JP2012528152A

JP2012528152A - バークホルデリア汚染菌株によって産生される独特の抗真菌糖ペプチドのオシジオファンジン

Info

Publication number: JP2012528152A
Application number: JP2012513041A
Authority: JP
Inventors: リュ、シエン; スミス、ジェームス、エル．; オースティン、フランク; グー、ギャンユ
Original assignee: ミシシッピーステートユニバーシティ
Priority date: 2009-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2012-11-12
Also published as: EP2435060B1; US20110136729A1; KR20120062644A; US20160008423A1; ES2757855T3; HUE047339T2; WO2010138173A1; PT2435060T; US10092622B2; DK2435060T3; PL2435060T3; CN102448481A; EP2435060A1; EP2435060A4

Abstract

【解決手段】本発明は、バークホルデリア汚染菌株によって生成され、動植物および当該化合物を生成する細菌菌株の真菌感染または疾患を予防または治療するために有用な、新規抗真菌性糖ペプチド化合物およびその塩に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願書類の相互参照
本出願書類は、２００９年５月２６日付で出願された米国暫定特許出願第６１／２１７，０２６の優先権を請求するものである。この暫定特許出願の全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。

政府支援に関する記載
本発明は、米農務省（ＵＳＤＡ）の共同研究教育普及局（ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＳｔａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，ａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ）から授与された０２０４３３２の政府支援により行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、真菌感染および疾患の予防または治療における、抗真菌化合物およびその治療上の利用の分野に関する。本発明は、動植物に対する薬学および農学的殺真菌薬としての新規抗真菌化合物の利用に関する。本発明はさらに、新規抗真菌化合物を産生する細菌菌株に関する。

本発明では、真菌感染を予防または治療するための新規抗真菌糖ペプチド化合物と、それに関連する少なくとも１つのアミノ酸残基を提供する。また本発明の好ましい実施形態では、真菌感染を治療または予防するための新規化合物とその塩から成る、薬学および農学的組成を提供する。本発明のさらなる実施形態では、前記新規抗真菌化合物を産生する新しい細菌菌株を提供する。

現在の抗真菌薬に耐性を示す病原体の有病率が高くなっていることを考えると、新しい抗真菌薬に対する需要は高まっている。現在存在する主な抗真菌薬の治療グループは４種類あり、ポリエン系抗真菌薬、アゾール系抗真菌薬、アリルアミン系抗真菌薬、エチノカンジンである。最初の３グループは主にエルゴステロール産生を標的とするか、エルゴステロールに結合し、真菌膜を崩壊させる。哺乳類細胞にみられるコレステロールに酷似したエルゴステロールは、適切な細胞の透過性および流動性を維持するために重要である。第４グループのエチノカンジンは、偽巣性コウジ菌が産生する天然化合物のエチノカンジンＢに由来する、合成修飾されたリポペプチドである。真菌では、共有結合的に架橋された２つの多糖類（１，３）−β−グルカンおよびキチンは、構造的完全性に関与し、細胞壁を形作る主要骨格を形成する。抗真菌薬のエチノカンジン類は、ウリジンジフォスファターゼグルコースを（１，３）−β−グルカン重合体に重合する酵素複合体、（１，３）−β−グルカン合成酵素を阻害する。

バークホルデリアの一部菌株の特筆すべき特徴は、様々な抗真菌化合物を産生することであり、このことから、前記菌は真菌性疾患の管理に有用となる可能性がある。しかし、バークホルデリア属を嚢胞性線維症患者から単離すると、この菌は日和見病原体に再分類され、その結果、真菌疾患の管理にバークホルデリア属を直接利用することができない。バークホルデリア菌株に観察された植物病害の抑制作用に関与する抗真菌薬の単離と同定は、直接細菌を利用することにより考えられる健康リスクを排除しながら、生物学的殺真菌薬を開発するために重要な方法を提供する。免疫不全患者では真菌感染が重要であり、活性および毒性スペクトルが現在利用できる抗真菌薬は限られているため、新規の抗真菌薬が必要である。さらに、新しい抗真菌薬は、食品保存と十分で手頃な食料補給品の生産においても、極めて重要である。本開示では、真菌キラーを意味するオシジオファンジン（ｏｃｃｉｄｉｏｆｕｎｇｉｎ）と名付けた、新規抗真菌化合物の構造と活性を特徴付ける。前記抗真菌薬の全共有構造は、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、およびＨＳＱＣ２ＤＮＭＲスペクトロスコピー実験によって解明された。様々な動物および真菌病原体に対して、オシジオファンジンの抗真菌活性が検討、証明されている。さらに、致死量以下の濃度でオシジオファンジンを処理後、抗真菌薬のエチオカンジン類で報告されたものと同様の異常な膜形態が観察され、オシジオファンジンが細胞エンベロープも標的としていることが示唆された。この研究は、化合物の作用様式を理解し、またオシジオファンジンの薬学的、農学的可能性を調査することを目的とした今後の実験の実質的な基礎を提供している。

結果として、殺真菌薬の分野では、典型的な抗真菌薬に耐性を示す動植物病原体に対して有効な、新しい抗真菌化合物への需要がある。本発明では、そのような化合物および組成を提供する。

本発明は、オシジオファンジンという名の新規抗真菌環状糖ペプチド化合物、これに結合する新規アミノ酸、そのような化合物を含む組成を提供する。本発明品は、ヒト、動物、植物に作用する広範な真菌病原体に対して有効である。さらに、本発明品は正常な真菌の膜形態を崩壊させる。また本発明では、新しい前記抗真菌化合物を産生する新規細菌菌株も提供する。

本発明品は、細菌菌株バークホルデリア汚染菌から精製され、８個のアミノ酸残基を含む。１つのアミノ酸には、アシル基とキシロース糖が結合されている。抗真菌組成は、前記新規化合物とその塩、および被験者に投与するための少なくとも１つの許容される基材または賦形剤を有する。真菌感染または疾患を治療する方法は、一時の間、前記感染を排除または改善するために有効な条件下、被験者に前記化合物および組成を投与する段階を有する。

以下に明らかとなる、前述およびその他の本発明の目的、特徴、および利点と共に、本発明の性質は、本発明の好適な実施形態および添付の請求項に関する以下の詳細な説明を参照することで、より明確に理解することができる。

