
できるのは驚くべきことである。同操作によって、 １、不活性化は放射線や毒性物質に曝すこと無く簡単に
行われ、 ２、抗原性を減少させているので、繰り返し使用した後
でも感作の危険が少なく、そして３、製造法が簡単にな
ったので経済性が改善される。

本方法はウィルス懸濁液のｐＨを約８ないし１１゜好ま
しくは９ないしｌＯに調整して実施する。

ｐＨ調整は無機アルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナ
トリウム又はカリウム、炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム
又はカリウム、又は重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウム
又はカリウムの水溶液を用いて実施する。

次いで熱処理による不活性化は約５０ないし６０°Ｃで
４０ないし１２０分間加熱して実施し、好ましくは５５
ないし６０℃、特に５６°Ｃで６０ないし１２０分間行
う。

不活性化工程は特にｐＨ約ｌＯ、モして５６゛Ｃで約６
０ないし１２０分間が好ましい。

非特異免疫誘発剤の製造で、本発明の不活性化が特に適
しているウィルスは、 ポックスウィルスで、特にアビボックス（ａｖｉｐ。

Ｘ）属のウィルス、特に好ましくはガリナエ（ｇａｌｌ
ｉｎａｅ）属の無毒免疫化株、ＨＰ−１，４３８゜にわ
とり胚繊維芽細胞中で継代培養したもの（ＦＨＥ）であ
る［同様は、例えばＧｏｌｌｅｇｉｕｍ　ＶｅＬｅｒｉ
ｎａｒｉｕｍ（獣医学委員会）　１９７８．３５頁以降
に示されている）。同ウィルス株は、“Ｍａｙｒ−５ｔ
ｉｃｋｌ　Ａｖｉｐｏｘ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｉｎ
ｄｕｃｅｒ“の寄託名で、西独、Ｎｏｒｄｒｈｅｉｎ−
Ｗｅｓｔ４ａｌｅｎ州立種痘所（Ｌａｎｄｅｓｉｍｐｆ
ａｎｓＬａｌｔ）、培養及び検査部に寄託されている。

同様は公開されており、般に入手可能である。

パラポックスウィルス属のウィルス、特に好ましくはオ
ルフウィルス種の無毒化株Ｃｌ７０１，１３８゜仔羊の
腎臓中、又はうし胎児肺中で継代培養したもの、（同様
ＯＲＦ　Ｄ１７０１は、例えばＴｉｅｒａｒｚｔｌ、　
Ｐｒａｘｉｓ　１４．２３７−２４４　（１９８６）；
同様から製造した製造した非特異免疫誘発剤用実験室指
示書（１ａｂｏ「ａｔｏｒｙ　ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ
）の部分に開示されている］　ＰＩＮＤ−ＯＲＦ、同様
は免疫化株として、西独、バイエルン州立種痘所［Ｎｅ
ｕｄｅｃｋ　１．８０００　Ｍｕｎｉｃｈ　９５（ミュ
ンヘン市）］に１９８１年９月１日寄託された。

同株は１９８８年４月４日、パリ、２５　ｒｕｅ　ｄｕ
　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ　７５２４にあるフランス
国立パスツール研究所の微生物培養コレクションに、Ｃ
ＮＣＭ　　ｌ−７５１の名前で、オルトポックスウィル
ス属の、特に好ましくはワクチニアウィルス種の無毒化
株ＭＶＡ　。

５３０として寄託された。ワクチニアウィルスＣＶＡの
Ｆ旺培養における継代培養によるＭＶＡ株は、　Ａ、　
ＭａｙｒによってＺｂｌ、　Ｂａｋ、　Ｈｙｇ、　１．
　Ａｂｔ、　Ｏｒｉｇ、　Ｂ、　１６７゜３６７　（１
９７８）に記載されている。同株は、Ｐａｕｌ−Ｅｈｒ
ｌｉｃｈ研究所（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）によってヒト天
然痘に対する予防免疫性を有することが証明され、微生
物学研究所（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ）に寄託されている
。

