JP2021176892A - 皮膚用化粧料用原料とこれを配合してなる皮膚用化粧料 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、かかる化粧料用基材を皮膚に塗布すると、角層水分量が増加するので、皮膚が潤うと共に、経皮水分の蒸散量が抑制され、皮膚のバリア機能が増強する。そのため、皮膚の粘弾性が向上するので、皮膚が柔らかくなると共に、皮膚のハリ具合が改善される。すなわち、皮膚の柔らかさやすべすべ感、しっとり感が向上する。
このように、上記(1)に記載の化粧料用原料は、皮膚用化粧料の原料として極めて有用である。
すなわち、上記(4)に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記(4)に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記(4)に記載の皮膚用化粧料は防腐性を備えたものとなる。
すなわち、上記(5)に記載の皮膚用化粧料は、極めて使用しやすい上、これを使用し続けると、皮膚の細胞内チロシナーゼ活性が低下し、メラニンの生成を抑制するので、皮膚に美白効果が生じる。また、かかる皮膚用化粧料は抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制できる。このように、上記(5)に記載の皮膚用化粧料は、皮膚の改善や光老化防止のために、極めて有用である。
さらに、バークホルデリア・コンタミナンスの培養液及び産生物質は、オシディオフンジンを含有しており抗真菌性を有するので、上記(5)に記載の皮膚用化粧料は、防腐性を備えたものとなる。
バークホルデリア・コンタミナンスを培養する培地としては、一般的な培地を使用すれば良く、取扱い易さから液体培地であることが好ましい。
例えば、日本製薬株式会社製のSCD培地(Soybean-Casein Digest Broth)製品を使用する場合、同製品は、カゼインペプトン(17g/L)、大豆ペプトン(3g/L)、リン酸一水素二カリウム(2.5g/L)、グルコース(2.5g/L)、塩化ナトリウム(5g/L)などによって構成されているため、この製品に精製水1Lを加えて溶解した後、高圧蒸気滅菌装置を用いて121℃×15分間程度の条件で滅菌して、液体のSCD培地を作成することができる。
バークホルデリア・コンタミナンスの培養は、例えば、上記の液体のSCD培地(250mL)にバークホルデリア・コンタミナンス(103cfu/mL)を接種し、30℃の恒温環境下で3日間静置培養すればよい。このようにして得られたバークホルデリア・コンタミナンスの菌体を含む液体培地から、遠心分離やろ過によって菌体を分離除去することで、本発明における培養液(上清)を得ることができる。
上記の培養液Aから産生物質を抽出する方法の一例について説明する。
培養液Aの適量(例えば50g)を秤取し、これに硫酸アンモニウム(15g)を添加して、約0℃に冷却しながら2時間ほど撹拌・混合する。得られた混合物を、品温を5℃程度に調整して相対遠心加速度10,000Gで20分間の遠心分離を行い、上澄み液と沈殿物に分離させる。上澄み液は廃棄し、その沈殿物に濃度35%のアセトニトリル(約1.5mL)を添加して混練し、沈殿物を溶解させる。得られた溶液を、孔径0.22μmのメンブランフィルターを用いて濾過すると、バークホルデリア・コンタミナンスの産生物質を含むアセトニトリル溶液(約8mL)を得ることができる。次に、高速液体クロマトグラフ装置を用いて、上記のアセトニトリル溶液からバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質(以下、「産生物質B」と称する。)を分取すれば良い。
a)HPLC:株式会社島津製作所製 LC-2030C 3D,LCMS-2020
b)カラム:Discovery(登録商標)HS F5-5,5μm,20mm×2.1mm
c)流速:0.25mL/min
d)溶媒:アセトニトニル/0.1%ギ酸水
0min:アセトニトニル0%
5min:アセトニトニル25%
11min:アセトニトニル35%
15min:アセトニトニル95%
そのため、上記のバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質には、オシディオフンジンが高濃度で含まれていることが分かった。
上記の産生物質Bからオシディオフンジンを分取する方法の一例について説明する。
