JPWO2019124410A1 - 化粧料用原料とこれを配合してなる皮膚用化粧料 - Google Patents
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Abstract
使用感が優れており、使用し続けることで皮膚に美白効果が生じると共に、皮膚のハリ具合の改善やしわ・シミの発生を抑制することができる化粧料用原料と皮膚用化粧料を提供する。上記化粧料用原料は、オシディオフンジン（occidiofungin）を含むバークホルデリア・コンタミナンス（Burkholderia contaminans）の培養液からなるか又はその培養液を配合してある。上記皮膚用化粧料は、上記化粧料用原料を含有させてあるか又は上記化粧料用原料を主原料としてなる。
Description
本発明は、化粧料用原料とこれを配合してなる皮膚用化粧料に関する。本発明に係る化粧料用原料は、使用感が優れていると共に、皮膚の美白作用と強い抗酸化力を備えている。そのため、本発明に係る皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、使用し続けると、皮膚のハリ具合の改善や皮膚のしわ・シミの発生を抑制することに効果がある。
従来から、皮膚に塗布したときの滑らかさやなじみやすさなどの使用感が良好な化粧料用原料や、これを用いた皮膚用化粧料がいくつか紹介されている（例えば特許文献１）。しかし、従来の使用感が良好な化粧料用原料は、塗布時の滑らかさの付与を油性原料に依存しており、流動パラフィンやスクワラン、シリコーン油などの油性原料を油中水型又は水中油型に乳化させたものが多く、そのため、油分特有のべたつき感を避けることができない。また、油性原料を用いない化粧水であっても、その保湿剤として多価アルコールを配合する傾向があるため、使用後の皮膚にべとつき感が残ることが多い（例えば特許文献２）。
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept.2011, p.6189-6198 Genetic and Biochemical Map for the Biosynthesis of Occidiofungin, an Antifungal Produced by Burkholderia contaminans Strain MS14
Biochemical and Biophysical Research Communications 380 (2009) 328-332 Biosynthesis of an antifungal oligopeptide in Burkholderia contaminans strain MS14
本発明は、使用感が優れていると共に、皮膚の美白作用と強い抗酸化力を備えている化粧料用原料と、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚のハリ具合の改善や皮膚のしわ・シミの発生を抑制する効果を奏する皮膚用化粧料を提供することを課題とする。
本発明者は、バークホルデリア・コンタミナンス（Burkholderia contaminans）を研究している過程において、その培養液が、皮膚用化粧料の原料とした場合に、使用感が優れているとともに、美白作用や抗酸化性に富んでいることを見出し、さらに研究の結果、本発明を完成するに至った。
バークホルデリア・コンタミナンスは、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する細菌の一種であり、その培養液から抽出した環状糖ペプチドのオシディオフンジン（occidiofungin）は、カビや酵母等の真菌の増殖を阻害する抗真菌性を有することが知られている（特許文献３及び非特許文献１）。
本発明の課題は、以下の化粧料用原料と皮膚用化粧料よって解決できる。
（１）オシディオフンジン（occidiofungin）を含むバークホルデリア・コンタミナンス（Burkholderia contaminans）の培養液からなるか又はその培養液を配合してあることを特徴とする化粧料用原料。
（２）オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質であるか又はその産生物質を含有させてあることを特徴とする化粧料用原料。
（３）オシディオフンジンであるか又はオシディオフンジンを含有させてあることを特徴とする化粧料用原料。
（４）上記（１）から（３）のいずれかに記載の化粧料用原料を含有させてあることを特徴とする皮膚用化粧料。
（５）上記（１）から（３）のいずれかに記載の化粧料用原料を主原料としてなることを特徴とする皮膚用化粧料。
上記（１）に記載の化粧料用原料は、オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの培養液からなるか又はその培養液を配合してあるものであり、極めて皮膚になじみやすく、しかも、塗布した後の皮膚が滑らかになる。すなわち、使用感が優れている。
さらに、かかる化粧料用基材を皮膚に塗布すると、角層水分量が増加するので、皮膚が潤うと共に、経皮水分の蒸散量が抑制され、皮膚のバリア機能が増強する。そのため、皮膚の粘弾性が向上するので、皮膚が柔らかくなると共に、皮膚のハリ具合が改善される。すなわち、皮膚の柔らかさやすべすべ感、しっとり感が向上する。
さらに、かかる化粧料用基材を皮膚に塗布すると、角層水分量が増加するので、皮膚が潤うと共に、経皮水分の蒸散量が抑制され、皮膚のバリア機能が増強する。そのため、皮膚の粘弾性が向上するので、皮膚が柔らかくなると共に、皮膚のハリ具合が改善される。すなわち、皮膚の柔らかさやすべすべ感、しっとり感が向上する。
また、上記（１）に記載の化粧料用原料を使用し続けると、皮膚を形成する細胞内のチロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。さらに、かかる化粧料用原料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。
