JPWO2019176442A1 - 検出装置、検出基板及び検出方法 - Google Patents

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Abstract

検出装置は、基板（１１）と、基板（１１）の表面に設けられ、被検出物質（１４）に結合する性質を有する固定化抗体（１３）が固定され、励起光（１９）が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属ナノ構造（３０）と、被検出物質（１４）に結合する性質を有し、蛍光物質（１５）で標識された標識抗体（１６）と、被検出物質（１４）を含む被検溶液（１８）とを、金属ナノ構造（３０）に導入する導入部（２９）と、標識抗体（１６）及び被検溶液（１８）が導入された金属ナノ構造（３０）に、基板（１１）の裏面側から励起光（１９）を照射する光源（４１）と、励起光（１９）の照射により蛍光物質（１５）から生じる蛍光に基づき、被検出物質（１４）を検出する光検出器（４２）と、を備え、金属ナノ構造（３０）は、基板（１１）の裏面側から照射された励起光（１９）を基板（１１）の表面側に透過させる透光部（３２）を有する。

Description

本開示は、金属微細構造体（以下、金属ナノ構造と称する）を有する検出基板及びこれを備える検出装置等に関する。ここで、金属ナノ構造は、その近傍で発生したラマン散乱光や蛍光を局在化表面プラズモン共鳴の作用によって増強する。特に、被検出物質と結合する蛍光標識抗体の蛍光を検出する表面増強蛍光分光法（Surface Enhanced Fluorescence Spectroscopy）により、被検出物質を検出する装置等に関する。
従来、タンパク質を検出する技術として、表面増強蛍光を利用する技術がある。これは溶液を流す流路内に金属ナノ構造を形成した領域を設け、この金属ナノ構造上に被検出物質と結合する抗体（以下、固定化抗体と称する）を固定化する。この流路に、被検出物質と蛍光標識された抗体（以下、標識抗体と称する）を含むサンプル溶液を滴下すると、標識抗体と結合した被検出物質が固定化抗体に捕捉される。ここに、金属ナノ構造が局在化表面プラズモン共鳴を起こす波長の光を照射すると、標識抗体で発生した蛍光が増強され表面増強蛍光となる。この局在化表面プラズモン共鳴による蛍光の増強の程度を増強度と呼ぶ。表面増強蛍光の強度は、当該被検出物質の濃度の増加に応じて増加する。増強度は１〜３桁（つまり、１０〜１０００倍）程度なので、表面増強蛍光は、通常の蛍光よりも１〜３桁程度高い強度を示す。従って、通常の蛍光では計測できないような低濃度の被検出物質も検出できる（特許文献１参照）。
特開２０１０−１９７６５号公報 特開２００８−２１６０４６号公報
しかしながら、上記従来の技術では、被検出物質に結合した標識抗体だけではなく、被検出物質に結合していない標識抗体でも蛍光が発生するため、被検出物質の検出精度が低下する。また、被検出物質に結合していない標識抗体を除去することもできるが、その場合、操作が複雑になり、検出時間も増加する。
そこで、本開示は、被検出物質に結合していない標識抗体の除去作業を行わなくても、当該標識抗体による検出精度の低下を抑制することができる検出装置等を提供する。
本開示の一態様に係る検出装置は、第１の主面及び前記第１の主面と反対側の第２の主面を有する基板と、前記第１の主面に設けられ、被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記被検出物質に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２の特異的結合物質と、前記被検出物質を含む試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、前記第２の特異的結合物質及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記基板の前記第２の主面側から前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備え、前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能な記録媒体で実現されてもよく、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、例えばＣＤ−ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ−Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）などの不揮発性の記録媒体を含む。
本開示によれば、被検出物質に結合していない標識抗体の除去作業を行わなくても、当該標識抗体による検出精度の低下を抑制することができる。本開示の一態様における更なる利点および効果は、明細書および図面から明らかにされる。かかる利点および／または効果は、いくつかの実施形態並びに明細書および図面に記載された特徴によってそれぞれ提供されるが、１つまたはそれ以上の同一の特徴を得るために必ずしも全てが提供される必要はない。
基礎となった知見における表面増強蛍光法を説明するための図 実施の形態に係る検出装置の構成図 実施の形態に係る金属ナノ構造の断面図 実施の形態に係る金属ナノ構造の斜視図 実施の形態に係る金属ナノ構造の突起部の拡大斜視図 実施の形態に係る検出方法を示すフローチャート 実施例に係る金属ナノ構造の断面図 実施例に係る金属ナノ構造の反射スペクトルのグラフ 実施例に係る金属ナノ構造周辺の電場強度の２乗の分布図 実施例における電場強度の２乗のｚ方向における位置依存性を示す図 他の実施の形態に係る金属ナノ構造の斜視図
（本開示の基礎となった知見）
