JPWO2019195492A5 - - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
この出願は、2018年4月5日に出願された「組換え受容体を発現する細胞の作製方法および関連組成物」と題する米国仮出願第62/653,522号からの優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
この出願は、2018年4月5日に出願された「組換え受容体を発現する細胞の作製方法および関連組成物」と題する米国仮出願第62/653,522号からの優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
特定の態様では、第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、および/またはgRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターは任意でウイルスベクターである。特定の態様では、該ベクターはAAVベクターである。いくつかの態様では、AAVベクターはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される。特定の態様では、AAVベクターはAAV2またはAAV6ベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
[本発明1001]
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くは、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含み、かつ/または該組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くは、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖を発現しかつ/または該抗原への結合を示し、かつ
該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、組成物。
[本発明1002]
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低く、かつ/または
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、
組成物。
[本発明1003]
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001または1002の組成物。
[本発明1004]
改変T細胞が、TRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001~1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊およびTRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001~1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1(TRBC1)遺伝子またはT細胞受容体β定常部2(TRBC2)遺伝子の一方または両方である、本発明1001~1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによるものである、本発明1001~1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによるものであり、CRISPR-Cas9の組み合わせが該少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1001~1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
複数の改変T細胞のそれぞれの遺伝子破壊が、エレクトロポレーションを介して複数のT細胞に導入されたRNPによってもたらされる、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1001~1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1008~1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1008~1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1008~1011のいずれかの組成物。
[本発明1015]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1008~1011および1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、該鋳型ポリヌクレオチドが構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1001~1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、本発明1016または1017の組成物。
[本発明1019]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100~750ヌクレオチド、100~600ヌクレオチド、100~400ヌクレオチド、100~300ヌクレオチド、100~200ヌクレオチド、200~1000ヌクレオチド、200~750ヌクレオチド、200~600ヌクレオチド、200~400ヌクレオチド、200~300ヌクレオチド、300~1000ヌクレオチド、300~750ヌクレオチド、300~600ヌクレオチド、300~400ヌクレオチド、400~1000ヌクレオチド、400~750ヌクレオチド、400~600ヌクレオチド、600~1000ヌクレオチド、600~750ヌクレオチド、または750~1000ヌクレオチドの長さである、本発明1016~1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1016~1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値であり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、500もしくは約500から600もしくは約600ヌクレオチドの長さである、本発明1016~1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さである、本発明1016~1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1022のいずれかの組成物。
[本発明1025]
組換え受容体がキメラ抗原受容体(CAR)である、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン(任意で、該抗原結合ドメインはscFvである);膜貫通ドメイン;共刺激分子(任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン;および一次シグナル伝達ITAM含有分子(任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
本発明1025の組成物。
[本発明1027]
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1028]
組換え受容体が、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする配列を含む、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
前記改変細胞が1つまたは複数の第2の導入遺伝子をさらに含み、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1032]
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
第2の導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された第2の鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造[第2の5'相同性アーム]-[1つまたは複数の第2の導入遺伝子]-[第2の3'相同性アーム]を含む、本発明1031~1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によっては組み込まれないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1031~1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1031~1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント(scFv)、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体(CSR)、またはコレセプターから選択される分子をコードする、本発明1031および1034~1036のいずれかの組成物。
[本発明1038]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1001~1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1031~1037のいずれかの組成物。
[本発明1040]
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、本発明1038または1039の組成物。
[本発明1041]
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターもしくはMNDプロモーターもしくはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、本発明1040の組成物。
[本発明1043]
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常(Cα)領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、本発明1028~1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、本発明1028~1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、本発明1001~1045のいずれかの組成物。
[本発明1047]
T細胞が、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそれらのサブタイプを含む、本発明1001~1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