また、オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの培養液は抗真菌性を有するので、上記（１）に記載の化粧料用原料を配合することによって、皮膚用化粧料に防腐性を付与することができる。
このように、上記（１）に記載の化粧料用原料は、皮膚用化粧料の原料として極めて有用である。
このように、上記（１）に記載の化粧料用原料は、皮膚用化粧料の原料として極めて有用である。
なお、ここで「皮膚」とは、人体の表面を覆っている全ての組織のことをいう。
また、「皮膚用化粧料」とは、皮膚に触れるようにして使用する全ての化粧料を含み、皮膚に塗布して使用する化粧料のみならず、皮膚を洗浄するための洗浄用化粧料や、入浴用の湯に溶かして使用する浴用化粧料も含むものである。
バークホルデリア・コンタミナンスの培養液とは、バークホルデリア・コンタミナンスを培養した培地から、遠心分離やフィルター等によって、バークホルデリア・コンタミナンスの菌体の全部又は大部分を取り除いた、いわゆる上清であり、オシディオフンジンを含有するものである。
上記（２）に記載の化粧料用原料は、オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質であるか又はその産生物質を含有するものであるから、上記（１）に記載の化粧料用原料と同様の効果を示し、皮膚用化粧料の原料として極めて有用である。
上記（３）に記載の化粧料用原料は、オシディオフンジンであるか又はオシディオフンジンを含有するものであるから、上記（１）に記載の化粧料用原料と同様の効果を示し、皮膚用化粧料の原料として極めて有用である。
上記（４）に記載の皮膚用化粧料は、上記（１）から（３）のいずれかに記載の化粧料用原料を含有するものであるから、上記（１）に記載の化粧料用原料と同様の効果を示す。
すなわち、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は防腐性を備えたものとなる。
すなわち、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記（４）に記載の皮膚用化粧料は防腐性を備えたものとなる。
上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、上記（１）から（３）のいずれかに記載の化粧料用原料を主原料としてなるものであるから、上記（４）に記載の皮膚用化粧料と同様かそれ以上の効果を示す。
すなわち、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、防腐性を備えたものとなる。
すなわち、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記（５）に記載の皮膚用化粧料は、防腐性を備えたものとなる。
本発明では、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液や産生物質を使用する。そのため、以下では、〔１〕バークホルデリア・コンタミナンスを培養する培地、〔２〕バークホルデリア・コンタミナンスを培養して得た培養液、〔３〕かかる培養液から得たバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質、〔４〕かかる産生物質から得たオシディオフンジンの順で説明する。
なお、本発明において「％」とは、特に断らない限り「質量％」を意味する。また、本発明において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
〔１．培地〕
バークホルデリア・コンタミナンスを培養する培地としては、一般的な培地を使用すれば良く、取扱い易さから液体培地であることが好ましい。
例えば、日本製薬株式会社製のＳＣＤ培地（Soybean-Casein Digest Broth）製品を使用する場合、同製品は、カゼインペプトン（１７g/L）、大豆ペプトン（３g/L）、リン酸一水素二カリウム（２．５g/L）、グルコース（２．５g/L）、塩化ナトリウム（５g/L）などによって構成されているため、この製品に精製水１Ｌを加えて溶解した後、高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃×１５分間程度の条件で滅菌して、液体のＳＣＤ培地を作成することができる。
バークホルデリア・コンタミナンスを培養する培地としては、一般的な培地を使用すれば良く、取扱い易さから液体培地であることが好ましい。
例えば、日本製薬株式会社製のＳＣＤ培地（Soybean-Casein Digest Broth）製品を使用する場合、同製品は、カゼインペプトン（１７g/L）、大豆ペプトン（３g/L）、リン酸一水素二カリウム（２．５g/L）、グルコース（２．５g/L）、塩化ナトリウム（５g/L）などによって構成されているため、この製品に精製水１Ｌを加えて溶解した後、高圧蒸気滅菌装置を用いて１２１℃×１５分間程度の条件で滅菌して、液体のＳＣＤ培地を作成することができる。
〔２．培養液〕
バークホルデリア・コンタミナンスの培養は、例えば、上記の液体のＳＣＤ培地（２５０mL）にバークホルデリア・コンタミナンス（１０３cfu/mL）を接種し、３０℃の恒温環境下で３日間静置培養すればよい。このようにして得られたバークホルデリア・コンタミナンスの菌体を含む液体培地から、遠心分離やろ過によって菌体を分離除去することで、本発明における培養液（上清）を得ることができる。
バークホルデリア・コンタミナンスの培養は、例えば、上記の液体のＳＣＤ培地（２５０mL）にバークホルデリア・コンタミナンス（１０３cfu/mL）を接種し、３０℃の恒温環境下で３日間静置培養すればよい。このようにして得られたバークホルデリア・コンタミナンスの菌体を含む液体培地から、遠心分離やろ過によって菌体を分離除去することで、本発明における培養液（上清）を得ることができる。