金属ナノ構造を利用した表面増強蛍光法においては、金属ナノ構造上に固定化された固定化抗体が被検出物質を介して標識抗体を捕捉する。そして、標識抗体で発生した蛍光を局在化表面プラズモン共鳴によって増強する。この増強された蛍光即ち表面増強蛍光を検出することにより、被検出物質を検出する。被検出物質の検出とは、被検出物質の濃度の計測を意味する。被検出物質の濃度の計測には、被検溶液中の被検出物質の絶対的な濃度の計測に加えて、所定濃度に対する相対的な濃度の計測が含まれる。
このように、金属ナノ構造で発生した局在化表面プラズモン共鳴による増強を利用した方法においては、局在化表面プラズモン共鳴を生成する励起光は、金属ナノ構造と被検出物質を含む被検溶液とが接する面（以降、表面と称する）側から照射される。
図１は、基礎となった知見における表面増強蛍光法を説明するための図である。図１において、基板１１１は、オレフィン等の樹脂からなり、その表面に直径が１００〜２０００ｎｍ程度の半円状の突起を有する。基板１１１の表面は、金、銀、アルミ等の金属からなる膜厚が３０〜１０００ｎｍ程度の金属膜１１２で覆われている。
金属膜１１２は、基板１１１の表面の突起上に成膜されているので、直径が１００〜２０００ｎｍ程度の半円状の突起構造、即ち金属ナノ構造１３０を形成する。この金属ナノ構造１３０に特定の波長の光を照射すると局在化表面プラズモン共鳴が発生する。
固定化抗体１１３は、金属膜１１２上に固定化される。被検出物質１１４は、固定化抗体１１３と結合する。標識抗体１１６は、蛍光物質１１５で標識されており、標識抗体１１６は、被検出物質１１４と結合する。つまり、被検出物質１１４は、固定化抗体１１３及び標識抗体１１６の間に挟まれる。
透明カバー１１７は、ガラス、樹脂等のからなり、被検出物質１１４を含む被検溶液１１８を、基板１１１との間に保持する。励起光１１９は、透明カバー１１７を介して金属ナノ構造１３０に照射される。励起光１１９は、金属ナノ構造１３０で局在化表面プラズモン共鳴を発生できる波長であって蛍光物質１１５を励起できる波長を有する。
励起光１１９が照射されると、金属ナノ構造１３０によって局在化表面プラズモン共鳴が発生し、かつ、被検出物質１１４を介して固定化抗体１１３に捕捉された標識抗体１１６から蛍光１２０が発生する。この蛍光１２０は、局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。増強された蛍光１２０は、透明カバー１１７を透過して外部へ出射して光検出器（図示せず）で検出される。
固定化抗体１１３に捕捉される標識抗体１１６の数は、被検出物質１１４の増加に応じて増加する。光検出器で検出される蛍光１２０の強度は、固定化抗体１１３に捕捉された標識抗体１１６の数に比例する。したがって、蛍光１２０の強度を計測することで、被検出物質１１４の濃度を計測することができる。ここで、被検出物質１１４と結合（Ｂｉｎｄ）している標識抗体１１６をＢ成分と称する。
また、被検出物質１１４と結合していない標識抗体１２１にも励起光１１９が照射されるので、標識抗体１２１から蛍光１２２が発生する。ここで、被検出物質１１４と結合していないフリー（Ｆｒｅｅ）な標識抗体１２１を、Ｆ成分と称する。蛍光１２２は、Ｆ成分から発生しており、被検出物質１１４の濃度を反映しない。Ｆ成分から発生した蛍光１２２は、単なるノイズ成分であり、Ｂ成分から発生した蛍光１２０の計測を妨害して計測精度を低下させる。
例えば、Ｆ成分から発生した蛍光１２２が強いと、光検出器が飽和してしまい計測不能になることもある。この飽和を防止するために励起光１１９の強度を低減すると、特に被検出物質１１４の濃度が低い場合の計測精度が低下する。
また、被検溶液１１８全体が励起光１１９に照射されているので、被検溶液１１８に共存する物質の散乱光や蛍光が、光検出器に混入してノイズになる。被検溶液１１８が、環境や生体から採取されたものであれば、被検溶液１１８内に共存物質が大量に混入していることが多いため、共存物質からの散乱光や蛍光による計測精度の低下は著しい。
このＦ成分によるＢ成分の検出に対する妨害を除去するために、標識抗体１１６が被検出物質１１４を介して固定化抗体１１３に捕捉される反応が完了した後に、金属ナノ構造１３０の周辺を洗浄して、被検出物質１１４と結合していないＦ成分である標識抗体１２１を除去してもよい（ＢＦ分離）。この場合、洗浄後に励起光１１９を照射することで、被検出物質１１４の濃度の計測精度を向上することができる。
ただし、このようなＢＦ分離は、計測操作を複雑にする。さらに、ＢＦ分離は、標識抗体１１６が被検出物質１１４を介して固定化抗体１１３に捕捉される反応が完了するまで始めることができず、計測時間の短縮を阻害する。また、金属ナノ構造１３０の周辺を洗浄することで、Ｆ成分の標識抗体１２１に加えて、固定化抗体１１３に捕捉されたＢ成分の標識抗体１１６も除去されてしまうことがある。
ＢＦ分離を用いない方法としては、特許文献２に記載されているように、基板の裏側から光を照射する裏面照射系を利用する方法がある。この方法では、基板の裏面から光を照射してエバネセント波を誘起する。このエバネセント波が、固定化抗体に補捉された標識抗体に照射されることで、標識抗体から蛍光が発生する。この方法の場合、エバネセント波は、抗体を固定化した基板表面から数百ｎｍの領域のみを照射するので、従来のように基板の表面から光を照射する場合と比べて、Ｆ成分又は共存物質に照射される光の量を低減することができる。
しかし、固定化抗体に捕捉された標識抗体は、基板表面から１０ｎｍ程度に位置することを考慮すると、エバネセント波の照射領域は過大であり、Ｆ成分から発生する蛍光の低減効果は限定的である。さらに、エバネセント波を誘起する場合は、基板への光の入射角を厳密に調整する必要があり、光学系が複雑になる。
以上のように、ＢＦ分離を利用する方法では、計測操作が複雑になるだけでなく、計測時間の短縮を阻害する。また、エバネセント波を利用する特許文献２の方法では、照射領域の制限が不十分であり、さらに複雑な光学系が要求される。