T細胞が対象の自己細胞である、本発明1001~1047のいずれかの組成物。
[本発明1049]
T細胞が対象に対して同種異系である、本発明1001~1048のいずれかの組成物。
[本発明1050]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1001~1049のいずれかの組成物。
[本発明1051]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含み、
ここで、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、方法。
[本発明1052]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1053]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で該1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
1つまたは複数の免疫細胞がT細胞を含む、本発明1001~1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
T細胞がCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1、任意で1:2もしくは約1:2から2:1もしくは約2:1、任意で1:1もしくは約1:1である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1051~1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1057の方法。
[本発明1059]
RNPの濃度が1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかもしくは約2μMである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
1つまたは複数の作用物質の導入がエレクトロポレーションによるものである、本発明1051~1058のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれ、かつ該鋳型ポリヌクレオチドの導入が形質導入によるものである、本発明1051~1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記ベクターがAAVベクターである、本発明1061の方法。
[本発明1063]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、本発明1051~1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
刺激剤が抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1:1であるかまたは約1:1である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、本発明1063または1064の方法。
[本発明1066]
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、前記細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
本発明1051~1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2;0.5ng/mL~50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7;および/または0.1ng/mL~20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、本発明1066または1067の方法。
[本発明1069]
組換え受容体がキメラ抗原受容体(CAR)である、本発明1051~1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン(任意で、該抗原結合ドメインはscFvである);膜貫通ドメイン;共刺激分子(任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン;および一次シグナル伝達ITAM含有分子(任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
本発明1069の方法。
[本発明1071]
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、本発明1051~1068のいずれかの方法。
[本発明1072]
組換え受容体が、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、かつ該導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1074]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1075]
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1077]
1つまたは複数の作用物質が、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質、およびTRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を含む、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1078]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を導入する段階であって、それによって、該標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1079]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびTRBC遺伝子の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質により誘発されたものであり、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1080]
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1(TRBC1)遺伝子またはT細胞受容体β定常部2(TRBC2)遺伝子の一方または両方である、本発明1051~1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、本発明1051~1056および1059~1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1051~1056および1059~1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1082の方法。
[本発明1084]
RNPの濃度が1μMまたは約1μMから5μMまたは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかまたは約2μMである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
RNPがエレクトロポレーションにより導入される、本発明1083または1084の方法。
[本発明1086]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1051~1076および1080~1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC遺伝子のエクソン内およびTRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1077~1085のいずれかの方法。
[本発明1088]
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1057~1072および1082~1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1057~1072および1082~1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1057~1072および1082~1087のいずれかの方法。
[本発明1091]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1057~1072および1082~1087および1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1051~1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、本発明1092または1093の方法。
[本発明1095]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100~750ヌクレオチド、100~600ヌクレオチド、100~400ヌクレオチド、100~300ヌクレオチド、100~200ヌクレオチド、200~1000ヌクレオチド、200~750ヌクレオチド、200~600ヌクレオチド、200~400ヌクレオチド、200~300ヌクレオチド、300~1000ヌクレオチド、300~750ヌクレオチド、300~600ヌクレオチド、300~400ヌクレオチド、400~1000ヌクレオチド、400~750ヌクレオチド、400~600ヌクレオチド、600~1000ヌクレオチド、600~750ヌクレオチド、または750~1000ヌクレオチドの長さである、本発明1092~1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1092~1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1092~1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さである、本発明1092~1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1051~1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1051~1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
組換え受容体がα(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1073~1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、本発明1072または1101の方法。
[本発明1103]