例えば、菌体を含む液体培地を、品温を４℃に維持しながら、相対遠心加速度１０，０００Ｇで３０分間の遠心分離を行い上清と沈殿物とに分け、得られた上清をメンブランフィルター（孔径０．２２μm）でろ過することにより、本発明におけるバークホルデリア・コンタミナンスの培養液（以下、「培養液Ａ」と称する。）を作成することができる。
以上の操作によって得られたバークホルデリア・コンタミナンスの培養液Ａは、抗真菌性を示すことから、オシディオフンジンが１μg/mL以上の濃度で存在していると考えられる。
〔３．産生物質〕
上記の培養液Ａから産生物質を抽出する方法の一例について説明する。
培養液Ａの適量（例えば５０g）を秤取し、これに硫酸アンモニウム（１５g）を添加して、約０℃に冷却しながら２時間ほど撹拌・混合する。得られた混合物を、品温を５℃程度に調整して相対遠心加速度１０，０００Ｇで２０分間の遠心分離を行い、上澄み液と沈殿物に分離させる。上澄み液は廃棄し、その沈殿物に濃度３５％のアセトニトリル（約１．５mL）を添加して混練し、沈殿物を溶解させる。得られた溶液を、孔径０．２２μmのメンブランフィルターを用いて濾過すると、バークホルデリア・コンタミナンスの産生物質を含むアセトニトリル溶液（約８mL）を得ることができる。次に、高速液体クロマトグラフ装置を用いて、上記のアセトニトリル溶液からバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質（以下、「産生物質Ｂ」と称する。）を分取すれば良い。
上記の培養液Ａから産生物質を抽出する方法の一例について説明する。
培養液Ａの適量（例えば５０g）を秤取し、これに硫酸アンモニウム（１５g）を添加して、約０℃に冷却しながら２時間ほど撹拌・混合する。得られた混合物を、品温を５℃程度に調整して相対遠心加速度１０，０００Ｇで２０分間の遠心分離を行い、上澄み液と沈殿物に分離させる。上澄み液は廃棄し、その沈殿物に濃度３５％のアセトニトリル（約１．５mL）を添加して混練し、沈殿物を溶解させる。得られた溶液を、孔径０．２２μmのメンブランフィルターを用いて濾過すると、バークホルデリア・コンタミナンスの産生物質を含むアセトニトリル溶液（約８mL）を得ることができる。次に、高速液体クロマトグラフ装置を用いて、上記のアセトニトリル溶液からバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質（以下、「産生物質Ｂ」と称する。）を分取すれば良い。
上記の操作によって得られる産生物質Ｂの成分を高速液体クロマトグラフ質量分析器（ＬＣ−ＭＳ）によって測定した。その際の操作条件は次のａ〜ｄのとおりである。
ａ）HPLC：株式会社島津製作所製 LC-2030C 3D，LCMS-2020
ｂ）カラム：Discovery（登録商標）HS F5-5，5μm，20mm×2.1mm
ｃ）流速：０．２５mL/min
ｄ）溶媒：アセトニトニル／０．１％ギ酸水
０min：アセトニトニル０％
５min：アセトニトニル２５％
１１min：アセトニトニル３５％
１５min：アセトニトニル９５％
ａ）HPLC：株式会社島津製作所製 LC-2030C 3D，LCMS-2020
ｂ）カラム：Discovery（登録商標）HS F5-5，5μm，20mm×2.1mm
ｃ）流速：０．２５mL/min
ｄ）溶媒：アセトニトニル／０．１％ギ酸水
０min：アセトニトニル０％
５min：アセトニトニル２５％
１１min：アセトニトニル３５％
１５min：アセトニトニル９５％
その結果、図１に示すように、産生物質Ｂのクロマトグラムにおいて大きく現れるピークの位置と分子量は、上記の非特許文献２（Biochemical and Biophysical Research Communications 380 (2009) 328-332）の３３１頁の右欄の「Isolation of antifungal compound production by strain MS14」及び「Fig4」に記載されているオシディオフンジンのピークの位置と分子量（１２００．６、１２１６．６）に一致することが確認された。
そのため、上記のバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質には、オシディオフンジンが高濃度で含まれていることが分かった。
そのため、上記のバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質には、オシディオフンジンが高濃度で含まれていることが分かった。
〔４．オシディオフンジン〕
上記の産生物質Ｂからオシディオフンジンを分取する方法の一例について説明する。
産生物質Ｂ（１９０mL）をエバポレーターで１．５mLになるまで濃縮して、ＳＰＥカートリッジヘッドにロードし、水とアセトニトリルを９：１の割合で混合した洗浄液（１０mL）で洗浄する。次に、洗浄後の産生物質Ｂを含む洗浄液（１０mL）を、エバポレーターで１．５mLになるまで濃縮して、洗浄液の濃縮物を得る。
上記の産生物質Ｂからオシディオフンジンを分取する方法の一例について説明する。
産生物質Ｂ（１９０mL）をエバポレーターで１．５mLになるまで濃縮して、ＳＰＥカートリッジヘッドにロードし、水とアセトニトリルを９：１の割合で混合した洗浄液（１０mL）で洗浄する。次に、洗浄後の産生物質Ｂを含む洗浄液（１０mL）を、エバポレーターで１．５mLになるまで濃縮して、洗浄液の濃縮物を得る。
この洗浄液の濃縮物から、高速液体クロマトグラフ装置（HPLC）を用いることによって、オシディオフンジンを分取することができる。その際の操作条件は次のａ〜ｄのとおりである。
ａ）HPLC：株式会社島津製作所製 LC-2030C
ｂ）カラム：InertSustain（登録商標）C18，3μm， 2.1 mm×150mm
ｃ）流速：０．２mL/min