そこで、本開示の一態様に係る検出装置は、第１の主面及び前記第１の主面と反対側の第２の主面を有する基板と、前記第１の主面に設けられ、被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記被検出物質に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２の特異的結合物質と、前記被検出物質を含む試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、前記第２の特異的結合物質及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記基板の前記第２の主面側から前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備え、前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する。
これによれば、金属微細構造体は、基板の第２の主面側から照射された励起光を基板の第１の主面側に透過させる透光部を有する。これにより、複雑な光学系を用いなくても、基板の第２の主面側から照射された励起光によって、（i）金属微細構造体で表面プラズモンを生じさせ、（ii）第１の特異的結合物質に捕捉された第２の特異的結合物質から蛍光を発生させ、（iii）その蛍光を表面プラズモンで増強させることができる。したがって、第１の主面側から励起光が照射される場合よりも、励起光の試料中の照射範囲を金属微細構造体の近傍に制限しつつ、第１の特異的結合物質に捕捉された第２の特異的結合物質で発生した蛍光（信号光）を増強することができる。その結果、金属微細構造体の近傍以外で発生するノイズ光に対する信号光のＳ／Ｎ比を増大させることができ、被検出物質の検出精度を向上させることができる。また、金属微細構造体から比較的離れた位置にある第２の特異的結合物質（つまり、第１の特異的結合物質に捕捉されていない第２の特異的結合物質）で発生する蛍光を低減することができるため、第１の特異的結合物質に捕捉されていない第２の特異的結合物質の除去作業（つまり、ＢＦ分離）を省略することも可能となる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体は、さらに、前記透光部よりも前記励起光の透光性が低い非透光部を有し、前記基板は、前記励起光を透過させる性質を有し、前記非透光部は、前記第１の主面の金属膜で覆われた領域であり、前記透光部は、前記第１の主面の前記金属膜に覆われていない領域、又は、前記第１の主面の前記非透光部の金属膜よりも薄い金属膜で覆われた領域であってもよい。
これによれば、金属微細構造体は、透光部に加えて、金属膜で覆われた非透光部を備えることができる。したがって、透光部によって励起光を基板の第１の主面側に導くことができ、非透光部によって表面プラズモンを生じさせることができる。つまり、金属膜によって励起光の透過及び表面プラズモンを制御することができ、被検出物質の検出精度を向上させるための金属微細構造体の製造の容易性を向上させることができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体は、複数の突起部を有し、前記透光部は、前記複数の突起部の各々の側面の領域であってもよい。
これによれば、突起部の側面に透光部を設けることができる。したがって、例えば電子ビーム蒸着等の成膜方法を用いて、基板の突起の上面及び突起間の溝の底面に金属膜を成膜することで透光部及び非透光部を形成することができ、比較的容易に金属微細構造体を製造することができる。さらに、試料中の励起光の照射範囲を金属微細構造体のより近傍に制限することができ、さらに被検出物質の検出精度を向上させることができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属微細構造体は、ラインアンドスペース構造を有し、前記複数の突起部の各々は、ライン状であってもよい。
これによれば、金属微細構造体にラインアンドスペース構造を採用することができる。ラインアンドスペース構造は比較的簡易な構造であるので、被検出物質の検出精度を向上させるための金属微細構造体の設計の難しさを低減することができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属膜は銀からなってもよい。
これによれば、金属膜として銀を用いることができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記第２の特異的結合物質は、金属コロイド粒子に結合されてもよい。
これによれば、第２の特異的結合物質に金属コロイド粒子を結合することができる。したがって、金属微細構造体と金属コロイド粒子との間でも表面プラズモンを生じさせることができ、蛍光をさらに増強することができる。特に、金属コロイド粒子が金属微細構造体に近いほど、より強い表面プラズモンを生じさせることができるので、第１の特異的結合物質に捕捉されている第２の特異的結合物質で発生した蛍光の増強効果を向上させることができる。
また、本開示の一態様に係る検出装置において、前記金属コロイド粒子は金コロイド粒子であってもよい。
これによれば、金属コロイド粒子として金コロイド粒子を用いることができる。
本開示の一態様に係る検出基板は、被検出物質を検出するための検出基板であって、第１の主面及び前記第１の主面と反対側の第２の主面を有する基板と、前記基板の第１の主面に設けられ、被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、を備え、前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する。
この検出基板を用いて被検出物質を検出すれば、上記検出装置と同様の効果を得ることができる。