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする配列を含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含み、
第2の導入遺伝子が、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、
本発明1051~1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
第2の鋳型ポリヌクレオチドが、構造[第2の5'相同性アーム]-[1つまたは複数の第2の導入遺伝子]-[第2の3'相同性アーム]を含む、本発明1104~1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1104~1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1104~1108のいずれかの方法。
[本発明1110]
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント(scFv)、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体(CSR)、またはコレセプターから選択される分子をコードする、本発明1104~1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1051~1110のいずれかの方法。
[本発明1112]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1104~1111のいずれかの方法。
[本発明1113]
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、本発明1111または1112の方法。
[本発明1114]
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、本発明1073、1074または1113の方法。
[本発明1115]
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、本発明1073、1074または1113の方法。
[本発明1116]
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常(Cα)領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、本発明1051~1115のいずれかの方法。
[本発明1117]
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、本発明1116または1117の方法。
[本発明1119]
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、本発明1051~1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
免疫細胞がT細胞を含むか、またはT細胞に富んでいる、本発明1051~1119のいずれかの方法。
[本発明1121]
T細胞がCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1123]
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプとCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1124]
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1、任意で1:2もしくは約1:2から2:1もしくは約2:1、任意で1:1もしくは約1:1である、本発明1123の方法。
[本発明1125]
免疫細胞が、任意でiPSCである多分化能細胞または多能性細胞に由来する、本発明1051~1053および1057~1119のいずれかの方法。
[本発明1126]
免疫細胞が対象由来の初代細胞である、本発明1051~1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
対象が疾患、障害、または症状を有するか、またはその疑いがある、本発明1126の方法。
[本発明1128]
対象が健康であるか、またはその疑いがある、本発明1126の方法。
[本発明1129]
免疫細胞が対象の自己細胞である、本発明1126または1127の方法。
[本発明1130]
免疫細胞が対象に対して同種異系である、本発明1126~1128のいずれかの方法。
[本発明1131]
前記鋳型ポリヌクレオチドが1つまたは複数のベクターに含まれ、任意で該ベクターがウイルスベクターである、本発明1073~1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがAAVベクターである、本発明1131の方法。
[本発明1133]
AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8ベクターからなる群より選択される、本発明1062または1132の方法。
[本発明1134]
AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、本発明1062、1132または1133の方法。
[本発明1135]
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、本発明1131の方法。
[本発明1136]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、少なくとももしくは少なくとも約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1051~1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
前記ポリヌクレオチドが、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750から4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである、本発明1051~1136のいずれかの方法。
[本発明1138]
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、本発明1073~1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
前記鋳型ポリヌクレオチドの導入が、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、本発明1073~1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、本発明1139の方法。
[本発明1141]
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、本発明1073~1138のいずれかの方法。
[本発明1142]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、本発明1073~1141のいずれかの方法。
[本発明1143]
刺激剤が、抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1:1であるかまたは約1:1である、本発明1142の方法。
[本発明1144]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、本発明1142または1143の方法。
[本発明1145]
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、該細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
本発明1073~1144のいずれかの方法。
[本発明1146]
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2;0.5ng/mL~50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7;および/または0.1ng/mL~20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、本発明1145の方法。
[本発明1147]
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、本発明1145または1146の方法。
[本発明1148]
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、本発明1051~1147のいずれかの方法。
[本発明1149]
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、本発明1051~1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、本発明1051~1149のいずれかの方法。
[本発明1151]
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、本発明1051~1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
本発明1051~1151のいずれかの方法を用いて作製された、1つまたは複数の改変細胞。
[本発明1153]
本発明1152の1つまたは複数の改変細胞を含有する、組成物。
[本発明1154]
前記組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、本発明1153の組成物。
[本発明1155]
前記組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、本発明1153または1154の組成物。
[本発明1156]
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、本発明1153~1155のいずれかの組成物。
[本発明1157]
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、本発明1153~1156のいずれかの組成物。
[本発明1158]
薬学的に許容される担体をさらに含有する、本発明1153~1157のいずれかの組成物。
[本発明1159]
本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む治療方法であって、任意で、該対象が疾患、障害、または症状を有し、任意で、該疾患、障害、または症状が癌である、方法。
[本発明1160]
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状を治療するための、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物の使用。
[本発明1161]