産生物質B(190mL)をエバポレーターで1.5mLになるまで濃縮して、SPEカートリッジヘッドにロードし、水とアセトニトリルを9:1の割合で混合した洗浄液(10mL)で洗浄する。次に、洗浄後の産生物質Bを含む洗浄液(10mL)を、エバポレーターで1.5mLになるまで濃縮して、洗浄液の濃縮物を得る。
a)HPLC:株式会社島津製作所製 LC-2030C
b)カラム:InertSustain(登録商標)C18,3μm, 2.1 mm×150mm
c)流速:0.2mL/min
d)溶媒:0.1%ギ酸アセトニトニル/0.1%ギ酸水
0min:0.1%ギ酸アセトニトニル10%
1min:0.1%ギ酸アセトニトニル10%
15min:0.1%ギ酸アセトニトニル90%
30min:0.1%ギ酸アセトニトニル90%
本発明者は、上記の作成例で作ったバークホルデリア・コンタミナンスの培養液Aについて、以下の試験を行い、その効果を確認することができた。そのため、この培養液Aは、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する原料の一つとして配合することもできる。さらに、培養液Aを皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
(イ)試験方法
熟練した官能試験技術者4名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体に培養液Aを塗布し、5分間経過させ、その前後における各人の感覚を5点満点(1点〜5点)で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「1点:感じない、2点:どちらでもない、3点:やや感じる、4点:感じる、5点:とても感じる」とした。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のSCD培地を用いた。
試験結果は、表1に示すとおりである。
上記の試験結果から、培養液Aは、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
(イ)試験方法
30歳代の女性1名を被験者とし、前腕の全体を石けんで洗って汗や汚れを除去した後、直ちに恒温恒湿室(室温21.0±0.2℃、湿度45.0±0.5%)に入って20分間馴化させてから、最初の皮膚の機能測定を行った。
その後、培養液Aを被験者の前腕内部に塗布し,時間の経過を追って皮膚の機能の変化を測定した。
皮膚の機能測定は、皮膚の乾燥度合いを評価するためコルネオメーター(Corneometer:Khazaka社製)を用いて「角層水分量」を、皮膚のバリア機能を評価するためテヴァメーター(Tewameter:Khazaka社製)を用いて「経皮水分蒸散量」を、皮膚の弾力性を評価するためキュートメーター(Cutometer:Khazaka社製)を用いて「皮膚粘弾性」(皮膚の柔らかさと皮膚のハリ)を、それぞれ3回ずつ測定し、その平均値を算出した。
さらに、最初の測定値(培養液Aを塗布する前)を100としたときの時間の経過による相対値を経過時間ごとに算定した。
なお、コントロールには、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のSCD培地を用いた。
a)角層水分量の推移
角層水分量は、培養液Aの塗布前を100としたとき、塗布15分後には132(コントロールは127)を示し、塗布30分後には129(コントロールは126)を示した。
角層水分量は、数値が大きいほど皮膚が潤っているといえる。
経皮水分蒸散量は、培養液Aの塗布前を100としたとき、塗布60分後には92(コントロールは108)を示した。
経皮水分蒸散量は、数値が小さいほど皮膚表面からの水分の蒸散量が少なく、皮膚のバリア機能が高いといえる。
皮膚粘弾性(皮膚の柔らかさ)は、培養液Aの塗布前を100としたとき、塗布5分後には118(コントロールは101)を示した。
皮膚粘弾性(皮膚の柔らかさ)は、数値が大きいほど皮膚が柔らかいといえる。
皮膚粘弾性(皮膚のハリ)は、培養液Aの塗布前を100としたとき、塗布15分後には107(コントロールは100のまま)を示し、塗布30分後には112(コントロールは101)を示した。
皮膚粘弾性(皮膚のハリ)は、数値が大きいほど皮膚の弾力性が強いといえる。