本開示の一態様に係る検出方法は、被検出物質に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２の特異的結合物質と、前記被検出物質を含む試料とを、（i）基板の第１の主面に設けられ、（ii）励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせ、（iii）前記被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定された金属微細構造体に導入し、前記第２の特異的結合物質及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記基板の前記第１の主面とは反対側の第２の主面側から前記励起光を照射し、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出し、前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する。
これによれば、上記検出装置と同様の効果を得ることができる。
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
（実施の形態）
以下、実施の形態に関して図面を参照しながら具体的に説明する。
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する。
［検出装置の構成］
図２は、実施の形態に係る検出装置の構成図である。
図２に示すように、本実施の形態に係る検出装置は、基板１１と、金属ナノ構造３０と、導入部２９と、光源４１と、光検出器４２と、コントローラ２６と、を備える。本実施の形態では、検出装置は、さらに、透明カバー１７と、レンズ２３、２４と、ロングパスフィルタ２５と、を備える。
基板１１は、第１の主面（以下、表面と称する）及び第１の主面と反対側の第２の主面（以下、裏面と称する）を有する。また、基板１１は、励起光１９を透過させる性質を有する。基板１１と透明カバー１７との間には、被検溶液１８が保持される。
金属ナノ構造３０は、基板１１の表面の少なくとも一部を金属膜で覆うことにより形成される。金属ナノ構造３０には、被検出物質に結合する性質を有する固定化抗体が固定される。被検出物質は、例えば病原体由来の分子である。病原体由来の分子としては、インフルエンザウイルスの核タンパク（ＮＰ）が例示される。固定化抗体は、第１の特異的結合物質の一例であり、例えばＩｇＧ抗体、または、ＶＨＨ抗体である。固定化抗体が金属ナノ構造３０に対する結合能を有する場合には、直接固定することができ、結合能を有しない場合には、有機分子などのリンカー材料を介して間接的に固定することができる。
この金属ナノ構造３０に特定の波長の励起光を照射することによって表面プラズモンを生じる。また、金属ナノ構造３０は、基板１１の裏面側から照射された励起光１９を基板１１の表面側に透過させる透光部を有する。金属ナノ構造３０の詳細については、図３〜図５を用いて後述する。
導入部２９は、標識抗体と、被検出物質を含む被検溶液１８とを、金属ナノ構造３０に導入する。標識抗体は、第２の特異的結合物質の一例であり、蛍光物質で標識され、被検出物質に結合する性質を有する。具体的には、標識抗体は、例えばＩｇＧ抗体、または、ＶＨＨ抗体である。被検溶液１８は、試料と称される場合もある。
具体的には、導入部２９は、例えば透明カバー１７に設けられた貫通孔に被検溶液１８を滴下する。より具体的には、導入部２９は、例えばポンプ（図示せず）及びバルブ（図示せず）を備えてもよい。この場合、導入部２９は、バルブを開いてポンプを作動することにより、被検溶液１８を金属ナノ構造３０に導入してもよい。
光源４１は、光照射部の一例であり、略平行光である励起光１９を基板１１の裏面側から照射する。基板１１の裏面側から照射された励起光１９は、金属ナノ構造３０の透光部を介して基板１１の表面側に透過し、金属ナノ構造３０に照射される。
固定化抗体に捕捉された標識抗体は、励起光１９に照射され、蛍光物質から蛍光２０を発する。標識抗体で発生した蛍光２０は、局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。増強された蛍光２０は、透明カバー１７を透過し、レンズ２３、ロングパスフィルタ２５及びレンズ２４を介して光検出器４２へ導かれる。ロングパスフィルタ２５は、励起光１９の波長成分を低減し、蛍光２０の波長成分を透過させる。
光検出器４２は、蛍光２０を分光して、スペクトルを検出する。光検出器４２は、蛍光２０のスペクトルデータを出力信号としてコントローラ２６に出力する。
コントローラ２６は、プロセッサ及びメモリを備え、メモリに格納されたソフトウェアプログラムをプロセッサが実行することによって実現される。また、コントローラ２６は、専用電子回路で構成されてもよい。コントローラ２６は、光検出器４２の出力信号である蛍光２０のスペクトルデータを解析して、被検出物質の濃度を算出する。さらに、コントローラ２６は、光源４１及び導入部２９を制御する。
光検出器４２及びコントローラ２６のセットは、検出部の一例であり、励起光１９の照射により蛍光物質から生じる蛍光に基づいて被検出物質を検出する。
［金属ナノ構造］
次に、金属ナノ構造３０の詳細について、図３〜図５を参照しながら具体的に説明する。図３は、実施の形態における金属ナノ構造３０の断面図である。図４は、実施の形態に係る金属ナノ構造３０の斜視図である。図５は、実施の形態に係る金属ナノ構造３０の突起部３１の拡大斜視図である。
基板１１は、励起光１９を透過するオレフィン等の樹脂製である。基板１１の表面には、幅が１０〜２０００ｎｍ程度、高さが１０〜４０００ｎｍ程度のライン状の突起が、ライン状の突起の幅と同程度の間隔で配置されている。基板１１の突起は、例えばナノインプリント法で形成される。
金属膜１２は、例えば金、銀、アルミ等の金属からなる。金属膜１２の膜厚は、１０〜１０００ｎｍ程度である。金属膜１２は、例えば電子ビーム蒸着によって基板１１の表面に成膜される。その結果、基板１１及び金属膜１２は、幅が１０〜２０００ｎｍ程度、厚みが１０〜１０００ｎｍ程度のライン状の突起部３１を有する金属ナノ構造３０を形成する。つまり、基板１１及び金属膜１２は、いわゆるラインアンドスペース構造を有する金属ナノ構造３０を形成する。ラインアンドスペース構造は、ライン方向（ｙ方向）と、ライン方向と直交する方向（ｘ方向）とで構造が異なる、いわゆる異方性を有する。