ｄ）溶媒：０．１％ギ酸アセトニトニル／０．１％ギ酸水
０min：０．１％ギ酸アセトニトニル１０％
１min：０．１％ギ酸アセトニトニル１０％
１５min：０．１％ギ酸アセトニトニル９０％
３０min：０．１％ギ酸アセトニトニル９０％
ａ）HPLC：株式会社島津製作所製 LC-2030C
ｂ）カラム：InertSustain（登録商標）C18，3μm， 2.1 mm×150mm
ｃ）流速：０．２mL/min
ｄ）溶媒：０．１％ギ酸アセトニトニル／０．１％ギ酸水
０min：０．１％ギ酸アセトニトニル１０％
１min：０．１％ギ酸アセトニトニル１０％
１５min：０．１％ギ酸アセトニトニル９０％
３０min：０．１％ギ酸アセトニトニル９０％
図４に示すように、上記洗浄液の濃縮物のクロマトグラムにおける１２．１３分の位置のピークは、オシディオフンジン（分子量１２１６．６）によるものである。かかるオシディオフンジンは、水とアセトニトリルを適宜割合で混合した洗浄液を用いてカラムから溶離した後、エバポレーターで液体を蒸発させることによって、固体のオシディオフンジン（４．８mg）として得ることができる。
〔試験例〕
本発明者は、上記の作成例で作ったバークホルデリア・コンタミナンスの培養液Ａについて、以下の試験を行い、その効果を確認することができた。そのため、この培養液Ａは、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する原料の一つとして配合することもできる。さらに、培養液Ａを皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
本発明者は、上記の作成例で作ったバークホルデリア・コンタミナンスの培養液Ａについて、以下の試験を行い、その効果を確認することができた。そのため、この培養液Ａは、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する原料の一つとして配合することもできる。さらに、培養液Ａを皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
《試験例１》 培養液Ａの使用試験
（イ）試験方法
熟練した官能試験技術者４名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体に培養液Ａを塗布し、５分間経過させ、その前後における各人の感覚を５点満点（１点〜５点）で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「１点：感じない、２点：どちらでもない、３点：やや感じる、４点：感じる、５点：とても感じる」とした。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を用いた。
（イ）試験方法
熟練した官能試験技術者４名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体に培養液Ａを塗布し、５分間経過させ、その前後における各人の感覚を５点満点（１点〜５点）で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「１点：感じない、２点：どちらでもない、３点：やや感じる、４点：感じる、５点：とても感じる」とした。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を用いた。
（ロ）試験結果
試験結果は、表１に示すとおりである。
試験結果は、表１に示すとおりである。
（ロ）所見
上記の試験結果から、培養液Ａは、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
上記の試験結果から、培養液Ａは、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
《試験例２》 培養液Ａを塗布した皮膚の機能測定試験
（イ）試験方法
３０歳代の女性１名を被験者とし、前腕の全体を石けんで洗って汗や汚れを除去した後、直ちに恒温恒湿室（室温２１．０±０．２℃、湿度４５．０±０．５％）に入って２０分間馴化させてから、最初の皮膚の機能測定を行った。
その後、培養液Ａを被験者の前腕内部に塗布し，時間の経過を追って皮膚の機能の変化を測定した。
皮膚の機能測定は、皮膚の乾燥度合いを評価するためコルネオメーター（Corneometer：Khazaka社製）を用いて「角層水分量」を、皮膚のバリア機能を評価するためテヴァメーター（Tewameter：Khazaka社製）を用いて「経皮水分蒸散量」を、皮膚の弾力性を評価するためキュートメーター（Cutometer：Khazaka社製）を用いて「皮膚粘弾性」（皮膚の柔らかさと皮膚のハリ）を、それぞれ３回ずつ測定し、その平均値を算出した。
さらに、最初の測定値（培養液Ａを塗布する前）を１００としたときの時間の経過による相対値を経過時間ごとに算定した。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を用いた。
（イ）試験方法
３０歳代の女性１名を被験者とし、前腕の全体を石けんで洗って汗や汚れを除去した後、直ちに恒温恒湿室（室温２１．０±０．２℃、湿度４５．０±０．５％）に入って２０分間馴化させてから、最初の皮膚の機能測定を行った。
その後、培養液Ａを被験者の前腕内部に塗布し，時間の経過を追って皮膚の機能の変化を測定した。
皮膚の機能測定は、皮膚の乾燥度合いを評価するためコルネオメーター（Corneometer：Khazaka社製）を用いて「角層水分量」を、皮膚のバリア機能を評価するためテヴァメーター（Tewameter：Khazaka社製）を用いて「経皮水分蒸散量」を、皮膚の弾力性を評価するためキュートメーター（Cutometer：Khazaka社製）を用いて「皮膚粘弾性」（皮膚の柔らかさと皮膚のハリ）を、それぞれ３回ずつ測定し、その平均値を算出した。