しかし、他のウィルス、例えばバラミクソポックスウィ
ルス、レオウィルス及びヘルペスウィルスも、本発明の
不活性化法を用いて非特異免疫誘発剤の製造に適してい
る。

ウィルスは最初、それ自体公知の、細胞培養に適した方
法で、例えば哺乳動物又は鳥類組繊細胞の細胞培養で育
成する。単層細胞培養、懸濁培養、又は町化鶏卵中で実
施する事が可能である。単層又は懸濁培養に使用する栄
養培地は公知のもので、例えばＥａｒｌｅＳＥａｇｌｅ
又はＨａｎｋｓ培地である。

ウィルスは公知の方法で採集され、適当な場合、精製さ
れる。採集したウィルスは次いで、本発明の方法によっ
て不活性化する。

不活性化したウィルス採集物は、続いて冷却するか、又
は凍結乾燥して貯蔵するか又は非特異免疫誘発剤の製造
に使用する。得られた製剤は経粘膜的に、例えば経口、
鼻腔内投与、及び非経口的に、例えば筋肉内又は皮下投
与される。

下記に示す実施例における様に製造した非特異免疫誘発
剤は、凍結乾燥しても良いし、そのまま適当な薬剤製造
の出発物質として使用することも出来る。冷凍乾燥物は
使用する前に、その適当な量を、通常の薬剤用賦形剤、
好ましくは滅菌した発熱物質を含まない蒸留水と混合す
る。こうして得られた製剤は非経口（例えば筋肉内又は
皮下）投与及び局部投与に適している。

非特異免疫誘発剤は又、その他の薬剤用賦形剤中に加え
る事も可能である。この場合、例えば賦形剤の中の蛋白
質分解を起こす成分によって、滅菌状態及び安定性が損
なわれないように注意しなければならない。

疫病予防では、非特異免疫誘発剤は、１回ないし２４時
間間隔で３回投与される。治療に際しては、１日当たり
１回ないし３回、病気の重さによって３ないし５日間手
当を行う。投与量は投与される動物の大きさ、及び投与
形態によって異なる（例えば牛に対して非経口的に投与
する際は４ｍ１Ｈ犬に対して非経口的に投与する際は０
．５　ｍｌ）。

実施例　１ 使用した出発材料は、無毒化された、プラーク法で３世
代継代培養して精製した鶏痘ウィルス株ＨＰ−１（にわ
とり胚繊維芽細胞中で４４１代継代培養してきたもの）
でその感染力指数（ｉｙｌ［６ｃＬｉｏｓｉｔｙｔｉｔ
ｒｅ）１０７’　ＣＩＤ５ｏ／ｍ＋であった。Ｅａｒｌ
ｅのＭＥＭ培地にうし胎児血清３％を加えてＦＨＥ培養
に使用し、添加していないＥａｒｌｅのＭＥＭ培地を維
持培地（ウィルス培地）として使用した。ウィルス材料
を、約９０％連続単層培養を用いて接種（例えばＲｏｕ
ｘ皿当たり２００　ｍｌの培地と０．５　ｍｌのウィル
ス懸濁液）した。感染２４時間後、又は細胞培養の８０
ないし１００％がウィルス特有の変化（例えば細胞の顆
粒化、円形化、剥離、溶解）を受けたら、なお存在する
細胞の液面上の塊を、培養物を振盪して剥がし、そして
ウィルスと細胞を含む培地を超音波（Ｂｒａｎｓｏｎ社
製：１５分間）で処理、まだウィルスによって攻撃され
ていない細胞を破壊する。破砕した細胞は低速延伸法で
分離する。

ウィルス採集物から試料を取り、その滅菌状態及び感染
力指数を検査した。ウィルス、細菌、かびおよび菌類、
マイコブラスマに汚染されておらず、そして感染力指数
が１０７’　ｃｏＤｓ。／ｍ１以上のウィルス採集物だ
けを次の試験で使用した。これに満たないものは廃棄し
た。

採集したウィルスは＋４℃又は−６０℃で、次に使用す
るまで貯蔵した。

得られたウィルス材料は、本発明の２段階不活性化を始
める前に３７°Ｃ迄加熱した。不活性化の第１段階で、
ウィルス懸濁液のｐＨをＩ　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を使用
して１０．０に調整した。アルカリ性にした懸濁液は、
続いて直ちに５６°Ｃに維持した湯浴に漬けた。ウィル
ス懸濁液はマグネティックスクーラーで連続的に混合し
、又湯浴も通常の撹拌機で撹拌して、均一混合、均一加
熱を行った。熱不活性化は６０分間実施した。