図５に示すように、金属ナノ構造３０は、透光部３２及び非透光部３３を有する。
透光部３２は、基板１１の裏面側から照射された励起光１９を基板１１の表面側に透過させる。具体的には、透光部３２は、基板１１の表面の金属膜１２で覆われていない領域である。より具体的には、透光部３２は、ライン状の突起部３１の側面（ｙｚ面）の領域である。
非透光部３３は、基板１１の表面の、透光部３２よりも励起光１９の透光性が低い領域であり、基板１１の表面の、金属膜１２で覆われた領域である。本実施の形態では、非透光部３３は、ライン状の突起部３１の上面（ｘｙ面）及び突起部３１間の溝の底面（ｘｙ面）の領域である。非透光部３３には、固定化抗体１３が固定される。
金属ナノ構造３０は、特定の波長の光が特定の偏光方向で照射された場合に、局在化表面プラズモン共鳴を発生する。局在化表面プラズモン共鳴は、金属ナノ構造３０の周辺で発生した蛍光を増強する。局在化表面プラズモン共鳴が発生する共鳴波長及び増強度は、金属ナノ構造３０のサイズ、金属種及び金属表面の粗さに依存する。例えば、本実施の形態の金属ナノ構造３０では、局在化表面プラズモン共鳴の共鳴波長及び増強度は、図３〜図５に示すライン状の突起部３１の幅、高さ、間隔、及び金属膜１２の膜厚及び表面粗さに依存する。
固定化抗体１３は、金属膜１２上に固定化される。被検出物質１４は、固定化抗体１３と結合する。標識抗体１６は、蛍光物質１５で標識されている。この標識抗体１６は、さらに、直径１０ｎｍ程度の金コロイド粒子（以下、金コロイド２７と称する）と結合している。図５に示すように、金コロイド２７は、標識抗体１６、被検出物質１４、及び固定化抗体１３を介して、金属膜１２に固定化されている。金コロイド２７と金属膜１２との間の距離は、約１５ｎｍである。
基板１１の裏面側から励起光１９が照射されると、励起光１９は、透光部３２を介して基板１１の表面側に到達し、金属ナノ構造３０に照射される。その結果、金属ナノ構造３０では、局在化表面プラズモン共鳴が発生する。
さらに、図３〜図５では、ライン状の突起部３１の側面（ｙｚ面）から出射した励起光１９の回折と、金属膜１２で発生した局在化表面プラズモン共鳴からの光放射とにより、金コロイド２７においても局在化表面プラズモン共鳴が発生する。これらの２つの局在化表面プラズモン共鳴の作用で、蛍光物質１５からの蛍光２０は、より増強される。
なお、励起光１９は、局在化表面プラズモン共鳴を発生させる波長を有していれば、必ずしも略平行光である必要はなく、拡散光のように斜めから入射する光であってもよい。そのため、簡易な光学系で励起光１９を照射することが可能である。
一方、固定化抗体１３に捕捉されていない標識抗体２１の多くは、金属ナノ構造３０から比較的離れた、電場増強の程度が低い領域に存在するため、Ｆ成分である標識抗体２１からの蛍光２２はほとんど増強されず、Ｆ成分である標識抗体２１からの蛍光２２の強度を抑制することができる。
［検出装置の動作］
次に、以上のように構成された検出装置の動作について、図６を参照しながら説明する。図６は、実施の形態に係る検出方法を示すフローチャートである。
まず、コントローラ２６は、導入部２９を用いて、金属ナノ構造３０に、標識抗体１６と、被検溶液１８とを導入する（Ｓ１１）。これにより、被検溶液１８に含まれる被検出物質１４は、固定化抗体１３及び標識抗体１６と結合する（抗原抗体反応）。ここでは、固定化抗体１３−被検出物質１４−標識抗体１６のように結合した複合体を形成させる、いわゆるサンドイッチ法を利用している。
被検物質１４に対する固定化抗体１３の結合能を調整することが可能であってよい。被検物質１４に対する標識抗体１６の結合能を調整することが可能であってよい。
続いて、コントローラ２６は、光源４１を用いて、基板１１の裏面側から励起光１９を照射する（Ｓ１２）。これにより、金属ナノ構造３０の透光部３２を介して、基板１１の表面側から励起光１９が金属ナノ構造３０、金コロイド２７及び標識抗体１６に照射される。その結果、標識抗体１６の蛍光物質１５から蛍光２０が発せられ、金属ナノ構造３０及び金コロイド２７の近傍で局在化表面プラズモン共鳴が発生する。標識抗体１６から発せられた蛍光２０は、局在化表面プラズモン共鳴によって増強される。
最後に、コントローラ２６は、光検出器４２を用いて、増強された蛍光２０を検出することにより、被検出物質１４を検出する（Ｓ１３）。
［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置によれば、金属ナノ構造３０は、基板１１の裏面側から照射された励起光１９を基板１１の表面側に透過させる透光部３２を有する。これにより、複雑な光学系を用いなくても、基板１１の裏面側から照射された励起光１９によって、（i）金属ナノ構造３０で表面プラズモンを生じさせ、（ii）固定化抗体１３に捕捉された標識抗体１６から蛍光を発生させ、（iii）その蛍光を表面プラズモンで増強させることができる。したがって、基板１１の表面側から励起光１９が照射される場合よりも、励起光１９の被検溶液１８中の照射範囲を金属ナノ構造３０の近傍に制限しつつ、固定化抗体１３に捕捉された標識抗体１６で発生した蛍光２０（信号光）を増強することができる。その結果、金属ナノ構造３０の近傍以外で発生するノイズ光に対する信号光のＳ／Ｎ比を増大させることができ、被検出物質１４の検出精度を向上させることができる。また、金属ナノ構造３０から比較的離れた位置にある標識抗体２１（つまり、固定化抗体１３に捕捉されていない標識抗体２１）で発生する蛍光２２を低減することができるため、固定化抗体１３に捕捉されていない標識抗体２１の除去作業（つまり、ＢＦ分離）を省略することも可能となる。