さらに、最初の測定値（培養液Ａを塗布する前）を１００としたときの時間の経過による相対値を経過時間ごとに算定した。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を用いた。
（ロ）試験結果
ａ）角層水分量の推移
角層水分量は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布１５分後には１３２（コントロールは１２７）を示し、塗布３０分後には１２９（コントロールは１２６）を示した。
角層水分量は、数値が大きいほど皮膚が潤っているといえる。
ａ）角層水分量の推移
角層水分量は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布１５分後には１３２（コントロールは１２７）を示し、塗布３０分後には１２９（コントロールは１２６）を示した。
角層水分量は、数値が大きいほど皮膚が潤っているといえる。
ｂ）経皮水分蒸散量の推移
経皮水分蒸散量は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布６０分後には９２（コントロールは１０８）を示した。
経皮水分蒸散量は、数値が小さいほど皮膚表面からの水分の蒸散量が少なく、皮膚のバリア機能が高いといえる。
経皮水分蒸散量は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布６０分後には９２（コントロールは１０８）を示した。
経皮水分蒸散量は、数値が小さいほど皮膚表面からの水分の蒸散量が少なく、皮膚のバリア機能が高いといえる。
ｃ）皮膚粘弾性（皮膚の柔らかさ）の推移
皮膚粘弾性（皮膚の柔らかさ）は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布５分後には１１８（コントロールは１０１）を示した。
皮膚粘弾性（皮膚の柔らかさ）は、数値が大きいほど皮膚が柔らかいといえる。
皮膚粘弾性（皮膚の柔らかさ）は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布５分後には１１８（コントロールは１０１）を示した。
皮膚粘弾性（皮膚の柔らかさ）は、数値が大きいほど皮膚が柔らかいといえる。
ｄ）皮膚粘弾性（皮膚のハリ）の推移
皮膚粘弾性（皮膚のハリ）は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布１５分後には１０７（コントロールは１００のまま）を示し、塗布３０分後には１１２（コントロールは１０１）を示した。
皮膚粘弾性（皮膚のハリ）は、数値が大きいほど皮膚の弾力性が強いといえる。
皮膚粘弾性（皮膚のハリ）は、培養液Ａの塗布前を１００としたとき、塗布１５分後には１０７（コントロールは１００のまま）を示し、塗布３０分後には１１２（コントロールは１０１）を示した。
皮膚粘弾性（皮膚のハリ）は、数値が大きいほど皮膚の弾力性が強いといえる。
（ハ）所見：
上記の試験結果から、培養液Ａを皮膚に塗布すると、皮膚が潤うと共に皮膚のバリア機能が向上し、皮膚が柔らかくなり、皮膚のハリ具合が強くなることが確認できた。
上記の試験結果から、培養液Ａを皮膚に塗布すると、皮膚が潤うと共に皮膚のバリア機能が向上し、皮膚が柔らかくなり、皮膚のハリ具合が強くなることが確認できた。
一般に、メラニンは色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって形成される。そのため、色黒い皮膚や皮膚のシミ・そばかすなどを予防・改善するためには、メラニンの産生に関与するチロシナーゼの活性を阻害することが効果的である。
本発明者は、培養液Ａについてチロシナーゼの活性を阻害する作用の有無を確認する試験を行った。
本発明者は、培養液Ａについてチロシナーゼの活性を阻害する作用の有無を確認する試験を行った。
《試験例３》 細胞内チロシナーゼ活性阻害作用確認試験
（イ）被験物質の調製
ａ）被験物質として培養液Ａを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を使用した。
ｂ）被験物質の溶媒は、Phosphate buffer saline （ＰＢＳ）を用いた。
ｃ）被験物質は、濃度１００％から公比２倍で連続希釈して合計８濃度のもの（０．７８％、１．５６％、３．１３％、６．２５％、１２．５％。２５．０％、５０．０％、１００．０％の８種類）を調製した。
（イ）被験物質の調製
ａ）被験物質として培養液Ａを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を使用した。
ｂ）被験物質の溶媒は、Phosphate buffer saline （ＰＢＳ）を用いた。
ｃ）被験物質は、濃度１００％から公比２倍で連続希釈して合計８濃度のもの（０．７８％、１．５６％、３．１３％、６．２５％、１２．５％。２５．０％、５０．０％、１００．０％の８種類）を調製した。
（ロ）試験方法
ａ）９６ウエルプレートに１ウエル当り９．９×１０３cells／９９μLのＢ１６メラノーマ細胞を播種し、Ｃ０２インキュベータ内で２４時間培養した。また、プレートは２枚作成し、１枚を細胞生存率測定用に、他の１枚を細胞内チロシナーゼ活性測定用とした。
ｂ）培養２４時間後に、上記の被検物質を各ウエルに１μL添加して、終濃度をそれぞれ、０．００７８％、０．０１５６％、０．０３１３％、０．０６２５％、０．１２５％。０．２５％、０．５％、１．０％として、Ｃ０２インキュベータ内で７２時間培養した。また，各被験物質は３ウエル使用し、ブランクはＰＢＳを用いた。
ｃ）培養７２時間後、細胞生存率測定用のプレートにCell Counting Kit−８を１０μL添加し、Ｃ０２インキュベータ内で２時間培養した。
ｄ）培養２時間後、９６ウエルプレートを２７０rpmで５秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０nmの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