以下の図には本発明の詳細な説明が加えられ、本発明とその利点についてさらに説明することを意図している。当該図は、本明細書の一部に、またそこから組み込まれ、本発明の一定の好適な実施形態を説明し、明細書全体と合わせ、本発明の好適な実施形態を当業者に説明する意味を持つ。
図１は、オシジオファンジンの共有構造の説明である。図Ａには、オシジオファンジンＡおよびＢの代表的な構造を示している。図Ｂには、新規アミノ酸ＮＡＡ２の代表的な構造を示している。化学シフト値（ｐｐｍ）は、それぞれの原子の隣に示している。ＮＯＥ値は、円の隣に記し、矢印はプロトンの相互作用を指す。図２は、キシロース（Ａ）およびオシジオファンジンのグリカン（Ｂ）標準物質のＧＣクロマトグラム図である。いずれのサンプルにも内部標準が添加されている。キシロースの標準物質は２つのピークを示し（Ｘｙｌ１およびＸｙｌ２）、オシジオファンジンのグリカンは２つのピークの移動時間が同じであることに基づき、キシロースと同定された。図３は、オシジオファンジンのＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹＮＭＲスペクトルを示した図である。図Ａでは、ＴＯＣＳＹ２ＤＮＭＲスペクトルの展開が、オシジオファンジンＡ（黒）とオシジオファンジンＢ（灰色）に帰属された各残基について、アミドからα位、およびアミドから側鎖スピン系へのクロスピークを示している。図Ｂでは、ＮＯＥＳＹ２ＤＮＭＲの展開がオシジオファンジンの短いアシル基とキシロース糖の化学シフトを示している。アシル炭素２および３のプロトンとＮＡＡのＨ^６プロトン間のＮＯＥ（灰色）は矢印で識別している。図４は、オシジオファンジンのＮＯＥＳＹＮＭＲスペクトルの図である。その展開は、アミドとαおよびアミドと側鎖の相互作用を示している。それぞれのアミノ酸の相互作用は、赤で示した残基間ＮＯＥの隣に表示している。オシジオファンジンＡおよびオシジオファンジンＢの残基はそれぞれ黒および灰色で示している。図５は、オシジオファンジン活性のスペクトルを表および図で示している。Ａの表では、数種の動植物病原体のＭＩＣ値が示されている。ＭＩＣおよびＭＩＣ５０は、それぞれ１００％の増殖抑制および５０％を超える増殖抑制を示す。図Ｂでは、ゲオトリクム・カンジドゥムの代表的なバイオアッセイプレートが示されている。ウェルＡ１の初期濃度は３２μｇ／ｍＬであり、ウェルＣ２の最終濃度は６２．５ｎｇ／ｍＬである。最後の２ウェルはネガティブコントロールとしている（抗真菌化合物なし）。ウェルＡ４はＭＩＣ５０をよく表しており、真菌の増殖が５０％以上抑制された。図６は、光学顕微鏡の図である。図ＡおよびＢでは、抑制濃度以下で増殖した紋枯病菌の重要な菌糸の形態変化が、特に対照（図Ｂ）と比較して観察される。黒矢印は細胞内封入体の形成を指し、白矢印は膜の変形を指している。図ＣおよびＤでは、ゲオトリクム・カンジドゥムに４８時間４μｇ／ｍＬのオシジオファンジンを処理し（図Ｃ）、対照（図Ｄ）と比較して細胞が大幅に腫脹した。図７は、透過型電子顕微鏡の図である。ゲオトリクム・カンジドゥムに４８時間４μｇ／ｍＬのオシジオファンジンを処理し（図Ｂ）、対照（図Ａ）と比較して著しい形態変化がみられた。細胞壁の厚さは、対照と比較して大幅に減少している。処理を行ったゲオトリクム・カンジドゥムの細胞外壁ははがれ落ちているように見える（黒矢印）。処理を行ったサンプル内でコントラストが消失していることを考えると（白矢印）、細胞が溶解し、細胞成分が溶出したことを示している。図Ｃは、オシジオファンジンを処理した分節胞子をいくつか含む、より広範囲の表示を示している。図Ａ、Ｂ、Ｃの画像は８，０００倍の倍率で撮像した。

本発明の新規抗真菌環状糖ペプチド化合物は、広範な真菌感染に対して有効である。前記化合物の構造は本明細書に開示し、また、これに結合する少なくとも１つの新規アミノ酸の構造についても開示する。

本発明の別の実施形態では、抗真菌組成が前記新規化合物とその塩、および殺真菌療法および治療を必要とするヒト被験者、動物被験体、および／または植物被験体に投与するための薬学的または農学的に許容される基材または賦形剤を少なくとも１つ含む。

さらに別の実施形態では、本発明が、本明細書に説明する新規抗真菌化合物を含む抗真菌化合物を産生する、新しい単離細菌菌株を提供する。

本開示の目的において、略語は以下の通りとする：ＮＭＲ：核磁気共鳴、ＮＯＥ：核オーバーハウザー効果、ＮＯＥＳＹ：核オーバーハウザー効果分光法、ＴＯＣＳＹ：全相関分光法、ＲＯＥＳＹ：回転フレーム核オーバーハウザー効果分光法、ＨＳＱＣ：異核種単一量子コヒーレンス法、ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレイイオン化質量分析、ＭＳ／ＭＳ：タンデム質量分析、ＧＣ：ガスクロマトグラフィー質量分析法、ＮＲＰＳ：非リボソームペプチド合成酵素、ＮＡＡ：新規アミノ酸、ＭＩＣ：最少発育阻止濃度。

分子の用語については、特に記述がない限り一般的な意味を有する。「アシル」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリール基に結合したカルボニル基と定義され、例はこれに限定されるものではないが、アセチルおよびベンゾイルなどの基を含む。「治療有効量」という表現は、前記化合物または組成に接触した真菌に対し、殺真菌効果を誘発するのに十分な量として定義される。治療上有効な薬学的または農学的組成の量は、前記組成を含む成分および要素、また治療指針によって決まる。

本発明では、細菌菌株のバークホルデリア汚染菌ＭＳ１４は、芝のブラウンパッチ病を抑制する土壌から単離された。新規抗菌化合物はこの細菌の液体培養から精製した。精製し、密接な関連性がある抗真菌化合物２つの完全な共有構造は、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、１３ＣＨＳＱＣ２ＤＮＭＲ、およびＥＳＩ−ＭＳとＧＣ実験により決定した。精製した標本のモノアイソトピック質量分析は２つの関連した化合物があることを示しており、質量は１１９９．５４３Ｄａおよび１２１５．５１８Ｄａと決定された。この差は酸素原子の質量に相当する。ＧＣ分析は、前記抗真菌化合物に結合したキシロース糖を同定した。ＮＭＲ実験では、前記化合物が環状であり、８個のアミノ酸から成り、このうち２つはＴｙｒおよびＡｓｎのβ−ヒドロキシ誘導体、１つは新規アミノ酸であることが明らかとなった。前記新規アミノ酸は、前記キシロース糖および短いアシル鎖が結合する骨格となる。抗真菌活性のスペクトルおよび濃度は、マイクロタイタープレート法により決定した。前記抗真菌化合物は、広範な菌性植物および動物病原体、およびピシウム属菌２種に対して強力な抗真菌活性を示した。顕微鏡所見は、前記抗真菌化合物が正常な膜の形態を崩壊させることを示していた。真菌細胞は大きな封入体で満たされており、抑制濃度以下で前記抗真菌化合物を処理後、膜は不規則な形をとり、膨張した。われわれのデータは、新規殺真菌薬を同定したことを裏付けており、前記化合物は真菌キラーを意味するオシジオファンジンと名付けた。

バークホルデリア汚染菌株ＭＳ１４は、疾病を抑制する土壌、つまり、土壌病原菌が宿主植物にほとんどまたは全く被害を引き起こさない土壌から、すでに単離されていた。この菌株の初期の特性評価では、広範な真菌病原体の増殖を抑制することが示された。その後、トランスポゾンの突然変異により、前記抗真菌活性に関与する遺伝子領域が同定され、５６ｋｂの遺伝子ＤＮＡフラグメントの配列が決定され、受入番号ＥＵ９３８６９８にてＧｅｎＢａｎｋに一部が預け入れられた。この遺伝子領域にはいくつかのオープン・リーディング・フレームが含まれ、その一部は調節タンパク質、環状ペプチドトランスポーター、グリコシルトランスフェラーゼ、アミノ基転移酵素、および非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）触媒モジュールをコードする。その後、前記抗真菌化合物は単離され、アミノ酸解析から前記抗真菌化合物の骨格がＮＲＰＳの機序により合成されるオリゴペプチドであることが確認された。