また、本実施の形態に係る検出装置によれば、金属ナノ構造３０は、透光部３２に加えて、金属膜１２で覆われた非透光部３３を備えることができる。したがって、透光部３２によって励起光１９を基板１１の表面側に導くことができ、非透光部３３によって表面プラズモンを生じさせることができる。つまり、金属膜１２によって励起光１９の透過及び表面プラズモンを制御することができ、被検出物質１４の検出精度を向上させるための金属ナノ構造３０の製造の容易性を向上させることができる。
また、本実施の形態に係る検出装置によれば、突起部３１の側面に透光部３２を設けることができる。したがって、例えば電子ビーム蒸着等の成膜方法を用いて、基板１１の突起の上面及び突起間の溝の底面に金属膜１２を成膜することで透光部３２及び非透光部３３を形成することができ、比較的容易に金属ナノ構造３０を製造することができる。さらに、被検溶液１８中の励起光１９の照射範囲を金属ナノ構造３０のより近傍に制限することができ、さらに被検出物質の検出精度を向上させることができる。
また、本実施の形態に係る検出装置によれば、金属ナノ構造３０にラインアンドスペース構造を採用することができる。ラインアンドスペース構造は比較的簡易な構造であるので、被検出物質１４の検出精度を向上させるための金属ナノ構造３０の設計の難しさを低減することができる。
また、本実施の形態に係る検出装置によれば、標識抗体１６に金コロイド２７を結合することができる。したがって、金属ナノ構造３０と金コロイド２７との間でも表面プラズモンを生じさせることができ、蛍光をさらに増強することができる。特に、金コロイド２７が金属ナノ構造３０に近いほど、より強い表面プラズモンを生じさせることができるので、固定化抗体１３に捕捉されている標識抗体１６で発生した蛍光の増強効果を向上させることができる。
以上のように、ライン状の突起部３１の側面（ｙｚ面）に透光部３２を有する金属ナノ構造３０に裏面より励起光１９を照射することで、Ｆ成分の蛍光の発生を抑制しつつ、Ｂ成分の蛍光を増強して検出できるので、ＢＦ分離不要な高精度な計測を簡単な光学系で実現できる。
（実施例）
本実施の形態の実施例として金属ナノ構造のシミュレーション結果を図７〜図１０を参照しながら説明する。図７は、実施例に係る金属ナノ構造の断面図である。
本実施例のシミュレーションモデルでは、基板１１としてオレフィンフィルムを用いた。オレフィンフィルムには、ライン幅＝１００ｎｍ、ライン高さ＝２００ｎｍ、ライン間隔（ピッチ）＝２００ｎｍのライン状の突起を形成した。この基板１１に、金属膜１２として、銀を１７５ｎｍ蒸着することで金属ナノ構造を形成した。その結果、金属ナノ構造には、ライン状の突起部の側面（ｙｚ面）にＺ＝１７５〜２００ｎｍの幅でライン状の透光部３２が形成された。
また、金コロイドが被検出物質を介して金属膜１２に固定化された場合は、金コロイド２７は、金属膜１２から約１５ｎｍ離れて位置する。したがって、本シミュレーションモデルでは、図７に示すように、金属膜１２の表面から１５ｎｍ離れた以下の位置に金コロイドを配置した。
（１）ｘ＝６５ｎｍ、ｚ＝１９０ｎｍ
（２）ｘ＝６５ｎｍ、ｚ＝３６０ｎｍ
（３）ｘ＝３５ｎｍ，ｚ＝３９０ｎｍ
（４）ｘ＝０ｎｍ、ｚ＝３９０ｎｍ
（５）ｘ＝−６５ｎｍ、ｚ＝１９０ｎｍ（図示せず）
（６）ｘ＝−６５ｎｍ、ｚ＝３６０ｎｍ（図示せず）
（７）ｘ＝−３５ｎｍ，ｚ＝３９０ｎｍ（図示せず）
これらの金コロイドによって、Ｂ成分の標識抗体１６に結合した金コロイド２７がモデル化された。
さらに、本シミュレーションモデルでは、図７に示すように、以下の位置にも金コロイドを配置した。
（８）ｘ＝６５ｎｍ、ｚ＝７５０ｎｍ
（９）ｘ＝０ｎｍ、ｚ＝７５０ｎｍ
（１０）ｘ＝−６５ｎｍ、ｚ＝７５０ｎｍ（図示せず）
これらの金コロイドによって、Ｆ成分の標識抗体２１に結合した金コロイド２７がモデル化された。
ここで、図７に示す金属ナノ構造及び金コロイドの局在化表面プラズモン共鳴に基づく電場分布を、ＦＤＴＤ法（Finite-difference time-domain method）にてシミュレーションした結果を図８〜図１０に示す。ここで、これら金属ナノ構造と金コロイドは被検溶液１８中にあるので、水の屈折率データを使用した。
まず、局在化表面プラズモン共鳴の共鳴特性を把握するために、励起光１９を基板１１の裏面よりｚ方向に照射した際の−ｚ方向への反射スペクトルを算出した。図８は、実施例に係る金属ナノ構造の反射スペクトルのグラフである。ここで、励起光１９の偏光方向は、ライン方向（つまり、ｘ方向）と直交する方向（つまり、ｙ方向）である。
図８より、局在化表面プラズモン共鳴を示す反射スペクトルのへこみが、波長＝４５６ｎｍ、５６４ｎｍ、及び８３０ｎｍ付近に見られた。また、金コロイドは水中では、波長＝５２０〜８８０ｎｍで局在化表面プラズモン共鳴を発生した。
そこで、波長＝５６４ｎｍの励起光を金属ナノ構造の周辺に照射した場合における金属ナノ構造の周辺の電場強度の２乗のｘｚ面の分布を算出した。図９は、実施例に係る金属ナノ構造の周辺の電場強度の２乗の分布図である。
この電場強度の２乗は、蛍光の増強度に相当する。これらは、電場強度＝１（Ｖ／ｍ）の励起光１９をｚ方向に照射した際の金属ナノ構造の周辺の電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）２）の分布図である。ここで、濃淡バー（凡例）の数値は、電場強度の２乗（（Ｖ／ｍ）２）を対数表示した数値である。濃淡バーにおいて、１は１０（Ｖ／ｍ）２、２は１００（Ｖ／ｍ）２を、−１は１／１０（Ｖ／ｍ）２、−２は１／１００（Ｖ／ｍ）２を示す。
図９から明らかなように、ライン状の突起部の角付近と、金属膜１２に固定化されている以下の位置の金コロイド周辺に電場が増強されている領域（ホットスポット）が見られる。
（１）ｘ＝６５ｎｍ、ｚ＝１９０ｎｍ
（２）ｘ＝６５ｎｍ、ｚ＝３６０ｎｍ
（３）ｘ＝３５ｎｍ、ｚ＝３９０ｎｍ
（５）ｘ＝−６５ｎｍ、ｚ＝１９０ｎｍ
（６）ｘ＝−６５ｎｍ、ｚ＝３６０ｎｍ