ｅ）細胞内チロシナーゼ活性測定用のプレートの培地を除去し、２００μLのＰＢＳにて１回洗浄した。
ｆ）９６ウエルプレートの各ウエルに０．５％Triton X−１００含有ＰＢＳを９０μL加え、１０mML-DOPA溶液を１０μL添加した。
ｇ）添加直後（０分後）に９６ウエルプレートを２７０rpmで５秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて４７５nmの吸光度（ＯＤ４７５）を測定した。
ｈ）９６ウエルプレートをＣ０２インキュベータ内で６０分間静置した後、再度ＯＤ４７５を測定した（６０分後）。
ｉ）ＯＤ４５０から被験物質の細胞生存率を求めた。ＯＤ４７５の０分後と６０分後の差分から細胞内チロシナーゼ活性を求めた（ΔＯＤ４７５）。また、ΔＯＤ４７５／ＯＤ４５０から細胞当りの細胞内チロシナーゼ活性を求めた。
ａ）９６ウエルプレートに１ウエル当り９．９×１０３cells／９９μLのＢ１６メラノーマ細胞を播種し、Ｃ０２インキュベータ内で２４時間培養した。また、プレートは２枚作成し、１枚を細胞生存率測定用に、他の１枚を細胞内チロシナーゼ活性測定用とした。
ｂ）培養２４時間後に、上記の被検物質を各ウエルに１μL添加して、終濃度をそれぞれ、０．００７８％、０．０１５６％、０．０３１３％、０．０６２５％、０．１２５％。０．２５％、０．５％、１．０％として、Ｃ０２インキュベータ内で７２時間培養した。また，各被験物質は３ウエル使用し、ブランクはＰＢＳを用いた。
ｃ）培養７２時間後、細胞生存率測定用のプレートにCell Counting Kit−８を１０μL添加し、Ｃ０２インキュベータ内で２時間培養した。
ｄ）培養２時間後、９６ウエルプレートを２７０rpmで５秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０nmの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
ｅ）細胞内チロシナーゼ活性測定用のプレートの培地を除去し、２００μLのＰＢＳにて１回洗浄した。
ｆ）９６ウエルプレートの各ウエルに０．５％Triton X−１００含有ＰＢＳを９０μL加え、１０mML-DOPA溶液を１０μL添加した。
ｇ）添加直後（０分後）に９６ウエルプレートを２７０rpmで５秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて４７５nmの吸光度（ＯＤ４７５）を測定した。
ｈ）９６ウエルプレートをＣ０２インキュベータ内で６０分間静置した後、再度ＯＤ４７５を測定した（６０分後）。
ｉ）ＯＤ４５０から被験物質の細胞生存率を求めた。ＯＤ４７５の０分後と６０分後の差分から細胞内チロシナーゼ活性を求めた（ΔＯＤ４７５）。また、ΔＯＤ４７５／ＯＤ４５０から細胞当りの細胞内チロシナーゼ活性を求めた。
（ハ）試験結果
試験結果は、図２に示すとおりである。
すなわち、図２から、培養液Ａの濃度０．２５％〜１％の範囲内でＢ１６メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性が有意に低下していることが確認できた。
試験結果は、図２に示すとおりである。
すなわち、図２から、培養液Ａの濃度０．２５％〜１％の範囲内でＢ１６メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性が有意に低下していることが確認できた。
（二）所見
上記の試験結果から、濃度０．２５％〜１％の培養液Ａは、Ｂ１６メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性を有意に低下させるので、メラニンの産生を抑制する働きをすることが理解できる。
上記の試験結果から、濃度０．２５％〜１％の培養液Ａは、Ｂ１６メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性を有意に低下させるので、メラニンの産生を抑制する働きをすることが理解できる。
一般に、酸化力の強い活性酸素等のフリーラジカルが生体組織や細胞の障害を引き起こし、皮膚の老化の原因となることが知られている。そのため、化粧料原料は、フリーラジカルの発生や作用を抑制・消去するための抗酸化力が優れているものが好ましい。
本発明者らは、培養液Ａについて、ＤＰＰＨ（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）
を用いて フリーラジカルの消去作用の有無を確認する試験を行った。
ＤＰＰＨは、ラジカル状態で５１７nmの極大吸収を有する化合物であり、ＤＰＰＨ消去率とは、ＤＰＰＨに抗酸化物質を添加して還元したときの、ＤＰＰＨの５１７nmにおける吸光度の減少率であり、この値によって抗酸化物質の抗酸化能を評価できる。すなわち、ＤＰＰＨ消去率が大きいほど抗酸化能が高いことを示す。
本発明者らは、培養液Ａについて、ＤＰＰＨ（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）
を用いて フリーラジカルの消去作用の有無を確認する試験を行った。
ＤＰＰＨは、ラジカル状態で５１７nmの極大吸収を有する化合物であり、ＤＰＰＨ消去率とは、ＤＰＰＨに抗酸化物質を添加して還元したときの、ＤＰＰＨの５１７nmにおける吸光度の減少率であり、この値によって抗酸化物質の抗酸化能を評価できる。すなわち、ＤＰＰＨ消去率が大きいほど抗酸化能が高いことを示す。
《試験例４》 フリーラジカル消去作用確認試験
（イ）被験物質の調製
ａ）被験物質として培養液Ａを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を使用した。
ｂ）被験物質は、濃度１００％から公比１０倍で連続希釈して合計６濃度のもの（０．００１％、０．０１％、０．１％，１．０％、１０．０％、１００．０％の６種類）を調製した。