この時点で継代培養を行って、感染力がもう残っておら
ず、検知できないことを示しｔ；。

こうして得られた非特異免疫誘発剤はＰＩＮＤ−ＡＶＩ
’（熱処理）と呼ば＋４”Ｏ又は−６０°Ｃで保管され
る。

同誘発剤は又冷凍乾燥した状態ででも保存することが出
来る。

本発明の方法によって得られた非特異免疫誘発剤、ＰＩ
ＮＤ−ＡＶＩ　’の純度、特異性、及び無害性を適当な
対照を用いて調べた。

試験の結果、凹刻の特異性、純度、及び無害性はヨーロ
ッパ薬局法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏ
ｅｉａ）が要求する下記基準を満たしていた。

１、電子顕微鏡を用いて、通常の方法で検査すると、製
品中で大部分が典型的なＰｏｘ　Ｐａｒｔｉｃｌｅを形
成しているのが見られ、その幾つかは中空である。他の
微生物による生成物は無い。

２、＠生物による汚染を通常の方法で検査すると、生成
物中には他のウィルス、細菌、カビ及び菌類及びマイコ
ブラスマは無い。

３、ヨーロッパ薬局法に規定しである方法によって毒性
、催奇形性及び発熱生をした所、プラスの結果は得られ
なかった。

４、残存する不活性化されなかったウィルスの量を検査
を、非特異免疫誘発剤最終製品を通常の方法でＦＨＥ試
験管培養で滴定し、そして感染力指数は細胞変性効果に
よって定量して行う。残存ウィルスの量は更ｆこ３回継
代培養すれば０になる。

非特異免疫誘発剤の活性を示すために凹刻を下記の方法
で調べた。

ベビーマウスのＶＳｖ感染モデルをｉｎ　ｖｉｖｏ指数
として使用した［Ｊ、　Ｖａｔ、　Ｍｅｄ、　Ｂ、　３
３．３２１　３３９（１９８６）参照］。これは又有効
単位（Ｅｌ／ｍｌ）決定に使用することが出来る。

表１はＶＳＶモデルに８けるＰＩＮＤ−ＡＶ″活性を滴
定した結果を示したものである。この滴定は、試料を段
階的に希釈して行って、有効指数（ｅｆｆｉｃｔｉｖｅ
ｉｎｄｅｘ）が少なくとも２０になる希釈段階（ｄｉｌ
ｕｔｉｏｎｓｔａｇｅ）の時、同試料が０．１　ｍｌ　
（マウス１匹当たりの注射量）当たりＩＥＵ又は１ｍｌ
当たり１０　Ｅｌ含むものとして、あるバッチの有効単
位（ＥＵ／ｍｌ）を定量するのに用いられる［例えば表
１で、ｌ１ｔ６の希釈が最終滴定になったなら（即ちｌ
：３２のＥｌが２０以下になったので）、同バッチは１
ｍｌ当たり１６０（１６ｘｌｏ）Ｅｌ含んでいるとする
１゜表　　１ ｖＳｖ感染モデルでのＰＩＩＮＤ−ＡＶ’の非特異免疫
原活性の滴定 生成物　　　　希釈段階　　　有効指数ＰＩＮＤ−ＡＶ
’　　　　ｌ　：　　４　　　　　　４８１：８　　　
　　　４５ １　：　１６　　　　　　３４ １　：　３２　　　　　　１３ 本発明の非特異免疫誘発剤のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性は、
放射性クローム５１放出４時間試験で腹腔ＮＫ細胞の活
性を、ＰＩ）ＪＤ−ＡＶ’で処理して２４時間後に測定
して行った［Ｊ、　Ｖｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ｂ、　３３．
３２１−３３９　（１９８６）参照］。この為に０．２
　ｍＨ７）　ＰＩＮＤ−ＡＶ’　ヲ、ａｍｍ胞を取り出
す２４時間前にマウスに投与する。この試験の結果ＰＩ
ＮＤ−ＡＶ’は、その効果が投与量依存的であることが
判った。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、ＰＩＮＤ−ＡＶ’のマウスの血清
中でのコロニー刺激活性に及ぼす、処理８時間後の効果
を試験した。Ｃ５Ａ試験で実施した結果、ＰＩＮＤ−Ａ
Ｖ’は・−の刺激効果が投与量依存的であることが判っ
た。