任意で癌である、疾患、障害、または症状を治療するための医薬の製造における、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物の使用。
[本発明1162]
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状の治療に使用するための、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物。
[本発明1163]
1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質;
組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド;および
本発明1051~1151のいずれかの方法を実施するための説明書
を含む、キット。
[本発明1001]
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くは、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含み、かつ/または該組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くは、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖を発現しかつ/または該抗原への結合を示し、かつ
該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、組成物。
[本発明1002]
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低く、かつ/または
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、
組成物。
[本発明1003]
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001または1002の組成物。
[本発明1004]
改変T細胞が、TRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001~1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊およびTRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、本発明1001~1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1(TRBC1)遺伝子またはT細胞受容体β定常部2(TRBC2)遺伝子の一方または両方である、本発明1001~1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによるものである、本発明1001~1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによるものであり、CRISPR-Cas9の組み合わせが該少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1001~1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
複数の改変T細胞のそれぞれの遺伝子破壊が、エレクトロポレーションを介して複数のT細胞に導入されたRNPによってもたらされる、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1001~1010のいずれかの組成物。
[本発明1012]
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1008~1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1008~1012のいずれかの組成物。
[本発明1014]
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1008~1011のいずれかの組成物。
[本発明1015]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1008~1011および1014のいずれかの組成物。
[本発明1016]
導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、該鋳型ポリヌクレオチドが構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1001~1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、本発明1016または1017の組成物。
[本発明1019]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100~750ヌクレオチド、100~600ヌクレオチド、100~400ヌクレオチド、100~300ヌクレオチド、100~200ヌクレオチド、200~1000ヌクレオチド、200~750ヌクレオチド、200~600ヌクレオチド、200~400ヌクレオチド、200~300ヌクレオチド、300~1000ヌクレオチド、300~750ヌクレオチド、300~600ヌクレオチド、300~400ヌクレオチド、400~1000ヌクレオチド、400~750ヌクレオチド、400~600ヌクレオチド、600~1000ヌクレオチド、600~750ヌクレオチド、または750~1000ヌクレオチドの長さである、本発明1016~1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1016~1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値であり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、500もしくは約500から600もしくは約600ヌクレオチドの長さである、本発明1016~1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さである、本発明1016~1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1022のいずれかの組成物。
[本発明1025]
組換え受容体がキメラ抗原受容体(CAR)である、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン(任意で、該抗原結合ドメインはscFvである);膜貫通ドメイン;共刺激分子(任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン;および一次シグナル伝達ITAM含有分子(任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
本発明1025の組成物。
[本発明1027]
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1028]
組換え受容体が、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする配列を含む、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
前記改変細胞が1つまたは複数の第2の導入遺伝子をさらに含み、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、本発明1001~1024のいずれかの組成物。
[本発明1032]
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1031の組成物。
[本発明1033]
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
第2の導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された第2の鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造[第2の5'相同性アーム]-[1つまたは複数の第2の導入遺伝子]-[第2の3'相同性アーム]を含む、本発明1031~1033のいずれかの組成物。
[本発明1035]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によっては組み込まれないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1031~1034のいずれかの組成物。
[本発明1036]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれる、本発明1031~1035のいずれかの組成物。
[本発明1037]
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント(scFv)、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体(CSR)、またはコレセプターから選択される分子をコードする、本発明1031および1034~1036のいずれかの組成物。
[本発明1038]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1001~1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1031~1037のいずれかの組成物。
[本発明1040]
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、本発明1038または1039の組成物。
[本発明1041]
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターもしくはMNDプロモーターもしくはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、本発明1040の組成物。
[本発明1042]
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、本発明1040の組成物。
[本発明1043]
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常(Cα)領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、本発明1028~1042のいずれかの組成物。
[本発明1044]
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、本発明1043の組成物。
[本発明1045]
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、本発明1028~1044のいずれかの組成物。
[本発明1046]
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、本発明1001~1045のいずれかの組成物。