上記の試験結果から、培養液Aを皮膚に塗布すると、皮膚が潤うと共に皮膚のバリア機能が向上し、皮膚が柔らかくなり、皮膚のハリ具合が強くなることが確認できた。
本発明者は、培養液Aについてチロシナーゼの活性を阻害する作用の有無を確認する試験を行った。
(イ)被験物質の調製
a)被験物質として培養液Aを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のSCD培地を使用した。
b)被験物質の溶媒は、Phosphate buffer saline (PBS)を用いた。
c)被験物質は、濃度100%から公比2倍で連続希釈して合計8濃度のもの(0.78%、1.56%、3.13%、6.25%、12.5%。25.0%、50.0%、100.0%の8種類)を調製した。
a)96ウエルプレートに1ウエル当り9.9×103cells/99μLのB16メラノーマ細胞を播種し、C02インキュベータ内で24時間培養した。また、プレートは2枚作成し、1枚を細胞生存率測定用に、他の1枚を細胞内チロシナーゼ活性測定用とした。
b)培養24時間後に、上記の被検物質を各ウエルに1μL添加して、終濃度をそれぞれ、0.0078%、0.0156%、0.0313%、0.0625%、0.125%。0.25%、0.5%、1.0%として、C02インキュベータ内で72時間培養した。また,各被験物質は3ウエル使用し、ブランクはPBSを用いた。
c)培養72時間後、細胞生存率測定用のプレートにCell Counting Kit−8を10μL添加し、C02インキュベータ内で2時間培養した。
d)培養2時間後、96ウエルプレートを270rpmで5秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度(OD450)を測定した。
e)細胞内チロシナーゼ活性測定用のプレートの培地を除去し、200μLのPBSにて1回洗浄した。
f)96ウエルプレートの各ウエルに0.5%Triton X−100含有PBSを90μL加え、10mML-DOPA溶液を10μL添加した。
g)添加直後(0分後)に96ウエルプレートを270rpmで5秒間振盪し、マイクロプレートリーダーを用いて475nmの吸光度(OD475)を測定した。
h)96ウエルプレートをC02インキュベータ内で60分間静置した後、再度OD475を測定した(60分後)。
i)OD450から被験物質の細胞生存率を求めた。OD475の0分後と60分後の差分から細胞内チロシナーゼ活性を求めた(ΔOD475)。また、ΔOD475/OD450から細胞当りの細胞内チロシナーゼ活性を求めた。
試験結果は、図2に示すとおりである。
すなわち、図2から、培養液Aの濃度0.25%〜1%の範囲内でB16メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性が有意に低下していることが確認できた。
上記の試験結果から、濃度0.25%〜1%の培養液Aは、B16メラノーマ細胞内のチロシナーゼ活性を有意に低下させるので、メラニンの産生を抑制する働きをすることが理解できる。
本発明者らは、培養液Aについて、DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)
を用いて フリーラジカルの消去作用の有無を確認する試験を行った。
DPPHは、ラジカル状態で517nmの極大吸収を有する化合物であり、DPPH消去率とは、DPPHに抗酸化物質を添加して還元したときの、DPPHの517nmにおける吸光度の減少率であり、この値によって抗酸化物質の抗酸化能を評価できる。すなわち、DPPH消去率が大きいほど抗酸化能が高いことを示す。
(イ)被験物質の調製
a)被験物質として培養液Aを使用した。また、コントロールとして、バークホルデリア・コンタミナンスを接種していない液体のSCD培地を使用した。
b)被験物質は、濃度100%から公比10倍で連続希釈して合計6濃度のもの(0.001%、0.01%、0.1%,1.0%、10.0%、100.0%の6種類)を調製した。
a)3.1mgのDPPH溶液を50mLのエタノールに溶解させ、0.16mMのDPPH溶液を調製し、これを、さらにエタノールにより20倍に希釈して0.008mMのDPPH溶液に調整して試験に用いた。