実験手順
すべての化学物質はＳｉｇｍａ（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）から購入し、特に記載のない限り、最高グレードのものとした。オシジオファンジンは前述の通り産生および精製した。

質量分析。前記抗真菌化合物の活性画分は、ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱ−ＴＯＦＩＩ質量分析計を用い、エレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。前記化合物は０．１％ギ酸を用いて５０／５０アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）に溶解し、Ｈａｒｖａｒｄシリンジポンプにより同溶媒を流速１μＬ／ｍｉｎとして、これに注入した。前記流れはｎａｎｏ−ＬＣインターフェイスを用いて噴霧した。標準的な衝突エネルギー（３４Ｖ）と高衝突エネルギー（５０Ｖ）を利用し、一価イオンによりタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行った。

単糖の組成分析。精製したオシジオファンジンの単糖は、ガス液体クロマトグラフィーによりメチル配糖体のトリフルオロアセテートとして決定した。前記分析は、２５ｍ溶融石英（内径０．２２ｍｍ）ＯＶ−１７０１ＷＣＯＴカラム（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ、ニュージャージー州Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ）および電子捕獲型検出器を備えたガスクロマトグラフ（モデル５８９０、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、カリフォルニア州Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ）を用いて行った。糖標準物質（ペントース、ヘキソース、Ｎ−アセチルアミノヘキソース）は被験化合物と同時に処理し、オシジオファンジンの糖は標準物質の糖のクロマトグラフィープロフィールとの比較に基づき決定した。ソルビトールを内部標準として用いた。

ＮＭＲ分光法。オシジオファンジンは、ＮＭＲに必要な濃度では水溶液中で安定ではない。そのため、オシジオファンジンの５ｍＭサンプルを５０％アセトニトリル−ｄ３（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅｓ）および５０％水中で総量７００μＬとして調整した。ＮＭＲデータは、プロトン振動数８００ＭＨｚで操作するＣｏｌｄＰｒｏｂｅ（商標）スペクトロメーターを用い、ＶａｒｉａｎＮＭＲシステムで収集した。^１Ｈの共鳴はＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験を利用し、標準的な方法に従い帰属した。ＲＯＥＳＹおよび^１３Ｃ−ＨＳＱＣ実験により、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルでは曖昧であった部分を解明した。ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、および１３ＣＨＳＱＣＮＭＲ実験は２５℃で収集し、ＲＯＥＳＹ実験は４℃で収集した。キャリア周波数は水の共鳴を中心とし、非常に効率的なｄｏｕｂｌｅ−ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｒａｄｉｅｎｔ選択的エコー法により抑制した。スキャンの間のｒｅｌａｘａｔｉｏｎｄｅｌａｙには１．５ｓを用いた。ＴＯＣＳＹ実験は、ＤＩＰＳＩ−２シークエンンスを用い、６０ｍｓの混合時間で取得した。ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹ実験は、それぞれ４００ｍｓおよび１００ｍｓの混合時間で取得した。ＨＳＱＣスペクトルを収集するためのパラメータを最適化し、脂肪族ＣＨ基を観察した（転送遅延時間を１４０Ｈｚのカップリング定数に調節し、１３Ｃの補正値を３５ｐｐｍに設定した）。ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、およびＲＯＥＳＹのスペクトル掃引幅は、両方の観測軸で９０００Ｈｚ（１１．２５ｐｐｍ）であった。ＨＳＱＣのスペクトル掃引幅は、プロトン観測軸で９０００．０Ｈｚ（１１．２５ｐｐｍ）、カーボン観測軸で２１，２００．０Ｈｚ（１０５．５ｐｐｍ）であった。すべての２Ｄデータは取得観測軸のクロスピークポイント８１９２点および間接観測軸のクロスピークポイント３２０点と５１２点の間で収集し、直接観測軸と間接観測軸それぞれ１０２４点と１９２点で収集したＨＳＱＣは例外とした。ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、およびＴＯＣＳＹ実験の間接的検位相敏感検波は、Ｓｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法により行った。ＨＳＱＣスペクトルを収集するため、勾配を選択した感度向上パルスシークエンスを用いた。^１Ｈ化学シフトはアセトニトリル（１．９３ｐｐｍ）を基準とした。データはまず、残留水分のシグナルをデコンボリューションにより取り除き、平方余弦関数または６０８シフト（ＨＳＱＣの^１Ｈ観測軸）を用いる平方余弦関数を用い、１回ゼロで埋め、フーリエ変換とベースライン補正を行うことで、両観測軸のデータを掛け、ｎｍｒＰｉｐｅにより処理した。データは双方向コンピュータープログラムＮＭＲＶｉｅｗにより分析した。ＮＯＥのクロスピーク強度はＮＭＲＶｉｅｗにより測定した。距離はｒ_ａｂ ^６＝ｒ_ｃａｌ ^６（Ｖ_ｃａｌ／Ｖ_ａｂ）の関係を用いて較正し、ｒ_ａｂは原子ａとｂの距離、Ｖ_ａｂはＮＯＥＳＹａからｂのクロスピーク容積、ｒ_ｃａｌは既知の距離、Ｖ_ｃａｌはＮＯＥＳＹ較正用クロスピークの対応する容積とした。較正に用いた距離は、β−ヒドロキシＴｙｒ４のＨ^δとＨ^ε芳香族プロトンとの距離であった（２．４６Å）。

微生物。真菌菌株はＭｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｙｓｔｅｍおよびＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙａｎｄＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔの所蔵品から入手したか、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から購入した。本研究に使用した真菌単離株は、黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ）、アスペルギルス・フミガーツス、黒色アスペルギルス、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ、ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉＡＴＣＣ９８４８、ゲオトリクム・カンジドゥムＦ−２６０、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａ６１、石こう状小胞子菌、ペニシリン属、紋枯病菌ＭＳＣＯＴ−Ｉ、および毛瘡白癬菌であった。さらに、ピシウム属菌２種Ｐｙｔｈｉｕｍｓｐｉｎｏｓｕｍ４７２−０４とＰｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ６７１−０４を検討した。

抗真菌薬感受性試験。最少発育阻止濃度は寒天微量希釈法により決定した。オシジオファンジンは滅菌水で連続的に２倍希釈し（３２μｇ／ｍＬ〜６２．５ｎｇ／ｍＬ）、１２ウェルの平底プレートに添加した。１ｍＬのＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天Ｄｉｆｃｏ（商標）（ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ニュージャージー州ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ）を各ウェルに添加した。寒天が固化したら、使用するまでプレートを４℃で逆さにして保存した。真菌培養は２２℃で７日間、１００ｘ１５ｍｍのＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｍｅｌＰｒｏｄｕｃｔｓ、カンサス州Ｌｅｎｅｘａ）にて増殖させた。寒天プレートの真菌が密集成長となっている部分から、直径１ｃｍの真菌の栓を含む円形パンチを作成した。前記栓を３ｍＬのＰＢＳに入れ、Ｔｅｎ−ｂｒｏｃｋホモジナイザーで約３０回粉砕した。５μＬの上清を各ウェルの中央に置き、マイクロタイタープレートを２２℃でインキュベートする前に乾燥させた。７２時間で測定したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓを除き、４８時間で各菌種の最少発育阻止濃度を測定した。ＭＩＣは、明らかに真菌成長を抑制する最低濃度として決定した。ＭＩＣ５０値は、対照と比較し、視覚的に（直径で）５０％以上コロニーの増殖を抑制した濃度として決定した。