[本発明1047]
T細胞が、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそれらのサブタイプを含む、本発明1001~1046のいずれかの組成物。
[本発明1048]
T細胞が対象の自己細胞である、本発明1001~1047のいずれかの組成物。
[本発明1049]
T細胞が対象に対して同種異系である、本発明1001~1048のいずれかの組成物。
[本発明1050]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1001~1049のいずれかの組成物。
[本発明1051]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含み、
ここで、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、方法。
[本発明1052]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1053]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で該1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
1つまたは複数の免疫細胞がT細胞を含む、本発明1001~1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
T細胞がCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1、任意で1:2もしくは約1:2から2:1もしくは約2:1、任意で1:1もしくは約1:1である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1051~1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1057の方法。
[本発明1059]
RNPの濃度が1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかもしくは約2μMである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
1つまたは複数の作用物質の導入がエレクトロポレーションによるものである、本発明1051~1058のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれ、かつ該鋳型ポリヌクレオチドの導入が形質導入によるものである、本発明1051~1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記ベクターがAAVベクターである、本発明1061の方法。
[本発明1063]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、本発明1051~1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
刺激剤が抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1:1であるかまたは約1:1である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、本発明1063または1064の方法。
[本発明1066]
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、前記細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
本発明1051~1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2;0.5ng/mL~50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7;および/または0.1ng/mL~20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、本発明1066または1067の方法。
[本発明1069]
組換え受容体がキメラ抗原受容体(CAR)である、本発明1051~1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン(任意で、該抗原結合ドメインはscFvである);膜貫通ドメイン;共刺激分子(任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン;および一次シグナル伝達ITAM含有分子(任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む)に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
本発明1069の方法。
[本発明1071]
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、本発明1051~1068のいずれかの方法。
[本発明1072]
組換え受容体が、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1071の方法。
[本発明1073]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、かつ該導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1074]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1075]
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1077]
1つまたは複数の作用物質が、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質、およびTRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を含む、本発明1051~1074のいずれかの方法。
[本発明1078]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を導入する段階であって、それによって、該標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1079]
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびTRBC遺伝子の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質により誘発されたものであり、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
[本発明1080]
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1(TRBC1)遺伝子またはT細胞受容体β定常部2(TRBC2)遺伝子の一方または両方である、本発明1051~1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、本発明1051~1056および1059~1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、本発明1051~1056および1059~1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、本発明1082の方法。
[本発明1084]
RNPの濃度が1μMまたは約1μMから5μMまたは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかまたは約2μMである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
RNPがエレクトロポレーションにより導入される、本発明1083または1084の方法。
[本発明1086]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1051~1076および1080~1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
少なくとも1つの標的部位が、TRAC遺伝子のエクソン内およびTRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、本発明1077~1085のいずれかの方法。
[本発明1088]
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1057~1072および1082~1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1057~1072および1082~1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
からなる群より選択される配列を含む、本発明1057~1072および1082~1087のいずれかの方法。
[本発明1091]
gRNAが、配列:
を含むターゲティングドメインを有する、本発明1057~1072および1082~1087および1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1051~1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、本発明1092または1093の方法。
[本発明1095]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100~750ヌクレオチド、100~600ヌクレオチド、100~400ヌクレオチド、100~300ヌクレオチド、100~200ヌクレオチド、200~1000ヌクレオチド、200~750ヌクレオチド、200~600ヌクレオチド、200~400ヌクレオチド、200~300ヌクレオチド、300~1000ヌクレオチド、300~750ヌクレオチド、300~600ヌクレオチド、300~400ヌクレオチド、400~1000ヌクレオチド、400~750ヌクレオチド、400~600ヌクレオチド、600~1000ヌクレオチド、600~750ヌクレオチド、または750~1000ヌクレオチドの長さである、本発明1092~1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1092~1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1092~1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さである、本発明1092~1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1051~1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1051~1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