（イ）被験物質の調製
ａ）被験物質として培養液Ａを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のＳＣＤ培地を使用した。
ｂ）被験物質は、濃度１００％から公比１０倍で連続希釈して合計６濃度のもの（０．００１％、０．０１％、０．１％，１．０％、１０．０％、１００．０％の６種類）を調製した。
（ロ）試薬の調製
ａ）３．１mgのＤＰＰＨ溶液を５０mLのエタノールに溶解させ、０．１６mMのＤＰＰＨ溶液を調製し、これを、さらにエタノールにより２０倍に希釈して０．００８mMのＤＰＰＨ溶液に調整して試験に用いた。
ｂ）１．４４mLの酢酸を精製水で溶解し、１００mLにメスアップした。また、２．０５gの酢酸ナトリウムを精製水で溶解し、１００mLにメスアップした。この酢酸溶液と酢酸ナトリウム溶液を１：８で混合し、０．２５M酢酸Bufferを調製し、ｐＨメータによりｐＨが５．５であることを確認した。
ａ）３．１mgのＤＰＰＨ溶液を５０mLのエタノールに溶解させ、０．１６mMのＤＰＰＨ溶液を調製し、これを、さらにエタノールにより２０倍に希釈して０．００８mMのＤＰＰＨ溶液に調整して試験に用いた。
ｂ）１．４４mLの酢酸を精製水で溶解し、１００mLにメスアップした。また、２．０５gの酢酸ナトリウムを精製水で溶解し、１００mLにメスアップした。この酢酸溶液と酢酸ナトリウム溶液を１：８で混合し、０．２５M酢酸Bufferを調製し、ｐＨメータによりｐＨが５．５であることを確認した。
（ハ）試験方法
ａ）９６ウエルプレートに被験物質を２０μL加えた。被験物質ウエルは２群用意し、一方をＤＰＰＨ（＋）、もう一方をＤＰＰＨ（−）とした。
ｂ）ＤＰＰＨ（＋）ウエルにエタノールを６０μL添加した。また、ＤＰＰＨ（−）ウエルにはエタノールを１００μL添加した。
ｃ）全てのウエルに０．２５M酢酸Bufferを８０μL添加し、９６ウエルプレートにプレートシールを貼付した後、３０℃で５分間インキュベートした。
ｄ）５分後、ＤＰＰＨ（＋）ウエルにＤＰＰＨ溶液を４０μL添加し、プレートミキサーを用いて３０秒撹拌した。撹拌後、３０℃で２０分間反応させた。
ｅ）２０分後、マイクロプレートリーダーで５１７nmの吸光度（ＯＤ５１７）を測定した。
ｆ）得られたＯＤ５１７を用いてコントロールに対する培養液ＡのＤＰＰＨ消去率を算出した。
ａ）９６ウエルプレートに被験物質を２０μL加えた。被験物質ウエルは２群用意し、一方をＤＰＰＨ（＋）、もう一方をＤＰＰＨ（−）とした。
ｂ）ＤＰＰＨ（＋）ウエルにエタノールを６０μL添加した。また、ＤＰＰＨ（−）ウエルにはエタノールを１００μL添加した。
ｃ）全てのウエルに０．２５M酢酸Bufferを８０μL添加し、９６ウエルプレートにプレートシールを貼付した後、３０℃で５分間インキュベートした。
ｄ）５分後、ＤＰＰＨ（＋）ウエルにＤＰＰＨ溶液を４０μL添加し、プレートミキサーを用いて３０秒撹拌した。撹拌後、３０℃で２０分間反応させた。
ｅ）２０分後、マイクロプレートリーダーで５１７nmの吸光度（ＯＤ５１７）を測定した。
ｆ）得られたＯＤ５１７を用いてコントロールに対する培養液ＡのＤＰＰＨ消去率を算出した。
（ニ）試験結果
試験結果は、図３に示すとおりである。なお、グラフの縦軸（ＤＰＰＨ消去）は、コントロール（ＳＣＤ培地）によるＤＰＰＨの消去率を０％としたときの被験物質の消去率の相対値（％）である。
図３から、培養液Ａの濃度０．００１％から１００．０％の範囲内で、ＤＰＰＨの消去能力が高いことが確認できた。
試験結果は、図３に示すとおりである。なお、グラフの縦軸（ＤＰＰＨ消去）は、コントロール（ＳＣＤ培地）によるＤＰＰＨの消去率を０％としたときの被験物質の消去率の相対値（％）である。
図３から、培養液Ａの濃度０．００１％から１００．０％の範囲内で、ＤＰＰＨの消去能力が高いことが確認できた。
（ホ）所見
上記の試験結果から、濃度０．００１％〜１００．０％の培養液Ａは、抗酸化性を有すると認めることができ、皮膚のしわやシミの発生を抑制する働きをすることが理解できる。
上記の試験結果から、濃度０．００１％〜１００．０％の培養液Ａは、抗酸化性を有すると認めることができ、皮膚のしわやシミの発生を抑制する働きをすることが理解できる。
《試験例５》 オシディオフンジンの使用試験
上記の産生物質Ｂからオシディオフンジンを分取する方法によって得られたオシディオフンジンを、水に溶解して０．００２%水溶液を作成し、これを皮膚に塗布する使用試験を行った。
上記の産生物質Ｂからオシディオフンジンを分取する方法によって得られたオシディオフンジンを、水に溶解して０．００２%水溶液を作成し、これを皮膚に塗布する使用試験を行った。
（イ）試験方法
熟練した官能試験技術者４名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体にオシディオフンジン水溶液を塗布し、５分間経過させ、その前後における各人の感覚を５点満点（１点〜５点）で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「１点：感じない、２点：やや感じない、３点：どちらでもない、４点：やや感じる、５点：感じる」とした。
なお、コントロールには水を用いた。
熟練した官能試験技術者４名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体にオシディオフンジン水溶液を塗布し、５分間経過させ、その前後における各人の感覚を５点満点（１点〜５点）で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「１点：感じない、２点：やや感じない、３点：どちらでもない、４点：やや感じる、５点：感じる」とした。
なお、コントロールには水を用いた。
（ロ）試験結果
試験結果は、表２に示すとおりである。
試験結果は、表２に示すとおりである。