顕微鏡法。上述の１２ウェルの平底プレートで増殖させた真菌を、菌糸体と分節胞子に対するオシジオファンジンの効果を検討するために利用した。各真菌について、ＭＩＣウェルの隣で増殖させ、４８時間でＭＩＣ５０が観察された菌糸または分節胞子を、光学顕微鏡および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）スライドの作成に用いた。光学顕微鏡については、ラクトフェノールコットンブルー液（Ｓｉｇｍａ）を陽性菌株およびスライドの封入剤として用いた。ＴＥＭでは、ゲオトリクム・カンジドゥムのサンプルを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、２．５％グルタルアルデヒドを用いて４０℃で固定した。前記緩衝液で洗い流した後、検体をリン酸緩衝液中、２％四酸化オスミウムで固定した。前記リン酸緩衝液で洗った検体を段階的濃度のエタノール（５０〜１００％）で脱水し、Ｓｐｕｒｒ樹脂に包埋した。Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−ＪｕｎｇＵｌｔｒａｃｕｔＥウルトラミクロトーム（６０〜９０ｎｍ）により作成した薄い切片を、すでに報告されているとおり、酢酸ウラニルとクエン酸鉛により二重染色した。透過型電子顕微鏡ＪｅｏｌＪＥＭ−１００ＣＸＩＩ（ＪｏｅｌＬｔｄ．、日本、東京）下、グリッドを観察した。画像は５，０００〜８，０００倍で取得した。

結果
オシジオファンジンは環状糖ペプチドである。高解像度質量分析データからは、抗真菌ペプチドには２つの構造変異体があることが明らかとなり、１つはモノアイソトピック質量１，１９９．５４３Ｄａ、もう１つはモノアイソトピック質量１，２１５．５１８Ｄａであり、これは最初の化合物に酸素を足した構造に相当する。これらの質量は、図１に示し、解明された構造と一致している（モノアイソトピック質量の計算値は１，１９９．５５８４と１，２１５．５５３３）。２つの構造変異体があることを考え、抗真菌化合物の変異体はオシジオファンジンＡ（１，１９９．５５８４Ｄａ）およびオシジオファンジンＢ（１，２１５．５５３３Ｄａ）と呼ぶ。標準的な衝突エネルギーではグリカンが失われるだけで、前記抗真菌化合物を断片化するために必要な高い衝突エネルギーによって、複雑な一連の娘イオンが生成するため、抗真菌化合物のＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ／ＭＳ分析の結論は得られていない。しかし、断片化が起こるために高い解離エネルギーが必要であったことは、前記化合物が環状ペプチドであることを示唆している。標準的な解離方法では、親イオンから１４９Ｄａが消失するだけであり、これはペントース糖があることを示している。ＧＣ分析では、オリゴペプチドに結合した前記糖がキシロースであることが明らかとなった（図２）。すでに報告されているとおり、アミノ酸分析ではリジンがあることが明らかとなっている。しかし、前記ペプチドをトリプシン消化しようとする試みは成功せず、これはおそらく、前記化合物の特殊な構造上の特徴のためであろう（データは図示せず）。前記抗真菌ペプチドを線状化することができないため、その後のＥＳＩ−ＭＳ分析もできなかった。

ＮＭＲは、前記抗真菌オリゴペプチドの構造を決定するもっとも確実な方法であることが証明された。前記抗真菌ペプチドの完全な共有構造を決定するため、われわれはＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹ、ＨＳＱＣのデータを収集した。ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹのデータセットは明白な配列帰属を提供しており、ＲＯＥＳＹおよびＨＳＱＣのデータセットはプロトンを基にした帰属を支持する根拠として用いた。ＴＯＣＳＹ／ＮＯＥＳＹのデータセットは、スペクトルのアミドプロトン周波数に１３個の注目すべきスピン系があることを明らかにした。このスピン系の数は、オリゴペプチドで予想される数よりも多く、質量は１１９９および１２１５Ｄａである。前記データセットのさらなる分析では、酸化型変異体のオシジオファンジンＢがＴＯＣＳＹスペクトルのアミド周波数にいくつか注目すべきスピン系を有していることが明らかとなった（図３Ａ）。

オシジオファンジンＡは、Ａｓｎ１−新規アミノ酸２（ＮＡＡ２）−Ｔｒｐ３−β−ヒドロキシＴｙｒ４−Ｌｙｓ５−Ｇｌｙ６−Ａｓｎ７−Ｓｅｒ８で構成される（図１Ａ）。前記アミノ酸の数値的帰属は、ＮＲＰＳ複合体のチオエステラーゼドメインの位置について概要を示した配列データに起因する。前記チオエステラーゼドメインの位置は、典型的には前記オリゴペプチドのＣ末端を指定している。オシジオファンジンＡの残基１および７は、Ａｓｎ残基に特徴的な化学シフトパターンを有する（表１）。ＮＡＡ２は脱アミノ化されたリジンに特徴的な化学シフトパターンを有し、短いアシル基とキシロース糖が結合している（図１Ｂおよび３Ｂ）。この残基の独特の特徴を前提として、その構造について以下に別に考察する。残基３はＴｒｐ残基に特徴的な化学シフトパターンを有する。インドール環プロトンからＴｒｐのβプロトンおよび前記化合物の他の残基の間には、ＮＯＥはない。このことは、前記トリプトファン環の回転が溶媒中では抑制されておらず、立体配置的な平均距離が５Å以上であるためにシグナルが消失していることを示している。前記トリプトファンインドール環が溶媒に近づきやすいというさらなる根拠は、ＴｒｐのインドールＮＨ（イプシロン）の共鳴がないことから来ている。水中環境では、インドール環が酸性ｐＨで溶媒に接触した時にインドールのＮＨプロトンの交換が加速され、線幅の拡大によりシグナルが消失する。残基４は修飾されたＴｙｒ残基である。β炭素がヒドロキシル化され、βプロトンが５．１６ｐｐｍまで著しく低磁場シフトしている。芳香環のδプロトンからβヒドロキシＴｙｒのβプロトンの間にＮＯＥが観察されるため、芳香族プロトンの周波数を明確に帰属することができる。残基５、６、および８はそれぞれＬｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒの典型的な化学シフトパターンを有している。オシジオファンジンＢは、Ａｓｎ１のβ炭素がヒドロキシル化され、１位がβヒドロキシＡｓｎ残基となっている点がオシジオファンジンＡと異なる。β炭素がヒドロキシル化され、βプロトンのシフトが２．６７ｐｐｍから４．２４ｐｐｍの低磁場にシフトした。さらに、Ａｓｎ１のβ炭素がヒドロキシル化され、ＮＡＡ２、Ｔｒｐ３、Ａｓｎ７、およびＳｅｒ８のアミドプロトン周波数の化学シフトに顕著な変化がみられたことから、オシジオファンジンＡとオシジオファンジンＢの全体構造には差があることが示唆される。前記抗真菌化合物のＡｓｎ残基およびβヒドロキシＡｓｎ残基すべての最終的な帰属はＲＯＥＳＹのデータセットから来ており、このデータでは、アミノ基のβプロトンからδプロトンへのＲＯＥが観察された（データは図示せず）。