組換え受容体がα(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1073~1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、本発明1072または1101の方法。
[本発明1103]
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする配列を含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含み、
第2の導入遺伝子が、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、
本発明1051~1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
第2の鋳型ポリヌクレオチドが、構造[第2の5'相同性アーム]-[1つまたは複数の第2の導入遺伝子]-[第2の3'相同性アーム]を含む、本発明1104~1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1104~1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、本発明1104~1108のいずれかの方法。
[本発明1110]
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント(scFv)、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体(CSR)、またはコレセプターから選択される分子をコードする、本発明1104~1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1051~1110のいずれかの方法。
[本発明1112]
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、本発明1104~1111のいずれかの方法。
[本発明1113]
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、本発明1111または1112の方法。
[本発明1114]
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、本発明1073、1074または1113の方法。
[本発明1115]
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、本発明1073、1074または1113の方法。
[本発明1116]
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常(Cα)領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、本発明1051~1115のいずれかの方法。
[本発明1117]
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、本発明1116または1117の方法。
[本発明1119]
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、本発明1051~1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
免疫細胞がT細胞を含むか、またはT細胞に富んでいる、本発明1051~1119のいずれかの方法。
[本発明1121]
T細胞がCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1123]
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプとCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、本発明1120の方法。
[本発明1124]
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1、任意で1:2もしくは約1:2から2:1もしくは約2:1、任意で1:1もしくは約1:1である、本発明1123の方法。
[本発明1125]
免疫細胞が、任意でiPSCである多分化能細胞または多能性細胞に由来する、本発明1051~1053および1057~1119のいずれかの方法。
[本発明1126]
免疫細胞が対象由来の初代細胞である、本発明1051~1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
対象が疾患、障害、または症状を有するか、またはその疑いがある、本発明1126の方法。
[本発明1128]
対象が健康であるか、またはその疑いがある、本発明1126の方法。
[本発明1129]
免疫細胞が対象の自己細胞である、本発明1126または1127の方法。
[本発明1130]
免疫細胞が対象に対して同種異系である、本発明1126~1128のいずれかの方法。
[本発明1131]
前記鋳型ポリヌクレオチドが1つまたは複数のベクターに含まれ、任意で該ベクターがウイルスベクターである、本発明1073~1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがAAVベクターである、本発明1131の方法。
[本発明1133]
AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8ベクターからなる群より選択される、本発明1062または1132の方法。
[本発明1134]
AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、本発明1062、1132または1133の方法。
[本発明1135]
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、本発明1131の方法。
[本発明1136]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、少なくとももしくは少なくとも約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1051~1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
前記ポリヌクレオチドが、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750から4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである、本発明1051~1136のいずれかの方法。
[本発明1138]
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、本発明1073~1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
前記鋳型ポリヌクレオチドの導入が、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、本発明1073~1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、本発明1139の方法。
[本発明1141]
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、本発明1073~1138のいずれかの方法。
[本発明1142]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、本発明1073~1141のいずれかの方法。
[本発明1143]
刺激剤が、抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1:1であるかまたは約1:1である、本発明1142の方法。
[本発明1144]
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、本発明1142または1143の方法。
[本発明1145]
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、該細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
本発明1073~1144のいずれかの方法。
[本発明1146]
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2;0.5ng/mL~50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7;および/または0.1ng/mL~20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、本発明1145の方法。
[本発明1147]
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、本発明1145または1146の方法。
[本発明1148]
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、本発明1051~1147のいずれかの方法。
[本発明1149]
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、本発明1051~1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、本発明1051~1149のいずれかの方法。
[本発明1151]
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、本発明1051~1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
本発明1051~1151のいずれかの方法を用いて作製された、1つまたは複数の改変細胞。
[本発明1153]
本発明1152の1つまたは複数の改変細胞を含有する、組成物。
[本発明1154]
前記組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、本発明1153の組成物。
[本発明1155]
前記組成物中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、本発明1153または1154の組成物。
[本発明1156]
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、本発明1153~1155のいずれかの組成物。
[本発明1157]
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、本発明1153~1156のいずれかの組成物。
[本発明1158]
薬学的に許容される担体をさらに含有する、本発明1153~1157のいずれかの組成物。
[本発明1159]