（ロ）所見
上記の試験結果から、オシディオフンジン水溶液は、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
したがって、オシディオフンジン水溶液は、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する物質の一つとして配合することもできる。さらに、オシディオフンジン水溶液を皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
上記の試験結果から、オシディオフンジン水溶液は、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
したがって、オシディオフンジン水溶液は、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する物質の一つとして配合することもできる。さらに、オシディオフンジン水溶液を皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
《実施例１》
上記のオシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの培養液（培養液Ａ）を配合してある化粧料用原料を製造した。
表３に示す配合量の精製水と培養液Ａを攪拌混合し、さらに1,3ブチレングリコールを加えて攪拌混合することで化粧料用原料を得た。
上記のオシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの培養液（培養液Ａ）を配合してある化粧料用原料を製造した。
表３に示す配合量の精製水と培養液Ａを攪拌混合し、さらに1,3ブチレングリコールを加えて攪拌混合することで化粧料用原料を得た。
得られた化粧料用原料は、皮膚になじみやすく、塗布した後の皮膚が滑らかになり、また、皮膚の柔らかさやすべすべ感、しっとり感を向上させるものであった。
また、得られた化粧料用原料は、培養液Ａを５０％含むものであるため、上記の試験例３の結果（培養液Ａは濃度０．２５％〜１％で細胞内チロシナーゼ活性を低下させる。）から明らかなとおり、細胞内チロシナーゼ活性を阻害して皮膚の美白効果を奏するものである。
さらに、かかる化粧料用原料は、上記の試験例４の結果（培養液Ａは濃度０．００１％〜１００％でＤＰＰＨ消去能力が高い。）から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
さらに、かかる化粧料用原料は、上記の試験例４の結果（培養液Ａは濃度０．００１％〜１００％でＤＰＰＨ消去能力が高い。）から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
また、得られた化粧料用原料を、ガラス製の容器に封入して常温で１ヵ月間保管したが、腐敗することなく、品質の低下は見られなかった。
《実施例２》
上記の実施例１の方法で得られた化粧料用原料を配合してある皮膚用化粧料を製造した。
表４に示す配合量の精製水にポリオキシエチレン（POE＝６０）硬化ヒマシ油を入れ攪拌溶解させた後、クエン酸およびクエン酸三ナトリウムを加え攪拌溶解させ、その後表３に示す他の原料を加えて攪拌溶解させて皮膚用化粧料を得た。
上記の実施例１の方法で得られた化粧料用原料を配合してある皮膚用化粧料を製造した。
表４に示す配合量の精製水にポリオキシエチレン（POE＝６０）硬化ヒマシ油を入れ攪拌溶解させた後、クエン酸およびクエン酸三ナトリウムを加え攪拌溶解させ、その後表３に示す他の原料を加えて攪拌溶解させて皮膚用化粧料を得た。
得られた皮膚用化粧料は、皮膚になじみやすく、塗布した後の皮膚が滑らかになり、また、皮膚の柔らかさやすべすべ感、しっとり感を向上させるものであった。
また、得られた皮膚用化粧料は、上記実施例１で得られた化粧料用原料を１％配合してあることから上記培養液Ａを０．５％含むものであるため、上記の試験例３の結果（培養液Ａは濃度０．２５％〜１％で細胞内チロシナーゼ活性を低下させる。）から明らかなとおり、細胞内チロシナーゼ活性を阻害して皮膚の美白効果を奏するものである。
さらに、かかる皮膚用化粧料は、上記の試験例４の結果（培養液Ａは濃度０．００１％〜１００％でＤＰＰＨ消去能力が高い。）から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
さらに、かかる皮膚用化粧料は、上記の試験例４の結果（培養液Ａは濃度０．００１％〜１００％でＤＰＰＨ消去能力が高い。）から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
また、得られた皮膚用化粧料を、ガラス製の容器に封入して常温で１ヵ月間保管したが、腐敗することなく、品質の低下は見られなかった。
本発明に係る化粧料用原料と皮膚用化粧料は、皮膚のハリ具合の改善や皮膚のしわ・シミの発生を抑制することができるので、主に美容分野において利用されるものである。
Claims (5)
- オシディオフンジン（occidiofungin）を含むバークホルデリア・コンタミナンス（Burkholderia contaminans）の培養液からなるか又はその培養液を配合してあることを特徴とする化粧料用原料。
- オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質であるか又はその産生物質を含有させてあることを特徴とする化粧料用原料。
- オシディオフンジンであるか又はオシディオフンジンを含有させてあることを特徴とする化粧料用原料。
- 請求項１から請求項３のいずれかに記載の化粧料用原料を含有させてあることを特徴とする皮膚用化粧料。
- 請求項１から請求項３のいずれかに記載の化粧料用原料を主原料としてなることを特徴とする皮膚用化粧料。
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