オシジオファンジンＡおよびＢの残基１〜８は、Ｈ^α _ｉおよびＨ^β _ｉからＨ^Ｎ _ｉ＋１を順次たどることで（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｗａｌｋ）連続的に帰属された。オシジオファンジンＡおよびＢのＮＯＥ結合性は図４に赤で示している。オシジオファンジンの両変異体について、完全に順次たどることができる。各変異体のＡｓｎ１のＨ^αおよびＨ^β、またβ−ヒドロキシＡｓｎ１のＨ^αからＮＡＡ２のＨ^ＮにＮＯＥが存在する。また、各変異体のＮＡＡ２のＨ^α、Ｈ^β、およびＨ^γからＴｒｐ３のＨ^ＮにＮＯＥが存在する。Ｔｒｐ３は、Ｈ^αのプロトンからβ−ヒドロキシＴｙｒ４のＨ^ＮにＮＯＥを有する。ＮＯＥは、それぞれβ−ヒドロキシＴｙｒ４およびＬｙｓ５のＨ^αおよびＨ^βからＬｙｓ５およびＧｌｙ６のＨ^Ｎの間にも存在する。Ｇｌｙ６は、各変異体のＡｓｎ７のＨ^Ｎに対するＨ^αプロトンのＮＯＥを有する。さらに、各変異体のＡｓｎ７のＨ^αおよびＨ^βとＳｅｒ８のＨ^Ｎの間にもＮＯＥが存在する。また、オシジオファンジンが環状の性質を持つという根拠は、オシジオファンジンＡのＳｅｒ８のＨ^αからＡｓｎ１のＨ^Ｎ、オシジオファンジンＢのＳｅｒ８のＨ^αおよびＨ^βからβ−ヒドロキシＡｓｎ１のＨ^Ｎの間のＮＯＥから来ている。オシジオファンジンＡおよびオシジオファンジンＢの両方について、ＮＡＡ２からＴｒｐ３、Ｌｙｓ５からＧｌｙ６、Ｇｌｙ６からＡｓｎ７、Ａｓｎ７からＳｅｒ８の間にＨ^Ｎ _ｉからＨ^Ｎ _ｉ＋１のＮＯＥが観察された。さらに、オシジオファンジンＡではＡｓｎ１からＮＡＡ２、オシジオファンジンＢではβ−ヒドロキシＡｓｎ１からＮＡＡ２の間にＨ^Ｎ _ｉからＨ^Ｎ _ｉ＋１のＮＯＥが観察された。

構造が独特であるため、残基２の図式を図１Ｂに提供する。ＮＡＡ２の構造基盤は脱アミノ化されたリジンと似ている。おそらく、この残基は、前記抗真菌化合物の合成に関与するゲノム領域に認められたケトアシルシンターゼおよびトランスアミナーゼによって形成される（Ｇｕ、Ｓｍｉｔｈ、およびＬｕ、未発表）。参照として脱アミノ化されたリジンの元素帰属を用いると、α、β、γ、δ、およびεプロトンの化学シフトの帰属はＮＯＥデータから支持される。ＮＡＡ２のＨ^α、Ｈ^β、およびＨ^γからＴｒｐ３のＨ^Ｎの間にＮＯＥが観察される。Ｔｒｐ３のＨ^Ｎとプロトンの距離が長くなるにつれてＮＯＥの強度は低下する（図１Ｂ）。さらに、上述のＮＯＥから観察されるとおり、脱アミノ化リジン様残基の末端アミノ基が前のＡｓｎ残基のカルボニル基と共有結合している。この領域の化学シフトの分析からは、前記ＮＡＡ２が４つの炭素アシル鎖およびキシロース糖を結合した塩基を提供していることが示唆される（表１）。前記データは、脱アミノ化リジン様残基のアシル鎖とδ炭素の結合、キシロース糖とβ炭素の結合を裏付けている。この領域の飽和炭素プロトンに予想される化学シフト値は約１．７ｐｐｍであろう。βおよびδプロトンはこの予想値から大幅に下流にシフトし、それぞれ４．２８ｐｐｍおよび３．５６ｐｐｍとなっている。これらのプロトンの化学シフトの変化は、近くに酸素などの電子求引基があることを示唆している。ケトアシルシンターゼによる脂肪酸合成の一部として存在すると考えられるδおよびβ炭素の二重結合酸素はヒドロキシル基に還元され、その後、４つの炭素アシル鎖およびキシロース糖が縮合反応によって結合することが予想される。アシル炭素２および３から脱アミノ化リジン様残基のＨ^εプロトンにＮＯＥがあるため（図１Ｂ）、アシル基がδ炭素に結合していることを裏付けている。前記分子のＳｅｒ８残基も、前記キシロースの結合を裏付けている可能性がある。しかし、予想される化学シフト値に目立った変化がないことが、ＮＡＡ２に観察されるＨ^βプロトンの劇的な下流へのシフトに重要性を付け加えている。前記分子のキシロースが他の残基に結合することで前記キシロース分子の酸素が失われ、上述の質量分析データに観察されるよりも質量が少なくなると考えられる。結果として、ＮＡＡ２のβ炭素は前記キシロースが結合する部位として最も蓋然性を有する。ＨＳＱＣデータは、ＮＡＡ２のプロトンと修飾された残基の炭素共鳴との間のさらなる関連性を提供した。例えば、γ炭素の炭素共鳴は１．８９および１．３９ｐｐｍの共鳴で２つの区別可能なプロトンを有していた（図１）。

オシジオファンジンは広範なスペクトルの抗真菌活性を有する。オシジオファンジンは広範囲の菌性植物および動物病原体に大きな抗真菌活性を示した（図５）。紋枯病菌はＭＩＣ２μｇ／ｍＬで検討し、最も感受性が高かった真菌であり、０．５μｇ／ｍＬの濃度で有意な増殖抑制を示した。アスペルギルス・フミガーツスおよび黒色アスペルギルスは浸潤性肺アスペルギルス症の一般的な原因菌であるが、いずれもオシジオファンジンに対する感受性が高く、ＭＩＣはそれぞれ８μｇ／ｍＬおよび４μｇ／ｍＬであった。２つの関連する真菌である石こう状小胞子菌および毛瘡白癬菌は、いずれも皮膚糸状菌症に関与しており、オシジオファンジンに対して感受性があり、ＭＩＣは４μｇ／ｍＬであった。さらなる病原性真菌のペニシリウム属、黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ）およびＭａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａｐｈａｓｅｏｌｉｎａも、オシジオファンジンに対する感受性が示されており、ＭＩＣはそれぞれ３２μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、および２μｇ／ｍＬであった。真菌フザリウム・オキシスポラムはオシジオファンジンに対する感受性がもっとも低く、ＭＩＣは>３２μｇ／ｍＬであった。ただし、１６μｇ／ｍＬで有意な増殖抑制が観察された。植物および動物の酵母病原菌であるゲオトリクム・キャンディダムは有意に抑制され、ＭＩＣは８μｇ／ｍＬであり、４μｇ／ｍＬで著しい増殖抑制が認められた（図５Ｂ）。Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍおよびＰ．ｕｌｔｉｍｕｍはオシジオファンジンに対する感受性がもっとも高く、ＭＩＣはそれぞれ１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬであった。これらのデータは、オシジオファンジンが植物および動物の真菌病原体に対する強力な広域スペクトルの抗真菌薬として応用できる可能性を有していることを示している。