本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む治療方法であって、任意で、該対象が疾患、障害、または症状を有し、任意で、該疾患、障害、または症状が癌である、方法。
[本発明1160]
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状を治療するための、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物の使用。
[本発明1161]
任意で癌である、疾患、障害、または症状を治療するための医薬の製造における、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物の使用。
[本発明1162]
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状の治療に使用するための、本発明1152の1つまたは複数の改変細胞、または本発明1001~1050および1153~1158のいずれかの組成物。
[本発明1163]
1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質;
組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド;および
本発明1051~1151のいずれかの方法を実施するための説明書
を含む、キット。
Claims (66)
- 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含み、
ここで、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、方法。 - 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。 - 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(i) (a)T細胞を含むか、またはT細胞に富んでいる免疫細胞に、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR-Cas9の組み合わせを含む遺伝子破壊を誘発することが可能な1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該CRISPR-Cas9の組み合わせは、該標的部位の遺伝子破壊を誘発することが可能であり、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する段階であって、
該CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体であり、
該導入は、エレクトロポレーションによるものであり、かつ、RNP複合体の濃度は、1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMである、段階;および
(b)該免疫細胞に、ウイルスベクターに含まれる鋳型ポリヌクレオチドを形質導入により導入する段階であって、該鋳型ポリヌクレオチドは、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRである組換え受容体をコードする導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含み、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、
該組換え受容体をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ
該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、該CRISPR-Cas9の組み合わせの導入の後に行われる、段階を含む;または
(ii) T細胞を含むか、またはT細胞に富み、かつ、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、ウイルスベクターに含まれる鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体をコードする導入遺伝子を含み、該導入は、形質導入によるものであり、かつ、該組換え受容体は、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含み、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、
該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR-Cas9の組み合わせを含む遺伝子破壊を誘発することが可能な1つまたは複数の作用物質によって誘導され、該CRISPR-Cas9の組み合わせは、遺伝子破壊を誘発することが可能であり、
該組換え受容体をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、
該CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体であり、かつ
該導入は、エレクトロポレーションによるものであり、かつ、RNP複合体の濃度は、1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMである、段階を含む、
方法。 - 前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、導入される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の免疫細胞がT細胞を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞がCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含む、請求項5に記載の方法。
- T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1である、請求項6に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、請求項1~2、および4~7のいずれか一項に記載の方法。
- CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、請求項8に記載の方法。
- RNPの濃度が1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMである、請求項9に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質の導入がエレクトロポレーションによるものである、請求項1~2、および4~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれ、かつ該鋳型ポリヌクレオチドの導入が形質導入によるものである、請求項1~2、および4~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターがAAVベクターである、請求項3または請求項12に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 刺激剤が抗CD3および/または抗CD28抗体を含む、請求項14に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、請求項14または15に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、前記細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mLの濃度のIL-2;0.5ng/mL~50ng/mLの濃度のIL-7;および/または0.1ng/mL~20ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、請求項17に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間実施される、請求項17または18に記載の方法。
- 組換え受容体が、(a)キメラ抗原受容体(CAR)または(b)組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え受容体が、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項20に記載の方法。
- 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、かつ該導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。 - 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。 - 1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
(a)免疫細胞に、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つまたは複数の作用物質およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、それによって、該標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階;および
(b)該免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。 - 遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊およびT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体(TCR)である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つまたは複数の作用物質およびTRBC遺伝子の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。 - 1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含む、請求項22~27のいずれか一項に記載の方法。
- CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、請求項28に記載の方法。
- RNPの濃度が1μMまたは約1μMから5μMまたは約5μMである、請求項29に記載の方法。
- RNPがエレクトロポレーションにより導入される、請求項29または30に記載の方法。
- 前記鋳型ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3'相同性アーム]を含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- (i) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、