実施例　２ 非特異免疫誘発剤製造の原料として、無毒化Ｐａｒａｐ
ｏｘ　ｏｖｉｓ（ＯＲＦ、羊の膿ｆ）　８１７１０株（
仔羊腎臓又は牛胎児肺中で１３８代継代培養した、感染
力指数１０７”　ＣＯＤ、。／ｍｌのもの）を使用した
。実施例１と同様に、只熱処理による不活性化を２時間
に延長してウィルスを調製、不活性化してウィルスを採
集した。約２時間後、完全に不活性化され、又はウィル
スの感染力が低下した。

純度、無害性、特異性、及び活性を、実施例１と同様に
実施した。結果も実施例１と同様であつＩこ　。

実施例　３ 無毒化０ｒＬｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｅ％
Ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ＭＶＡ株を用いて、実
施例１と同様に非特異免疫誘発剤を製造、その純度、及
び活性を試験した。

本発明の方法で不活性化したウィルスは非特異免疫化性
を有していた。

実施例　４ ７発性（Ｉｅｒ＋ｔｏｇｅｎｉｃ）ニューカッスル病ウ
ィルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）　Ｈｉｔｃｈｎ
ｅｅｒ　Ｂ＋株を使用して、実施例１と同様に非特異免
疫誘発剤を製造、純度、及び活性を試験した。この方法
で不活性化したウィルスは非特異免疫化性を有していた
。

実施例　５ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ　５ｅｒｏｔｙｐｅ　３を使用して、
実施例１と同様に非特異免疫誘発剤を製造、その純度、
及び活性を試験した。この方法で不活性化したウィルス
は非特異免疫化性を有していた。

実施例　６ 実施例１と同様に製造した非特異免疫誘発剤の使用可能
性及び活性を示すために、その治療のだめの使用及び予
防のための使用を表２及び３に示し　ｔこ　。

ＰＩＮＤ−ＡＶ１′を使用して、妊娠した雌大とその仔
犬達への作用を２重盲験試験を行った所、明らかに感染
による衰弱、これは一般に子が生まれてその第１週の死
亡率が特徴的に高くなることで示されるが、それが効果
的に抑制され、同誘発剤が予防的に使用できることを示
した（表２）。

仔牛肥育場での２重盲験試験で、仔牛を肥育場に受は入
れて直ちにＰＩＮＤ−ＡＶＩ　’を投与した（４　ｍｌ
づつ２回、２４時間間隔で）ところ、明らかに各種病原
による感染に対する優れた予防作用が見られＩこ　。

これらのデータから明らかなように、本非特異免疫誘発
剤を使用して各種病原体による感染症の進行を停止させ
るか、又は改善し、あるし１はその発生を完全に防ぐこ
とが可能である。

これら試験で更に、本発明の非特異免疫誘発剤が無害性
であり、副作用も無いことが示された。

表　　２ ＰＩＮＤ−ＡＶＩ　’の感染による衰弱予防効果表　　
３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非特異免疫誘発剤を製造するために用いられるウィ
   ルス懸濁液を不活性化するための方法であって、ウィル
   ス懸濁液をｐＨ上昇及び熱処理の２段階の不活性化に付
   すことを特徴とする方法。 ２、採取するウィルスがオルフウィルス種のバラボック
   スウィルス又は丘疹性口内炎ウィルスであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、採取するウィルスを最初にｐＨ８ないし１１に調整
   し、次いで５０ないし６０℃の温度で４０ないし１２０
   分間加熱することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の方法。４、採取するウィルスを最初にｐＨ９ないし
   １０に調整し、次いで５５ないし６０℃で６０ないし９
   ０分間加熱することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５、鶏痘ウィルスを用いて実施することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。６、バラミクソウィル
   ス又はレオウィルスを用いて実施することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。