オシジオファンジンは膜の整合性を変化させる。上記の研究では、年齢が同等の菌糸および細胞を用いた。オシジオファンジンの抑制濃度（０．５μｇ／ｍＬ）以下で増殖させた紋枯病菌の菌糸を前記抗真菌化合物なしで増殖させた紋枯病菌の菌糸と比較した。この濃度では、紋枯病菌の増殖が５０％以上抑制された（図５Ａ）。オシジオファンジンは菌糸の形態を大きく変化させ、最も注目すべき変化の１つは細胞内封入体の形成である（図６ＡおよびＢ、黒矢印）。別の注目すべき違いは、オシジオファンジン処理後にみられた金糸先端の変形および細胞膜の波状パターンであった（図６ＡおよびＢ、白矢印）。抑制濃度以下で増殖させたＭ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａの金糸の形態にも同様の所見が認められた（図示せず）。４８時間オシジオファンジン４μｇ／ｍＬを処理したゲオトリクム・カンジドゥムの分節胞子は、非処理細胞と比較し、処理後に細胞が腫脹したため、無定形を示した（図６ＣおよびＤ）。ＴＥＭデータは、４８時間抑制濃度以下のオシジオファンジンを処理後、ゲオトリクム・カンジドゥムの細胞壁の厚さが劇的に減少したことを示している（図７）。さらに、処理サンプルでは細胞壁の脱落のようなものが存在し（黒矢印）、オシジオファンジンの処理により細胞壁の整合性に影響が見られることを示唆している。処理したゲオトリクム・カンジドゥムの細胞内のコントラストがなくなっていることも細胞が溶解したことを示唆している（白矢印）。おそらく、薄い細胞壁は浸透圧を維持できないのであろう。分節胞子が円筒形であり、横断面で切断された可能性が高いため、ＴＥＭデータからは腫脹について記載することはできない。いくつか分節胞子を示したより広視野では、一部の分節胞子が円筒形を保持していることを示している（図７Ｃ）。それにもかかわらず、これらの分節胞子がすべて内部および図Ｂに示された分節胞子に見られる細胞壁に同じ形態変形を共有している。これらの所見は、目に見える封入体の形成は基質が蓄積したことが原因であるため、オシジオファンジンが細胞壁の形成を崩壊させることで膜の整合性を標的とし、またオシジオファンジンが酵素機能を阻害する可能性があることを示している。

考察
本研究の所見は、新規アミノ酸を含むオシジオファンジンの全共有構造が解明されたこと、オシジオファンジンの広域スペクトルの抗真菌活性の特徴が決定されたこと、前記抗真菌化合物処理後に細胞封入体および膜が不安定になるというｉｎｖｉｖｏ所見が得られたことなどである。

構造的な特徴解析では、オシジオファンジンが独特な抗真菌薬であることが確認される。上記の質量分析およびＮＭＲデータはすべて完全に一致し、図１に示したオシジオファンジンの構造を支持している。前記構造データは明白なアミノ酸の帰属を提供しており、オシジオファンジンの２つの構造変異体であるオシジオファンジンＡとオシジオファンジンＢを区別することができた。各分子の骨格に沿って完全に順次たどることができることが示された。さらに、Ｃ末端残基Ｓｅｒ８からオシジオファンジンＡのＡｓｎ１およびオシジオファンジンＢのβ−ヒドロキシＡｓｎ１へのＮＯＥから、すでに予測されていたオリゴペプチドが環状であるという性質が確認される。

新規アミノ酸が同定され、ＮＭＲデータによって十分特徴が決定される。抗真菌活性に対するこの独特な残基の重要性は分かっていないが、われわれのグループにとっては非常に興味深い分野である。さらに、２つのアミノ酸誘導体β−ヒドロキシＡｓｎ（オシジオファンジンＢのみ）とβ−ヒドロキシＴｙｒがＮＭＲデータにおいて同定された（表１）。まだ、各変異体をクロマトグラフィーにより分離することはできていない。従って、Ａｓｎ１のβ炭素のヒドロキシル化が前記化合物の生物活性にとって重要であるか否かはまだ分かっていない。β−ヒドロキシＡｓｎ１に近い残基のアミド周波数が劇的にシフトしたことは、前記ペプチドの構造がＡｓｎ１のβ炭素のヒドロキシル化後に変化したことを示している。

オシジオファンジン活性の正確な機序は分かっていないが、本研究はその作用機序を解明する実験を開始するためのしっかりとした基礎を提供している。オシジオファンジンは２つのピシウム属菌に強い抑制作用を示した。ピシウム属菌は真菌ではなく、エルゴステロールは細胞膜の主要ステロールではないため、エルゴステロールを標的とした抗真菌薬には感受性がない。従って、オシジオファンジンの抗真菌活性には、おそらくエルゴステロールへの結合またはエルゴステロール合成の阻害は関与していない。ピシウム属菌の細胞壁にはキチンが含まれておらず、この卵菌には細胞壁に多量のβ−グルカンが含まれている点も重要である。従って、オシジオファンジンはキチン合成を標的としている可能性もない。

オシジオファンジン処理した真菌の形態は、エキノカンジン系薬物を処理した真菌について文献で報告された形態と似ており、オシジオファンジンがグルカゴン合成を標的としている可能性があることを示唆している。エキノカンジン系薬物であるミカファンギンを抑制濃度で処理したアスペルギルス・フミガーツスでは金糸が破裂したことが示され、抑制濃度以下で波状の膜と変形した金糸先端が示された。致死量のエキノカンジン系薬物で処理したカンジダ・アルビカンスは腫脹を誘発し、抑制用量以下で膜に異常な形態学的変化が観察された。アスペルギルス・フミガーツスの異常な膜形態の形成は、紋枯病菌およびＭ．ｐｈａｓｅｏｌｉｎａを抑制濃度以下で増殖させた場合に観察された現象と同様であり、カンジダ・アルビカンスの細胞腫脹は、抑制用量以下のオシジオファンジンを処理したゲオトリクム・カンジドゥムに観察された現象と似ている。興味深いことに、フザリウム属種はエキノカンジン系薬物に耐性を示す。耐性の機序は、（１，３）−β−グルカン合成酵素の触媒サブユニットの自然突然変異体および細胞壁構造の自然の差異の結果であると考えられ、特にフザリウム属は保有する１，３−β−グルカゴンが少ない。本研究ではフザリウム・オキシスポラムのＭＩＣが>３２μｇ／ｍＬであったが、オシジオファンジンは１６μｇ／ｍＬでこの真菌の増殖を劇的に遅くした。さらなる研究では、オシジオファンジンがグルカンの真菌細胞壁合成を抑制するか否か、特に、その（１，３）−β−グルカン合成酵素を抑制する能力について調査する予定である。細胞壁の形成と細胞壁損傷に対する反応には、複雑な細胞シグナル伝達ネットワークが関与しており、このネットワークが真菌細胞壁表面と生合成酵素の間の伝達を調整し、合成および修復を司っている。従って、オシジオファンジンの正確な作用機序には完全に新規の標的が関与している可能性がある。

本発明品を有する組成は、感染または疾患の重症度により、治療有効量で被験動物または植物に投与し、それによって真菌感染の短期的または長期的作用を予防または軽減することができる。

本開示は初めて、ヒト被験者、動物被験体、および植物被験体の広範な真菌感染を予防および抑制するための応用を目的とした、一連の新規で非常に有効な抗真菌化合物、また前記抗真菌化合物を産生する新規の単離細菌菌株について報告し、完全にその特徴を解析した。

上述の詳細な説明は、当業者が当該発明品を作成および利用することができるように提示している。具体的な詳細は、本発明を包括的に理解するために開示され、提供された情報を説明するために利用される。ただし、これらの具体的な詳細は、当業者には明白であるため、本発明を実施するためには必要ない。具体的な応用、分析、計算の説明は、代表的な例としてのみ挙げることを意味している。好適な実施形態に対する様々な適切な変更、修正、併用、同等物および追加または異なる相互作用と材料および結果として得られる利点は、当業者に容易に明らかとなり、本明細書で定義した一般的な原則は他の実施形態および応用に適用されるが、本発明の精神と範囲内にまだとどまっている。当該請求項および明細書は、本発明に権利を与えられた完全な保護の範囲を過度に狭めるためのものと解釈すべきではない。当該数値は例の目的のみとして提示されていることも理解する必要がある。本発明は、示された実施形態に限定する意図はなく、本発明は、本明細書に開示された原則および特徴と一致する最も広範囲にわたる可能な範囲と一致する。