(ii) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50から100ヌクレオチド長、100から250ヌクレオチド長、250から500ヌクレオチド長、500から750ヌクレオチド長、750から1000ヌクレオチド長、または1000から2000ヌクレオチド長である、
(iii) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100~1000ヌクレオチド、100~750ヌクレオチド、100~600ヌクレオチド、100~400ヌクレオチド、100~300ヌクレオチド、100~200ヌクレオチド、200~1000ヌクレオチド、200~750ヌクレオチド、200~600ヌクレオチド、200~400ヌクレオチド、200~300ヌクレオチド、300~1000ヌクレオチド、300~750ヌクレオチド、300~600ヌクレオチド、300~400ヌクレオチド、400~1000ヌクレオチド、400~750ヌクレオチド、400~600ヌクレオチド、600~1000ヌクレオチド、600~750ヌクレオチド、または750~1000ヌクレオチドの長さである、
(iv) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、
(v) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300ヌクレオチドを超える長さであり、かつ/または
(vi) 5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300ヌクレオチドを超える長さである、
(vii) 5'相同性アームがSEQ ID NO:124に記載の配列を含み、かつ/または3'相同性アームがSEQ ID NO:125に記載の配列を含む、
請求項34に記載の方法。 - 前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え受容体がα(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項22~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、請求項21または37に記載の方法。
- マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードする配列を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含み、
第2の導入遺伝子が、相同組換え修復(HDR)を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、
請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。 - 1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント(scFv)、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体(CSR)、またはコレセプターから選択される分子をコードする、請求項40に記載の方法。
- 前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、調節または制御エレメントをさらに含む、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、請求項40~42のいずれか一項に記載の方法。
- 異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、請求項42または43に記載の方法。
- TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常(Cα)領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、請求項4~21、24、25、28~44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、請求項1~21、24、25、28~45のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫細胞がT細胞を含むか、またはT細胞に富んでおり、該T細胞が
(i) CD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、
(ii) CD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、
(iii) CD4+ T細胞またはそのサブタイプとCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、かつ/または
(vi) CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1である、
請求項1~46のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫細胞が対象由来の初代細胞である、請求項1~47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型ポリヌクレオチドが1つまたは複数のベクターに含まれる、請求項22~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが
(i) ウイルスベクターであり、ウイルスベクターがAAVベクターである、または
(ii) レトロウイルスベクターである、請求項49に記載の方法。 - 前記鋳型ポリヌクレオチドが、
(i) 少なくとももしくは少なくとも約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、かつ/または
(ii) 2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750から4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである、
請求項1~50のいずれか一項に記載の方法。 - (i) 複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、
(ii) 複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%、または35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、もしくは90%より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、
(iii) 複数の改変細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、かつ/または
(iv) 複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10%低い、
請求項1~51のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1~52のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された、1つまたは複数の改変細胞。
- 請求項53に記載の1つまたは複数の改変細胞を含有する、組成物。
- 疾患、障害、または症状を治療するための医薬の製造における、請求項53に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項54に記載の組成物の使用。
- 癌疾患、障害、または症状の治療に使用するための、請求項53に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項54に記載の組成物。
- 1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部(TRAC)遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部(TRBC)遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質;
組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復(HDR)を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド;および
請求項1~52のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書
を含む、キット。 - 相同組換え修復による標的組み込みのためのシステムであって、
(i) SEQ ID NO:124に記載の5'相同性アーム、
(ii) SEQ ID NO:125に記載の3'相同性アーム、および
(iii) Casタンパク質およびTRAC遺伝子またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR-Casの組み合わせ、
を含む、システム。 - a) 該Casタンパク質がCas9タンパク質である、かつ/または
b) 該CRISPR-Cas9の組み合わせがgRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体である、
請求項58に記載のシステム。 - 組換え受容体をコードする導入遺伝子配列をさらに含む、請求項58~60のいずれか一項に記載のシステム。
- 該組換え受容体がキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)である、請求項61に記載のシステム。
- a) システムが構造:[5’相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3’相同性アーム]を含むポリヌクレオチドを含む、かつ/または
b) ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれる、
請求項61または62に記載のシステム。 - 構造:[5’相同性アーム]-[導入遺伝子]-[3’相同性アーム]を含むポリヌクレオチドであって、5'相同性アームがSEQ ID NO:124に記載のアミノ酸配列を含み、かつ/または3'相同性アームがSEQ ID NO:125に記載の配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 該導入遺伝子は、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードし、任意でさらに、該組換え受容体は、α(TCRα)鎖およびβ(TCRβ)鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項64に記載のポリペプチド。
- 請求項65に記載のポリペプチドを含むウイルスベクター。
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