（７）ｘ＝−３５ｎｍ、ｚ＝３９０ｎｍ
図１０は、実施例における電場強度の２乗のｚ方向における位置依存性を示す図である。図１０は、ｘ＝５７．５ｎｍの位置における電場強度のｚ方向の位置依存性を示している。図１０には、このｘ５７．５ｎｍの位置を示す直線が描かれている。このｘ＝５７．５ｎｍの位置は、ｘ＝６５ｎｍに配置された金コロイド（直径＝１０ｎｍ）から２．５ｎｍ離れており、蛍光物質１５の近傍である。したがって、ｘ＝５７．５ｎｍの位置の電場強度の２乗は、蛍光物質１５から発生する蛍光の増強度に相当する。なおｘ＝−５７．５ｎｍの位置は、ｘ＝５７．５ｎｍの位置と同様の増強度が得られる。
図１０において、ｚ＝１７５ｎｍの増強度のピークは主に金属ナノ構造の局在化表面プラズモン共鳴によって生成されている。ｚ＝１９０ｎｍ及びｚ＝３６０ｎｍのピークは、金属ナノ構造の局在化表面プラズモン共鳴に加えて、金コロイドの局在化表面プラズモン共鳴によって生成されている。これらが、Ｂ成分の標識抗体から発生した蛍光を増強する。一方、ｚ＝７５０ｎｍの増強度のピークは、金コロイドの局在化表面プラズモン共鳴によって生成されている。これは、Ｆ成分の標識抗体から発生した蛍光を増強する。ただし、このＦ成分の蛍光の増強度は、上記Ｂ成分の蛍光の増強度の１／１０程度である。
また、基板１１の表面から励起光１９を照射した場合は、ｚ＞３７５ｎｍ以上の領域における電場強度の２乗は、平均１（（Ｖ／ｍ）２）になる。一方、本実施例では、図１０に示すように、金コロイドが存在しないｚ＞３７５ｎｍ以上の領域では、電場強度の２乗は、１（（Ｖ／ｍ）２）以下であり、約０．１５（（Ｖ／ｍ）２）まで低下する。
基板１１と透明カバー１７との間の距離は、１０μｍ程度以上なければ、被検溶液１８を保持することが困難なので、被検溶液１８のｚ方向の厚みは１０μｍ程度以上ある。これを考慮すると被検溶液１８の大部分の電場強度の２乗は、約０．１５（（Ｖ／ｍ）２）になる。したがって、本実施例では、被検溶液１８に共存する物質の散乱光や蛍光の増強度を従来よりも１／７程度に低減することができる。
さらに、金属ナノ構造の周辺で電場強度の２乗が１以上になる増強領域の幅は、５０ｎｍ程度であり、エバネセント波によって生成される増強領域の幅より、１桁程度小さい。これにより、Ｆ成分からの蛍光、並びに、共存物質の散乱光及び蛍光が被検出物質の検出に与える悪影響を低減できる。
また、図９からわかるように、ｘ＝５７．５ｎｍ以外の位置も同様に、金コロイド周辺以外は、電場強度の２乗が低く、Ｆ成分の蛍光、並びに、共存物質の散乱光及び蛍光の増強を抑制できることがわかる。
以上のように、金属ナノ構造３０を有する基板の裏面より励起光１９を照射することで、Ｆ成分の蛍光、並びに、共存物質の散乱光及び蛍光の増強を抑制でき、ＢＦ分離を行わなくても、高精度に被検出物質を検出することができる。
（他の実施の形態）
以上、本開示の１つまたは複数の態様に係る検出装置について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、本開示の１つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
例えば、上記実施の形態では、透光部３２は、基板１１の表面の金属膜１２に覆われていない領域であったが、これに限定されない。透光部３２は、励起光１９が透過すればどのような構成であってもよい。例えば、透光部３２は、基板１１の表面の非透光部３３の金属膜よりも薄い金属膜で覆われた領域であってもよい。例えば、透光部３２は、金属膜が金、銀又はアルミニウムである場合、５０ｎｍ程度以下の膜厚を有する金属膜で覆われた領域であってもよい。５０ｎｍ程度の金属膜であれば、励起光は、当該金属膜に覆われた領域を透過するので、当該領域は、透光部３２として機能する。また、透光部３２が基板１１の表面の薄い金属膜で覆われた領域である場合、金属膜の成膜法として、スパッタリング等を用いることができる。
なお、上記実施の形態では、標識抗体１６は、金コロイド２７と結合されていたが、必ずしも金コロイド２７と結合されなくてもよい。つまり、金コロイド２７が用いられなくても、上記実施の形態に係る金属ナノ構造３０に基板１１の裏面から励起光１９を照射することで、Ｆ成分の蛍光及びその増強を抑制することができ、ＢＦ分離を伴わなくても被検出物質の検出精度の向上を実現することができる。
なお、上記実施の形態では、金コロイド２７が用いられていたが、他の金属コロイド粒子が用いられてもよい。例えば、金コロイド２７の代わりに、銀又はアルミニウムのコロイド粒子が用いられてもよい。
なお、上記実施の形態では、金属ナノ構造３０は、ラインアンドスペース構造を有していたが、これに限定されない。例えば、金属ナノ構造３０は、行列状に配置された角柱状の複数の突起部を有してもよい。
図１１は、他の実施の形態に係る金属ナノ構造３０Ａの斜視図である。基板１１Ａ及び金属膜１２Ａによって金属ナノ構造３０Ａが形成されている。金属膜１２Ａは、角柱状の複数の突起部３１Ａを備える。複数の突起部３１Ａの上面（ｘｙ面）及び複数の突起部３１Ａ間の溝の底面（ｘｙ面）には、金属膜１２Ａに覆われた領域である非透光部３３Ａが形成される。また、複数の突起部３１Ａの側面（ｘｚ面及びｙｚ面）には、金属膜１２Ａに覆われていない領域である透光部３２Ａが形成される。
なお、図１１では、複数の突起部は角柱状であったが、他の形状であってもよい。例えば、複数の突起部は、円柱状又は六角柱状であってもよい。
なお、上記実施の形態では、透光部３２は、突起部の側面の領域に形成されていたが、これに限定されない。例えば、突起部の上面又は突起部間の溝の底面の領域に形成されてもよい。
なお、上記実施の形態では、レンズ２３、２４、及びロングパスフィルタ２５が検出装置に含まれていたが、必ずしも含まれなくてもよい。例えば、光検出器４２が、レンズ２３、２４、及びロングパスフィルタ２５の機能を実現してもよい。