表１．化学シフト

プロトンの化学シフト値はＴＯＣＳＹ実験によるものである。括弧内の化学シフト値はＨＳＱＣ実験の^１３Ｃ値である。オシジオファンジンＢに独特の化学シフト値は角括弧に示している。＊はＲＯＥＳＹ実験の化学シフト値を示している。

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Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｈａｓｕｍｉ，Ｙ．，Ｕｅｄａ，Ｋ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，ａｎｄＹａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．（２００５）ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉｃａｆｕｎｇｉｎｏｎｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ．Ｊ．ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃ．５４，６７−７７．
Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ｈａｔａｎｏ，Ｋ．，Ｉｋｅｄａ，Ｆ．，ａｎｄＳｈｉｂｕｙａ，Ｋ．（２００５）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｆｉｎｄｉｎｇｓｆｏｒｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ−ｔｒｅａｔｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｕｌｍｏｎａｒｙａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓｉｎｍｉｃｅ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．４３，４３９−４４５．
Ａｎｇｉｏｌｅｌｌａ，Ｌ．，Ｍａｒａｓ，Ｂ．，Ｓｔｒｉｎｇａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ａｒａｎｃｉａ，Ｇ．，Ｍｏｎｄｅｌｌｏ，Ｆ．，Ｇｉｒｏｌａｍｏ，Ａ．，Ｐａｌａｍａｒａ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄＣａｓｓｏｎｅ，Ａ．（２００５）Ｇｌｕｃａｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓａｎｄｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｉｎＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ，ａｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ，ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ．Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１７，４０９−４１６．Ｔｏｍａｎａ，Ｍ．，Ｐｒｃｈａｌ，Ｊ．，Ｇａｒｎｅｒ，Ｌ．，Ｓｋａｌｋａ，Ｈ．，ａｎｄＢａｒｋｅｒ，Ｓ．（１９８４）Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｌｅｎｓｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０３，１３７−１４２．
Ｒｅｎｆｒｏｗ，Ｍ．Ｂ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｈ．Ｊ．，Ｔｏｍａｎａ，Ｍ．，Ｋｕｌｈａｖｙ，Ｒ．，Ｈｉｋｉ，Ｙ．，Ｔｏｍａ，Ｋ．，Ｅｍｍｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｌ，Ａ．Ｇ．，ａｎｄＮｏｖａｋ，Ｊ．（２００５）ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｂｅｒｒａｎｔＯ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＩｇＡｌｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｃａｐｔｕｒｅｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍ−ｉｏｎｃｙｃｌｏｔｒｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，１９１３６−１９１４５．
Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．（１９８６）ＮＭＲｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ．
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｌｅｒ，Ｌ．，ａｎｄＥｒｎｓｔ，Ｒ．Ｒ．（１９８３）ＣｏｈｅｒｅｎｃｅＴｒａｎｓｆｅｒＢｙＩｓｏｔｒｏｐｉｃＭｉｘｉｎｇ −ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏＰｒｏｔｏｎＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．５３，５２１−５２８．
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Ｂｏｔｈｎｅｒ−Ｂｙ，Ａ．Ａ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄＪｅａｎｌｏｚ，Ｒ．Ｗ．（１９８４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ｔｒａｎｓｉｅｎｔｎｕｃｌｅａｒＯｖｅｒｈａｕｓｅｒｅｆｆｅｃｔｓｉｎｔｈｅｒｏｔａｔｉｎｇｆｒａｍｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６，８１１−８１３．Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ．，ａｎｄＲｕｂｅｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８０）Ｎａｔｕｒａｌａｂｕｎｄａｎｃｅｎｉｔｒｏｇｅｎ− １５ＮＭＲｂｙｅｎｈａｎｃｅｄｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６９，１８５−１８８．
Ｈｗａｎｇ，Ｔ．Ｌ．，ａｎｄＳｈａｋａ，Ａ．Ｊ．（１９９５）Ｗａｔｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｔｈａｔｗｏｒｋｓ．Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｓｃｕｌｐｔｉｎｇｕｓｉｎｇａｒｂｉｔｒａｒｙｗａｖｅｆｏｒｍｓａｎｄｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｒａｄｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ａｌ１２，２７５−２７９．
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Ｂｏｂａｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｌａｎｔ，Ｄ．，ａｎｄＨｕｒｄ，Ｒ．Ｅ．（１９９２）ＩｍｐｒｏｖｅｄＰｒｏｔｏｎ−ＤｅｔｅｃｔｅｄＨｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＧｒａｄｉｅｎｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄｚａｎｄｚｚｆｉｌｔｅｒｓ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．ＡｌＯｌ，１１３．Ｄｅｌａｇｌｉｏ，Ｆ．，Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，Ｖｕｉｓｔｅｒ，Ｇ．Ｗ．，Ｚｈｕ，Ｇ．，Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｊ．，ａｎｄＢａｘ，Ａ．（１９９５）ＮＭＲｐｉｐｅ −ａＭｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＳｐｅｃｔｒａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＳｙｓｔｅｍＢａｓｅｄｏｎＵｎｉｘＰｉｐｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ６，２７７−２９３．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄＢｌｅｖｉｎｓ，Ｒ．Ａ．（１９９４）ＮＭＲＶｉｅｗ − ａＣｏｍｐｕｔｅｒ−ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒｔｈｅＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮＭＲＤａｔａ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ４，６０３−６１４．Ｇｒｏｓｓ，Ｄ．，ａｎｄＤｅＶａｙ，Ｊ．（１９７７）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｙｒｉｎｇｏｍｙｃｉｎ，ａｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．１１，１３−２８．
Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．，ａｎｄＹａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．（２００２）ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ（ＦＫ４６３），ａｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎｌｉｋｅｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃ．５１，２４７−２５５．Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｌｉｅｈｒ，Ｓ．，Ｃｏｏｐｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄＣｏｔｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．（２００１）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｙｃｌｉｃｐｅｐｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｂｙｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６，６５８−６６３．
Ｆｒｉａｓ，Ｈ．Ｖ．，Ｍｅｎｄｅｓ，Ｍ．Ａ．，Ｃａｒｄｏｚｏ，Ｋ．Ｈ．Ｍ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｖ．Ｍ．，Ｔｏｍａｚｅｌａ，Ｄ．，Ｃｏｌｅｐｉｃｏｌｏ，Ｐ．，ａｎｄＰｉｎｔｏ，Ｅ．（２００６）Ｕｓｅｏｆｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓｄｕｒｉｎｇａｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｂｌｏｏｍｅｖｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４４，７４１−７４６．
Ｆｅｌｎａｇｌｅ，Ｅ．Ａ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｃｈａｎ，Ｙ．Ａ．，Ｐｏｄｅｖｅｌｓ，Ａ．Ｍ．，Ｂｅｒｔｉ，Ａ．Ｄ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄＴｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｇ．（２００８）Ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃａｌｌｙｒｅｌｅｖａｎｔｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＭｏＩ．Ｐｈａｒｍ．５，１９１−２１１．
Ｗａｅｌｄｅｒ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｌ．，ａｎｄＲｅｄｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｇ．（１９７５）Ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｅｘｃｈａｎｇｅａｂｌｅｐｒｏｔｏｎｓ．Ｉ．Ｆｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｓａｔｕｒａｔｉｏｎ−ｒｅｃｏｖｅｒｙａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎｄｏｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｐｒｏｔｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７，２９２７−２９２８．
Ｋｒｉｓｈｎａｎ−Ｎａｔｅｓａｎ，Ｓ．，ａｎｄＣｈａｎｄｒａｓｅｋａｒ，Ｐ．Ｈ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｏｐｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｉｎｖａｓｉｖｅａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ．Ｄｒｕｇｓ６８，２６５−２８２．
Ｎｇｗｏｇｕ，Ａ．Ｃ，ａｎｄＯｔｏｋｕｎｅｆｏｒ，Ｔ．Ｖ．（２００７）ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓｉｎａｒｕｒａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎＥａｓｔｅｒｎＮｉｇｅｒｉａａｎｄｒｅｖｉｅｗｏｆｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｆｒｏｍＡｆｒｉｃａ．Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ１６４，１４９−１５８．
Ｙａｇｈｍｏｕｒ，Ｍ．Ａ．，Ｉｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ，Ｐ．，Ｂｏｓｔｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄＭｉｃｈａｉｌｉｄｅｓ，Ｔ．Ｊ．（２００８）ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍｃａｕｓｉｎｇｓｏｕｒｒｏｔｏｆｐｅａｃｈｅｓａｎｄｎｅｃｔａｒｉｎｅｓｉｎＣａｌｉｆｏｒｎｉａ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ９８，Ｓｌ７５−Ｓｌ７５．Ｓｆａｋｉａｎａｋｉｓ，Ａ．，Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ，Ｋ．，Ｓｔｅｆａｎｉｄｏｕ，Ｍ．，Ｍａｒａｋｉ，Ｓ．，Ｋｏｕｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．，Ｋｏｆｔｅｒｉｄｉｓ，Ｄ．，
Ｓａｍｏｎｉｓ，Ｇ．，ａｎｄＴｏｓｃａ，Ａ．（２００７）ＩｎｖａｓｉｖｅｃｕｔａｎｅｏｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ −ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢａｎｄｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．４５，８１−８４．
Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄ．Ｉ．Ｂ．，Ｓａｎｔｕｒｉｏ，Ｊ．Ｍ．，Ａｌｖｅｓ，Ｓ．Ｈ．，Ａｒｇｅｎｔａ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｌ．，Ｓｐａｎａｍｂｅｒｇ，Ａ．，ａｎｄＦｅｒｒｅｉｒｏ，Ｌ．（２００７）ＣａｓｐｏｆｕｎｇｉｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＢｒａｚｉｌｉａｎＰｙｔｈｉｕｍｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｎｉｍａｌｓ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．６０，１１６８−１１７１．
Ａｒｇｅｎｔａ，Ｊ．Ｓ．，Ｓａｎｔｕｒｉｏ，Ｊ．Ｍ．，Ａｌｖｅｓ，Ｓ．Ｈ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄ．Ｉ．Ｂ．，Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ，Ａ．Ｓ．，Ｓｐａｎａｍｂｅｒｇ，Ａ．，ａｎｄＦｅｒｒｅｉｒｏ，Ｌ．（２００８）Ｉｎｖｉｔｒｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ，ｉｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ，ａｎｄｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅａｌｏｎｅｏｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＰｙｔｈｉｕｍｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＢｒａｚｉｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２，７６７−７６９．Ｐｏｐｏｌｏ，Ｌ．，Ｇｕａｌｔｉｅｒｉ，Ｔ．，ａｎｄＲａｇｎｉ，Ｅ．（２００１）Ｔｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌ−ｗａｌｌｓａｌｖａｇｅｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３９，１１１−１２１．
Ｌｅｖｉｎ，Ｄ．Ｅ．（２００５）ＣｅｌｌｗａｌｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９，２６２−２９１．
Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｃ．Ｍ．（２００１）Ｆｕｎｇａｌｂｅｔａ（ｌ，３）−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．３９，５５−６６．