b)1.44mLの酢酸を精製水で溶解し、100mLにメスアップした。また、2.05gの酢酸ナトリウムを精製水で溶解し、100mLにメスアップした。この酢酸溶液と酢酸ナトリウム溶液を1:8で混合し、0.25M酢酸Bufferを調製し、pHメータによりpHが5.5であることを確認した。
a)96ウエルプレートに被験物質を20μL加えた。被験物質ウエルは2群用意し、一方をDPPH(+)、もう一方をDPPH(−)とした。
b)DPPH(+)ウエルにエタノールを60μL添加した。また、DPPH(−)ウエルにはエタノールを100μL添加した。
c)全てのウエルに0.25M酢酸Bufferを80μL添加し、96ウエルプレートにプレートシールを貼付した後、30℃で5分間インキュベートした。
d)5分後、DPPH(+)ウエルにDPPH溶液を40μL添加し、プレートミキサーを用いて30秒撹拌した。撹拌後、30℃で20分間反応させた。
e)20分後、マイクロプレートリーダーで517nmの吸光度(OD517)を測定した。
f)得られたOD517を用いてコントロールに対する培養液AのDPPH消去率を算出した。
試験結果は、図3に示すとおりである。なお、グラフの縦軸(DPPH消去)は、コントロール(SCD培地)によるDPPHの消去率を0%としたときの被験物質の消去率の相対値(%)である。
図3から、培養液Aの濃度0.001%から100.0%の範囲内で、DPPHの消去能力が高いことが確認できた。
上記の試験結果から、濃度0.001%〜100.0%の培養液Aは、抗酸化性を有すると認めることができ、皮膚のしわやシミの発生を抑制する働きをすることが理解できる。
上記の産生物質Bからオシディオフンジンを分取する方法によって得られたオシディオフンジンを、水に溶解して0.002%水溶液を作成し、これを皮膚に塗布する使用試験を行った。
熟練した官能試験技術者4名について、それぞれの顔面の皮膚のほぼ全体にオシディオフンジン水溶液を塗布し、5分間経過させ、その前後における各人の感覚を5点満点(1点〜5点)で評価してもらい、その平均値を算出した。評価の基準は「1点:感じない、2点:やや感じない、3点:どちらでもない、4点:やや感じる、5点:感じる」とした。
なお、コントロールには水を用いた。
試験結果は、表2に示すとおりである。
上記の試験結果から、オシディオフンジン水溶液は、皮膚になじみやすく、使用後に皮膚に潤いが感じられ、皮膚がすべすべしてきしみが感じられない滑らかな状態になり、また、皮膚が柔らかくなることが理解できる。
したがって、オシディオフンジン水溶液は、そのまま皮膚用化粧料の原料として用いることができる。また、保湿剤や油分などと共に化粧料用原料を構成する物質の一つとして配合することもできる。さらに、オシディオフンジン水溶液を皮膚用化粧料の主原料として用いることもできる。
上記のオシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの培養液(培養液A)を配合してある化粧料用原料を製造した。
表3に示す配合量の精製水と培養液Aを攪拌混合し、さらに1,3ブチレングリコールを加えて攪拌混合することで化粧料用原料を得た。
さらに、かかる化粧料用原料は、上記の試験例4の結果(培養液Aは濃度0.001%〜100%でDPPH消去能力が高い。)から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
上記の実施例1の方法で得られた化粧料用原料を配合してある皮膚用化粧料を製造した。
表4に示す配合量の精製水にポリオキシエチレン(POE=60)硬化ヒマシ油を入れ攪拌溶解させた後、クエン酸およびクエン酸三ナトリウムを加え攪拌溶解させ、その後表3に示す他の原料を加えて攪拌溶解させて皮膚用化粧料を得た。
さらに、かかる皮膚用化粧料は、上記の試験例4の結果(培養液Aは濃度0.001%〜100%でDPPH消去能力が高い。)から明らかなとおり、抗酸化性を有するので、皮膚のしわやシミの発生を抑制する効果を奏するものである。
Claims (4)
- オシディオフンジンを含むバークホルデリア・コンタミナンスの産生物質であるか又はその産生物質を含有する皮膚用化粧料用原料。
- オシディオフンジンであるか又はオシディオフンジンを含有する皮膚用化粧料用原料。
- 請求項1又は請求項2に記載の皮膚用化粧料用原料を含有する皮膚用化粧料。
- 請求項1又は請求項2に記載の皮膚用化粧料用原料を主原料として含有する皮膚用化粧料。
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