なお、上記実施の形態では、金属ナノ構造３０は、樹脂基板と金属膜とで形成されていたが、これに限定されない。例えば、金属ナノ構造３０は、突起部を有する金属基板であってもよい。この場合、金属基板の厚い領域を非透光部として機能させ、金属基板の薄い領域を透光部として機能させてもよい。
本開示は、病原体由来のタンパク質等の濃度を計測するセンサデバイスに用いることができる。
１１、１１Ａ、１１１ 基板
１２、１２Ａ、１１２ 金属膜
１３、１１３ 固定化抗体
１４、１１４ 被検出物質
１５、１１５ 蛍光物質
１６、２１、１１６、１２１ 標識抗体
１７、１１７ 透明カバー
１８、１１８ 被検溶液
１９、１１９ 励起光
２０、２２、１２０、１２２ 蛍光
２３、２４ レンズ
２５ ロングパスフィルタ
２６ コントローラ
２７ 金コロイド
２９ 導入部
３０、３０Ａ、１３０ 金属ナノ構造
３１、３１Ａ 突起部
３２、３２Ａ 透光部
３３、３３Ａ 非透光部
４１ 光源
４２ 光検出器

Claims (10)

  1. 第１の主面及び前記第１の主面と反対側の第２の主面を有する基板と、
    前記第１の主面に設けられ、被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、
    前記被検出物質に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２の特異的結合物質と、前記被検出物質を含む試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、
    前記第２の特異的結合物質及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記基板の前記第２の主面側から前記励起光を照射する光照射部と、
    前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出する検出部と、を備え、
    前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する、
    検出装置。
  2. 前記金属微細構造体は、さらに、前記透光部よりも前記励起光の透光性が低い非透光部を有し、
    前記基板は、前記励起光を透過させる性質を有し、
    前記非透光部は、前記第１の主面の金属膜で覆われた領域であり、
    前記透光部は、前記第１の主面の前記金属膜に覆われていない領域、又は、前記第１の主面の前記非透光部の金属膜よりも薄い金属膜で覆われた領域である、
    請求項１に記載の検出装置。
  3. 前記金属微細構造体は、複数の突起部を有し、
    前記透光部は、前記複数の突起部の各々の側面の領域である、
    請求項２に記載の検出装置。
  4. 前記金属微細構造体は、ラインアンドスペース構造を有し、
    前記複数の突起部の各々は、ライン状である、
    請求項３に記載の検出装置。
  5. 前記金属膜は銀からなる、
    請求項２〜４のいずれか１項に記載の検出装置。
  6. 前記第２の特異的結合物質は、金属コロイド粒子に結合されている、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出装置。
  7. 前記金属コロイド粒子は金コロイド粒子である、
    請求項６に記載の検出装置。
  8. 被検出物質を検出するための検出基板であって、
    第１の主面及び前記第１の主面と反対側の第２の主面を有する基板と、
    前記基板の第１の主面に設けられ、被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、を備え、
    前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する、
    検出基板。
  9. 被検出物質に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２の特異的結合物質と、前記被検出物質を含む試料とを、（i）基板の第１の主面に設けられ、（ii）励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせ、（iii）前記被検出物質に結合する性質を有する第１の特異的結合物質が固定された金属微細構造体に導入し、
    前記第２の特異的結合物質及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記基板の前記第１の主面とは反対側の第２の主面側から前記励起光を照射し、
    前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記被検出物質を検出し、
    前記金属微細構造体は、前記第２の主面側から照射された前記励起光を前記第１の主面側に透過させる透光部を有する、
    検出方法。
  10. 励起光が入射する第１面と、
    前記励起光に対応する出力光を出力する前記第１面に垂直な複数の第２面と、
    前記第１面に平行かつ複数の金属膜で覆われた複数の第３面を含み、
    前記複数の金属膜に直接的または非直接的に複数の第１抗体が固定され、
    前記複数の第１抗体が液体中にある場合、前記複数の第２面と前記複数の第３面を含む複数の面は前記液体を保持し、
    前記液体は複数の被検出物質、前記複数の被検出物質と結合する複数の第２抗体、前記複数の第２抗体と結合する複数の標識物質を含み、
    前記複数の第１抗体は前記複数の被検出物質と結合し、
    前記複数の標識物質は前記励起光に対応する蛍光を出力し、
    前記金属膜は、前記複数の標識物質のうち前記複数の第１抗体に含まれる抗体に結合する標識物質が発する蛍光の強度を、前記複数の標識物質のうち前記複数の第１抗体に含まれる抗体と結合しない標識物質が発する蛍光の強度よりも大きくさせる
    検出基板。
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