Claims

真菌感染または疾患を予防または治療するための抗真菌環状糖ペプチド化合物、およびその薬学的および農学的に許容される塩であって、以下の式（Ｉ）を有し、
オシジオファンジンＡ
Ｃ_５４Ｎ_１２Ｏ_１９Ｈ_７９
モノアイソトピック質量１１９９．５５８４
（Ｉ）

Ａｓｎ１、ＮＡＡ２、Ｔｒｐ３、ＢＨＴ４、Ｌｙｓ５、Ｇｌｙ６、Ａｓｎ７、およびＳｅｒ８はアミノ酸残基である、抗真菌環状糖ペプチド化合物。
真菌感染または疾患を予防または治療するための抗真菌環状糖ペプチド化合物、およびその薬学的および農学的に許容される塩であって、以下の式（ＩＩ）を有し、
オシジオファンジンＢ
Ｃ_５４Ｎ_１２Ｏ_２０Ｈ_７９
モノアイソトピック質量１２１５．５５３３１
（ＩＩ）

ＢＨＮ１、ＮＡＡ２、Ｔｒｐ３、ＢＨＴ４、Ｌｙｓ５、Ｇｌｙ６、Ａｓｎ７、およびＳｅｒ８はアミノ酸残基である、抗真菌環状糖ペプチド化合物。
請求項１または２記載の抗真菌化合物において、前記アミノ酸残基ＮＡＡ２は、さらに、結合したアシル基およびキシロース糖を有するものである、抗真菌化合物。
請求項３記載の抗真菌化合物において、前記アミノ酸残基ＮＡＡ２は下記構造を有するものである、抗真菌化合物。
請求項３記載の抗真菌化合物において、前記化合物は菌性植物、動物、およびヒト病原体に対して有効である、抗真菌化合物。
請求項３記載の抗真菌化合物において、前記化合物は菌性植物、動物、およびヒト病原体の細胞膜形態を崩壊させるものである、抗真菌化合物。
請求項１または２いずれか記載の抗真菌化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容される基材または賦形剤を有する医薬組成物。
請求項７記載の組成物において、少なくとも１つの基材または賦形剤は農学的に許容される基材または賦形剤である、組成物。
請求項５記載の抗真菌化合物において、前記化合物は真菌菌株バークホルデリア汚染菌に由来するものである、抗真菌化合物。
単離細菌菌株ＭＳ１４であって、当該細菌菌株はバークホルデリア汚染菌種に属するものであり、その遺伝子ＤＮＡ断片は配列が決定され、受入番号ＥＵ９３８６９８でＧｅｎｂａｎｋに預け入れられ、前記菌株は少なくとも１つの抗真菌化合物を産生する活性を上昇させる原因となる遺伝子領域を有するものである、単離細菌菌株ＭＳ１４。
請求項１０記載の単離細菌菌株において、前記少なくとも１つの抗真菌化合物は、請求項１記載の抗真菌環状糖ペプチド化合物である、単離細菌菌株。
請求項１０記載の単離細菌菌株において、前記少なくとも１つの抗真菌化合物は、請求項２記載の抗真菌環状糖ペプチド化合物である、単離細菌菌株。